超净台的规范使用
1.打开无菌工作台及净化室的紫外灯，消毒30min以上。
2.进入净化室前先关闭紫外灯，打开超净台风机，等待30min以上，以排尽臭氧。
3.穿好隔离衣，戴好口罩，帽子。
4.风淋2分钟。
5.75%酒精喷手上手套消毒
6.再超净台内的整个过程必须一直点燃着酒精灯；超净台内应避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。
7.打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。
8.水平式风机的超净台，应使瓶口斜置，应尽量避免瓶口敞开直立。
9.同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。
10.漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。
11.操作完毕后恢复工作台面，关闭风机。
2012.06.29
小鼠肾小管上皮细胞培养
基础培养液配置：
完全培养基的配置：基础培养基+胎牛血清+抗生素和链霉素
1.取两个灭菌平皿，一个加适量基础培养基，一个加适量基础培养基
2.试验小鼠最好禁食12小时，自由饮水。在细胞间外颈椎脱臼致死，75%酒精中
浸泡即可带进细胞间，75%酒精浸泡5min左右取出
3.以下步骤须在超净台操作。用镊子将小鼠拿出后放于干净托盘在超净台上（小鼠均腹部
向上以便肾脏取出）
4.用镊子和剪刀剪开肚皮，用另一镊子和剪刀取出肾脏放入盛有基础培养基的培养皿
5.用两个弯镊子剖肾筋膜，之后放于80目细胞筛（细胞筛浸有完全培养基的培养皿中），
肾脏用培养基浸湿后直接在细胞筛上研磨，直至磨至近白色即可弃去此筛
6.用150目细胞筛进行过滤（因肾小管段在范围为80—150目内所以150目筛上的是我们
所要的），此筛下放一平皿用来接过滤液即为废液（过滤时用移液枪操作）
7.另取一新培养皿，将150细胞筛反过来放在培养皿上，用移液枪吸取完全培养液将肾小
管段冲洗至培养皿中，尽量少用培养液
8.弃去细胞筛，将有肾小管段的培养液倒入15ml离心管1000r/min离心4min
9.弃上清，加等量胶原酶，37度温浴15min
10.1100r离心5min，弃上清
11.两只小鼠加36ml完全培养基，用移液器将肾小管段尽可能的吹散
12.细胞瓶中放5ml培养且细胞瓶盖不要拧紧以便细胞呼吸，六孔板中放2ml培养，24孔板
放100微升培养为佳。这是原代细胞培养。
2012.06.30下午
13.细胞传培养：
从对侧倒掉培养液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精灯。
如果细胞不干净可用什么液清洗(冲洗)，加入适量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，然后让其停止消化。
细胞培养所用试管洗涤方法
洗衣粉洗---冲净20遍---烘干---泡酸8h----自来水冲洗20遍----双蒸水2-3遍---烘干---包装高压
超净台的规范使用 1.打开无菌工作台及净化室的紫外灯，消毒30min以上。 2.进入净化室前先关闭紫外灯，打开超净台风机，等待30min以上，以排尽臭氧。 3.穿好隔离衣，戴好口罩，帽子。 4.风淋2分钟。 5.75%酒精喷手上手套消毒 6.再超净台内的整个过程必须一直点燃着酒精灯；超净台内应避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。 7.打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。 8.水平式风机的超净台，应使瓶口斜置，应尽量避免瓶口敞开直立。 9.同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。 10.漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。 11.操作完毕后恢复工作台面，关闭风机。 2012.06.29 小鼠肾小管上皮细胞培养 基础培养液配置： 完全培养基的配置：基础培养基+胎牛血清+抗生素和链霉素 1.取两个灭菌平皿，一个加适量基础培养基，一个加适量基础培养基 2.试验小鼠最好禁食12小时，自由饮水。在细胞间外颈椎脱臼致死，75%酒精中 浸泡即可带进细胞间，75%酒精浸泡5min左右取出 3.以下步骤须在超净台操作。用镊子将小鼠拿出后放于干净托盘在超净台上（小鼠均腹部 向上以便肾脏取出） 4.用镊子和剪刀剪开肚皮，用另一镊子和剪刀取出肾脏放入盛有基础培养基的培养皿 5.用两个弯镊子剖肾筋膜，之后放于80目细胞筛（细胞筛浸有完全培养基的培养皿中）， 肾脏用培养基浸湿后直接在细胞筛上研磨，直至磨至近白色即可弃去此筛 6.用150目细胞筛进行过滤（因肾小管段在范围为80—150目内所以150目筛上的是我们 所要的），此筛下放一平皿用来接过滤液即为废液（过滤时用移液枪操作） 7.另取一新培养皿，将150细胞筛反过来放在培养皿上，用移液枪吸取完全培养液将肾小 管段冲洗至培养皿中，尽量少用培养液 8.弃去细胞筛，将有肾小管段的培养液倒入15ml离心管1000r/min离心4min 9.弃上清，加等量胶原酶，37度温浴15min 10.1100r离心5min，弃上清 11.两只小鼠加36ml完全培养基，用移液器将肾小管段尽可能的吹散 12.细胞瓶中放5ml培养且细胞瓶盖不要拧紧以便细胞呼吸，六孔板中放2ml培养，24孔板 放100微升培养为佳。这是原代细胞培养。 2012.06.30下午 13.细胞传培养：
