ClC-3氯通道蛋白磷酸化及其功能的研究进展
柏志全;李华荣;张海峰;朱林燕;王立伟;陈丽新
【摘要】ClC - 3 channel is one of voltage - gated chloride channels for chloride ion transmembrane, and participates in a variety of physiological and pathological processes, such as cell volume regulation, proliferation, migration, apoptosis, organic release and acidification of synaptic vesicle. The ClC -3 channel is controlled by many factors, including phosphorylation and dephosphorylation, to regulate the opening and closing. PKA( protein kinase A ), PKB, PKC and calcium calmodulin kinase Ⅱ are the key kinases in cell signal transduction pathway, which take part in the processes of ClC - 3 channel phosphorylation and regulate their functions. The study of ClC - 3 phosphorylation and functions are helpful to understand the importance of ClC - 3 in physiological and pathological processes and are premise to exploit the channel drugs for clinical therapy.%@@ 细胞容积调节广泛参与细胞的各种生理病理过程,如上皮细胞物质转运、物质代谢、细胞兴奋性、激素释放、细胞迁移、细胞增殖及细胞坏死凋亡等[1, 2].在低渗环境刺激下,容积激活性氯通道参与细胞容积调节,对维持细胞容积起着重要调节作用.
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2011(027)008
【总页数】5页(P1647-1651)
【关键词】ClC-3氯通道;磷酸化;信号转导通路
【作者】柏志全;李华荣;张海峰;朱林燕;王立伟;陈丽新
【作者单位】暨南大学医学院生理学系,广东,广州,510632;暨南大学医学院生理学系,广东,广州,510632;暨南大学医学院生理学系,广东,广州,510632;暨南大学医学院药理学系,广东,广州,510632;暨南大学医学院生理学系,广东,广州,510632;暨南大学医学院药理学系,广东,广州,510632
【正文语种】中文
【中图分类】Q7
细胞容积调节广泛参与细胞的各种生理病理过程，如上皮细胞物质转运、物质代谢、细胞兴奋性、激素释放、细胞迁移、细胞增殖及细胞坏死凋亡等［1，2］。在低
渗环境刺激下，容积激活性氯通道参与细胞容积调节，对维持细胞容积起着重要调节作用。目前，普遍认为容积激活性氯通道的候选蛋白是电压门控氯通道家族蛋白成员3［voltage－gated chloride channel(ClC)family protein 3，ClC－3］。ClC－3氯通道分布广泛，各种组织器官和细胞中都有表达，并且具有较高基础活性，通道开放，Cl－外流形成氯电流，参与细胞容积调节、介导物质跨膜转运、胞内有机物释放及突触囊泡酸化等过程。不同生理病理过程中，各种刺激信号通过各自的信号通路转导或者直接刺激氯通道，导致通道开放或者关闭，说明ClC－3氯通道门控特性是由多种机制参与调节。那么，研究ClC－3门控调节机制对理解其在多种生理病理过程的作用成为关键点。
磷酸化和去磷酸化是蛋白质功能调节的重要机制之一，通过磷酸化或去磷酸化使该蛋白激活或者失活从而影响其功能。研究发现，多种蛋白激酶参与了ClC－3氯通
道的开放或关闭过程。因此，探讨不同蛋白激酶对ClC－3氯通道的调节，从而推断其在不同生理病理过程中的作用具有重要意义。本文将讨论ClC－3氯通道相关蛋白激酶及其对ClC－3氯通道功能调节作用。
1 ClC－3氯通道及蛋白磷酸化
1.1 ClC－3氯通道 ClC－3氯通道蛋白是电压门控氯离子通道ClC家族成员之一，该蛋白与ClC－4及ClC－5两种氯离子转运体氨基酸序列相近。位于常染色体
4q33区的CLCN3基因，编码ClC－3蛋白，ClC－3氯通道有2种亚型:其一，Transcript variant e(NM_173872.2)翻译的ClC－3e蛋白全长866个氨基酸;其二，Transcript variant b(NM_001829.2)翻译的ClC－3b蛋白全长818个氨基酸，ClC－3b在羧基末端较ClC－3e少48个氨基酸。
