圆二色谱中文版
圆二色谱，判断黄酮类化合物绝对构型的重要手段1．简介：
手性化合物的旋光性是化合物分子的立体构型的不对称性对平面偏振光的作用。若对组成平面偏振光的左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的吸收系数不同，即εL≠εR,，这种性质称为手性化合物的圆二色性。当测定的仪器接收透过手性化合物溶液的平面偏振光时，记录的是手性化合物溶液对左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的吸收系数之差△ε，或化合物生色团吸收波长附近的摩尔椭圆度［θ］即可获得圆二色谱〔CD〕。
CD即圆二色谱，是以吸收系数之差或摩尔椭圆度［θ］为纵坐标，波长为横坐标记录的谱线，其中△ε=（d L－d R）／C×1，d L和d R为吸光度。C为溶液浓度，1为测定用池的池长；［θ］=ψ（λ）M／100LC其中ψ（λ）为所用测定池情况下的平面偏振光的椭圆度，C为溶液浓度，单位g/ml，1为池长，单位dm，M为分子量。它们之间的关系为［θ］=3300△ε，而△ε=θ/33×C·1。2．黄酮类：
多酚类是生物体内主要的二次代谢产物。根据他们的碳骨架能划分为几种主要种类。例如，黄酮类与酚酸类。黄酮类根据的氧化情况又可以分为许多种类。已知的黄酮类化合物中都具有的骨架形式，并常有羟基取代，甲氧基取代，苷化及其他修饰和组合。
虽然黄酮类化合物的绝对构型在50年代起已经通过旋光性和ORD方法进行解析了，但是更方便，更简易的CD谱方法却在60年代中期更为流行。CD 谱现已广泛用于具有旋光性的黄酮类化合物的解析，如：二氢黄酮类，二氢黄酮醇类，黄烷-3-醇类，黄烷-4-醇类，黄烷-3，4-二醇类，黄烷类，异黄烷类，二氢异黄酮类，类鱼藤同类，前花色素类和各种类型的双黄酮类。
3．二氢黄酮类
二氢黄酮类的两个结构特征在判定它们绝对构型时非常重要。一个是之间的单键，一个是位的手性中心，大多数天然二氢黄酮类化合物中在位具有苯基，其为α取向时，其绝对构型被定为S。
利用CD 或ORD连用NMR光谱数据判定二氢黄酮类化合物绝对构型始于Gaffield。
二氢黄酮类化合物的UV最大吸收在270----290处，320----330处有一弱峰，这是由于苯乙酮型和之间的相互转化产生的。八区律规则已经从判定α，β不饱和酮的手性及它们的长波CE图上扩展到了芳香酮。这样，二氢黄酮类化合物绝对构型为2S时，在构象上就具有杂环的P ----螺旋性和C2位芳基处于平伏键，并在CE谱上表现为正性的n---π※吸收带和负性的π---π※吸收带。
利用n---π※吸收带判定构型的优点是这种转变在芳香环取代系统中是独立的。虽然n---π※转变处于长波区趋于随构型相反对映体量的增加而消失。
杂环上的H2与H3之间的较大偶合常数（J2，3）表明所有天然二氢黄酮类在热力学稳定构象中C2芳香基处于平伏键（fig2）。这说明所有左旋的二氢黄酮类具有2S构型。
利用这个信息的例子在确定OBO---二氢黄酮A和二氢黄酮B构型可以清楚的发现。（fig.3 and table1）
4．二氢黄酮醇类
二氢黄酮醇类化合物中具有C2和C3两个手性中心，所以存在四种可能的立体异构体，（2R，3R）异构体在天然界中非常普遍，也有其他类异构体的相关报道。
判定二氢黄酮醇类的绝对构型分两步，第一步，通过NMR谱中H2与H3的偶合常数J2，3判定C2和C3取代基的相对构型是反式或顺式。对于反式异构体，热力学稳定型构象为H2与H3处于直立键，这样的构型为（2R，3R）或（2S，3S）。对于顺式异构体，热力学稳定型构象为H2处于直立键，H3处于平伏键，这样的构型为（2R，3S）或（2S，3R）。第二步，根据CD数据来决定C2的绝对构型。CE中在长波方向（300----340）出现正性n---π※跃迁吸收时表明C2的绝对构型为R，而出现负性n---π※跃迁吸收时表明C2的绝对构型为S。（表2）对于二氢黄酮醇类应该强调指出n---π※跃迁取决于杂环的螺旋性，这于相对构型和C2位芳基的平面性有关，这样就确定了绝对构型。
还应该强调指出的是（2R，3R）--二氢黄酮醇类和（2S）二氢黄酮类是同手性的。（2R，3R）--二氢黄酮醇类和（2S）二氢黄酮类具有相同的杂环螺旋性和相似的n---π※跃迁CE峰。（fig.4）
根据CD谱中正性n---π※跃迁CE判断出phellodensin-A和 phellodensin-C的绝对构型都是（2R，3R）。（fig.5，表3）
5．黄烷-3-醇类
5.1 简介
目前在各种天然化合物中苯并二氢吡喃发色团在O-杂环上（fig.6）苯并二氢吡喃衍生物属于具有第二手性球的苯发色团。非手性苯环发色团受手性O-杂环和O-杂环上取代基的影响。这就产生了在260---280处（L b带）和200---240处（L a带）能观察到的CE谱带。如果非芳香性环的平面结构与CD中L b带的关系已知的话手性环的构象就能通过CD谱推断。然后绝对构型就能通过NMR 数据提供的手性中心取代基的相对构型而归属。
如果苯环C4位没有假不对称取代且苯环再无其他取代时，杂环的P---螺旋性（半椅式构象）产生正性CE L b带，M---螺旋性产生负性CE L b带。（fig.6）黄烷-3-醇类（儿茶素类）（17）具有两个芳基发色团，分别为芳环A和芳环B，这些发色团的吸收带位于280（L b转变）和240（L a转变）。两个芳基发色团在每个区域内均给出两个吸收带。黄烷-3-醇具有两个立体中心和四个异构体，分别为（2R，3S）---2，3---反式；（2S，3R）---2，3---反式；（2R，
3R）---2，3---顺式；（2S，3S）---2，3---顺式。
5.2 L b吸收带
黄烷-3-醇类（17）的CD谱能通过3，4---二氢苯并吡喃环系统的平面规则来阐明。处于半椅式构象或沙发构象的C环为P---螺旋性时将产生正性CE L b 带，M---螺旋性将产生负性CE L b带，这些是通过一系列1，2，3，4---四氢萘类衍生物的测定而得到的.黄烷-3-醇类的2R和2S绝对构型分别对应为P---和
M---螺旋性。（fig.8）
但是 Korver and wilkins,1971; van rensburg et al, 1999报道的A发色团的CD 数据却表明2R和2S的绝对构型分别产生负性和正性CE L b带（fig.9；fig.10，
表5），这个结果与已知的1，2，3，4---四氢萘类遵循的螺旋性规则相反。这种情况可能是由于二氢苯并吡喃类较1，2，3，4---四氢萘类缺少C2V对称性。C环上O的P Z轨道跃迁到π*轨道发生的N----π*跃迁对这个反规则也产生影响。
2，3-顺式-黄烷-3-醇类的A-构象是一个相对稳定构象，将产生在长波方向上CE峰高降低的现象，这是由于平面从E-构象向A-构象转化的结果。（fig.8；fig.10）
5.3L a吸收带
与L b吸收带（280）相比（2R，3S）-和（2S，3R）-反式对映体具有相反的CE属性，（2R，3R）-和（2S，3S）-顺式对映体具有相同的L a吸收（240）属性。位于240区的正性和负性CE能分别表明3S和3R的绝对构型（表6
fig.9；fig.10），
当A环无任何羟基化取代时这个规则不再适用。
一个新从大麦中分离出来的黄烷-3-醇葡萄糖苷通过利用NMR，FAB-MS，UV，和CD确定为（2R，3R）-儿茶素类-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（18），J2，3偶合常数为7.4H Z证实2,3为-反式构型.280负性CE表明C2位构型为2R.( fig.11) 6. 黄烷-4-醇类
6.1. 2,4-顺式-黄烷-4-醇类
(+)-(2R，4R)-4-氨基黄烷盐酸盐(19),(+) -(2R，4R)-4acetamidoflavan(20), -
(2R，4R)-flavan-4-ol各自的NMR光谱和J2,4偶合常数建立了顺式相对构型, 二氢吡喃C环此时或是半椅式或是沙发构象.( fig.12)