第八章肾脏的排泄功能 【习题】 一、名词解释： 1.肾小球滤过率 2.肾小球滤过分数 3.肾小球有效滤过压 4.肾小管重吸收 5.排泄 6.肾糖阈 7.球管平衡 8.水利尿 9.渗透性利尿 二、填空题 1.肾脏的结构和功能的单位是_____，它由_____和_____两部分组成。 2.供应肾单位血液的两套毛细血管网是_____和_____。 3.皮质肾单位的主要功能是_____和_____。 4.交感神经兴奋时，肾血管_____。 5.滤过分数是指_____与_____的比值。 6.Cl-在_____为主动重吸收。 7.在远曲小管和集合管，水的重吸收主要接受_____的调节。 8.肾小管和集合管有分泌_____，_____和_____的作用。 9.酸中毒时H＋的分泌_____，H+－Na+交换_____，K+－Na+交换_____，导致血K+_____。 10.血管升压素由下丘脑_____和_____分泌，并在_____释放入血。 11.血管升压素分泌的主要刺激是_____和_____的改变。 12.醛固酮由_____分泌，能促进远曲小管和集合管对_____的重吸收和对_____的排出。 13.醛固酮的分泌主要受_____和_____的调节。 14.肾小管上皮细胞分泌H＋过程中，需要_____的参加。 15.影响肾小球滤过的因素包括_____，_____，_____。 16.机体的排泄途径有_____，_____，_____和_____。 17.肾脏的主要功能有_____，_____和_____。 18.尿生成的基本步骤为_____，_____和_____。 19.肾小球有效滤过压＝_____。 20.糖尿病人的多尿属于_____利尿。 21.肾脏内与肾内分泌调节有关的感受器是_____和_____。 22.肾外髓部高渗梯度形成的主要原因是_____；内髓部高渗梯度形成则与_____和有关。 23.排尿反射的初级中枢在_____。 24.正常人动脉血压保持在_____范围时，肾血流量保持相对恒定。 25.排尿反射的传出神经是_____和_____。 26.水利尿时，引起血管升压素释放减少的感受器是_____。 27.尿液的浓缩主要是小管液在通过集合管时完成，其关键因素是_____和_____的作用。 28.交感神经兴奋时，膀胱逼尿肌_____，尿道内括约肌_____。
大鼠骨骼肌细胞培养 骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。 肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。 体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据. 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。瓶口消毒后室温待用。 取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。 无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、骨骼肌提取 眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。 吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。 将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。 轻轻摇匀，室温静置消化30分钟 收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。 轻轻吹打混匀组织块悬浮液。
正常人肾脏近球小管上皮细胞（RPTEC）的培养方法 拆装与贮存 1.检查所有容器是否漏液或破损。 2.对于冻存细胞：将细胞冷冻管从干冰中取出并迅速放入液氮中贮存。或者，解冻并立即 培养。 3.对于增殖细胞：用70%的乙醇或异丙醇擦洗盛有细胞的培养皿，将细胞培养皿置于培养 箱（如不特殊说明，均为37℃，5% CO2）中3到4个小时。细胞处于平衡状态后，除去运送时的培养基并更新。 4.Bulletkit?使用说明：送达后，在无自动除霜功能的冰箱中4-8℃下冷藏保存基础培养基， -20℃下冷冻保存SingleQuots?细胞生长因子。如送达后已经解冻，生长因子可在4℃下冷藏，并需要在72小时之内加入基础培养基中。加入基础培养基后，在一个月之内使用，不要再次冷冻。 5.ReagentPack TM传代试剂在运送前已经过无菌过滤在-20℃下保存。传代试剂在运送过程 中可能会解冻。可以进行一次再冷冻。如果在3天之内使用，可以在4℃下冷藏。 