gfp蛋白吸收波长
摘要：
1.GFP 蛋白简介
2.GFP 蛋白的吸收波长
3.GFP 蛋白的应用
正文：
【1】GFP 蛋白简介
绿色荧光蛋白（GFP，Green Fluorescent Protein）是一种源自水母的荧光蛋白，具有在紫外光下吸收能量并在可见光下发射绿色荧光的特性。自1994 年被发现以来，GFP 蛋白被广泛应用于生物学研究领域，作为标记生物分子的一种手段，以便于研究人员对生物过程进行实时监测。
【2】GFP 蛋白的吸收波长
GFP 蛋白的吸收波长通常在395-400 纳米（nm）范围内，发射波长则在490-510 纳米范围内。这意味着当紫外光照射在GFP 蛋白上时，它会吸收这部分的光能量，并在可见光范围内发射出绿色荧光。
【3】GFP 蛋白的应用
GFP 蛋白在生物学研究中的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：
1.荧光显微镜下细胞内定位：通过将GFP 蛋白与目标分子融合，可以实现对目标分子在细胞内的实时定位和跟踪。
2.蛋白质互作研究：GFP 蛋白可以与其他蛋白质融合，用于研究蛋白质之间的相互作用和相互定位。
3.生物传感器：利用GFP 蛋白的荧光特性，可以构建生物传感器，对生物环境中的物理、化学因素进行实时监测。
4.转基因生物研究：将GFP 蛋白基因导入转基因生物中，可以通过检测荧光信号来判断转基因生物是否成功以及目的基因的表达情况。
总之，GFP 蛋白作为一种重要的荧光标记工具，在生物学研究领域发挥着不可替代的作用。
⏹人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色 770-622 nm 橙色 622~597 nm 黄色 597~577 nm 绿色 577~492 nm 蓝靛色 492～455nm 紫色 455～350nm ⏹常见显微镜滤光片的波长 在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。 红色滤光片G-2A Ex 510-560 DM 575 BA 590 绿色滤光片B-2A Ex 450-490 DM 505 BA 520 蓝色滤光片UV-2A Ex 330-380 DM 400 BA 420
其它荧光染料介绍 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2,Cy3,Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。 Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。 【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果
绿色荧光蛋白(GFP 的特性及其在分子生物学研究中 的应用 薛启汉 (江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所,南京210014 薛启汉:男,56岁,大学,研究员。 本综述系联合国教科文组织生物技术合作研究项目部分内容。收稿日 期:1997212202 摘要作为1种新型、方便的活性标记,来自水母的绿色荧光蛋白(GFP 正在多种原核和真核生物研究中应用。近来研究表明,GFP 具有很多理想的特性,适合用作普遍的报告标记,尤其适合于活体细胞或组织。譬如,GFP 在细胞中表达,在蓝光或紫外光照射下可以产生明亮的绿色荧光。而且,GFP 在细胞中呈自主性表达,没有细胞或位置表达的专一性,无需外源反应底物,无需进行细胞或组织的固定和渗透处理,使表达检测很方便。由于GFP 对光漂白、氧化剂、还原剂以及其它许多化学试剂具有极强的稳定性,因此,可用来监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。本文就GFP 的特性及其在分子生物学研究中的应用潜力,作一简要阐述。 关键词绿色荧光蛋白(GFP ;分子生物学中图法分类号Q 71 Character istics of the Green Fluorescen t Prote i n (GFP and Its Application i n M olecular B iology Research X U E Q ihan (Institu te of A g robiolog ica l Genetics and P hy siology ,J iang su A cad e my of A g ricu ltu ra l S ciences ,N anj ing 210014
实验报告 题目:单元四:重组蛋白的分离纯化及检测 指导老师:王磊 日期:2013/11/7-201311/9 一．实验目的： 1、学习亲和层析的原理； 2、掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作； 3、了解和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理； 4、掌握SDS-PAGE分离蛋白质组分的操作方法； 5、了解Western blotting的原理及其意义，掌握Western blotting的操作方法； 6、应用Western blotting 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上的重组蛋白。 二．实验原理： (1)亲和层析：以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，
