K E X I N科昕生物
北京科昕生物科技有限公司
重组抗PD-1全人单克隆抗体(细胞培养级别)
Recombinant anti-Human PD-1
Functional Monoclonal Antibody
（Cell Culture Grade）
产品说明：
PD1 全人单抗可以有效地封闭PDL1 和PD1 的结合，并且不会引起 HAMA 反应（人抗鼠抗体反应）。PD1 的抗体已作为广谱性抗肿瘤药物被接受，也可能成为最有效地平衡细胞治疗的工具。PD1 是激活的T细胞、B 细胞以及髓样细胞膜表面重要的免疫调控受体。与配体PDL1和PDL2 结合，抑制T 细胞增殖和细胞因子分泌，影响细胞治疗的效果。近来研究发现，DC 细胞含有PDL1，DC‐CIK 联合治疗时，PDL1 可能是潜在的细胞治疗的负调节因素。PD‐1 主要在活化的T、B 和NK 等细胞上呈诱导性表达,PD‐1 有PD‐L1(B7‐H1,CD274)和PD‐L2(B7‐DC,CD273)两个配体。PD‐L1 广泛组成性表达于多种实质器官组织、免疫细胞以及多种类型的肿瘤细胞上,而PD‐L2 仅表达于活化的巨噬细胞、树突状细胞、骨髓来源的基质细胞和个别肿瘤细胞株。PD‐1 随T 细胞活化程度逐步上调表达,与PD‐L 结合后引发抑制信号的产生，致使效应性T 细胞失能并及时进入凋亡。
本产品系由单克隆细胞株表达并高度纯化后的抗体经超滤换液分装制成。
本产品为无菌澄明液体，由含有 10mM PBS pH为 7.2的蛋白溶液经0.2um过滤后分装。
规格参数：
货号：kx10-1 体积：50ul/500ul/1ml 浓度：1mg/ml.
质量控制：
纯度：经高效液相色谱（SEC-HPLC）和SDS-PAGE检测，纯度大于98.0%.
内毒素：小于1EU/mg.
使用说明：
建议长期-80℃分装保存，无菌条件下操作，避免污染。
具体用量需通过预实验确定。
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抗HER2人源化单克隆抗体Herceptin的专利剖析供稿人：彭建新供稿时间：2004-12-30 关键字：HER2 单克隆抗体乳腺癌 乳腺癌严重地威胁着人们的健康，几乎所有人群的乳腺癌发病率都在上升，平均每年约升高1%，估计全球每年发病患者超过100万（cancer statistics 2002 cancer J Clin 2002,52(1):23）。 c-erbB2/ HER-2/ neu 编码产物p185erbB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生 长因子受体(EGFR) 家族成员。C-erbB2/ HER-2/ neu 基因的扩增和p185erbB2蛋白的过度表 达见于多种恶性肿瘤,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺 癌。 p185erbB2过度表达提示肿瘤预后差，如转移、复发、易耐药及存活期短等。p185erbB2作为肿瘤 抗原，是一个理想的肿瘤治疗靶点。美国食品及药物管理局( FDA) 已于1998 年10 月正式 批准将一株抗p185erbB2人源化抗体Trastuzumab （商品名Herceptin，Genentech/罗氏公 司）用于临床治疗p185erbB2高表达的转移性乳腺癌。 Genentech公司就Herceptin产品相关的专利申请了如下保护： （1）一种可与HER2受体胞外区特异性结合、抑制肿瘤细胞生长的单克隆抗体及该其在在治 疗过量表达HER2受体的癌症病人方面的应用。 （2）一种可与HER2受体胞外区特异性结合、使过量表达HER2受体的肿瘤细胞对细胞毒性 因子更敏感的单克隆抗体。 （3）治疗过量表达HER2受体的癌症病人的方法，包括给上述患者服用有效量的细胞毒性因 子和能与HER2受体结合、使过量表达HER2受体的肿瘤细胞对细胞毒性因子更敏感的抗体， 以消除或减小患者的肿瘤。 （4）细胞毒性因子和抗体抗原结合残基在上述权利要求方面的应用。 Genentech公司就与Herceptin产品相关的技术已在美国、日本、加拿大申请了专利保护， 具体的专利为：JP3502885、US5677171、US5720937、US5720954、US5725856、US5770195、 US5772997、JP11255666、JP11335297、JP3040121、CA1341082、US6165464、US6387371、 US6399063、US2002192211。 Genentech公司就抗HER2抗体的最新专利申请为（2004年公开的，以Her2 or c-erbB2 or c-erbB-2 or p185作为主题词）：