Trypsin/EDTA溶液的保存时间有限并会在4℃下活化。如果在送达之后出现解冻，立即分装并在-20℃下冷冻。建议HEPES缓冲液（以下简称HEPES）和Trypsin中和液不要在4℃下冷藏超过一个月。 注意：为保持解冻后的Trypsin/EDTA的新鲜和活性，可将其按20ml分装并置于消毒的离心管中，-20℃下再次冻存。 培养基的制备 1.用乙醇或异丙醇对所有的添加剂管瓶及装有培养基的试剂瓶消毒。 2.用移液管将全部的添加剂加入培养基中。 3.用培养基冲洗添加剂管瓶。对于每瓶添加剂，可能会有少量残存未被移取。少量的残存， 即使10%，也不会显著影响在含有添加剂培养基中的细胞生长。 4.将添加剂管瓶上的标签撕下并贴于培养基的试剂瓶上。以此记录每种添加剂加入的时间 和含量。建议将全部标签贴于培养基试剂瓶上（不要将培养基的批号及有效期覆盖）以避免混淆和重复添加。 细胞解冻/起始培养 1.RPTEC(Renal Proximal Tubule Epithelial Cell，肾脏近球小管上皮细胞)的建议接种密
铁、氧自由基与肾小管上皮细胞(一) 关键词：铁氧自由基肾小管上皮细胞铁，过渡态金属元素之一，外层轨道电子分布呈3d64s2，化学性质活泼，极易得失电子，产生高反应性氧自由基或铁氧、过铁氧复合物，导致组织损伤。正常情况下，体内的铁以血红素铁或非血红素铁等非反应态存在，但在急、慢性肾脏病变，尤其是伴发蛋白尿的临床和动物模型中可发现小管液及上皮细胞浆内博莱霉素敏感铁即具有催化活性的游离铁显著增加〔1〕，并且可积聚于肾近曲、远曲小管细胞的溶酶体中，偶见于线粒体内。铁的积聚与蛋白尿、肾小管间质病变、脂质过氧化、次全切除肾的肾小球滤过率、残余肾重量等病损程度直接相关〔1，2〕，铁负荷可增加缺血肾的损伤易感性〔3〕；而肾小管上皮细胞是铁介导的氧自由基损伤的主要部位，小管间质病变又是继发性肾单位毁损和慢性进展性肾功能衰竭的主要决定因素〔2〕。因此阐明铁、氧自由基、肾小管上皮细胞间的相互作用机制正受到日益重视。 一、铁代谢与肾小管上皮细胞 蛋白尿时，尿转铁蛋白排泄增多，转铁蛋白是铁的主要转运形式，相对分子质量为88000，球形，等电点5.2，与白蛋白(相对分子质量为65000，pI4.7)相比，其通过肾小球滤膜更多的是由膜孔的改变而不是受电荷屏障影响〔2〕。尿铁/尿转铁蛋白比例增高提示蛋白尿损害加重，铁的毒性作用与下列因素有关：铁的游离、Fe3+→Fe2+及用以生成·OH的H2O2或其他过氧化体。转铁蛋白结合铁或小管腔内解离铁(亦可来源于血红蛋白、肌红蛋白)可经位于基底膜侧的转铁蛋白受体或刷状缘胞饮作用进入肾小管细胞。一般认为，铁的解离与尿液pH 有关，当尿pH接近至6时，有催化活性的游离铁迅速增加，但尿液中铁螯合剂存在的浓度、种类，离子成分，可能存在的还原成分，使尿pH在＜6或＞6时，也能使铁游离〔4〕。尿中游离铁溶解度极低(＜10-6)，当pH＞4时，铁以羟氧化体和磷酸形成不溶性复合物存在，因此小管液中非转铁蛋白结合铁，必须与小分子物质如焦磷酸、ADP或柠檬酸(可能性更大)结合，增加铁的溶解度与反应性。值得注意的是，凡是可缓解肾功能恶化、改善组织学形态的方法，均可同时降低小管液铁，如血管紧张素转换酶抑制剂(如开博通与铁结合可降解O2-〔5〕)、铁缺失、甲状腺切除、限制饮食蛋白、限磷。 入胞后的铁大部分以铁蛋白、含铁血黄素形式积聚于溶酶体。胞浆内催化铁的来源途径可能有三：小管腔的重吸收、跨基底膜的摄取、原有细胞内铁储存池的释放。铁释放的因素包括：氧自由基，铁蛋白的动员(Fe3+→Fe2+)，细胞色素P450转换不足，后者可能是缺血再灌注损伤中额外铁、催化铁的重要来源〔6〕。其他来源包括：血红蛋白、线粒体中的细胞色素、过氧化氢酶、某些情况下肾外的血红蛋白、肌红蛋白、脱氢酶4Fc=4S簇等。 二、肾小管细胞的铁毒性作用机理 近曲小管细胞是铁介导的氧自由基损伤的主要部位铁对小管细胞的毒性作用取决于铁剂的剂量、接触时间、接触铁的类型、有无转运蛋白等〔7〕。10-4mol/L铁作用于小管细胞即可引起溶酶体铁积聚，各种细胞损伤，包括内质网扩张、线粒体变性、中间纤维增多、自嗜体鞘样结构增加、β1整合素亚基表达下调，损伤修复障碍，肌红蛋白尚有抗细胞增殖作用〔8〕。但目前对于哪个自由基触发和引起损伤、铁源性自由基产生部位和作用途径、导致细胞死亡的关键生化事件等尚有争议。 1.氧化损伤学说(oxidantstress)：在缺血、免疫、中毒性(包括肌注甘油后、肌红蛋白、顺铂、庆大霉素)肾病的临床和实验动物模型中，均发现氧自由基作用的直接和间接证据(脂质过氧化产物MDA)。铁通过催化Fenton/Haber-Weiss反应使O2逐步还原，依次形成O2-、H2O2、·OH。·OH的产生具有部位特异性，由于附着于刷状缘胞外膜磷脂的游离铁原位催化而来，且作用于小管腔中＜100nm的有效范围，去铁胺(DNA，deferoxamine)可阻断其通路，而只有到达该部位的·OH清除剂才能发挥作用；H2O2和O2-则分别可自由穿过胞膜及经离子通道出入细胞。自由基可直接作用于蛋白质、脂质、多糖、DNA，破坏生物大分子；同时
细胞培养实验指导陈轶霞刘俊林
实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。 注：(不写实验报告)