C环具有半椅式构象时(fig.13),C4-OH可能被迫处于不利的φ-平伏键位置(H2和H4处于直立键),当为另一种可能的半椅式构象时,C2苯基采用不利的直立键((H2和H4处于平伏键).通过构象分析同样可以排除船式构象.在沙发构象中, C4-OH遵循避免迫位影响这样一种方式.于是沙发构象转为半椅式构象更为合
理.( fig.14)
通过实验可以发现C4位的差向异构化作用将改变L b吸收带属性,这样就能假设C2是对称二氢苯并吡喃分子的good approximation.(2R，4R)-顺式非对映体(22)在L a和L b带中都能得到来自C4-OH对CE的正性贡献( fig.15).对于L b带具有沙发构象的手性环来讲,第二个球面的影响教临近A环发色团的C4-OH影响小, C4-OH影响称为第三个sphere影响.antus et al (2001)认为2,4-顺式对映体具有半椅式平面构象(fig.13),由C2-苯基的平伏键取向所决定,但是却得到了以下相同结论:当O-杂环采用一个半椅式构象且在合并芳香环上无任何取代时, 苯并二氢吡喃发色团中O-杂环的P-/M-螺旋性受到苯环L b吸收带产生正性/负性CE影响.（表7）
6.2 2,4-反式-黄烷-4-醇类
NMR光谱分析表明2，4-反式-黄烷-4-醇类的构象或为半椅式（fig.16）或为沙发型（fig.17）。构象分析上不能区分这两种形式。C4-OH对（2R，4S）-2，4-反式对映体（23/25）的半椅式和沙发型构象的贡献在L a和L b吸收带上表现为负性CE。
Antus et al报道了2，4-反式-黄烷-4醇类采用与2，4-顺式-黄烷-4-醇类（半椅式或沙发构象）不同的规则（fig.13， fig.14），这是由于处于竖直键的C4-
OH迫使O-杂环采用沙发构象（fig.17）。因此，当O-杂环采用沙发构象且稠合芳环上无任何取代时P-/M-螺旋性分别表现出正性或负性的苯环L b吸收带CE。3个黄烷-4-醇类化合物的CD数据见表8（fig.15）。
7. 黄烷-3，4-二醇类
黄烷-3，4-二醇类的相对构型能通过C-环中J H，H三根键的质子偶合常数来判断。2，3-顺式-3，4-反式和2，3-顺式-3，4-顺式类似物的相对构型细微差别能通过NOE效应来区别。
7.1 L b吸收带
与2，，3-反式-3，4-顺式类相黄烷类C-环取代的L b吸收带（280）常用于构型的判断。构象为半椅式或沙发型的C-环为P-螺旋型时（C2位绝对构型为R）将在L b吸收带产生负性CE，M-螺旋型（C2位绝对构型为S）时将产生正性CE。（fig.18-20，table9）。
所有反式E-构型化合物如：（2R，3S，4R）-和（2S，3R，4S）-2，3-反式-3，4-反式-黄烷-3，4-二醇类在C4-OH和H5之间为烯丙键。这就将引发半椅式和沙发型相对稳定构象的转变以消除烯丙键的影响，于是M-螺旋型对应所有的2R-反式黄烷-3，4-二醇类，P-螺旋型对应所有的2S-反式黄烷-3，4-二醇类。（fig.21）比2-3，3-4-全为反式构型的化合物类构象的转变所产生的影响是位于L b吸收带的CE峰高降低。2，4-顺式双直立键A-构型类似物如：
（2R，3R，4R）-和（2S，3S，4S）-2，3-顺式-3，4-顺式-黄烷-3，4-二醇，（2R，3S，4R）-和（2S，3R，4S）-2，3-反式-3，4-反式-黄烷-3，4-二醇可能通过C4-OH与芳B环之间的氢键而稳定（fig.22）。一旦C4-OH被衍生化，氢键和A-构型将消失，L b吸收带的CE峰高较L a吸收带的CE峰高将增加。
所有顺式E-构型化合物如：（2R，3R，4R）-和（2S，3S，4S）-2，3-顺式-3，4-顺式-黄烷-3，4-二醇通过C3-OH直立键和C-环中的O-杂原子之间的氢键而稳定。（fig.23）
7.2 L a吸收带
除2，3-反式-3，4-顺式-无色花色素类以外，2，3-反式-3，4-顺式-黄烷-3，4-二醇类的L a吸收带（240）的属性与L b吸收带（280）相反，同样也可以得知化合物的CE并不总遵循deangelis-wildman芳香象限规则。
8. 黄烷类
Antus et al 证实了黄烷类具有半椅式构象且C2-苯基处于平伏键，并遵循熟知的二氢苯并吡喃发色团O-杂环P-/M-螺旋型规则，在L b吸收带处产生正性或负性CE。即L b吸收带处的负性CE表明C2位绝对构型为S，L b吸收带处的正性CE表明C2位绝对构型为R（fig.24.table10）。 sashida et al 报道的从buckleya lanceolata 的叶中分离得到的黄烷苷类其C2位绝对构型就是通过CD谱来确定的。（fig.25）
9. 异黄烷类
通过与环己烯比较及最小扭应变力基础上并结合其他大多数黄酮类化合物认为异黄烷类中O-杂环的优势构象为半椅式（fig.26），当苯基位于C3直立键并不象环己烷和环己烯系统那样由于1，3-二直立键产生不稳定性时就不能认为
E-或A-可能具有较低的自由能。异黄烷类临近质子的偶合常数（J2，3， J3，4）并不与理想中的C3处于平伏键的半椅式构象一致。
异黄烷类的ORD和CD 数据揭示异黄烷类遵循的螺旋型规则与前面讨论的黄酮类苯并二氢吡喃发色团螺旋型规则相反。O-杂环的P-/M-螺旋型在L b吸收带区域内（260---320）产生正性或负性CE，在L a吸收带区域内（220---260）产生负性或正性CE（fig.26.table11）。
虽然这一规则在归属异黄烷类化合物绝对构型时较为有用，但是当在B-环上有2‘，6’-双取代将在O-杂环上因为立体效应产生不同的构象。（fig.27）在这些化合物的NMR谱上也反映了这种效应。
Versteeg et al 合成了6个异黄烷类和其对应体（31a/b---36a/b）且利用标准的3S和3R-vestiol 衍生物确正了合成的异黄烷类C3绝对构型（fig.28）。在A 环和B环有含氧取代的（3S）-异黄烷类（34a，35a，36a）在L a吸收带（240）和L b吸收带（270---280）区域内分别显示正性和负性CE。相反地，（3R）-异构体在L a吸收带（240）和L b吸收带（270---280）区域内分别显示负性和正性CE。（fig.29）7-脱氧3S-异黄烷类在B环上具有单氧取代（31a）和双氧取代（32a和33a）时，在L a吸收带（230---240）和L b吸收带（270---280）区域内都显示负性CE，而3R-对映体则与之相反（31 b,32b,33b）。（fig.30）
10. 二氢异黄酮类
CD数据对于二氢异黄酮类绝对构型的归属极为重要。用于芳基稠环的修改八区律规则预测B环处于平伏键的3R-二氢异黄酮类其羰基的n—π*跃迁将表现出正性CE,( fig.31)B环的平伏取代可以通过H2β和H3在NMR光谱中的偶合常数为11H Z判定出H2β和H3处于反式双直立键。虽然其他种方法如L a吸收带，L b吸收带，π---π※跃迁等已被用在归属上面，但仍然建议采用n---π※吸收带去归属。（table 12）
11. 紫檀烷类
紫檀素（40），6a-OH-紫檀素（41）（fig.33）,鱼藤酮类（42），12a -OH 鱼藤酮类（43）（fig.34）是黄酮类化合物中四环黄酮型化合物。
11.1 紫檀素类
紫檀素类中含有两个手性中心，但自然界中仅发现（6aR,11aR）-顺式和（6aS，11aS）-顺式两种构型。B环和C环的反式稠合方式已经合成出来了且是外消旋体，已知所有左旋紫檀素类的绝对构型为（6aR,11aR），右旋的构型为（6aS，11aS）。
简单的紫檀素类在UV光谱的285---310处给出一强峰，280---287给出一弱峰，而ORD谱在250---350区域内表现出一复合峰，这也能用于归属绝对构型。在顺式环合紫檀素类中苯并二氢吡喃和2，3-苯并[b]二氢呋喃手性基团影响非手性发色团。这些化合物的CD谱归属如下：L a吸收带位于220---240，L b 吸收带
位于260---310，B b带位于200处。主要谱带L b吸收带/L a吸收带的正性/负性CE反映（6aR,11aR）构型，L b吸收带/L a吸收带的负性/正性CE反映（6aS，11aS）构型。芳香C环的O取代（O11）采用非对称的直力键来避免C1位上迫