人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体通过基因克隆及DNA重组技术等进行改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，同时又降低了其异源性，有利应用于人体。然而，即使通过嵌合抗体技术把C区替换，人源化抗体V区的互补决定区（CDR）和框架区（FR）也仍有可能诱导相当强的抗体反应。因此，研究者开始着手将部分CDR和FR区也改造为人抗体序列，以便能进一步提高抗体的人源化程度，降低药物抗体反应发生的可能。经过数年的研究和改进，人们已经创建并完善了以重构抗体、表面重塑抗体、去免疫化抗体和链替换抗体等为代表的多种人源化抗体技术。 人源化抗体技术 重构抗体 重构抗体是由异源抗体中和抗原结合相关的残基与人抗体重新剪接构建的抗体，包括互补决定区移植、部分互补决定区移植和特定决定区转移。构建重构抗体的流程：①克隆分析亲本鼠单抗的V区基因，确定CDR和FR区；②通过数据库检索比对及辅助计算机分子模拟等，找出有最大同源性的人FR 区模板；③确定需要保留和改变的关键残基，经基因合成、真核表达、检测实际结合效果后，对需要保留和改变的关键残基进行相应的修正；④最终获得高亲和力的、具有与亲本鼠单抗相同抗原结合表位的人源化抗体。 表面重塑抗体 表面重塑抗体是通过对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造而获得的人源化抗体。表面重塑抗体的库构建流程：①首先在结构数据库中寻找鼠源的最大同源性蛋白，利用相应的软件并采用分子三维结构分析的方式确定表面残基的位置；②在公用数据库中寻找最大同源性的人抗体序列，在相应的表面残基位置上尝试替换为相应的人抗体残基（替换中要兼顾考虑被替换残基的侧链匹配情况和与CDR是否在空间上紧邻）；③确定替换后的残基种类，即可采用定点突变或基因合成等方法获得
K E X I N科昕生物 北京科昕生物科技有限公司 重组抗PD-1全人单克隆抗体(细胞培养级别) Recombinant anti-Human PD-1 Functional Monoclonal Antibody （Cell Culture Grade） 产品说明： PD1 全人单抗可以有效地封闭PDL1 和PD1 的结合，并且不会引起 HAMA 反应（人抗鼠抗体反应）。PD1 的抗体已作为广谱性抗肿瘤药物被接受，也可能成为最有效地平衡细胞治疗的工具。PD1 是激活的T细胞、B 细胞以及髓样细胞膜表面重要的免疫调控受体。与配体PDL1和PDL2 结合，抑制T 细胞增殖和细胞因子分泌，影响细胞治疗的效果。近来研究发现，DC 细胞含有PDL1，DC‐CIK 联合治疗时，PDL1 可能是潜在的细胞治疗的负调节因素。PD‐1 主要在活化的T、B 和NK 等细胞上呈诱导性表达,PD‐1 有PD‐L1(B7‐H1,CD274)和PD‐L2(B7‐DC,CD273)两个配体。PD‐L1 广泛组成性表达于多种实质器官组织、免疫细胞以及多种类型的肿瘤细胞上,而PD‐L2 仅表达于活化的巨噬细胞、树突状细胞、骨髓来源的基质细胞和个别肿瘤细胞株。PD‐1 随T 细胞活化程度逐步上调表达,与PD‐L 结合后引发抑制信号的产生，致使效应性T 细胞失能并及时进入凋亡。 本产品系由单克隆细胞株表达并高度纯化后的抗体经超滤换液分装制成。 本产品为无菌澄明液体，由含有 10mM PBS pH为 7.2的蛋白溶液经0.2um过滤后分装。 规格参数： 货号：kx10-1 体积：50ul/500ul/1ml 浓度：1mg/ml. 质量控制： 纯度：经高效液相色谱（SEC-HPLC）和SDS-PAGE检测，纯度大于98.0%. 内毒素：小于1EU/mg. 使用说明： 建议长期-80℃分装保存，无菌条件下操作，避免污染。 具体用量需通过预实验确定。 1
人源化单克隆抗体的构建技术 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。 关键词：人源化，单克隆抗体，构建 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。 1 嵌合抗体的构建 抗体分子与抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆
https://www.doczj.com/doc/0d13132283.html, HA标签抗体，抗HA单抗，HA小鼠源单克隆抗体 Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody （ 4F6） HA标签系统利用一个HA (流感病毒血凝素，influenza hemagglutinin epitope: YPYDVPDYA)短肽肽融合到目标蛋白。HA标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于多种细胞类型，相应的HA标签抗体也被广泛应用。HA 标签抗体能特异识别C末端或N末端带有HA标签(HA-tagged)的融合蛋白，也可以用于检测和HA tag融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测HA tag融合表达蛋白等。 应用类型：WB（1:1,000-1:10,000）,IF（1:500-1:2,000）,IP（1:200-1:500）。 Fig.1.Immunofluorescence staining (1:2,000) of HA fusion protein in 293 cells with red and counterstained with DAPI.