ClC－3由Sasaki等［3］在大鼠肾脏克隆并鉴定，随后研究发现该蛋白分布广泛，在不同种属的不同组织器官和细胞都有表达。ClC－3蛋白不仅分布在细胞膜上，
同时在胞浆和细胞核内都有分布［4，5］。对其通道特性、生理功能研究时发现ClC－3氯通道可以调节细胞多种功能，参与到各种生理病理过程中，其开放或关
闭受多种因素调节，如氯离子浓度、渗透压、pH、膜电位、ATP、钙离子及蛋白
激酶等。其中，已发现可以影响通道开放关闭的蛋白激酶如PKA (protein kinase A)、PKB、PKC等是各种信号通路中的关键蛋白激酶，可磷酸化下游蛋白使其行
使功能。不同刺激信号作用细胞后通过第二信使或第三信使激活这些蛋白激酶，它们通过对ClC－3氯通道的磷酸化影响其功能，如cAMP→PKA→ClC－3。因此，ClC－3氯通道在不同生理病理过程中的功能受多种信号通路调节控制。
1.2 蛋白质磷酸化可逆性磷酸化是蛋白质功能调节的重要机制，蛋白激酶和磷酸
酶通过磷酸化或去磷酸化调节蛋白质功能，参与调控细胞信号转导、基因转录翻译、细胞周期等过程。细胞生命关键活动都有蛋白激酶介导磷酸化修饰参与，其中蛋白质可逆性磷酸化是细胞信号转导的重要方式。
真核生物蛋白质的磷酸化位点主要是丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸残基，而原核生物蛋白质磷酸化多发生在组氨酸、精氨酸和赖氨酸残基。一种蛋白质可能存在多个磷酸化位点并受多种蛋白激酶和磷酸酶调控，因此对蛋白质磷酸化研究就比较复杂。蛋白质磷酸化研究包括磷酸化类型、磷酸化位点预测及鉴定、磷酸化定量分析、磷酸化功能研究、磷酸化调控信号通路研究等。
2 ClC－3氯通道磷酸化及其功能
ClC－3氯通道在低渗环境下被激活，通道开放，参与细胞多种生理调节过程，在
细胞容积调节中具有重要作用。多年研究发现，不仅低渗可以激活ClC－3氯通道，其它多种胞内或胞外刺激信号都可以使通道开放或者关闭。这些信号如何激活或关闭ClC－3氯通道是多年来的研究热点。以下将主要讨论磷酸化对通道开关的影响及其意义。
2.1 PKA信号通路 ClC－3、ClC－4和ClC－5属于ClC家族同一分支，ClC－5
首次从大鼠脑克隆并鉴定，其80%氨基酸序列与ClC－3相同，并证实有PKA的
磷酸化位点，然而人为提高细胞内cAMP浓度对其电流特性没有影响［6］。PKA 激动剂forskolin可以明显激活小鼠睾丸细管中未成熟足细胞TM4的氯电流，其
抑制剂H－89则能消除1，25(OH)2－D3激活的氯电流［7］。Nagasaki等［8］较为详细研究了胞内cAMP对ClC－3的作用，结果显示8－BrcAMP可以抑制豚鼠心肌细胞低渗激活ClC－3电流;异丙肾上腺素在无钙条件下可以减低ClC－3电流;高表达ClC－3氯通道的NIH/3T3细胞，8－BrcAMP可抑制ClC－3电流，其效应可被PKA拮抗剂KT5720和ClC－3突变(S51A)阻断，提示cAMP通过PKA 磷酸化S51(PKC磷酸化位点)位丝氨酸抑制ClC－3电流。但PKA是否确实通过磷酸化S51而影响ClC－3通道还有待于进一步证实，其主要原因有两点:第一，cAMP对ClC－5没有影响;其二，研究发现某些ClC－3突变体可以降低对氯离子通透性，其特性同ClC－5对氯离子的转运相似［9］，由此可推断该突变点附近
可能存在PKA磷酸化位点。
G蛋白偶联受体→cAMP→PKA信号转导通路是经典激素信号转导通路，ClC－3
通道可能是PKA效应蛋白之一。正如上文所述异丙肾上腺素作用于肾上腺受体后，激活腺苷酸环化酶导致cAMP浓度升高，活化的PKA磷酸化ClC－3通道影响细
胞功能。cAMP→PKA信号转导通路不仅影响ClC－3通道，同时也影响其它阳离子通道如钾离子通道［10，11］，共同调节细胞容积维持内环境稳态。
2.2 Akt(PKB)信号通路磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，
PI3K)家族参与多种信号通路，该酶可使磷脂酰肌醇的3位磷酸化而生成PI－(3，4)P2和PI－(3，4，5)P3。其中，IA型PI3K磷酸化磷脂酰肌醇形成的磷脂酰肌
醇三磷酸酯(phosphatidylinositol 3，4，5－trisphosphate，PIP3)可调节下游Akt/PKB活性，该信号通路与肿瘤发生发展密切相关而备受关注［12，13］。活
化的Akt/PKB通过磷酸化下游许多靶蛋白如GSK－3β、Bad、caspase－9、NF
－κB、CREB、p21Cip1和p27Kip1等，调节细胞多种活动如迁移、增殖和分化等。
ClC－3氯通道参与细胞多种功能，研究发现其在细胞迁移过程中具有重要作用。Wnt通路是介导细胞迁移的主要信号通路，其中GSK－3β是该信号转导通路中关键蛋白激酶，GSK－3β同样也是Akt/ PKB信号通路的下游蛋白［14］，那么
