第四章酶的提取与分离纯化
1、细胞破碎的目的、方法。
?大多数酶都存在于细胞内部，为了获得细胞内的酶，首先要收集细胞并进行细胞破碎，使细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取与分离纯化。
?机械法
?物理法
?化学法
?酶促破碎法（酶解）
2 选择细胞破碎方法的依据。
?（1）细胞的处理量：大规模用机械法，小规模用非机械法。
?（2）细胞壁的强度与结构
?（3）目标产物对破碎条件的影响。机械法考虑剪切力，酶法考虑对目标产物是否具有降解作用。
?（4）破碎程度：高压匀浆法，细胞碎片细小，固液分离困难。
?（5）提取分离的难易
3. 酶抽提的目标及方法。
提取目标：
? a. 将目的酶最大限度地溶解出来。
? b. 保持生物活性。
提取原则
? a. 相似相溶。
? b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
4．三种离心方法（差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心）的特点。
（1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
（2）密度梯度离心特点：：
?区带内的液相介质密度小于样品物质
?颗粒的密度。
?适宜分离密度相近而大小不同的固相
?物质。
（3）等密度梯度离心特点：
?介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。
?适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
5. 酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。
种类：
⑴中性盐沉淀（盐析法）
基本原理（盐溶和盐析）
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：
1) 盐溶（salting in）：
低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。
2) 盐析（salting out）：
高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
⑵有机溶剂沉淀
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。
1. 沉淀机理
降低溶液的介电常数
部分地引起蛋白质脱水
2. 常用有机溶剂
丙酮>乙醇>甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。
⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。
⑴热变性
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。
⑵ pH变性
等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。
⑶有机溶剂变性
使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。
⑷等电点沉淀
原理：
蛋白质在等电点时溶解度最低
不同的蛋白质具有不同的等电点
⑸有机聚合物沉淀
作用机理：
与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。
沉淀剂：
常用聚乙二醇（简写 PEG ）
多用分子量为6000～20000的 PEG。
6. 双水相萃取、超临界流体萃取的概念。
?超临界萃取，又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。
?利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离。
7. 膜分离的原理及应用。
?膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。
?应用（自己整理）超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。
?反渗透：海水淡化
?电场膜分离：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。
8. 比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析，高效液相色谱的概念及原理上的不同点。
?吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的层析方法。
?离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。
?凝胶层析又称为凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析等，是指以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
?亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的层析技术。
?HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。
9. 比较连续与非连续、变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳区别。
连续电泳：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统，只有分离胶；
不连续电泳：采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系，有分离胶和浓缩胶。
连续PAGE：电荷效应、分子筛效应
不连续PAGE：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应
1）电荷效应 : 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。
2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。
3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。
系统的不连续性表现在以下几个方面：
1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
3.在电场中形成不连续的电位梯度。
因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：加了SDS
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：不加SDS
10. 蛋白质浓度测定方法及酶活力测定方法。
蛋白质浓度测定
1.紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。
特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。
2. 双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。
优点：快速；缺点：灵敏度差
3. 酚试剂（Folin-酚）测定法：繁琐，但灵敏度、准确度高。
4. 染料结合法（考马斯亮蓝染色法）：又称Bradford法，灵敏、简便、快速、干扰少，是近年来常用的检测法。
11. 比活力、提纯倍数、回收率的含义及用途。
酶的比活力(纯度)=活力单位数/毫克蛋白
比活力越高，酶纯度也越好。表示酶制剂纯度的一个指标。
纯化倍数=提纯后比活力/提纯前比活力
表示提纯过程中纯度提高的倍数。提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。
总活力＝酶活力单位数 酶液总体积
即样品中全部酶活力。
回收率＝提纯后酶总活力/提纯前酶总活力×100％
表示提纯过程中酶损失程度的大小。回收率越高，损失越小。
判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。
回收率：反映酶的损失情况。
提纯倍数：表示方法的有效程度。
一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。
12. 电泳的基本原理是什么？
在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。
13. 凝胶过滤层析有哪四个方面的应用。
1）脱盐
2）生物大分子物质的分离纯化
3）分子量的测定
4）溶液浓缩
14. 影响凝胶过滤分辨率的因素有哪些？分配系数的含义及作用。
凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示：
Ve-Vo
Kd=————
Vi
Vo——外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）
Vi——内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）
Ve——某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）分配系数Kd的意义：
1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。
2) 判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，Kd差异小，分离效果差。
15 .酶的分离纯化中，纯化方法的排序.