小鼠肾小管上皮细胞 小鼠肾小管上皮细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肾小管上皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肾小管上皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肾小管上皮细胞产品简介： 1、产品名称：小鼠肾小管上皮细胞（Mouse Renal Tubular Epithelial Cells） 2、组织来源：小鼠肾近曲小管组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠肾小管上皮细胞细胞简介： 小鼠肾小管上皮细胞分离自正常小鼠肾组织，细胞形态为上皮样铺路石状。肾小管上皮细胞主要功能： （1）肾小管上皮细胞重吸收原尿中几乎全部的葡萄糖和氨基酸。 （2）排泌非营养物质进入终尿。 （3）细胞能分泌炎症介质如细胞因子和趋化因子，通过产生IL-8 或直接趋化白细胞参与急性炎症反应。 （4）移植肾炎症和新月体肾炎中PTEpiC表达IL-2R alpha 和MHC-Ⅱ类抗原，
BMP7对TGFβ 1诱导人近端肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质分泌的影响
优秀毕业论文 精品参考文献资料英文缩略词表 a-SMA(a-smooth muscle actin) a一平滑肌肌动蛋白 BMP-7(bone moiphogenctic protein-7) 骨形态发生蛋白一7 Col I(type I collagen) I型胶原 DEPC(diethyl pyrocaeoonate) 焦碳酸二乙酯 E-cadhcrin B钙粘连素 ECM(extmcellular matrix) 细胞外基质 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 酶联免疫吸附实验 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition) 蚴胞·间充质转分化CrGF(connectivc tissue growth factor) 结缔组织生长因子 fN(h'bronectin) 纤维连接蛋白 HK-2(human renal proximal tubular epithelial cells) 人近端肾小管上皮细胞 MET(mesenehymal-to-epithclial transition) 间充质细胞．E皮细胞转化 MMP-2(malri metalloproteinase-2) 基质金属蛋白酶-2 MFB(myofibroblast) 肌成纤维细胞 MCP-l(monocyte chcmoatWactant protein-I) 单核细胞趋化蛋白．1 "IGF冯,(transforming growth factor一01) 转化生长因子B l Tm(mbmommrstitial fibrosis) 肾小管间质纤维化 TIMP-I(tissue inlu'bitor of the matri metalloproteinase-1) 组织基质金属蛋白酶抑制物．1 TEC(r砌tubular epithelial cell) 肾小管E皮细胞 PAI-1(plasminogen activator inlu'bitor-1) 纤溶酶原激活物抑制剂一1 PBS(phosphate buffered saline) 磷酸盐缓冲液 RT-PCR(reverse Iranscription-polymerase chain system) 反转录一聚合酶链式反 应SDS(sodium dodecyl sulphate) 十二烷基磺酸钠 I兀Jo(unilateral ureteral obstruction) 单侧输尿管梗阻 2
肾小管的常见病变有哪些？ ( l ）肾小管上皮细胞颗粒变性：光镜下各种染色均可显示小管上皮细胞肿胀，胞浆呈大小不一的颗粒状，管腔狭小，严重者部分细胞崩解。电镜下初期可见内质网肿胀，继而线粒体肿胀、囊状改变，甚至崩解，是肾脏缺血、中毒的早期可逆性病变。粗颗粒变性小管上皮细胞结构粗大，病变较重，除线粒体肿胀外尚有线粒体的崩解及融合。 ( 2 ）吸收性蛋白滴状变性或玻璃滴状变性：光镜下可见近端肾小管上皮细胞胞浆内遍布球状蛋白滴，直径为0 . 5 一2 um ，电镜下主要为电子密度较高的溶酶体。这是由于严重的蛋白尿导致近端小管异常回吸收所造成的，见于严重蛋白尿患者。 ( 3 ）肾小管上皮细胞空泡变性可分为以下类型： l ）细小空泡变性：光镜下可见上皮细胞肿胀，胞浆淡染并且遍布微小空泡。这些空泡可以是碳水化合物或糖原的沉积，也可以是脂类物质。电镜下可见很多的各级溶酶体、吞噬泡、脂滴。见于因过量输注高渗性液体而导致的渗透性肾病、先天性糖蓄积肾病，以及因缺氧、中毒和大量蛋白尿引起的肾小管上皮细胞脂肪变性。 2 ）粗大空泡变性：光镜下可见肾小管上皮细胞肿胀，胞浆内出现边界清晰的巨大空泡。