ClC－3氯通道是否作为这些信号通路的最终效应蛋白从而影响细胞迁移。目前没
有直接证据说明PKB和GSK－3β影响ClC－3氯通道的报道。Tang等［15，16］在研究内皮素对大鼠基底血管平滑肌增殖时发现，利用siRNA干扰阻断ClC－3
表达后，PKB和GSK－3β的磷酸化程度明显减弱。该结果可推测ClC－3氯通道
可能是PKB或GSK－3β信号通路中的参与者。因此，细胞外刺激信号是否通过PKB或GSK－3β信号通路影响ClC－3氯通道从而调节细胞功能还有待于进一步
证实。
2.3 PKC信号通路 1994年，Kawasaki等［17］从大鼠脑神经元克隆出ClC－3基因，研究发现活化的PKC可以抑制ClC－3氯通道。此后，科学家对PKC调节ClC－3氯通道功能进行了大量研究。目前对于PKC调节ClC－3氯通道有两种相反的观点，一种是PKC抑制ClC－3氯通道开放，一种是PKC激活ClC－3氯通道。Du等［18］研究犬科动物心房肌细胞容积激活性氯通道时发现活化的PKC 可以激活ClC－3通道，其研究结果同PKC抑制兔心房肌细胞ClC－3通道相反，认为这是由于种属差异引起的。Gong等［19］在研究PKC对小鼠心室肌细胞容积激活性氯通道影响中得出的结论与上述Du等［18］研究结果相同，即活化的PKC可以激活ClC－3通道。目前，多数实验数据提示活化的PKC抑制ClC－3，如Duan等［20］、Boese等［21］、Do等［22］等科学家研究结果表明PKC 抑制ClC－3。
PKC通过磷酸化ClC－3氯通道起调节作用，那么就需要确定其磷酸化位点。Duan等［20］利用位点突变技术，发现51位丝氨酸可能是PKC磷酸化作用位点，其它科学家利用膜片钳技术研究了51位丝氨酸突变体ClC－3电流特性，发现PKC不能抑制突变体ClC－3。该研究小组的Rossow等［23］利用缺失突变技术研究了ClC－3氨基末端前100个氨基酸对通道门控影响，发现缺失型ClC－3氯通道对PKC没有反应，而胞内透析磷酸化片段肽(氨基末端12－61位序列)可以明显抑制缺失型ClC－3氯通道电流。这些实验结果说明51位丝氨酸是PKC磷酸化作用潜在位点。
PKC参与的信号通路对生物体影响广泛，在膜离子转运、机体代谢、基因表达、细胞分化和增殖等起重要调节作用［24］。PKC受多种第二信使调节，并且有多达12种同工酶，这就注定以PKC为中心的信号通路十分复杂。ClC－3氯通道作为PKC下游的一种效应蛋白，可能受不同信号通路和不同亚型PKC调节，所以就不难理解PKC对ClC－3氯通道调节具有显著差异。
2.4 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶 II(calcium calmodulin kinase II，CaMKII)信号通路钙离子具有十分重要的生理意义，不仅可做为第二信使参与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶等信号通路转导，同时可作为某些蛋白的直接调节因子起作用，如参与肌纤维细胞收缩、囊泡分泌等。钙/钙调蛋白可激活信号通路下游多种效应物如
质膜和肌浆网钙通道、钙调蛋白依赖性蛋白激酶、磷酸化酶激酶、环化酶、NO合酶等，各种活化的效应物质又可作用于下游的效应蛋白，共同调节细胞各种生理病理过程。信号通路中关键激酶CaMKII的底物谱非常广泛，研究证实该激酶可以磷酸化ClC－3通道蛋白［25，26］。
Robinson等［27］对CaMKII调节ClC－3进行了较系统的研究，对tsA、T84、HT29以及平滑肌细胞研究发现:CaMKII可以激活ClC－3通道，氨基末端109位丝氨酸可能是CaMKII调控ClC－3通道的作用位点。血小板激活因子(platelet－activating factor，PAF)参与炎症介质引起的肠损伤，Claud等［28］发现PAF
对肠上皮细胞具有直接病理作用，PAF可激活ClC－3氯通道引起细胞内酸化继而细胞发生凋亡，PAF激活的氯电流可被钙螯合剂或CaMKII抑制剂阻断，说明
PAF介导的细胞凋亡是通过CaMKII激活ClC－3氯通道导致细胞内酸化而引起。ClC－3氯通道蛋白不仅分布在细胞膜上，同时在胞浆和细胞核内都有分布，那么ClC－3蛋白是如何在细胞内移动。Huang等［25］在研究 CaMKII对ClC－3作用时发现，提高细胞内钙离子浓度可以促使ClC－3从胞浆向胞膜移位。目前，钙和CaMKII对ClC－3的调节机制研究还不清楚，尚待进一步研究。
2.5 SGK信号通路血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serum and glucocorticoid－regulated kinase，SGK)是Ser/Thr蛋白激酶，作为多种细胞信号转导通路和细
胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点，可通过影响钠、钾离子跨膜转运调节多种细胞容积、细胞增殖等，其对快速转录水平的调节具有重要作用［29，30］。此