位羟基的立体影响。（fig.35）苯环上存在一个假不对称直立键取代时在CD中的L a吸收带，L b吸收带遵循苯并二氢吡喃发色团的属性。在自然界中（-）-（6aR,11aR）顺式-紫檀素类的B环与其正性L b吸收带和负性L a吸收带相关。（fig.36）若根据在芳环位置取代（C11a位于苯并二氢吡喃，C6a位于2，3-苯并[b]二氢呋喃分子中）在顺式紫檀素类中两个发色团都表现出反常行为，对顺式紫檀素类适用的螺旋型规则与已知的苯并二氢吡喃规则相反。2，3-苯并[b]二氢呋喃发色团要求无直立苯基取代存在。（table13）
通过H6a和H11a质子的NMR偶合常数（J=13.4H Z）可知在（6aS，11aR）-反式-紫檀素类中（45）H6a和H11a为反式双直立键，O11和C7a处于平伏键。因此不存在直立取代基影响不饱和（6aS，11aR）-反式-紫檀素类（fig.37）的CD 情况。这样独立发色团的螺旋型规则就适用了：正性L b吸收带对应C环或B环中的五元或六元环发色团的M-螺旋型。
总之O-杂环的螺旋型决定了（6aS，11aR）-反式-紫檀素类的CD谱特性，这表明苯并二氢吡喃和2，3-苯并[b]二氢呋喃发色团的M-螺旋型都将产生正性L b吸收带（table14）。
11.26a-二氢紫檀素类
由于具有顺式紫檀素类型，顺式-6a-二氢紫檀素类的旋光活性与绝对构型相关，左旋化合物具有（6aS，11aS）-顺式构型，右旋化合物具有
（6aR,11aR）顺式-构型（table15；fig.38，39）
相比与紫檀素类，反式-6a-二氢紫檀素类（45，46）发生构型的反转：左旋化合物为（6aR，11aS）-反式构型，右旋化合物为（6aS,11aR）-反式构型（45）（table15；fig.40，41）
顺式和反式-6a-二氢紫檀素类中杂环质子在NMR谱中呈现AB偶合系统，C6a-OH呈现宽单峰，H11a在反式异构体中较顺式异构体处于屏蔽区是因为H11a 在前者中相对于芳香A和D环为直立键取向（fig.40）。存在于顺式异构体中的C6a-OH和H11a之间的NOE效应在反式异构体中消失，表明B/C环为几何反式。
12. 鱼藤酮类
通过H1质子在CDCl,acetone-d6,acetonitrile-d3,benzene-d6中化学位移δ6.6-6.8,在DMSO- d6化学位移δ6.4,在pyridine-d5中化学位移δ7.3可知天然鱼藤酮类热力学稳定式为B/C环处于顺式系统,通过偶合常数近似夹角65---55°,以及X-ray也都表明B/C环处于顺式为优势构象.
B/C环反式的鱼藤酮类需通过合成得到,利用DIBAL还原脱氢鱼藤酮的1,4位得到了(±)反式-异鱼藤酮,它们的构型通过X-ray单晶衍射而确定. B/C环反式的一系列特征是H1质子的强去屏蔽效应,在CDCl,acetone-d6,Methanol-d4中位于δ7.6---7.9,在pyridine-d5中位于δ8.2---8.5。两种可能的B/C环反式构象能通过
H6a与C6质子的相对构型来确定，此时H6a可处于平伏键或直立键。 H6a与一个C6质子的偶合常数（J=11～12H Z）可以确定为反式双直立质子偶合关系。
当B/C环稠合关系通过H-NMR确定为顺式或反式之后，利用CD数据决定C6a和C12a的绝对构型。鱼藤酮类的CD谱在190---360内呈现多重CE峰，在350附近的长波长CE为苯甲酰系统产生的n---π※跃迁，320附近的CE为A
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圆二色谱，判断黄酮类化合物绝对构型的重要手段1．简介： 手性化合物的旋光性是化合物分子的立体构型的不对称性对平面偏振光的作用。若对组成平面偏振光的左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的吸收系数不同，即εL≠εR,，这种性质称为手性化合物的圆二色性。当测定的仪器接收透过手性化合物溶液的平面偏振光时，记录的是手性化合物溶液对左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的吸收系数之差△ε，或化合物生色团吸收波长附近的摩尔椭圆度［θ］即可获得圆二色谱〔CD〕。 CD即圆二色谱，是以吸收系数之差或摩尔椭圆度［θ］为纵坐标，波长为横坐标记录的谱线，其中△ε=（d L－d R）／C×1，d L和d R为吸光度。C为溶液浓度，1为测定用池的池长；［θ］=ψ（λ）M／100LC其中ψ（λ）为所用测定池情况下的平面偏振光的椭圆度，C为溶液浓度，单位g/ml，1为池长，单位dm，M为分子量。它们之间的关系为［θ］=3300△ε，而△ε=θ/33×C·1。2．黄酮类： 多酚类是生物体内主要的二次代谢产物。根据他们的碳骨架能划分为几种主要种类。例如，黄酮类与酚酸类。黄酮类根据的氧化情况又可以分为许多种类。已知的黄酮类化合物中都具有的骨架形式，并常有羟基取代，甲氧基取代，苷化及其他修饰和组合。 虽然黄酮类化合物的绝对构型在50年代起已经通过旋光性和ORD方法进行解析了，但是更方便，更简易的CD谱方法却在60年代中期更为流行。CD 谱现已广泛用于具有旋光性的黄酮类化合物的解析，如：二氢黄酮类，二氢黄酮醇类，黄烷-3-醇类，黄烷-4-醇类，黄烷-3，4-二醇类，黄烷类，异黄烷类，二氢异黄酮类，类鱼藤同类，前花色素类和各种类型的双黄酮类。 3．二氢黄酮类 二氢黄酮类的两个结构特征在判定它们绝对构型时非常重要。一个是之间的单键，一个是位的手性中心，大多数天然二氢黄酮类化合物中在位具有苯基，其为α取向时，其绝对构型被定为S。 利用CD 或ORD连用NMR光谱数据判定二氢黄酮类化合物绝对构型始于Gaffield。 二氢黄酮类化合物的UV最大吸收在270----290处，320----330处有一弱峰，这是由于苯乙酮型和之间的相互转化产生的。八区律规则已经从判定α，β不饱和酮的手性及它们的长波CE图上扩展到了芳香酮。这样，二氢黄酮类化合物绝对构型为2S时，在构象上就具有杂环的P ----螺旋性和C2位芳基处于平伏键，并在CE谱上表现为正性的n---π※吸收带和负性的π---π※吸收带。 利用n---π※吸收带判定构型的优点是这种转变在芳香环取代系统中是独立的。虽然n---π※转变处于长波区趋于随构型相反对映体量的增加而消失。 杂环上的H2与H3之间的较大偶合常数（J2，3）表明所有天然二氢黄酮类在热力学稳定构象中C2芳香基处于平伏键（fig2）。这说明所有左旋的二氢黄酮类具有2S构型。 利用这个信息的例子在确定OBO---二氢黄酮A和二氢黄酮B构型可以清楚的发现。（fig.3 and table1）
圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。 一．简介 圆二色谱是用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱。光学活性物质对组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏振光的吸收系数(ε)是不相等的，εL≠εR，即具有圆二色性。如果以不同波长的平面偏振光的波长λ为横坐标，以吸收系数之差Δε=εL-εR为纵坐标作图，得到的图谱即是圆二色光谱，简称CD。如果某手性化合物在紫外可见区域有吸收，就可以得到具有特征的圆二色光谱。由于εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，摩尔椭圆度[θ]与Δε的关系为：[θ]=3300Δε。圆二色谱也可以摩尔椭圆度为纵坐标，以波长为横坐标作图。由于△ε有正值和负值之分，所以圆二色谱也有呈峰的正性圆二色谱和呈谷的负性圆二色谱。在紫外可见光区域测定圆二色谱与旋光谱，其目的是推断有机化合物的构型和构象。 二．样品要求 1、样品必须保持一定的纯度不含光吸收的杂质，溶剂