Fig.2.IP (1:200) - WB (1:5,000) analysis of HA fusion protein expression in 293 cells. Untransfected 293 cell lysate (lane A), transfected 293 cell lysate with HA-tag protein (lane B); IP untransfected 293 cell lysate with Anti HA tag mAb (lane C); IP transfected 293 cell lysate with normal Mouse IgG (lane D), or with Anti HA tag mAb (lane E), and IP transfected 293 without both normal Mouse IgG and HA tag mAb (lane F). 免疫原：KLH偶联的HA标签YPYDVPDYA多肽序列 来源宿主：小鼠 反应性：该HA标签抗体可识别在细胞内表达的HA标记重组蛋白，包括HA位于氨基末端、中段以及羧基末端的重组蛋白。 保存建议：能在-20℃保存1年。为最大限度的避免损失，请在打开管盖之前融化抗体并离心。建议使用前分装以避免反复冻融，分装后可在4℃保存1个月 选择合适HA标签抗体需要考虑的因素 在选择一个标签抗体时，主要根据自己实验应用上的需要。这里需要考虑的因素包括，HA 抗体的应用检测类型、HA抗体的克隆性及制备来源等。比如该HA抗体是否能用于免疫荧光IF的检测？是否可以用于Western Bloting和免疫沉淀IP实验？是否需要特异性更好的单克隆HA标签抗体？还是一个兔来源的HA多抗更合适？ https://www.doczj.com/doc/0d13132283.html,
论人源化单克隆抗体的研究进展 *** （生物工程一班生命科学学院 ***大学哈尔滨 150080） 摘要：自从单克隆抗体问世至今已广泛应用与临床治疗，然而鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会产生人抗鼠抗体反应，从而使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。随着基因工程技术和抗体工程技术的迅速发展，人源性单克隆抗体开始快速发展而逐渐代替鼠源性单克隆抗体。本文将就人源化单克隆抗体的构建以及其在临床治疗方面的应用进行综述。 关键词：单克隆抗体人源化临床治疗 Theory humanized monoclonal antibody research progress *** (The 1st class of Bioengineering , College of Life Science, *** University, Harbin, 150080) Abstract: Since the advent of monoclonal antibody has been widely applied in clinical treatment, but the mouse source sex monoclonal antibodies in clinical treatment will produce people resistance to mouse antibody response, so that the rat source sex monoclonal antibody application are highly limited. Along with the genetic engineering technology and the rapid development of antibody engineering technology, humanized sex monoclonal antibody began to rapid development and gradually replaces the rat source sex monoclonal antibody. This paper will review humanized monoclonal antibody construction and the application of clinical treatment in this article. Keywords: monoclonal antibody humanized clinical treatment 1975年。Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术[1]，此后单抗药物开始迅速发展并广泛应用于临床。1982年，Philip Karr 将第一株抗独特型单抗(anti- ld) 应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功[2]，使得治疗性抗体的研究很快成为生物医药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。然而，鼠源性单克隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，能诱发人抗鼠抗体( Human ant-i mouse antibody, HAMA) 反应，引起强烈的免疫排斥反应[3]，而且鼠源性单克隆抗体不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用。这使研究学者意识到研制鼠源性单克隆抗体人源化或完全的人源性抗体才有可能减少或避免HAMA反应并提高疗效。然而反复实验证明, 杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。直到80年代末期，随着分子生物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一