外 Wang等［31］报道 SGK能间接激活ClC－3氯通道从而调节细胞容积。
3 小结
增殖、分化、凋亡、迁移、分泌等细胞行为过程中都有细胞容积改变，而参与细胞容积调节过程具有多种因素如钠离子、钾离子、钙离子、氯离子、细胞骨架蛋白等。容积激活性氯通道ClC－3调节氯离子跨膜转运，对细胞容积调节具有重要作用。细胞容积不断变化但处于相对稳定状态，而细胞在接受内外刺激信号后，如何通过ClC－3调节细胞容积以适应内外环境是研究其容积调节作用的关键内容。多年研
究证实多种内外刺激信号可通过不同信号通路激活的蛋白激酶磷酸化ClC－3影响其功能。因此，研究不同蛋白激酶对ClC－3功能影响并寻找其作用位点，针对这些作用位点开发药物从而阻断某一信号通路干预细胞特定行为，对于研究和治疗包括高血压、心脏病、肿瘤等多种疾病具有参考意义。
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龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/2819348047.html, 钙激活氯离子通道研究进展 作者：谢瑞芳 来源：《中国科技博览》2019年第10期 [摘要]钙激活氯离子（CaCCs）是参与多样的重要的生理学进程的细胞质膜蛋白。在上皮细胞中，CaCC的活性调节Cl-和其他阴离子的分泌，例如碳酸氢盐和硫氰酸盐。在平滑肌和 神经系统的可兴奋细胞中，CaCCs是连接细胞内Ca2+和膜去极化兴奋的一个重要角色。最近的研究表明TMEM16A（跨膜蛋白16A或者ANO1）和TEMEM16B（跨膜蛋白16B或者ANO2）是CaCC形成蛋白。本文通过介绍氯离子的种类以及钙激活氯离子通道参与的不同生理活动而对其有一个全面的了解。 [关键词]钙激活氯离子通道；TMEM16A；TEMEM16B；阴离子 中图分类号：TP747 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）10-0306-01 1氯离子通道的种类 氯离子和其他阴离子的离子通道是细胞里的关键蛋白，涉及到许多生理活动。例如细胞容积调节。然而他们的分子身份仅仅有部分是已知的。许多年前，大部分基于膜片钳技术的研究报道了以不同于生物物理学的性能，管理机制和药理学敏感性为特点的氯离子通道的存在。激活机制包括通过细胞外配体，细胞内Ca离子浓度升高，cAMP依赖性信号通路磷酸化作用。这些通路的一部分在分子水平上已经被确定：囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）作为上皮细胞的cAMP活化通道，γ-氨基丁酸和甘氨酸活化抑制突触的促离子型受体，CLC-1在骨骼肌，肾脏和内耳的CLC-Ka和CLC-Kb和无所不在的CLC-2。其他Cl离子通道种类的特性是未知的且有很大争议。 2上皮细胞中的CaCC 氯离子通道在上皮细胞中具有非常重要的作用，用于分泌或吸收所需的基本电解质和水。CaCC是特别的包括通过外分泌腺和其他上皮分泌氯离子。分泌的机制位于顶端和基底外侧膜极化上皮细胞是基于具体协调各种膜蛋白的活性。基本模型假设通过激活布美他尼敏感的Cl-在细胞内积累Na+/K+/2Cl-（NKCC）协同转运蛋白，利用由Na+/K+-ATPase产生的Na+梯度以介导跨基底外侧膜的氯离子摄取。因此，氯离子的平衡电位变为比静息膜电位更积极，因此有利通过位于顶端的通道的出口。 3平滑肌中的CaCCs
ClC-3氯通道蛋白磷酸化及其功能的研究进展 柏志全;李华荣;张海峰;朱林燕;王立伟;陈丽新 【摘要】ClC - 3 channel is one of voltage - gated chloride channels for chloride ion transmembrane, and participates in a variety of physiological and pathological processes, such as cell volume regulation, proliferation, migration, apoptosis, organic release and acidification of synaptic vesicle. The ClC -3 channel is controlled by many factors, including phosphorylation and dephosphorylation, to regulate the opening and closing. PKA( protein kinase A ), PKB, PKC and calcium calmodulin kinase Ⅱ are the key kinases in cell signal transduction pathway, which take part in the processes of ClC - 3 channel phosphorylation and regulate their functions. The study of ClC - 3 phosphorylation and functions are helpful to understand the importance of ClC - 3 in physiological and pathological processes and are premise to exploit the channel drugs for clinical therapy.