必须在测定波长没有吸收干扰;样品能完全溶解在溶剂中, 形成均一透明的溶液。 2、氮气流量的控制 3、缓冲液、溶剂要求与池子选择：缓冲液和溶剂在配制溶液前要做单独的检查，看是否在测定波长范围内有吸收干扰，看是否形成沉淀和胶状；在蛋白质测量中，经常选择透明性极好的磷酸盐作为缓冲体系。 4样品浓度与池子选择 样品不同，测定的圆二色光谱范围不同，对池子大小(光径)的选择和浓度的要求也不一样。蛋白质CD光谱测量一般在相对较稀的溶液中进行。 三．谱带宽度 选为1 nm。对于高分辨率测量，要用较窄的狭缝宽度，此时光电倍增管的电压较高，谱的信噪比差。虽然对于正常测量最佳谱带宽度是1~2 nm，但是在下列情况下要牺牲分辨率而需要较宽的狭缝宽度。当样品的吸光度很高但CD信号很弱时，一方面要尽量保证测定CD峰所需要的足够浓度，另一方面要设置较宽的狭缝。不过此时要特别小心，因为样品在吸光度过高(A>2)的情况下可能存在荧光或杂散光引起的某些假象。另外，在固体CD光谱测试时也需要较大的狭缝宽度(一般要求> 2 nm)。 (2)椭圆率和摩尔椭圆率都依赖于测量条件。因此，温度、
圆二色光谱实验 一、实验目的 1、了解圆二色（CD）光谱的原理和使用方法。 2、学会用圆二色光谱检测蛋白质二级构象的基本原理和方法，并学会分析物质的手性。 3、了解圆二色光谱仪的基本构造，并学会使用。 二、实验原理 1.CD光谱的基本知识 圆二色性是研究分子立体结构和构象的有利手段。在一些物质的分子中，没有任意次旋转反映轴，不能与镜像相互重叠，具有光学活性。电矢量相互垂直，振幅相等，位相相差四分之一波长的左和右圆偏振光重叠而成的是平面圆偏振光。 平面圆偏振光通过光学活性分子时，这些物质对左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，就是该物质的圆二色性。 圆二色性用摩尔系数系数差ΔεM来度量，且有关系式：ΔεM = εL –εR，其中，εL 和εR分别表示左和右偏振光的摩尔吸收系数。如果εL –εR >0，则ΔεM为“+”，有正的圆二色性，相应于正Cotton效应；如果εL –εR<0，则ΔεM为“-”，有负的圆二色性，相应于负Cotton效应。 由于这种吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此从圆偏振光通过介质后变成了椭圆偏振光。圆二色性也可用椭圆度θ或摩尔椭圆度[θ]度量。[θ]和ΔεM之间的关系式：[θ]=3300*Δε 圆二色光谱表示的[θ]或ΔεM与波长之间的关系，可用圆二色谱仪测定。一般仪器直接测定的是椭圆度θ，可换算成[θ]和ΔεM：[θ] = 100θ/cl，ΔεM= θ/33cl 其中，c表示物质在溶液中的浓度，单位为mol/L；l为光程长度（液池的长），单位为cm。输入c和l的值，一般仪器能自动进行换算，给出所需要的关系。 2.定性分析原理 圆二色光谱仪需要将平面偏振调制成左、右圆偏振光，并用很高的频率交替通过样品，因而设备复杂，完成这种调制的是电致或压力致晶体双折射的圆偏振光发生器（也称Pocker池或应力调制器）。圆二色谱仪一般采用氙灯作光源，其辐射通过由两个棱镜组成的双单色器后，就成为两束振动方向相互垂直的偏振光，由单色器的出射狭缝排除一束非寻常光后，寻常光由CD调制器制成交变的左圆偏振光、
圆二色谱的介绍 圆二色性 circulardichroism 对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象。这种吸收程度的不同与波长的关系称圆二色谱，是一种测定分子不对称结构的光谱法。在分子生物学领域中主要用于测定蛋白质的立体结构，也可用来测定核酸和多糖的立体结构。 光是一种电磁波。假如用电矢量来表示，光的前进就是由矢量端点在一特定的平面里沿正弦波运动的轨迹。对于自然光讲，正弦波振动的平面是随机的。如有一束光，它所有的电矢量的振动平面都是相互平行的，这种光称为平面偏振光。有一种特殊的情况，光前进的过程中电矢量绕前进轴转动，若电矢量的绝对值不变，则运动轨迹的投影是一个圆，这时就变成圆偏振。面对光前进的方向看去，电矢量端点的圆运动可以是顺时针方向的，也可以是逆时针方向的，因此圆偏振有R与L两种。 假如L与R两束圆偏振光在一起辐射，强度、速度、频率和位相都相同，它们就会叠合成一束平面偏振光。如波长λ的L光和R光的光强度相等，在光学各向异性物质中传播某一距离后，它们的综合光将变成椭圆偏振光，椭圆的长轴处于两个圆偏振的电矢量相叠合的地方。假如两个圆偏振的传播速度也不相同，而所经的途径与上述相同，则叠合的椭圆偏振光的长轴与上面所述的椭圆偏振光的长轴相夹θ角(图1）。 由不对称分子组成的物质是光学各向异性的,即L与R两束圆偏振光在这类物质中的传播速度不相等。假如光学各向异性物质在某一波长λ有吸收，那将在该时对L光和R光有不同的吸收,如该物质的吸光率是A,而对L光和R光的吸光率是AL和AR，AL和AR的差ΔA＝AL-AR,称为圆二色性。 从（图2）可看出,因光吸收不同而产生的椭圆的形状与ΔA有直接的关系。θ称为椭圆值，也是一种定量描述圆二色性的单位。在条件相同的情况下，θ＝3300ΔA。 在蛋白质分子中，肽链的不同部分可分别形成α-螺旋、β-折叠、β-转角等特定的立体结构。这些立体结构都是不对称的。蛋白质的肽键在紫外185～240纳米处有光吸收，因此它在这一波长范围内有圆二色性。几种不同的蛋白质立体结构所表现的椭圆值波长的变化曲线——圆二色谱是不同的。如(图3)所示，α-螺旋的谱是双负峰形的，β-折叠是单负峰形的，无规卷曲在波长很短的地方出单峰。蛋白质的圆二色谱是它们所含各种立体结构组分的圆二色谱的代数加和曲线。因此用这一波长范围的圆二色谱可研究蛋白质中各种立体结构的含量。 蛋白质含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它们在240～350纳米处有光吸收,当它们处于分子不对称环境中时也表现出圆二色性。这一范围的圆二色性反映出在蛋白质分子中上述氨基酸残基环境的性质。 核酸中所含糖有不对称的结构，它们所含的双螺旋结构也是不对称的。它们在185～300纳米范围内也有特征的圆二色谱（图4）。这些谱与核酸的立体结构的关系虽不甚显著，但也可以用它研究某些立体结构。同时圆二色谱与核酸的碱基配对数有关系，因此也可用圆二色谱研究核酸的化学组成。 1.CD的安装与测量准备: 为避免CD强度随温度而发生变化的变化,CD应安装在空调室中.而且还需要
圆二色谱仪 使用手册 实验前请先阅读第一部分注意事项 2011年4月6日整编 河北大学理化中心
目录 一、注意事项 二、光源的选择 三、MOS 450波长的校正 四、电压的调节 五、MOS-450 圆二色光谱扫描操作规程 六、MOS 450-SFM 300动力学操作方法
一、注意事项 1、滴定及变温实验时，需要磁子搅拌。实验结束时首先拔掉搅拌电源。在样品池内无磁子的情况下搅拌器空转会烧毁控温元件。 2、光源(也就是氙灯或汞氙灯)不可频繁开关。举例而言，如果马上不用仪器，但半个小时后需要使用仪器，就不要为了节约光源寿命而将光源关闭。短时间内频繁开关光源反而会缩短光源寿命。 3、光电倍增管移动时(比如从圆二色模式换为荧光模式)，注意用软件将Hv（高压）关闭。 4、扫描速度在0.5-5s/nm。使用手册上写的扫描速度有误，特别注意不要低于0.5秒/nm,过快的扫描速度易造成calibration移位。 5、如需用到emission单色器，就是那个需要用光纤连接的单色器，扫描速度要大于1s/nm,连0.5s/nm都不能用。 6、PMT的HV不要超过1000V. 7、使用控温附件进行变温实验时，一定要将地上的那个水浴恒温槽打开，水槽温度设为20度以下即可。 8、TCU上设置为remote; Power supply设置为ARC. 9、仪器运行过程中，更换样品时，shutter最好关闭。
二、光源的选择 1、电源： 图1中的Lamp power supply处有Xe（红色）、Xe(Hg)（红色）、零线（黑色）三个插孔。 零线插头为黑色，直接插到黑色的零线插孔中。 火线插头为红色，在做圆二色、紫外、荧光的光谱扫描时插在Xe（红色）插孔中，在做快速动力学测量的时候插在Xe(Hg)插孔中。 2、光源选择： 图2中的Vertical setting部位下方的底座上有Xe、Xe(Hg)两个标示前后排列。手动松开中间的大圆头Screws(图2中)，可以拉出或推进Vertical setting。当Vertical setting的金属头通过前后移动到下方的哪个标示位置上，也就是那个标示所示的灯正对着光路，为测试用光源。做快速动力学测量的时候选Xe(Hg)，做圆二色、紫外、荧光的光谱扫描时选Xe，最后再旋紧中间的大圆头Screws。 注：Xe（Hg）灯中的Hg元素有一些很强的特征谱线，加强了Xe元素发光的强度，对于动力学测量要求一个波长的光源能量要强，才能测量较为精确的谱图。而对于光谱扫描，单独的Xe元素谱线较为平滑，光源对扫描的影响较小。 图1 图2