电镜下可见界膜清晰的空泡，或由于细胞基底膜内折扩张造成。主要为细胞水盐代谢障碍所致。见于低钾血症和大量糖原沉积所致的l 肾损害。 3 ）等立方空泡变性：为最特征性的病变，空泡主要发生在近端小管段，空泡含液体而非脂质。此病变需与等渗性利尿剂造成的小管空泡变性相鉴别。 ( 4 ）肾小管上皮细胞融合：肾小管上皮细胞增生及融合可导致多核巨细胞形成，见于各种慢性损伤。 ( 5 ）肾小管上皮细胞内含铁血黄素沉积：患者尿内出现血红蛋白、肌红蛋白、胆色素时，由于肾小管上皮细胞的再吸收作用，胞浆内出现相应的血色素、肌红蛋白素、黑色素、胆色素等沉积。老年患者或长期慢性消耗性疾病患者的肾小管上皮细胞内可见脂褐素沉积。( 6 ）肾小管上皮细胞内包涵体：缺血和中毒可引起小管上皮细胞损害。光镜下缺血性小管上皮细胞损害散在分布，病变较轻，仅类及小管的某个节段。而病毒感染和铅、秘等重金属中毒性小管损伤则往往相反，病变范围广，累及大多数小管上皮细胞，肾小管上皮细胞可出现核内或胞浆内包涵体。 ( 7 ）肾小管上皮细胞的再生：细胞染色质深，常失去沿肾小管基底膜单层规整排列的特点，呈现大小不一、排列紊乱的形态。 ( 8 ）萎缩：小管萎缩的程度，常与间质纤维化的严重程度相平行。而各种肾小球疾病及间质性肾炎引起的肾小管萎缩，常伴有严重的纤维化及淋巴细胞、单核细胞浸润。来源：上海市医师协会资料提供，版权所有
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
肾小管上皮细胞病 *导读：肾小管上皮细胞主要功能，担负着对肾小球滤出的有用物质…… 1.肾小管上皮细胞功能 肾小管上皮细胞主要功能，担负着对肾小球滤出的有用物质，如水、Na+、Cl-、HCO3、葡萄糖、氨基酸的重吸收功能，同时还担负着对电解质与酸碱度的调节功能来维持体内的渗透压、电解质和酸碱度的平衡，促进体内物质代谢。 2.肾小管上皮细胞受损后的变化 (1)肾小管功能一旦受损，其重吸收与调节功能、浓缩功能都会受到影响，原发性肾小管损伤较少见，多数继发因素来自于肾小球，来自肾间质损伤，同时也来自于肾毒性药物和毒物损伤。 最突出的临床早期表现为夜尿增多、电解质紊乱与酸碱失衡。 如药物或细菌感染时则会表现出尿路炎症反应，血尿、细菌尿。临床上可通过病史和化验结果分析，做为鉴别诊断依据，如：肾小球损伤在先，而后漫延到肾小管功能损伤，多为原发性肾小球病变;如果肾小管功能损伤在先，同时伴有肾脏萎缩，多为慢性间质性肾损害。而间质性损害一定有原发病因的。如常见的急慢性肾盂肾炎，高尿酸血症，结缔组织病，药物性肾损害，毒物性肾损害等。 (2)肾小管上皮细胞受损后，分泌系列促炎症因子与促纤维化因
子，引起间质炎症反应，血管收缩加重肾缺血。 (3)在炎症反应与纤维化因子作用下易导致肾小管上皮细胞凋亡，肾小管萎缩、肾间质纤维化。 3.临床上常见的肾小管上皮细胞病 (1)慢性间质性肾炎 慢性间质性肾炎首先对肾小管上皮细胞损伤，其临床表现以肾小管浓缩功能受损造成的夜尿增多为早期表现(夜尿量24小时总 尿量的1/3)，尿比重降低，尿PH值异常，尿糖、少量蛋白尿、尿电解质异常，肾小管功能损伤表现，该类表现早于肾小球的滤过率降低。慢性间质性肾炎一定有原发病因，要仔细询问病史，找出原因，祛除病因。如慢性肾盂肾炎与下尿路感染等。 (2)以痛风肾或高尿酸血症形式发病的肾小管上皮细胞病 血清尿酸浓度达到或超过386.8umol/L(7mg/dl)时称高尿酸血症。当GFR≦25ml/min时，肾脏对尿酸的滤过率降低，就会出现高尿酸血症。 由于人体内对尿酸的代谢紊乱而导致高尿酸血症，部分病人尤其是青少年由于参与尿酸代谢的酶有遗传性缺陷而导致高尿酸血症。 还有部分病人患有骨髓瘤、白血病、其他恶性肿瘤、核酸分解亢进，促使尿酸急剧增加。 肾小管上皮细胞受损后，分泌与浓缩尿酸功能障碍，促使尿酸在肾小管局部聚集，尤其是在尿液呈酸性环境时，尿酸更易析出，
植物生理学实验指导 Prepared on 24 November 2020
植物生理学实验指导
目录
植物材料的采集、处理与保存 植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。 一、原始样品及平均样品的采取、处理 植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。 在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。 除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
肾小管重吸收与排泄 人两肾每天生成的肾小球滤过液达180L，而终尿仅为1.5L。这表明滤过液中约99%的水被肾小管和集合管重吸收，只有约1%被排出体外。不仅如此，滤过液中的葡萄糖已全部被肾小管重吸收回血；钠、尿素告示不同程度地重吸收；肌酐、尿酸和K+等还被肾小管分泌入管腔中。 泵。由于肾小管上皮细胞基侧膜