抗体人源化技术进阶之路 在过去的十几年中，FDA已经批准了近100种抗体用于人类的疾病治疗。抗体药物经历了最初的多克隆抗体到单抗，并最终到基因工程的三个阶段。20世纪80年代初，随着鼠单抗在临床的大量应用，人们发现异源的鼠单抗所具有的免疫原性会引起强烈的抗抗体反应（HAMA），从而使患者发生严重的过敏反应和毒副作用，使其药物失去其应有的疗效。这使得之后的研究者致力于进行人源化改造，从而避免其在人体中免疫反应。经过多年的努力，目前人们已经可以使用嵌合抗体技术、人源化抗体技术、全人抗体技术来大大降低抗体药物的HAMA反应，以满足临床的要求（图1）。 虽然嵌合抗体成功地保留了亲本小鼠抗体的特异性，降低了其免疫原性，但是V区的FR区和CDR区仍有可能诱导强烈的HAMA反应。因此V区的人源化甚至全人源势在必行。在过去的几十年中，人源化方法已经多样化，目前人们已经创建了以重构抗体、表面重塑抗体、链替换抗体为代表的多种人源化抗体技术。 图1. 抗体人源化 重构抗体技术是英国剑桥大学Winter研究小组在1986年首先发明的，经过进一步完善，目前成熟的重构抗体技术路线是分析亲本鼠单抗的V区，确定CDR区和FR区，进而通过数据库检索比对和计算机同源建模，寻找出具有最大同源性的人的FR区模板，综合考虑确定FR区需要进行回复突变的关键残基，最终获得高亲和的人源化抗
体（图2）。目前在GeneBank 和IMGT等公用数据库中收录了大量的抗体的可变区基因共寻找最佳匹配的亲本鼠单抗的人FR序列。确定需要保留和改变的关键残基目前仍然是重构抗体人源化抗体最关键也是最困难的一步，它要求我们对于抗体抗原复合物的空间结构要具有足够的知识积累。当然目前人们已经总结出了一些需要保留的重要残基的规律，包括CDR两侧保守序列，有可能直接参与抗原结合位点以及对空间结构有重要影响的残基。目前已被批准的上市的人源抗体中，基本全采用的重构抗体技术。 图2. 重构抗体技术 CDR移植产生的人源化抗体对人类的免疫原性通常比小鼠或嵌合抗体低；但是，由于CDR不是人类的，它们仍然具有免疫原性。为了克服这一问题，一些研究人员提出用特异性决定残基(SDR)移植代替CDR移植来人源化抗体。人们发现在绝大多数抗体中通常只有约30%的CDR残基直接构成抗原抗体的结合位点。与CDR移植相比，仅移植数量更少且更关键的SDR将可能取得更佳的效果，比CDR移植相比具有更低的免疫原性。 CDR移植和SDR移植均是寻找最大同源性人抗体的V区序列作为改造的模板。与此不同，Hwang和他的同事设计了一种基于CDR区域同源性的抗体人源化的新方法。与通常的CDR移植方法不同，该方法不是寻找最大同源的人抗体作为模板，而是寻找与被改造的抗体的CDR结构同源的人胚系V区基因作为模板，然后简单、快速的将鼠单
鼠源抗体的人源化设计 前言 (1) 方法 (2) 结果与讨论 (3) 鼠源抗体筛选人源框架 (3) 人源化抗体CDR的改造 (4) 结论 (6) 附录 (6) 参考文献 (7) 前言 第一个人用抗体药物来自鼠源抗体，直到现在鼠源抗体仍然是抗体药物的一大来源[Pogson et al.,2016]。由于鼠源抗体的免疫原性，一般会对其作人源化处理。目前最通用的方法是将鼠抗的CDR序列移植到人源框架上[Hwang et al., 2005]。通常CDR移植后的人源化抗体与抗原的亲和力会减弱，如何保持人源化抗体的亲和力是目前最大的技术瓶颈。通过高通量的筛选方法可以得到适合CDR
移植的人源框架，但是这种实验方法周期长，价格昂贵[Townsend et al.,2015]。为了快速筛选出适合的人源框架，研究者利用序列比对和结构模拟的方法筛选出适合的人源框架，然后通过实验验证抗体与抗原的亲和力，减少了实验工作量，节约了成本和时间，未来会成为具有潜力的抗体人源化设计方法[Kurella et al., 2014;Choi et al.,2015;Choi et al.,2016]。本文采用自主开发的抗体人源化设计程序，对已知的鼠源抗体进行人源化设计，结果表明计算的方法可以筛选出序列同源性靠后但是亲和力更高的人源化框架。 方法 抗体阻断蛋白-蛋白相互作用的受体和配体结构已知（图1）。配体与抗体结合的区域重叠在受体和配体结合的区域（图2），所以鼠源的抗体可以有效阻断受体和配体的相互作用[Apgar et al.,2016]。通过鼠源抗体的人源化设计可以最大限度减少抗体的免疫原性。首先使用鼠源抗体（PDBID为5F3B）的序列在人源框架库中搜索排名靠前的序列作为候选序列，然后将人源序列同源建模到鼠源抗体的骨架上，保留鼠源CDR的序列，然后计算同源模型的能量，判断人源化抗体的稳定性。人源化CDR突变体采用相同的策略，不同之处在于替换鼠源CDR 序列为突变体序列，并且保留抗原的结构。
生物技术制药之单克隆抗体 【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。 【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用 【前言】 1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。 1、单克隆抗体定义 抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决