这种方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 本实验用IPTG诱导表达的蛋白质GFPuv是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。 (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：由丙稀酰胺单体（acrylamide)和交联试剂N，N’－甲叉双丙稀酰胺（N,N-methylene bisacrylamide)在催化剂存在的情况下聚合而成的三维网状结构的凝胶，改变单体的浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径大小的凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：①化学聚合－催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），通常控制这两种溶液的用量使聚合在1h内完成；②光聚合－催化剂：核黄素，通过控制光照时间和强度可控制聚合时间。 聚丙烯酰胺凝胶电泳常分为两大类，一是连续电泳：使用相同孔径的凝胶和相同缓冲系统的样品缓冲液、凝胶缓冲液和电极缓冲液，pH值恒定，只是离子强度不同，具有电荷和分子筛效应；二是不连续电泳：使用不同孔径凝胶和不同缓冲系统的电泳，具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应，分离效果好，分辨率高。 SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)，一种阴离子表面活性剂，以一定比例与蛋白质结合，形成一种SDS－蛋白质复合物，带有大量负电荷，降低乃至消除蛋白质分子之间的电荷差别。 SDS和强还原剂的作用，可以使分子解聚，结构松散，形状趋于一致。 电泳迁移率的差别仅取决于蛋白质的分子量。 当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，以分离和鉴定纯化的蛋白产物。 （3）western blot：蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜）上；然后以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体和酶标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中培育，显出谱带，即可检测出样品中的特异组分。 三．材料和试剂 材料： 重组pGFPuv质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白； Ni 2＋chelating Sepharose Fast Flow 填料及层析柱。 试剂： (1)蛋白纯化所需试剂（溶液1－3全班共用） 1、1.5M咪唑（MW68.08 溶液全班共500ml (1组配置）） 2、0.5M EDTA溶液用NaOH调pH8.0，全班共300ml （2组配置） 3、20％乙醇溶液全班共1000ml （8组配置） （以下溶液每组配一份，可用母液稀释）： 4、超声和平衡缓冲液：50mMTris-HCl, 500mM NaCl, pH7.0 500mL 5、洗脱液I：50mM咪唑, 50mMTris-HCl, 500mM NaCl, pH7.0，75mL 6、洗脱液II：300mM咪唑(MW68.08), 50mMTris-HCl, 500mM NaCl, pH7.0，50mL
生物技术实验报告 姓名：张龙龙 学号：2011506066 班级：11级生技02班
前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水 母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二．实验原理 基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达 三.实验材料及仪器 1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21； 2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。 四.实验内容 4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定： 1)实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ； 酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸 DNA 染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T 4 lisase。 2)实验步骤： 质粒的提取与鉴定
gfp荧光蛋白发光原理 【原创实用版】 目录 1.GFP 荧光蛋白的概述 2.GFP 荧光蛋白的发光原理 3.GFP 荧光蛋白的应用领域 正文 一、GFP 荧光蛋白的概述 GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）是一种源自水母的荧光蛋白，具有在紫外光下吸收能量并在可见光下发射出绿色荧光的特性。自从 1962 年被科学家发现以来，GFP 已经成为生物学和生物医学研究领域的重要工具，被广泛应用于蛋白质表达、细胞追踪和生物成像等方面。 二、GFP 荧光蛋白的发光原理 GFP 荧光蛋白的发光原理主要基于其特殊的分子结构。GFP 蛋白由 20 个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基在空间上形成了一个特殊的结构，使得 GFP 蛋白具有荧光性质。 GFP 蛋白在紫外光的照射下，会吸收紫外光的能量，并使蛋白质分子 中的电子跃迁到激发态。在激发态下，电子会通过一系列的振动和旋转，最终回到基态。当电子回到基态时，多余的能量以光的形式释放出来，形成绿色荧光。 值得注意的是，GFP 荧光蛋白在不同的环境下，其发光强度和颜色可能会发生变化。为了提高 GFP 荧光蛋白的稳定性和发光效率，科学家们 通过基因工程技术，开发出了许多 GFP 的改进型，例如增强型 GFP（EGFP）、快速熒光蛋白（RFP）和黄色荧光蛋白（YFP）等。
三、GFP 荧光蛋白的应用领域 GFP 荧光蛋白及其改进型在生物学和生物医学研究领域具有广泛的应用。以下是 GFP 荧光蛋白的一些主要应用领域： 1.蛋白质表达：GFP 荧光蛋白可以作为融合蛋白的标签，用于检测蛋白质的表达水平和定位。 2.细胞追踪：通过将 GFP 荧光蛋白融合到细胞膜蛋白上，可以实现对细胞在活体状态下的实时追踪和成像。 3.生物成像：GFP 荧光蛋白在生物成像领域具有重要应用，可以用于实时监测细胞内的生物过程和信号传导。 4.药物筛选：GFP 荧光蛋白可以用作药物筛选的指标，通过检测荧光蛋白的活性变化，评估药物对蛋白质功能的影响。 总之，GFP 荧光蛋白作为一种具有独特发光特性的蛋白质，为生物学和生物医学研究提供了强大的工具。