并释放能量提供其他物质的转运。许多物质的转运都与Na+的主动转运相耦联，例如小管液中的葡萄糖、氨基酸、有机酸和CI-等物质的重吸收都与Na+同向转运（cotransport）有关。同向转运是指两种物质与细胞膜上的同向转运体（cotransporter,symporter）特殊蛋白质结合，以相同方向通过细胞膜的转运；又如肾小管细胞分泌H+是与Na+的逆向转运相耦联。逆向转运（antiport）是指两种物质与细胞膜上的逆向转运体（antiport）又称交换体（exchanger）结合，以相反方向通过细胞膜的转运。可见，Na+的主动转运在肾小管上皮细胞的转运中起着关键作用（图8-9）。 一个带正电荷和一个带负电荷的两种物质的同向转动，或电荷相同的两种物质的逆向转运都不会造成小管内外电位改变，这种转运称为电中性转动。如果一个物质是离子，另一个是电中性物质，这种转运就会使小管内外出现电位差，称为生电性转运。如在近球小管，Na+与葡萄糖的同向转运，因葡萄糖是电中性物质，Na+和葡萄糖被重吸收就会造成小管外带负电位。又如在近球小管的后半段，小管液CI-浓度比管外高，CI-顺浓度差被动重吸收造成管内带正电位。 图8-9Na+转运与其他溶质转运之间的伴联关系 二、各段肾小管和集合管的转运功 （一）近端小管
肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤在肾间质纤维化中的作用及机制 [摘要] 目的探讨肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤在肾间质纤维化中的作用机制。方法 2015年6～12月期间，于本地动物实验中心选取60只健康雄性大鼠，根据处理方法的不同将其分为实验组和对照组，其中实验组行左侧输尿管结扎术，对照组则仅接受左侧输尿管游离，14 d后对两组大鼠的左侧肾脏中线粒体相关基因的表达情况、肾脏功能等参数进行检测分析。结果实验组大鼠术后14 d mtDNA（1.49±0.12）、NRF1（1.87±0.17）、PGC1a（1.76±0.21）、Drp1（2.49±0.24）、Mfn2（2.45±0.27）的表达水平均明显高于对照组（1.07±0.23、1.11±0.29、1.05±0.32、1.14±0.35、1.17±0.14），差异具有统计学意义（P<0.05）；术后14 d，实验组大鼠肾脏组织中的COX（2.61±0.27）明显高于对照组的（1.07±0.19），SOD较对照组明显降低（0.55±0.16 vs 1.07±0.18），其RIF指数（22.76±1.39）明显高于对照组的（0.81±0.16），差异具有统计学意义（P<0.05）。结论在肾间质纤维化中肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤发挥着十分重要的作用，缺氧所造成的线粒体氧化损伤会造成肾小管功能受损，引起大量致纤维因子的产生，并从多途径引起肾间质纤维化。
[关键词] 肾间质纤维化；肾小管上皮细胞；线粒体氧化损伤；肾小管功能 [中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）20-0032-03 [Abstract] Objective To discuss the effect and mechanism of mitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on renal interstitial fibrosis. Methods A total of 60 health male rats were selected from a local animal experimental center from June to December 2015 and divided into study group and control group. Rats in the study group were given left ureteral obstruction，while those in the control group were only given left ureteral mobilization. Parameters including the expression of genes in mitochondria and renal function of the left kidney were detected and analyzed after 14 days. Results At 14 d after surgery， the expression levels of mtDNA （1.49±0.12）， regenerating gene （1.87±0.17），interrupted gene（1.76±0.21）， and fusion gene（2.49±0.24， 2.45±0.27）in the study group were all significantly higher than those（1.07±0.23， 1.11±0.29，1.05±0.32， 1.14±0.35， and 1.17±0.14） in the control group（P<0.05）. The level of COX （2.61±0.27） in kidney