圆二色谱实验总结 圆二色谱是用来表征蛋白的二级结构和三级结构的常用方法，在界面课题组主要用来表征肽自组装体的二级结构；通常对于三级结构不予考虑。这一方法的实验操作容易，与一般的光谱测量相同，但是形成的机制比较复杂。在此只能说我自己理解了的部分，对于不理解的部分还需要继续查文献进行了解。 1圆二色谱的原理 名称中虽有“色谱”两字，但是这一测量方法实际上是一光谱法，光谱法对应的即为电子的跃迁行为。同时，光谱法中必然存在的定量关系就是朗伯-比尔定律，圆二色谱的方法就是建立在这一光吸收过程上的光谱方法。 1.1预备知识 需要推演圆二色谱的原理用到的工具有数学工具和物理知识两个方面，分别叙述如下。 1.1.1 数学工具 在推演圆二色谱的数学表达形式时，需要用到一些数学知识，主要有圆的普通方程及参数方程、椭圆的普通方程及参数方程，相关的三角函数知识，这些数学知识基本都在高中阶段学过。 首先说明圆的普通方程和参数方程：圆的普通方程即为仅对圆上点的坐标关系进行描述的方程。圆上点的特点是对固定点（即圆心）的距离相等，设圆心的坐标为(x0, y0)半径为r，则圆的普通方程为 √(x?x0)2+(y?y0)2=r 通常用的是化简的形式，为讨论方便，将圆心设为原点，即得到 x2+y2=r2 利用同角三角函数关系，即sin2θ+cos2θ=1可将上述方程参数化，得到圆的参数方程 {y=r sinθ x=r cosθ使用同样的思路，可以得到椭圆的参数方程，即 {y=b sinθ x=a cosθ消去参数后，得到椭圆的标准方程，即 x2 a2+ y2 b2 =1 上述有关于椭圆的方程中均有a≠b。 1.2 物理预备知识 关于物理的预备知识是最基本的波动光学的观点。按照波动光学的观点，光是在空间中交替传播的电磁场，电场强度的方向与磁感应强度的方向垂直。从能量分布的角度来说，光的能量被认为主要以电场的形式传播，因而通常也将光的电场强度矢量方向定义为光矢量方向。以上即最基本的波动光学观点，下面解释光的偏振特点。 1.2.1 自然光和偏振光 自然光即任何光源发出的光，其特点为光矢量在垂直于传播方向的平面上均匀分布，但在传播方向上并不体现出规律性，如图1(a)所示，图中z轴的方向由纸面向外，以圆的半径表示光矢量的大小，对于一给定的自然光，光矢量的大小即光的强度是恒定不变的。光的偏振现象可理解为在传播方向上光矢量振动的不对称性。在圆二色谱的原理中，涉及到的偏振光有平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光三类。
ADF教程：如何计算电子圆二色 （ECD）谱 本文以“电子圆二色谱技术在天然产物绝对构型确定中的应用，《国际药学研究杂志》，卷42，第6期，P734”中测量过ECD谱的两种异构分子为例，对ADF中的ECD计算功能进行演示。 文中两个分子结构如下： 二者对应的ECD谱如下（实线）： 图中单位为L/Mol·cm-1，ADF计算的单位是10-40·esu·cm·erg/Gauss 计算之前，应该进行结构优化，这里省略了这个步骤的说明，其中包括结构优化、ECD计算。需要说明的是：其中的甲醇分子的位置对ECD的影响并不大，所以即使没有严格收敛，也并不太影响ECD的计算。 ECD计算参数设置 下面以B分子为例：
A分子计算参数完全相同，这里不赘言。 保存任务后，提交计算。 结果查看 ADF LOGO > Spectra > Spectra > CD:
§窗口上方显示的是ECD谱（可以通过调整窗口中间的peak width来调整谱图的展宽情况），可以用过鼠标拖动、滚轮放大缩小调整； §窗口下方具体列出了ECD的峰的位置、强度（有正、负值）。
每一个ECD的峰，对应一个激发态，这些激发态是由哪些占据轨道到哪些空轨道的激发，可以在窗口中菜单栏，选择：Spectra > Excitation，窗口切换为显示紫外吸收谱，下方的窗口列出了这些激发态的情况，点击其中每一行，可以看到该激发态的组成，点击蓝色的字，可以看到这些轨道的具体空间分布(详见下文)。 结果比较 调整A、B分子的ECD谱的展宽，与文献中的实验测量结果比对： A分子的ECD谱（横坐标上的短红线是ECD峰的位置，具体数字对应上面的图中，下方的窗口）：
圆二色谱 圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。 简介：用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱。光学活性物质对组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏振光的吸收系数(ε)是不相等的，εL≠εR，即具有圆二色性。如果以不同波长的平面偏振光的波长λ为横坐标，以吸收系数之差Δε=εL-εR为纵坐标作图，得到的图谱即是圆二色光谱，简称CD。如果某手性化合物在紫外可见区域有吸收，就可以得到具有特征的圆二色光谱。由于εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，摩尔椭圆度[θ]与Δε的关系为：[θ]=3300Δε。圆二色谱也可以摩尔椭圆度为纵坐标，以波长为横坐标作图。由于△ε有正值和负值之分，所以圆二色谱也有呈峰的正性圆二色谱和呈谷的负性圆二色谱。在紫外可见光区域测定圆二色谱与旋光谱，其目的是推断有机化合物的构型和构象。 样品要求 1、样品必须保持一定的纯度不含光吸收的杂质，溶剂必须在测定波长没有吸收干扰;样品能完全溶解在溶剂中, 形成均一透明的溶液。 2、氮气流量的控制 3、缓冲液、溶剂要求与池子选择：缓冲液和溶剂在配制溶液前要做单独的检查，看是否在测定波长范围内有吸收干扰，看是否形成沉淀和胶状；在蛋白质测量中，经常选择透明性极好的磷酸盐作为缓冲体系。4样品浓度与池子选择 样品不同，测定的圆二色光谱范围不同，对池子大小(光径)的选择和浓度的要求也不一样。蛋白质CD光谱测量一般在相对较稀的溶液中进行。 原理 光是横电磁波，是一种在各个方向上振动的射线。其电场矢量E 与磁场矢量H 相互垂直，且与光波传播方向垂直。由于产生感光作用的主要是电场矢量，一般就将电场矢量作为光波的振动矢量。光波电场矢量与传播方向所组成的平面称为光波的振动面。若此振动面不随时间变化，这束光就称为平面偏振光，其振动面即称为偏振面。平面偏振光可分解为振幅、频率相同，旋转方向相反的两圆偏振光。其中电矢量以顺时针方向旋转的称为右旋圆偏振光，其中以逆时针方向旋转的称为左旋圆偏振光。两束振幅、频率相同，旋转方向相反的偏振光也可以合成为一束平面偏振光。如果两束偏振光的振幅(强度) 不相同,则合成的将是一束椭圆偏振光。 光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率不同,其光吸收的差值ΔA ( Al - Ad) 称为该物质的圆二色性(circular dichroism ,简写作CD) 。圆二色性的存在使通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆偏振光,且只在发生吸收的波长处才能观察到。所形成的椭圆的椭圆率θ为:θ= tg- 1 短轴/长轴 根据Lambert-Beer 定律可证明椭圆率近似地为：θ= 0. 576 lc (εl - εd) = 0. 576 lcΔε公式中l 为介质厚度, c 为光活性物质的浓度,εl及εd分别为物质对左旋及右旋圆偏振光的吸