绿色荧光蛋白（GFP）的研究史 先看一道试题： GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 （1）构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_______。 （2）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______。 答案：（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因（2）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达 解析：有关密码子，考生可从以下几方面把握： ①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。 ②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。 这是2023全国乙卷试题节选。以绿色荧光蛋白（GFP）为情景考查基因工程。 2019高中生物学必修二也提到了绿色荧光蛋白： 那么，什么是绿色荧光蛋白（GFP）？是如何发现的？ 绿色荧光蛋白（GFP）是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。近些年其被广泛应用
gfp蛋白序列 GFP蛋白序列是一种广泛用于生物学研究的荧光蛋白，具有多种应用价值。本文将介绍GFP蛋白序列的结构、功能和应用，并对其在科学研究中的意义进行探讨。 GFP蛋白序列是由238个氨基酸残基组成的多肽链，具有三个主要结构域：环状的β桶结构、α螺旋和β转角。其中，β桶结构是GFP蛋白的核心结构，是其荧光性质的基础。GFP蛋白的结构稳定，不易受到外界环境的影响，使其能够在许多生物体中稳定地表达。GFP蛋白的荧光性质使其成为生物学研究中广泛应用的工具。通过将GFP蛋白与其他蛋白或细胞器结合，可以实现对其定位、追踪和表达水平的研究。例如，研究人员可以通过将GFP蛋白与目标蛋白结合，观察其在细胞中的分布情况，从而揭示蛋白在细胞内的功能和调控机制。此外，GFP蛋白还可以作为报告基因在遗传转化研究中起到标记作用，帮助研究人员追踪和鉴定转基因生物。 GFP蛋白的应用不仅局限于细胞和生物体的研究，还可以在生物医学领域发挥重要作用。由于GFP蛋白的荧光性质稳定且不需要外部刺激，可以应用于体内活体显微成像。通过将GFP蛋白与特定的疾病标记物结合，可以实现对疾病相关细胞和组织的高分辨率成像，为疾病的早期诊断和治疗提供有力支持。 除了在科学研究中的应用，GFP蛋白还具有实际应用的潜力。例如，
GFP蛋白可以应用于环境监测中，通过将其引入到特定微生物中，实现对污染物的追踪和监测。此外，GFP蛋白还可以作为生物传感器，用于检测环境中的重金属离子、有机物和生物毒素等。 尽管GFP蛋白在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景，但也存在一些局限性。首先，GFP蛋白的荧光强度较低，不能满足某些高灵敏度检测的需求。其次，GFP蛋白的荧光波长在绿色区域，可能与其他标记物的波长重叠，造成信号干扰。此外，GFP蛋白的荧光性质受到温度、pH值等因素的影响，需要进行相应的优化和校正。GFP蛋白序列是一种重要的荧光蛋白，具有广泛的应用价值。通过对GFP蛋白序列的结构和功能的研究，我们可以更好地理解其在生物体内的作用机制，为生物学和医学研究提供有力支持。随着技术的不断发展和创新，相信GFP蛋白的应用前景将更加广阔，为生命科学的发展做出更大贡献。
egfp荧光蛋白激发波长 【原创实用版】 目录 1.EGFP 荧光蛋白简介 2.EGFP 荧光蛋白的激发波长 3.EGFP 荧光蛋白的应用领域 正文 1.EGFP 荧光蛋白简介 EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）是一种增强型绿色荧光蛋白，它是在原始的绿色荧光蛋白（GFP）基础上进行突变而得到的。相比于原始的 GFP，EGFP 具有更高的荧光强度、更快的熒光成熟速度以及更好的光稳定性。这使得 EGFP 成为了生物学研究领域中应用最为广泛的荧光蛋白之一。 2.EGFP 荧光蛋白的激发波长 EGFP 荧光蛋白的激发波长为 395-400 纳米（nm），这意味着当用395-400 纳米的光线照射 EGFP 时，它将被激发并发出荧光。而 EGFP 的荧光波长主要集中在 500-530 纳米，呈现出明亮的绿色。 3.EGFP 荧光蛋白的应用领域 由于 EGFP 具有诸多优点，使其在生物学研究领域具有广泛的应用。以下是一些典型的应用领域： （1）荧光显微镜下细胞内定位：通过将目标蛋白质与 EGFP 融合，可以实现在荧光显微镜下对蛋白质在细胞内的定位和动态观察。 （2）蛋白质互作研究：将目标蛋白质与 EGFP 融合后，可以利用共免疫沉淀等方法检测蛋白质之间的相互作用。
（3）细胞内信号传导研究：EGFP 可以作为信号分子的传感器，用于研究信号传导过程中蛋白质的激活和失活。 （4）基因表达调控：通过将 EGFP 与转录因子或启动子区域融合，可以实现对基因表达的实时监测。 （5）生物传感器：EGFP 可以与其他信号分子融合，构建成生物传感器，用于检测环境中的化学物质、物理因素等。 总之，EGFP 荧光蛋白因其优异的性能，成为了生物学研究领域不可或缺的工具。