人源化抗体研究进展 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。人源化抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植和病毒感染等方面已经显示出独特的优势和良好的应用前景。本文综述了人源化抗体的构建及其表达系统，在临床上的应用，存在的问题及展望。 关键词：嵌合抗体，人源化抗体，构建，临床应用 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 1 人源化抗体的构建 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。 1.1 嵌合抗体 抗体分子与大抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆抗体C区用人抗体C区代替而拼接成嵌合抗体(chimeric antibody)，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗
人源化抗人CD28单克隆抗体说明书 产品名称 通用名称：人源化抗人CD28单克隆抗体 英文名称：Humanized anti-human CD28 monoclonal antibody 适用范围 用于T淋巴细胞激活扩增，适用于直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、恶性 CD28分子存在于大多数T细胞表面，被认为是一种T细胞特有的表面分子。T细胞对抗原的反应性主要 通过CD3/TCR复合物介导，但也有赖于T细胞表面其他分子的协同。T细胞可通过CD3/TCR、CD2和 CD28等多种途径被有效激活。从外周血、骨髓或脐血中分离出的单个核细胞在CD3、CD28单克隆抗体和 多种细胞因子存在的条件下，经过一定时间培养可以获得具有肿瘤细胞杀伤活性的CIK（Cytokine-induced Killer）细胞。 功能参数 使用说明 可溶法：推荐使用浓度为400ng/ml，在该浓度条件下细胞可获得充分的活化和刺激，细胞扩增倍数和最终的CD3+CD56+双阳率有明显提高。 包被法： 10mL PBS缓冲液（5ug/mL anti-human CD28）铺T75方瓶置于4℃过夜。使用前去除PBS缓冲液，生理盐水洗涤三次。 参考文献 1、Daniel Teschner *, Gregor Wenzel *, Eva Distler *, Elke Schnürer *, Matthias Theobald *, AxlA. Neurauter ?, Karoline Schjetne ? and Wolfgang Herr *. In vitro stimulation and expansion of human tumor- reactive CD8+cytotoxic T-lymphocytes by anti-CD3/CD28/CD137 magnetic beads .Scandinavian Journal of Immunology 2011, 74(2):155–164 2、D Sangiolo?, G Mesiano, F Carnevale-Schianca, W Piacibello, M Aglietta & A Cignetti . Cytokine induced killer cells as adoptive immunotherapy strategy to augment graft versus tumor after hematopoietic cell transplantation. Expert Opin. Biol. Ther. (2009) 9(7):831-840 3、RENATE SIEFKEN, ROLAND KURRLE,* AND REINHARD SCHWINZER.CD28-Mediated Activation of Resting Human T Cells without Costimulation of the CD3/TCR Complex. CELLULAR IMMUNOLOGY 176, 59–65 (1997)
小鼠单克隆抗体的制备与纯化 关键词：细胞骨髓瘤细胞 B细胞培养基试剂标准物质北京标准物质网 小鼠单克隆抗体的制备与纯化一般可分为细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选与单克隆化、单克隆抗体的生产与纯化等过程。 1.细胞融合动物免疫方法与抗血清制各相同。为保证得到的B细胞有较强的分泌抗体活性，在融合前3天须进行一次静脉加强免疫。融合时小鼠骨髓瘤细胞(如SP2／0-Ag14细胞株)要处于对数分裂期的良好生长状态，对在无菌条件下获得的小鼠脾脏B细胞需用无血清培养液洗2至3遍，以去除小鼠血清。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例一般为5：1至10：1，常用的融合剂为50%的聚乙二醇，完成融合后要用培养液缓慢稀释后离心，除去PEG，然后将细胞用HAT选择培养基(RPMI1640含10%～20％胎牛或小牛血清和HAT悬浮后接种于96孔板中。正常情况下在融合后的第3、4天在光镜下即可看到克隆的生长，在第10 天后可以进行筛选。 PEG虽融合效率较低，但方法简单，成本低廉，故较为常用。电融合虽融合率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故较少使用。在融合后的细胞培养过程中，可同时添加同种动物的腹腔细胞(即饲养细胞)，其中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片，有助于杂交瘤细胞的生长。商品化的杂交瘤细胞生长因子，也可以促进杂交瘤细胞的生长。 2.阳性杂交瘤细胞的筛选与单克隆化杂交细胞经约10～14天培养后(此间要换培养液1～2次)可进行筛选，ELISA是最常用的筛选方法。对获得的阳性克隆细胞要通过有限稀释法进行亚克隆，以保证抗体分泌细胞来源于单个细胞。由于融合细胞的染色体容易发生丢失，故一般要通过数次亚克隆，直至来自同一克隆的所有亚克隆细胞均为反应阳性，表明该克隆的抗体编码基因已较稳定，可以扩大培养并建株。 3.单克隆抗体的扩大生产采用什么方法进行单克隆细胞株的扩大培养及抗体制备，取决于实际需要。目前生产大量单克隆抗体的常用方法有小鼠腹水制备、大瓶培养和中空纤维反应器三种，前者多用于实验室制备，后二者适用于工厂化生产。腹水制备方法成本低，但因腹水中杂蛋白多，易使抗体失活，故腹水收集后应尽快纯化，以防止抗体降解。大瓶培养获得的上清体积大，但抗体浓度低，培养成本和抗体纯化成本均较高。相对于大瓶培养，利用中空纤维反应器进行单克隆抗体生产是比较经济的方法，但设备装置的费用投入较大。