紫外圆二色谱分析蛋白结构 根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范围: (1) 250nm以下的远紫外光谱区，圆二色性主要由肽键的电子跃迁引起; (2) 250～300nm的近紫外光谱区，主要由侧链芳香基团的电子跃迁引起; (3) 300～700nm的紫外-可见光光谱区，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起。 相应地，远紫外CD主要用于蛋白质二级结构的解析，近紫外CD主要揭示蛋白质的三级结构信息，紫外-可见光CD主要用于辅基的偶合分析。 远紫外CD谱: 在蛋白质或多肽的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，二级结构不同的蛋白质或多肽，所产生CD谱带的位置、峰的强弱都不同。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息。 紫外区段（190-240nm），α-螺旋的CD谱在192nm附近有一正峰，在208nm、222nm处呈两个负的特征肩峰；β-折叠在216-218nm有一负峰，在185-200nm有一强的正峰；β-转角则在206nm附近有一正峰；无规则卷曲构象的CD谱在198nm附近有一负峰，在220nm附近有一小而宽的正峰。 近紫外CD光谱： 蛋白质中芳香氨基酸残基，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区250～320nm表现出CD峰。研究表明：色氨酸在290及305nm处有精细的特征峰；酪氨酸在275及282nm有峰；苯丙氨酸在255、260及270 nm有弱的但比较尖锐的峰带；另外芳香氨基酸残基在远紫外光谱区也有CD信号；二硫键于195-200nm和250-260处有谱峰?。总的来说，在250～280nm之间，由于芳香氨酸残基的侧链的谱峰常因微区特征的不同而改变，不同谱峰之间可能产生重叠。 蛋白浓度与使用的光径厚度和测量区域有一定关系，测量远紫外区氨基酸残基微环境的蛋白，浓度范围在0.1~1.0mg/ml，则光径可选择在0.1~0.2cm之间，溶液体积则在200~500ul。而测量近紫外区的蛋白三级结构，所需浓度要至少比远紫外区的浓10倍方能检测到有效信号，且一般光径的选择均在 0.2~1.0cm，相应的体积也需增加至1~2mL。缓冲液可选50~100mmol Tris-HCl、PBS等，尽量除去EDTA。） 测蛋白二级结构的CD峰图中，在正常条件下，正峰或负峰都趋向于最大正/负峰值。图6中由于外界条件（温度）不断升高，导致蛋白的二级结构逐渐被破坏，峰值逐渐向0靠近，趋于平缓。
3.3.9圆二色性（Circular dichroic，CD）测定 1%(w/w)的蛋清溶液调节到pH 4.0，6.0，10.0，在85oC加热不同时间，离心，取上清液，然后稀释至100~200μg/mL溶液。对照组为天然蛋清样品。用Jasco J-715光度计测定样品的CD谱。测定条件设定：测定波长范围190~250 nm，25oC，比色皿光径1 mm，分辨率0.2 nm，扫描速率100 nm/min，扫描5次。使用Jasco SSE软件确定样品的二级结构百分含量。 3.4.6蛋白质的二级结构对DH的影响 蛋白酶的水解反应还受到蛋白质的结构的影响，一般结构紧密的蛋白质提供的酶切位点少于结构松散的蛋白质。因此有必要研究蛋白质结构对DH的影响。蛋白质的热处理可能引起二级、三级和四级结构的变化。从二级结构看，α-螺旋结构表现蛋白质分子的有序性，而其结构如β-折叠、β-转角、无规卷曲等反映了蛋白质分子的松散性[26]。蛋白质分子的有序性差，越有利于蛋白酶的水解。目前，研究蛋白质构象最好的方法是x-射线衍射，但对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说，制备蛋白质单晶较为困难。二维、多维核磁共振技术能测出溶液状态下蛋白质分子的构象，可是对分子量较大的蛋白质的计算处理非常复杂。相比之下圆二色性是研究稀溶液中蛋白质分子构象的一种快速、简单、较准确的方法。圆二色性在紫外区段(190~240 nm)，主要生色团是肽链，这一波长范围的CD谱包含着生物大分子主链构象的信息。在一般情况下，实验中得到的CD谱线是α-螺旋、β-折叠和无规卷曲构象的CD 谱的线性迭加[27]。图3-7显示天然蛋清的CD谱线a在222 nm处和208 nm处呈负峰，在190 nm附近有一正峰，这是存在部分α-螺旋构象的特征。谱线b、c、d、e在221 nm处的负谱带减弱，意味着α-螺旋的百分比减小。谱线b、c、d、e向短波长方向移动，即发生蓝移。由于发色团吸收光谱发生位移主要取决于它的微环境更加亲水或疏水的结果[28]，因此谱线b、c、d、e蓝移的发生说明体系的亲水性降低,即疏水性增加。表3.3列出了天然蛋清和热处理蛋清的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲构象所占的比例。从表中可以看出，通过热处理，天然蛋清的α-螺旋比例下降，而β-折叠和无规卷曲的比例增加，说明蛋清蛋白分子结构的有序性降低，形成了以β-折叠和无规卷曲为主的二级结构。 图3-7天然和热处理的蛋清的CD光谱 a-天然蛋清；b-pH4，85oC加热36 min蛋清；c-pH6，85oC加热36 min蛋清；d-pH10，85oC 加热30 min蛋清；e-pH10，85oC加热60 min蛋清。 4.19圆二色谱分析动态超高压微射流均质对卵清蛋白二级结构的影晌
高级物理化学实验 实验项目名称：圆二色光谱原理、实验技术及应用 姓名: 张诗群学号：130420123 指导教师：吴舒婷老师成绩评定：评阅教师： 日期：2014 年7 月10 日 一、实验目的： 1 圆二色性； 2 圆二色谱的原理及应用； 3 圆二色谱的相关拓展知识； 4 圆二色谱的实验技术及操作； 二、实验原理： 圆二色性是手性分子在光学上表现的一种特性。光可视为振动方向与传播方向垂直的电磁横波。当光波的电矢量方向以一个固定的角速度以传播方向为轴心匀速旋转时，称之为圆偏振光。根据圆偏振光电矢量旋转方向的不同，可以将其区分为左圆偏振光和右圆偏振光。一束平面偏振光可以看成是由两个振幅和速度相同而螺旋前进方向相反的圆偏振光叠加而成（图1）。两圆偏振光彼此对映，互为镜像。当手性物质在偏振光的波长范围内存在吸收的时候，其对左右圆偏振光的吸收程度，也就是摩尔吸光系数，是不同的。此时不但偏振光的偏振平面将被旋转，构成该偏振光的左右圆偏振光的振幅也将不再相等。组成出射光的左右圆偏振光的电矢量和将沿一个椭圆轨迹移动，此时的出射光就是椭圆偏振光（图2）。这种光学现象就称为手性物质所具有的圆二色性。对于纯手性物质，其椭圆偏振光的椭圆度θ在特定溶剂、浓度、温度和光程下，在特定波长处为定值。同时，在特定波长处的椭圆度θ与在该波长处对左右圆偏振光的摩尔吸光系数之差(Δε)成正比。将θ或Δε对波长作图，即得到圆二色光谱。
图1 右圆偏振光(a)、左圆偏振光(b)及平面偏振光示意图，水平箭头表示光的传播方向。 图2 (a) 平面偏振光的圆组分；(b) 平面偏振光的旋转与圆组分；(c) 椭圆偏振光的旋转与圆组分被吸收的情况。其中，OB与OC分别表示右、左圆偏振光被吸收后的振幅，OD表示OB与OC的矢量和，θ表示椭圆偏振光的椭圆率角，tanθ= OE/OA″≈θ。 圆二色光谱的英文名称为Circular Dichroism，简称CD光谱。其光谱仪的基本测试原理是——通过入射圆偏振光的波长变化，测定手性样品的左圆偏振光和右圆偏振光摩尔消光系数之差Δε。由于CD光谱反映了光和分子间的能量交换，因而只能在有最大能量交换的共振波长范围内测。CD光谱可用于分析一般电子光谱所不能体现出来的能级跃迁的细节，是讨论手性化合物电子跃迁性质的重要表征手段。当测试条件严格一致时，一对对映异构体的CD光谱呈镜像对称。通 常采用光学纯的样品（即仅含单一对映体）进行CD光谱的测定，可由实验值θ
2009年第29卷有机化学V ol. 29, 2009第6期, 848～857 Chinese Journal of Organic Chemistry No. 6, 848～857 * E-mail: zhoucx10@https://www.doczj.com/doc/0f1466240.html, Received September 17, 2008; revised October 22, 2008; accepted November 18, 2008. 国家自然科学基金(No. 30801429)资助项目.