DAPI 溶液染色说明书 华越洋 --------------------------------------------------------------- - 保存：-20℃避光保存。 说明： 华越洋的DAPI溶液(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)是一种能够与 DNA 中大部分 A，T 碱基相互结合的荧光染料﹐常用于荧光显微镜观测。因为 DAPI 可以透过完整的细胞膜﹐它可以用于活细胞和固定细胞的染色。当 DAPI 与双链 DNA 结合时，最大吸收波长为 358nm，最大发射波长为 461nm。DAPI 的发射光为蓝色，且 DAPI 和绿色荧光蛋白 GFP 或 Texas Red 染剂(红色荧光染剂)的发射波长仅有少部分重叠，可以利用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。 DAPI溶液，纯度≥90%，为即用型工作液，可以直接用于固定细胞或组织的细胞核染色。 使用方法：（仅供参考） 1，固定细胞或组织样品，经过固定后，适当洗涤除去固定剂。如果需要进行免疫荧光染色，可先进行免疫荧光染色，染完毕后再进行 DAPI 染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行 DAPI 染色。 2，对于贴壁细胞或组织切片，加入少量 DAPI 染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积 3 倍的染色液，混匀。 3，室温染色 5-10 分钟。 4，吸除 DAPI 染色液，用 TBST、PBS 或生理盐水洗涤 2-3 次，每次 3-5 分钟。 5，置于荧光显微镜下观察，激发波长 360-400nm。 DAPI 溶液注意事项： DAPI 被普遍认为具有致癌性，操作时应戴手套，并避免交叉污染。 本产品需避光，并尽量避免反复冻融。 荧光染料都存在淬灭问题，建议染色后尽量当天完成检测。 为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光衰减封片剂。
gfp荧光蛋白发光原理 GFP（Green Fluorescent Protein）是一种源自于海葵的荧光蛋白，因其独特的发光性质而被广泛应用于生物学研究领域。GFP的发现和研 究为科学家们提供了一种非常有用的工具，可以用来追踪和观察生物 体内的分子和细胞。 GFP的发光原理可以追溯到其分子结构。GFP由238个氨基酸组成，形成一个螺旋状的结构。在这个结构中，存在一个特殊的色氨酸残基（Trp-66），它被称为“光子转换器”。当GFP受到紫外线或蓝光的激 发时，色氨酸残基会吸收能量并进入激发态。然后，这些激发态的能 量会通过共振能量转移的方式传递给GFP分子中的另一个色氨酸残基（Tyr-66）。这个过程会导致Tyr-66残基发生氧化反应，产生一个高 能态的中间体。 在这个高能态的中间体中，Tyr-66残基会与GFP分子中的一个氨基酸残基（Glu-222）发生共价键的形成。这个共价键的形成会导致GFP 分子的结构发生变化，使得GFP从原来的非发光态转变为发光态。在 发光态下，GFP会发出绿色的荧光。 GFP的发光原理还与其环境有关。在GFP分子内部，存在一个环境敏感的氨基酸残基（Ser-65）。当GFP分子受到外界环境的影响时， 这个氨基酸残基会发生结构变化，从而影响GFP的发光性质。例如， 当GFP分子处于酸性环境中时，Ser-65残基会发生质子化反应，导致GFP的发光峰值发生红移。相反，当GFP分子处于碱性环境中时， Ser-65残基会发生去质子化反应，导致GFP的发光峰值发生蓝移。
GFP的发光原理不仅仅是一种有趣的现象，还具有广泛的应用价值。科学家们利用GFP的发光性质，可以将其与其他蛋白质或分子标记结合，从而实现对这些分子在生物体内的追踪和观察。通过将GFP与特 定的蛋白质或分子标记结合，科学家们可以研究细胞的生理过程、蛋 白质的定位和交互以及基因表达的调控等。此外，GFP还可以用于研 究疾病的发生机制和药物的研发。 总之，GFP荧光蛋白的发光原理是基于其分子结构和环境敏感性质的。通过对GFP的研究，科学家们可以更好地理解生物体内的分子和 细胞的行为，为生物学研究提供了强大的工具。随着对GFP的进一步 研究和应用，相信它将在更多领域展现出其巨大的潜力。
⏹人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm ⏹常见显微镜滤光片的波长 在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。 红色滤光片G-2A Ex 510-560 DM 575 BA 590 绿色滤光片B-2A Ex 450-490 DM 505 BA 520 蓝色滤光片UV-2A Ex 330-380 DM 400 BA 420
其它荧光染料介绍 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。 Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。 【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。 注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区
gfp激发光波长和发射光波长 GFP激发光波长和发射光波长：深入探究 引言 绿色荧光蛋白（GFP）是一种非常流行的荧光蛋白家族成员，自从1990年首次从水螅上分离出来以来，已经成为生物技术和分子生物学领域的研究热点。GFP 是一种蛋白质，能够在特定条件下发出特定颜色的荧光，广泛应用于荧光显微镜和融合蛋白质表达等领域。在使用GFP时，有两个重要的概念需要了解，即GFP 激发光波长和发射光波长。本文将介绍这两个概念的定义和相关背景知识，并探讨它们对GFP应用的影响。 第一部分：GFP的背景知识 GFP的背景知识我们不必过多赘述，因为它在分子生物学和生物技术领域已被广泛运用，但我们仍然需要介绍一下它的简要历史和结构。 GFP的简要历史 GFP最初是在1962年从海葵（Aequorea victoria）的触手中分离出来的。然而，由于当时在结构和化学组成方面的技术限制，GFP的分子结构和工作机制一度不为人们所知。
1990年，Martin Chalfie等人成功地将GFP引入到线虫（Caenorhabditis elegans）的基因表达研究中。随后，Douglas Prasher和Roger Tsien分别研究GFP的发射光波长和在其他生物系统中的应用。由于这些重要研究的贡献，GFP成为了分子生物学和生物技术领域的研究热点，并在2008年赢得了化学领域的诺贝尔奖。 GFP的结构 GFP是由一个238个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子结构的最重要特点是三个环状结构。这三个环状结构共同构成了GFP的一个色团（chromophore），这个色团是GFP能够发出荧光的根本原因，因此这个结构是研究GFP的重要关键之一。 值得一提的是，GFP虽然是从海葵中分离出来的，但它实际上是一种正常存在于海葵内的分子。海葵在需要发出荧光时，GFP就会在细胞中储存并释放出来，所以GFP对于海葵来说就像是一种反应器，而我们可以通过基因工程技术在其他生物体系中引入这个反应器，从而实现在生物学中的应用。 第二部分：GFP的光学性质 GFP的荧光性