细胞复苏 细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，将无菌培养瓶，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。然后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。 将离心机调节至800rpm，5min。水浴箱调节至37度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约10ml细胞完全培养基放于15ml离心管中。 实验前备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。然后迅速将冻存管投入到已经预热到37度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 二、制备细胞悬液 以无菌枪头吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO的浓度，减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。 配平离心：采用天平配平两端，800rpm，室温离心5min。 三、细胞计数 采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入10ml CASY-ton至以标记viable的管子中，加入100ul细胞悬液，颠倒混匀三次，可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞2乘10的5次方. 四、细胞培养 离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。根据计数结果，向离心管内的细胞沉淀加入10ml细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液，吹打过程中尽量不要产生气泡。
细胞划痕 细胞划痕实验是指将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用枪头或其他硬物在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。其意义在于：价格低廉，操作简单，还有很重要的一点在于细胞外围环境简单、单纯，容易控制，是肿瘤细胞最基本的研究方法。 一、实验前准备 实验开始前，将离心管、吸管筒、移液枪、枪头，直尺等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。然后，采用通风机通风3min。 取出无菌6孔板，用黑色记号笔在6孔板底部，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过3条线。每条黑线的上下缘与划痕交叉点作为观察点，这样一方面便于观察另一方面可以一次取多个观察点，最终可以获得多个数据。 画好横线后，在板上分别做好标记。 取下试剂瓶和离心管上的封口膜，且将每个试剂瓶和离心管拧松，方便后续试验的操作。 二、细胞准备 取出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。加入1ml 胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入完全培养基终止消化。收集细胞悬液于15ml离心管中，800rpm/min室温离心5min。用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数，弃去上清，加入培养基重悬细胞。，以每孔1~4×105细胞的密度接种到6孔培养板上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养一天。具体数量因细胞种类不同而不同，掌握为过夜能铺满。 三、直线划痕 取出铺满六孔板的细胞，用200ul枪头垂直于细胞表面，由孔一端划向另一端。尽量垂直于背面的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈#字形划痕。
上皮-间充质转化（e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l transition, EMT ）在胚胎发育、伤口愈合、组织再生、器官纤维化和肿瘤转移过程中发挥关键作用[1-2]。很多证据表明，EMT 是肾小管间质纤维化（tubular interstitial fibrosis ，TIF ）的关键发病机制之一，借此肾小管上皮细胞从形态及功能上向肌纤维母细胞转化[3]。因此，肾脏中EMT 作为治疗靶目标之一是目前研究的热点[4]，全面了解EMT 的发生机制及在TIF 的作用，有利于临床提出有效的干预措施。本文综述了肾小管EMT 的研究现状，旨在加深对EMT 分子机制及EMT 在TIF 中作用的认识，从而为TIF 治疗措施的研究提供理论支持。 一、 EMT 概述 1. EMT 的定义：EMT 是指上皮细胞从形态和功能上转变为间充质细胞的过程。