No. 6 甘礼社等：振动圆二色谱: 一种确定手性分子绝对构型的新方法849 定手性分子的绝对构型, 该方法要求分子中必须含有某些基团或者需要衍生化, 而且要用到昂贵的手性试剂. 基于Bijvoet法的X射线衍射也时常成为有机化学家的一项重要选择, 而要确定绝对构型需要分子中有“重原子”, 而且适合的单晶培养也时常限制了它的应用. 与前三者相比, 光谱学方法由于对样品(纯度、官能团、结晶与否等)要求不高, 测量过程无损失, 因而得到了广泛应用. 在光谱方法中, 最有名和应用最广泛的手性分子光学性质为旋光(OR)和圆二色谱(circular dichroism, CD). 组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏光在通过手性介质时吸收系数不同(εR≠εL), 吸收系数之差?ε随波长变化即可获得圆二色谱(CD). 对映异构体的CD谱图呈现正负相反. 传统的圆二色谱是指波长在200～400 nm之间的吸收谱, 20世纪70年代, 由于“八区律”、“激子手性法”[5]等方法的发现和发展, 圆二色谱得到了广泛应用. 然而, 传统的圆二色谱要求手性分子必须有紫外吸收, 这一点成为限制其应用的重大问题. 由此人们提出: 如何在红外光区频率下测定圆二色谱? 20世纪70年代, Holzwart[6], Nafie和Stephens等[7]先后成功测定了红外光区频率下的圆二色谱, 即振动圆二色谱(vibrational circular dichroism, VCD). 此后, 随着傅立叶变换红外光谱等新技术的发展, VCD的测量范围逐渐扩大为4000～750 cm?1, 测量精度不断提高, 信噪比不断降低. 1997年, 由Nafie等[7]及其公司ABB Bomem/BioTools 开发的第一台VCD光谱仪ChiralIR上市. 其后, 有多家公司分别推出其傅立叶变换红外振动圆二色谱光谱仪(FTIR VCD spectrometer), 包括: Nicolet/Thermo公司的TOM, Jasco公司的JV-2001/FVC-4000, Bio-Rad公司的FTS-60A, Bruker Optics公司的PMA37/PMA50红外附件等. VCD确定手性分子绝对构型已经得到越来越广泛地应用. 由于振动光谱谱图的复杂性, VCD很难象传统圆二色谱(electronic circular dichroism, ECD)那样发展出合适的理论来进行结构-谱图的对应解释, 而只能依靠理论计算值和实测值对比来判断手性分子的绝对构型. 事实上, 随着量子化学理论的创新(如从头算ab initio, 密度泛函 DFT等)和计算机技术的进步, 很多的有机化学家已经开始采取纯理论计算, 如计算NMR[8]、旋光(OR)[9]和电子圆二色谱(ECD)[10]等, 结合实际中的实验室测定来解决手性分子构型中的许多问题. 振动圆二色谱(VCD)正是在这样的双重推动下, 近年来才取得了巨大的发展, 逐渐成为一项鉴定手性分子绝对构型的强有力的工具[11,12]. 本文将简要介绍振动圆二色谱的原理、确定手性化合物绝对构型的方法和应用. 1 振动圆二色谱的原理与方法 1.1 光的性质和VCD的产生 光是一种电磁波, 是由与传播方向垂直的电场和磁场交替转换的振动形成的. 振动方向与传播方向垂直, 为横波. 横波有一个特性, 就是它的振动是有极性的. 在与传播方向垂直的平面上, 它可以向任一方向振动. 如果把这种光通过一个Nicol棱镜(起偏器), 由于它只允许振动方向与其晶轴平行的光线通过, 其它光被阻挡, 一束光线都在一个平面内振动, 称为平面偏振光(polarized light). 平面偏振光通过手性物质时, 能使其偏振面发生旋转, 这种现象称之为旋光. 产生旋光的原因是, 组成平面偏振光的左旋光和右旋光在手性物质中传播时, 他们的折射率不同(n R≠n L), 这种性质叫做手性化合物的双折射性, 由此造成两个方向的圆偏光在手性物质中的传播速度不同(v R≠v L), 从而导致偏振面的旋转. 用仪器记录通过手性化合物溶液的平面偏振光的振动面偏转的角度, 即为旋光度α, 我们平常所测定的旋光即为波长在589.6 nm的Na灯的黄光下的比旋光度. 旋光度随波长的变化而变化就可获得旋光光谱(optical rotatory dispersion, ORD). 组成平面偏振光的左旋圆偏光和右旋圆偏光在通过手性介质时, 不但产生因折射率、传播速度不同而导致的旋光现象, 而且还产生因吸收吸收系数不同εR≠εL 而导致的“圆二色性”. 用仪器可以记录通过手性化合物溶液的左旋圆偏光和右旋圆偏光的吸收系数之差?ε, ?ε随波长变化即可获得圆二色谱(CD). 传统的圆二色谱(CD)所用的平面偏振光的波长范围一般在200～400 nm, 属于紫外区, 由于其吸收光谱是分子电子能级跃迁引起的, 称为电子圆二色谱(ECD). 与此对应, 当平面偏振光的波长范围在红外区时, 由于其吸收光谱是分子的振动转动能级跃迁引起的, 称为振动圆二色谱(VCD). VCD谱即为红外光中的左旋圆偏光和右旋圆偏光的吸收系数之差?ε随波长变化所给出的图谱(图1). 长期以来, 电子圆二色谱由于其干扰少、容易测定而被广泛应用, 而振动圆二色谱在傅立叶变换红外光谱和量子化学计算的双重推动下, 最近几年才得到越来越广泛的应用. 与ECD相比, VCD的最大优势就是不需要分子中含有生色团(紫外吸收), 几乎所有手性分子都在红外区有吸收, 都会产生VCD谱图.