荧光 一、定义 荧光（fluorescence ）又作“”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种的（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、原理 光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共振荧光。 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP） 在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白： （1）来源 绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为。 （2）性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67位残基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有
GFP的简介和应用LT
GFP及其变种分为7种，每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长)。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450~ 490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上，不像其他荧光素， 荧光容易淬灭。其中，GFP的一个引人注目的特点，其生色团的形成没有物种的特异性。可以在翻译后2~ 4h通过自动催化作用来合成。Cubitt 等认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此Kolb等提出一个假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。 1.3 GFP的荧光性质及应用优点 GFP的荧光性质比较特殊，具有诸多优点而备受关注。 （1）易于检测，灵敏度高。 GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次，即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的，在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。 （2）荧光性质稳定。
GFP对光漂白（一种荧光衰减现象）有较强的耐受性，能耐受长时间的光照，从而延长了可探测时间；GFP在pH7~ 12范围内也能正常发光，对高温（70 ℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。 （3）对细胞无毒害。 从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能没有影响，转化后细胞仍可连续传代。（4）构建载体方便。 由于编码GFP的基因序列很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。 （5）可直接用于活细胞测定。 GFP 是能在异源细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且GFP的分子量较小，N-端和C-端都能忍受蛋白的融合，是理想的标记物，可进行活细胞实时定位观察，更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态，还可实时观察到 外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助荧光显微镜观察，使研究更为方便。使用激光共聚
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达 背景知识 绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅 和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解 出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中 心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光 活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内 部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 . 实验一质粒DNA 的分离与纯化 一、实验目的 掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用 于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的 质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。 二、基本原理 质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到 200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地 整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多 数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制 10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白