先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。
16. 酶结晶的主要方法有哪些？
?1、盐析结晶法 ;
?2、有机溶剂结晶法；
?3、等电点结晶法
?4、透析平衡结晶法
?5、温度差结晶法
?6、金属离子复合结晶法
2. 提高过滤性能的方法
●1）絮凝和凝聚
●2）稀释、加热
●3）加助滤剂，常用硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩和淀粉等。
●4）反应剂
●5）酶降解
（三）细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数：
破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；
破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
2.测定导电率：
利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。
3.测定释放的蛋白质量或酶活力：
测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。
三、酶的提取(extraction)
把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。
提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。
b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，
一般采用低温下（0~10℃）操作。
提取原则
a. 相似相溶。
b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取方法：
（一）盐溶液提取：常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大，最常用。
（二）酸、碱溶液提取
（三）有机溶剂提取：乙醇、丙酮和丁醇
各种微生物细胞壁的结构与组成
●初步纯化（rough fractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂
质。
●高度纯化（fine fractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。
●浓缩与干燥（concentration and desiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的
过程。
（三）常用离心方法
差速离心法
沉降速度法：
密度梯度离心
沉降平衡法：等密度梯度离心
1．差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。
特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
优点：操作简单。
缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。
2）壁效应严重。
3）沉降的颗粒受到挤压。
2．密度梯度离心
样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。
常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。
特点：
?区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。
?适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。
3. 等密度梯度离心
又称沉降平衡离心
根据颗粒的密度不同而进行分离。
离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。
常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。
特点：
?介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。
?适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
沉降速度离心和沉降平衡离心的特点
?等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。
?差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。
?密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。（四）应用
根据不同离心目的，分为
?制备性离心：
分离纯化和制备
?分析性离心：
测分子量、沉降系数、密度、纯度
五、沉淀分离（根据溶解度的不同）
使溶液中的溶质由液相转变为固相析出
古老、实用、简单的初步分离方法
?在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：
?⑴中性盐沉淀（盐析法）
?⑵有机溶剂沉淀
?⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）
?⑷等电点沉淀
?⑸有机聚合物沉淀
影响迁移率的因素：
1）颗粒性质：
Q越大、r 越小、形状越接近球形，v 越快。
2）电场强度：E越高，v越快。
3）溶液性质：
? pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）?离子强度：离子强度越高，v 越低。
原因：离子氛（ionic atmosphere）。
通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。
4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
应避免用高电渗物质作支持介质。
盐浓度的表示
用饱和（溶解）度表示:
溶液中饱和硫酸铵的质量
饱和度＝
溶液的总体积
亲和萃取酶实例
蛋白质配基胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂
磷酸果糖激酶三嗪染料
甲酸脱氢酶三嗪染料
葡糖-6-磷酸脱氢酶三嗪染料
一膜分离
●（一）扩散膜
●（二）加压膜
●（三）电场膜
二层析法
（一）吸附层析法
（二）凝胶层析法
（三）离子交换层析法
（四）疏水层析法
（五）亲和层析法
（六）高效液相法
影响迁移率的因素：
1）颗粒性质：
Q越大、r 越小、形状越接近球形，v 越快。
2）电场强度：E越高，v越快。
3）溶液性质：
pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）
离子强度：离子强度越高，v 越低。
原因：离子氛（ionic atmosphere）。
通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。
4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
应避免用高电渗物质作支持介质。
17.名词解释：
膜分离技术：借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。
酶促破碎法：
结晶：是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。
萃取分离：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。
酶活力：又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。
沉降系数：指单位离心力下颗粒的沉降速度，用S表示。
外水体积（V o）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积
内水体积（V i）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。
柱床体积（V t）是凝胶柱所能容纳的总体积。
电泳：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。
料液：供提取的溶液。
溶质：料液中欲提取的物质。
萃取剂：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂。
萃取液：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液。
萃余液：被萃取出溶质后的料液。
反萃取：完成萃取操作后，将产物从有机相转入水相的萃取操作。
临界温度：高于此温度时，无论加压多大也不能使气体液化。
临界压力：在临界温度下，液化气体所需要的压力。
反胶团：又称反胶束，指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。
凝胶过滤：又称分子筛层析、排阻层析，是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。
第四章酶的提取与分离纯化 1、细胞破碎的目的、方法。 ?大多数酶都存在于细胞内部，为了获得细胞内的酶，首先要收集细胞并进行细胞破碎，使细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取与分离纯化。 ?机械法 ?物理法 ?化学法 ?酶促破碎法（酶解） 2 选择细胞破碎方法的依据。 ?（1）细胞的处理量：大规模用机械法，小规模用非机械法。 ?（2）细胞壁的强度与结构 ?（3）目标产物对破碎条件的影响。机械法考虑剪切力，酶法考虑对目标产物是否具有降解作用。 ?（4）破碎程度：高压匀浆法，细胞碎片细小，固液分离困难。 ?（5）提取分离的难易 3. 酶抽提的目标及方法。 提取目标： ? a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 ? b. 保持生物活性。 提取原则 ? a. 相似相溶。 ? b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 4．三种离心方法（差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心）的特点。 （1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 （2）密度梯度离心特点：： ?区带内的液相介质密度小于样品物质 ?颗粒的密度。 ?适宜分离密度相近而大小不同的固相 ?物质。 （3）等密度梯度离心特点： ?介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。 ?适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。 5. 酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。 种类： ⑴中性盐沉淀（盐析法） 基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in）： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out）： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。 ⑵有机溶剂沉淀 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。