一种抗HER2人源化单克隆抗体药物的药学研究 王晓闻，刘培培，吕锋华，谭青乔*（抗体药物国家工程研究中心，201203） 摘要：目的对一种用于治疗HER2阳性乳腺癌的抗HER2人源化单克隆抗体靶向生物制剂进行有效性和安全性的药学研究。方法采用高效液相色谱、毛细管电泳、圆二色谱、差示扫描量热技术、液质联用和基于人乳腺癌细胞的体外活性检测以及SPR技术分析抗HER2抗体的纯度、结构、翻译后修饰以及功能活性等关键质量属性。结果该抗体的单体纯度>98%，聚体含量<2%；轻重链电泳纯度>97%；具有正确的二级与三级结构，相变温度为72.65±0.1℃，和85.08±0.1℃；大于99%的分子具有正确的糖基化修饰，且N糖分布大体上与参比制剂高度相似，高甘露糖含量少但唾液酸含量多；对人乳腺癌细胞的增殖抑制活性和ADCC活性与参比制剂相当（P=0.96），与HER2抗原以及Fc受体的结合也无显著差异。结论该抗体在药学评价上展现了高纯度、低杂质、结构稳定以及正确的翻译后修饰的特性，通过如此精心的分子和工艺设计，使其表现出与参比制剂相同的生物等效功能作用，而且也在免疫原性和稳定性上都表现出低风险，具备良好的安全性和有效性。 关键词: HER2; 单克隆抗体; 质量; 有效性; 安全性 The Pharmaceutical Research of an Anti-HER2 Humanized Monoclonal Antibody Drug Product WANG Xiao-wen, LIU Pei-pei, LV Feng-hua，TAN Qing-qiao*（National Engineering Research Center of Antibody Medicine，Shanghai 201203，China） ABSTRACT：OBJECTIVE To perform a pharmaceutical study on the efficacy and safety of a therapeutic anti-HER2 humanized monoclonal antibody targeting HER2-positive breast cancer. METHODS The critical quality attributes such as purity, structure, post-translation modifications, function and efficacy are analyzed using HPLC, CE-SDS, Circular Dichroism, Differential Scanning Calorimeter, LC-MS/MS, human breast cancer cell-based in vitro bioactivity assay and SPR binding kinetics. RESULTS The monomer content of the antibody is more than 98% while the polymer impurities are less than 2%. The sum of heavy chain and light chain peak area is over 97% on the CE-SDS electrophoretogram. The antibody drug demonstrates correct secondary and tertiary structure with two phase transition temperatures of 72.65±0.1℃and 85.08±0.1℃. More than 99% of the molecules are correctly glycosylated with a highly similar N-glycan profiling to the reference product. The differences exist where the experiment subject has higher content of high mannose structure but lower sialic acids. The two products keep the same level on BT474 proliferation inhibiting bioactivity and ADCC efficacy（P=0.96）,and show no significant difference on the binding affinity to HER2 and Fc Receptors. CONCLUSION The antibody drug product demonstrates excellent characteristics such as high purity, few impurities, stable structure and correct post translation modifications in the pharmaceutical evaluation. By means of these well-designed molecules and production process, the drug product is proved bioequivalent to the reference product as well as low-risk of immunogenicity and stability. The antibody drug product has good safety and efficacy. KEY WORDS: HER2; monoclonal antibody ; quality;efficacy;safety 作者简介：王晓闻，女，硕士研究方向：抗体药物质量分析评价 *通讯作者：谭青乔，男，博士研究方向：抗体药物质量分析评价Tel：（021）60753275 E-mail:
２０１８年８月第２６卷一第４期中国实验动物学报ＡＣＴＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＵＭＡＮＩＭＡＬＩＳＳＣＩＥＮＴＩＡＳＩＮＩＣＡＡｕｇｕｓｔ２０１８Ｖｏｌ．２６一Ｎｏ．４ ［基金项目］国家自然科学基金（Ｎｏ．８１４７１５３０）；广东省自然科学基金（Ｎｏ．２０１５Ａ０３０３１３５２６）三 ＦｕｎｄｅｄｂｙＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏ．８１４７１５３０），ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．２０１５Ａ０３０３１３５２６）．［作者简介］施蕾（１９８９ ），女，内科学硕士研究生三研究方向：自身免疫性肾脏疾病三Ｅ?ｍａｉｌ：１１５２０５７８４＠ｑｑ．ｃｏｍ ［通信作者］潘庆军，男，副教授，博导三研究方向：自身免疫性疾病三Ｅｍａｉｌ：ｓｔｉｌｗａｐａｎ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ 研究进展从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术 及改造策略的研究进展 施蕾，林洁平，廖淑珍，招春飞，刘华锋，潘庆军? （湛江市慢性肾脏病防控重点实验室，广东医科大学附属医院肾脏疾病研究所，广东湛江一５２４００１）一一?摘要?一单克隆抗体（单抗）因其专一性二高效价二低耐药性等显著优势，已成为生物制药业行业发展最快的 领域之一，并成功用于治疗多种癌症二自身免疫病和其他疾病等三从最初的鼠源性单抗发展至现今的全人源单抗，新的制备技术不断涌现，如单细胞分选和测序技术等三同时，通过改变全人源单抗的糖基化水平二优化单抗亲和力 成熟技术等，有助于进一步提高其稳定性二亲和力三目前，全人源单抗的疗效和安全性仍受到行业关注，也面临很 多挑战，如何平衡在降低其免疫原性的同时，进一步提高其亲和力等，仍寄希望于新的技术或策略三 ?关键词?一鼠源；全人源；单克隆抗体；糖基化；单细胞分选技术 ?中图分类号?Ｑ９５－３３一一?文献标识码?Ａ一一?文章编号?１００５?４８４７（２０１８）０４?０５２８?０５Ｄｏｉ：１０ ３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－４８４７ ２０１８ ０４ ０２０Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｒｅｔｒｏｆｉｔｓｔｒａｔｅｇｙｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｔｏｗｈｏｌｅｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＳＨＩＬｅｉ，ＬＩＮＪｉｅｐｉｎｇ，ＬＩＡＯＳｈｕｚｈｅｎ，ＺＨＡＯＣｈｕｎｆｅｉ，ＬＩＵＨｕａｆｅｎｇ，ＰＡＮＱｉｎｇｊｕｎ? （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＣｈｒｏｎｉｃＫｉｄｎｅｙＤｉｓｅａｓｅｏｆＺｈａｎｊｉａｎｇＣｉｔｙ，ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆ ＧｕａｎｇｄｏｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ５２４００１，Ｃｈｉｎａ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＰＡＮＱｉｎｇｊｕｎ．Ｅｍａｉｌ：ｓｔｉｌｗａｐａｎ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ ?Ａｂｓｔｒａｃｔ?一Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｍＡｂｓ）ｈａｖｅｂｅｃｏｍｅｏｎｅｏｆｔｈｅｆａｓｔｅｓｔ?ｇｒｏｗｉｎｇａｒｅａｓｉｎｔｈｅｂｉｏ?ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｙｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅｉｒｕｎｉｑｕｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｓｕｃｈａｓｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｈｉｇｈｐｏｔｅｎｃｙ，ａｎｄｌｏｗｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｙｈａｖｅｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｖａｒｉｏｕｓｃａｎｃｅｒｓ，ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｏｔｈｅｒｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆｒｏｍｔｈｅｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍｕｒｉｎｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｗｈｏｌｅｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｎｅｗｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｓｕｃｈａｓｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｈａｖｅｂｅｅｎｅｍｅｒｇｉｎｇ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｉｔｗｉｌｌｈｅｌｐｔｏｆｕｒｔｈｅｒｉｍｐｒｏｖｅｉｔｓｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄａｆｆｉｎｉｔｙｂｙｃｈａｎｇｉｎｇｔｈｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｗｈｏｌｅｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｕｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙａｎｄｓａｆｅｔｙｏｆｗｈｏｌｅｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｒｅｓｔｉｌｌｃｏｎｃｅｒｎｅｄｂｙｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｙ，ａｎｄｔｈｅｙａｌｓｏｆａｃｅｍａｎｙｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，ｓｕｃｈａｓｈｏｗｔｏｂａｌａｎｃｅｔｈｅｍｗｈｉｌｅｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｉｒｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｉｒａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｒｅｓｔｉｌｌｐｒｏｍｉｓｉｎｇｎｅｗｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｏｒｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ． ?Ｋｅｙｗｏｒｄｓ?一ｍｕｒｉｎｅ；ｗｈｏｌｅｈｕｍａｎ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ；ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ；ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｎｆｌｉｃｔｏｆｉｎｔｅｒｅｓｔｓｔａｔｅｍｅｎｔ：Ｗｅｄｅｃｌａｒｅｔｈａｔｗｅｈａｖｅｎｏｃｏｎｆｌｉｃｔｏｆｉｎｔｅｒｅｓｔｓｔａｔｅｍｅｎｔ．一一抗体是Ｂ淋巴细胞经抗原刺激而增殖分化为浆细胞后所产生的一种糖蛋白，主要介导体液免疫三单一Ｂ淋巴细胞系只产生针对一种特异性抗原决定簇的抗体，即单克隆抗体（简称单抗，ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
细胞与分子免疫学杂志 1997;13(1):68-72 Journal of Cellular and Molecular Immunology 鼠单克隆抗体人源化 袁清安俞炜源黄翠芬 (军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071) 提要鼠源性单克隆抗体应用于临床由于HAMA反应的存在而受到阻碍。以CDR 移植为核心,以同源分析及分子模建为辅助设计的人源化方案，已成为克服HAMA 反应的主要手段。本文结合单克隆抗体人源化的最新进展对该领域的工作作一综述。 关键词人源化 CDR移植分子模建 HAMA 单克隆抗体 抗体是免疫系统中最重要的分子,在临床上有极大的应用价值。其立体结构组成 与功能关系表明，不同的结构模块(CH1、CH2、CH3、V L 、V H )在空间和折叠上相对 独立,对应着不同的功能。抗体的效应功能由Fc引发，特异性和高亲和性由Fv 决定。大量的抗体一级结构序列和越来越多的抗体立体结构数据分析表明,Fv在空间结构上十分保守,但人、鼠间有差异的框架区(FR)、空间构象及序列各由有差别的6个互补决定区(CDR)组成。CDR上有直接的抗原接触位点,FR是Fv最主要的抗原性决定区,是引起人抗鼠抗体(HAMA)反应的主要部分,在异种间可引起抗个体型抗体。 1 鼠源单克隆抗体的临床应用与问题 以细胞融合为基础的鼠杂交瘤技术的发展，使得人们能够大量获取高亲和性和强特异性的鼠单克隆抗体(McAb),它们在临床上有多方面的潜在应用[1]。 1.1 感染性疾病抗体提供的被动免疫,消除了病原体的致病能力: 仅仅是Fab 与抗原的结合，足以中和很多毒素与病毒的毒力；Fc与相应受体结合，可引发包括ADCC在内的诸多效应功能。 1.2 体内定位诊断同位素标记的McAb或Fab在病灶的定位造影,对确诊及手术有很大帮助,已用于心血管、原发癌及转移癌等疾病的定位诊断。 1.3 免疫调节在免疫活化方面,双特异性的抗体将效应细胞表面的信号转导分子和病变细胞表面的抗原分子交联,便可活化效应细胞,使之发挥免疫功能；在免疫抑制方面,抗受体抗体可封闭受体,阻断效应细胞活化的路径。因受体分子的分