许多生物大分子都是手性分子。所谓手性就是具有不能重叠的三维镜像对应异构体。一般来说，凡具有手性的分子就具有旋光活性，这一点很早就认为人们所认识并广泛应用于研究分子的非对称性结构。振动方向在同一平面内的电磁波为平面偏振光。当一束平面偏光通过介质时，光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不同，其差值称为圆二色性。由于存在圆二色性，平面偏振光通过光学活性物质后，其两圆偏振光分量的强度将不同，它们合成的不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光。吸收随波长的变化构成圆二色谱。圆二色谱仪利用这一原理，将平面偏振光调制成左圆偏振光和右圆偏振光，并以很高的频率交替通过样品，这两束圆偏振光通过样品产生的吸收差由光电倍增管接收检测。 圆二色谱是快速确定蛋白质和肽二级结构的方法。在紫外区段主要的生色团是肽链，这一范围的圆二色谱包含着肽主链的构象信息。在近紫外区占支配地位的生色基团是芳香氨基酸侧链，这一区域的圆二色谱能给出局域侧链间相互作用的信息。在波长大于300nm 的区域，包括可见光区，对圆二色谱的贡献主要来自含有金属离子的一类生色团，这一波段的圆二色谱对于金属的氧化态、配位体以及链一链相互作用均较敏感。不含非氨基酸发色团的肽和蛋白质在300nm 以上没有吸收或圆二色谱带。 通常由样品圆二色谱形状、谱峰位置、强度以及它们随时验条件的变化本身就可以得到很重要的结构信息。最主要的圆二色谱参量是谱峰位置及该处摩尔椭圆率。酰胺基是用圆二色谱观察肽和蛋白质
的最重要的发色团。已确定它的两种电子迁移方式。n-π迁移通常很弱，在220nm附近呈一个负带。它的能量对氢键的形成敏感。π-π迁移一般较强，在192nm附近出现一个正带，在210nm附近出现一个负带。 а-螺旋、β-折叠构象和不规则构象的比例可用圆二色谱确定。а-螺旋构象的特征是常在222nm和208nm处出现负带，在192nm 处为一正带。短肽在溶液中通常不形成稳定的螺旋，但已表明加入2，2，2-三氟乙醇能使大多数肽的螺旋成分增加。如前文所述，与а-螺旋相比，β-折叠具有不确定性，可以平行或反平行方式形成，它的特征性圆二色谱是在216nm处有一负带，在接近195nm处，有一个相当大的正带。不规则构象的圆二色谱通常在200nm以下有一个较强的负带。 虽然圆二色谱分析不像X线衍射分析那样能给出比较全面的绝对信息，并且它总是必须与标准相比较和利用X线衍射的结果。但它对构象变化灵敏，因此通过圆二色谱的观察和分析可以灵敏地检测一些反应引起的构象变化，并进一步进行半定量测定。由于常规圆二色谱仪所检测的光谱范围一般在200nm以上，丢失了200nm以下的重要信息，因此从远圆二色谱上一般得不到精确的结果。近10多年来，随着同步辐射光的出现，圆二色谱区的扩展已经成为现实。现在，利用同步辐射光作为光源，可以把圆二色谱区拓展到110-130nm，实现了真空紫外圆二色。此外，磁圆二色与振动圆二色的发展可以用来探测普通光谱学无法分辨的分子的多重跃迁及某些分子激发态的
圆二色谱，判断黄酮类化合物绝对构型的重要手段1．简介：手性化合物的旋光性是化合物分子的立体构型的不对称性对平面偏振光的作用。若对组成平面偏振光的左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的吸收系数不同，即ε，这种性质称≠εR,L为手性化合物的圆二色性。当测定的仪器接收透过手性化合物溶液的平面偏振光时，记录的是手性化合物溶液对左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的吸收系数之差△ε，或化合物生色团吸收波长附近的摩尔椭圆度［θ］即可获得圆二色谱〔CD〕。 CD即圆二色谱，是以吸收系数之差或摩尔椭圆度［θ］为纵坐标，波长为横坐标记录的谱线，其中△ε=（d－d）／C×1，d和d为吸光度。C为溶液浓度，1为测定用池的RLRL池长；［θ］=ψ（λ）M／100LC其中ψ（λ）为所用测定池情况下的平面偏振光的椭圆度，C为溶液浓度，单位g/ml，1为池长，单位dm，M为分子量。它们之间的关系为［θ］=3300。1C·ε=θ/33 ×△ε，而△2．黄酮类： 多酚类是生物体内主要的二次代谢产物。根据他们的碳骨架能划分为几种主要种类。例如，黄酮类与酚酸类。黄酮类根据的氧化情况又可以分为许多种类。已知的黄酮类化合物中都具有的骨架形式，并常有羟基取代，甲氧基取代，苷化及其他修饰和组合。 虽然黄酮类化合物的绝对构型在50年代起已经通过旋光性和ORD方法进行解析了，但是更方便，更简易的CD谱方法却在60年代中期更为流行。CD谱现已广泛用于具有旋光性的黄酮类化合物的解析，如：二氢黄酮类，二氢黄酮醇类，黄烷-3-醇类，黄烷-4-醇类，黄烷-3，4-二醇类，黄烷类，异黄烷类，二氢异黄酮类，类鱼藤同类，前花色素类和各种类型的双黄酮类。3．二氢黄酮类 二氢黄酮类的两个结构特征在判定它们绝对构型时非常重要。一个是之间的单键，一个是位的手性中心，大多数天然二氢黄酮类化合物中在位具有苯基，其为α取向时，其绝对构型被定为S。 利用CD 或ORD连用NMR光谱数据判定二氢黄酮类化合物绝对构型始于Gaffield。 二氢黄酮类化合物的UV最大吸收在270----290处，320----330处有一弱峰，这是由于苯乙酮型和之间的相互转化产生的。八区律规则已经从判定α，β不饱和酮的手性及它们的长波CE图上扩展到了芳香酮。这样，二氢黄酮类化合物绝对构型为2S时，在构象上就具※吸收带n---π，并在CE谱上表现为正性的C2有杂环的P ----螺旋性和位芳基处于平伏键※---π吸收带。和负性的π※利用n---π吸收带判定构型的优点是这种转变在芳香环取代系统中是独立的。虽然n---※π转变处于长波区趋于随构型相反对映体量的增加而消失。杂环上的H与H之间的较大偶合常数（J）表明所有天然二氢黄酮类在热力学稳定3322，构象中C芳香基处于平伏键（fig2）。这说明所有左旋的二氢黄酮类具有2S构型。2 构型可以清楚的发现。B和二氢黄酮A二氢黄酮OBO---利用这个信息的例子在确定 ）（fig.3 and table14．二氢黄酮醇类 二氢黄酮醇类化合物中具有C2和C3两个手性中心，所以存在四种可能的立体异构体，（2R，3R）异构体在天然界中非常普遍，也有其他类异构体的相关报道。 判定二氢黄酮醇类的绝对构型分两步，第一步，通过NMR谱中H与H的偶合常数J232，C2和C3取代基的相对构型是反式或顺式。对于反式异构体，热力学稳定型构象为判定3H与H处于直立
一、实验目的 1. 圆二色性； 2. 圆二色光谱的原理与应用； 3. 圆二色光谱的相关拓展知识； 4. 圆二色光谱的实验技术与操作。 二、实验原理 圆二色性是手性分子在光学上表现的一种特性。光可视为振动方向与传播方向垂直的电磁横波。当光波的电矢量方向以一个固定的角速度以传播方向为轴心匀速旋转时，称之为圆偏振光。根据圆偏振光电矢量旋转方向的不同，可以将其区分为左圆偏振光和右圆偏振光。一束平面偏振光可以看成是由两个振幅和速度相同而螺旋前进方向相反的圆偏振光叠加而成（图1）。两圆偏振光彼此对映，互为镜像。当手性物质在偏振光的波长范围内存在吸收的时候，其对左右圆偏振光的吸收程度，也就是摩尔吸光系数，是不同的。此时不但偏振光的偏振平面将被旋转，构成该偏振光的左右圆偏振光的振幅也将不再相等。组成出射光的左右圆偏振光的电矢量和将沿一个椭圆轨迹移动，此时的出射光就是椭圆偏振光（图2）。这种光学现象就称为手性物质所具有的圆二色性。对于纯手性物质，其椭圆偏振光的椭圆度θ在特定溶剂、浓度、温度和光程下，在特定波长处为定值。同时，在特定波长处的椭圆度θ与在该波长处对左右圆偏振光的摩尔吸光系数之差(Δε)成正比。将θ或Δε对波长作图，即得到圆二色光谱。 图1 右圆偏振光(a)、左圆偏振光(b)及平面偏振光示意图，水平箭头表示光的传播方向。
图2 (a) 平面偏振光的圆组分；(b) 平面偏振光的旋转与圆组分；(c) 椭圆偏振光的旋转与圆组分被吸收的情况。其中，OB与OC分别表示右、左圆偏振光被吸收后的振幅，OD表示OB与OC的矢量和，θ表示椭圆偏振光的椭圆率角，tanθ= OE/OA″≈θ。 圆二色光谱的英文名称为Circular Dichroism，简称CD光谱。其光谱仪的基本测试原理是——通过入射圆偏振光的波长变化，测定手性样品的左圆偏振光和右圆偏振光摩尔消光系数之差Δε。由于CD光谱反映了光和分子间的能量交换，因而只能在有最大能量交换的共振波长范围内测。CD光谱可用于分析一般电子光谱所不能体现出来的能级跃迁的细节，是讨论手性化合物电子跃迁性质的重要表征手段。 当测试条件严格一致时，一对对映异构体的CD光谱呈镜像对称。通常采用光学纯的样品（即仅含单一对映体）进行CD光谱的测定，可由实验值θ根据浓度c、光程长l 求出该纯样的Δε。在严格相同的测试条件下，测定未知样品的CD光谱，可根据实验值求出未知样的Δε’ 。根据上述数据可估算未知样品的对映体过量值（Enantiomeric Excess，简称ee%）。当样品溶解性差、溶剂背景干扰、溶解过程中绝对构型发生变化时，固相CD光谱测试很有必要。通常对纯样进行CD光谱的测试，可在样品绝对构型与CD信号间建立关联。对同物质未知ee%值的样品，可通过CD光谱，简单判断其哪种对映体过量。此外，光谱还可结合其他结构表征手段用于关联确定手性化合物的绝对构型，或检测靶向分子与DNA等生物大分子的相互作用。