主要表现为：（1）细胞形态由典型的立方形转变为长梭形；（2）细胞上皮标志物如E 肾小管上皮-间充质转化的研究现状 李旭艳 谢院生 陈香美 【摘要】 肾小管间质纤维化（TIF ）几乎是所有慢性肾脏病进展至终末期肾病（ESRD ）的最终共同通路，肾小管上皮-间充质转化（EMT ）是TIF 的关键发病机制，成为目前肾脏领域研究的热点。本文旨在综述肾小管EMT 的研究现状，总结目前肾小管EMT 研究存在的问题及展望，为今后肾小管EMT 的研究以及TIF 的治疗提供新的思路。 【关键词】 肾小管； 上皮-间充质转化； 肾小管间质纤维化 Research status of tubular epithelial-mesenchymal transition LI Xu-yan, XIE Yuan-sheng, CHEN Xiang-mei. Department of Nephrology, Kidney Institute of Chinese People’s Liberation Army, State Key Laboratory of Kidney Disease, Chinese People’s Liberation Army General Hospital, Beijing 100853, China Corresponding author: XIE Yuan-sheng, Email: xieyuansn@https://www.doczj.com/doc/2417113923.html, 【Abstract 】 Renal tubular interstitial ? brosis (TIF) is the ? nal common pathway of a wide variety of chronic kidney diseases that eventually lead to end-stage renal disease (ESRD). Growing evidence has implicated tubular epithelial-mesenchymal transition (EMT) as a major pathway leading to TIF in diseased kidneys. Therefore, EMT has become the focus of research in kidney diseases. The purpose of this study is to review the status of renal tubular EMT. It also summarizes the remaining problems and prospects for future research to provide new clues for the study of tubular EMT as well as the treatment of TIF. 【Key words 】 Renal tubule; Epithelial-mesenchymal transition; Renal tubular interstitial ? brosis 钙粘蛋白和扣带蛋白等的表达丢失，细胞表达间充质标志物如α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和成纤维细胞特异性蛋白1等；（3）细胞获得迁移能力，可通过基底膜向间质内迁移，同时细胞外基质合成增加[1-3,5]。EMT 在胚胎发育、伤口愈合、组织再生、器官纤维化和肿瘤转移过程中均发挥关键作用[1-2]。 2. EMT 的分型：根据EMT 的作用及表达的生物标志物不同，将其分为3种亚型[6-7]：1型EMT 在胚胎发育过程中发生，如胚胎着床、原肠胚形成及神经嵴细胞的迁移等，是指原始上皮细胞转化为原始间充质细胞，参与中胚层的构成；2型EMT 是指第二级上皮细胞转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞，参与器官、组织的再生及纤维化过程；3型EMT 与肿瘤进展及转移相关，如上皮类癌细胞转化为易于转移及侵袭的肿瘤细胞，随血液或淋巴转移至远处，形成转移灶[1,6]。因此，1型EMT 产生的是原始间充质细胞，这些间充质细胞可发生MET 而转化为第二级上皮细胞，参与器官的发育；2型EMT 产生的是成纤维细胞或肌成纤维细胞，是机体对炎症、损伤等不利刺激做出的一种适应性反应，参与组织的修复与再生，但如果损伤持续存在，则最终导致器官损伤、组织纤维化；3型EMT 产生的是具有迁移、侵袭能力的肿 ?综述? DOI ：10．3877/cma ．j ．issn ．2095-3216．2013．02．010 基金项目：国家重大科学研究计划项目（2011CB944004）；国家自然科学基金面上项目（30971377） 作者单位：100853 北京，解放军总医院肾脏病科 全军肾脏病研究所 肾脏疾病国家重点实验室 通讯作者：谢院生，Email ：xieyuansn@https://www.doczj.com/doc/2417113923.html,