第三章酶活性的测定及分离纯化 在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。 3.1 酶活性单位 酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶蛋白的浓度有关，又与酶分子的催化能力大小有关。酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即u/ml或u/mg。 3.1.1 实用单位 不同的酶采用不同的标准。如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量；又如T4 DNA连接酶的单位定义为：在20μl反应体积中，16℃，30分钟内，将50%的HindⅢ酶切的λDNA片段重新连接起来所需的酶量。ACC合成酶的单位是：30℃，1小时转化SAM生成1nmol ACC所需的酶量。 3.1.2 国际酶活性单位 1961年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下，1分钟转化1μmol底物，或转化1μN底物有关基团所需的酶量为1个单位(u)。这是酶活性的国际单位。 3.1.3 Katal 1972年，国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位，叫katal(kat)，katal是一个很大的酶活单位，1 katal是指1秒钟转化1mol底物，或转化1N底物有关基团所需的酶量。1 katal＝6×10u。 3.1.4 转换数 在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的μmol数，可 表示为： 1/Kp称为一个催化循环，单位为分钟。 3.1.5 比活性 酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位
酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。
蛋白质和酶的分离与 纯化
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等） 二、常用的蛋白质的分离纯化技术
胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术 有机溶剂法
可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】 透析法 胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】 3胃蛋白酶的纯化技术 凝胶过滤法
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等） 二、常用的蛋白质的分离纯化技术 可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。 （一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离
酶的分离纯化 提取原则 a. 相似相溶。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 酶的提取方法 酶的分离方法 1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。 每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。 3、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
第二节固定化酶的制备和应用 学习导航明目标、知重点难点 固定化酶和固定化细胞的应用。(重点) 固定化酶与固定化细胞的制备方法。(难点) [学生用书P43] 一、阅读教材P63分析固定化酶 1．概念：是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用，且保持了酶的催化性能，可实现酶促反应的连续化和自动化。 3．制备固定化酶的常用方法 目前，制备固定化酶的方法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。 二、阅读教材P64～65分析固定化细胞技术的应用 1．应用：固定化细胞可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 2．优点 (1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。 (2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 (4)细胞生长停滞时间短，反应快等。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。 4．酵母菌细胞的固定化技术的主要流程 准备各种实验药品和器材 ↓ 制备麦芽汁 ↓
活化酵母菌细胞 ↓ 配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液 ↓ 制备固定化细胞 ↓ 浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤 ↓ 发酵麦芽汁 判一判 (1)酶在催化时会发生变化，不可反复利用。(×) (2)某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应。(×) (3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作用。(×) (4)制备固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。(×) 连一连 固定化酶技术[学生用书P44] 由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。人们针对酶的这种不足寻着改善的方法之一是固定化酶技术的应用。结合教材P63内容完成以下探究。
酶分离纯化过程中的问题以及进行酶活力等测定的意义班级:生物技术133 组别：第六组姓名：董冰夏学号：2013013906 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。 酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。因为酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。 酶是一种特殊的蛋白质，在分离纯化过程中需要注意温度以及PH值等的控制，注意在纯化过程中所使用的缓冲溶液的离子强度的控制(常用PBS缓冲溶液)，在实际纯化过程中，一般要在低温冰箱中进行，缓冲溶液中注意加入EDTA二钠盐(1-5mM)螯和重金属离子一般避免酶失活。常用分离步骤包括分子筛层析、离子交换、疏水层析等步骤。同时要注意防止酶的变性失活。酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时．酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供直接依据。在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性．一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。 酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。 酶比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度
胃蛋白酶提取的分离纯 化 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 1.2工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸3.6-4升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术
2.1有机溶剂法 可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在5.0—5.2时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为5.0%--5.5%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 2.3底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】 2.4透析法 胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，
酶的分离纯化酶的分离纯化方法简介 生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。 酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达到175Mpa时，破碎率可达100%。当压力超过70Mpa 时，细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。 容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%（体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。 2.离心 离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心