%@@ 细胞容积调节广泛参与细胞的各种生理病理过程,如上皮细胞物质转运、物质代谢、细胞兴奋性、激素释放、细胞迁移、细胞增殖及细胞坏死凋亡等[1, 2].在低渗环境刺激下,容积激活性氯通道参与细胞容积调节,对维持细胞容积起着重要调节作用. 【期刊名称】《中国病理生理杂志》 【年(卷),期】2011(027)008 【总页数】5页(P1647-1651)
论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展 病毒所梁晓声200628012415030 细胞信号传导过程中磷酸酶/磷酸激酶对蛋白磷酸化程度的调控控制了细胞信号传递与否，信号强度等等细胞信号传导的过程从某种程度上说就是信号传导相关分子磷酸化水平的调节过程。 磷酸酶/磷酸激酶作为胞内信号直接或间接的靶酶通过磷酸化程度控制其它酶类或蛋白质的活性，一般情况下被磷酸化的酶有活性，脱磷酸后的酶没有活性。通过这种方式可以在不改变细胞内酶或相关蛋白的浓度的情况下将部分酶活冻结或解冻。在有外界信号刺激的时候可以迅速解冻酶活而不必合成新的酶。 由于酶反应具有高度专一性，使得蛋白质磷酸化与去磷酸化这种方式在胞内介导胞外信号时具有专一应答的特点。这就使得细胞信号传导途径的上游成分只能针对一个或几个的下游成分起作用,使信号传递具有很强的专一性。同时对信号的灭活也不会由于识别的错误而影响其他信号传导途径。 磷酸化与去磷酸化在细胞对外界信号的持续反应中具有重要的作用。信号引起的细胞生理学效应中，有许多是相当持久的，如细胞的分裂、分化等。虽然胞内信号分子的寿命可以很短，但蛋白激酶一旦激活，其活性却可以通过某些方式（如自身磷酸化）维持较长时间；更重要的是被它磷酸化所调节的蛋白质和酶类，其效应可以维持更长时间，直到被蛋白磷酸酶脱磷酸化为止。 蛋白磷酸化对外界信号具有放大作用，由于是酶促反应，一个酶分子可以催化成百上千个底物分子，即使只有很弱的胞外信号也可以通过酶促反应得到充分的放大。 蛋白质激酶 蛋白质激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨基酸残基的特异性，将这些激酶分为4类。其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为250-300个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的，并认为它们有共同的祖先。因此，它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是，这些序列表现为一组组高度保守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有11种这类高度保守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名，从最N-端的I开始,到最C-端的XI。对这些酶的结晶进行X-射线结构分析，发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为，亚域I,II和VII在结合ATP中起重要作用；而亚域VIII则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说，在亚域VIII中，紧靠关键模体上游的氨基酸残基有十分有趣的差异，它们是-KWTAPE- 或-KWMAPE-，看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。 蛋白磷酸酯酶 丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶，选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性。主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C等。 酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)分胞质型(非受体型)和受体型(PTPR)
氯离子通道药理学特征分析 氯离子转运通常被认为是阴离子转运的代表，其转运形式及转运通道 蛋白的状态对细胞的活性来说显得尤为重要。深受研究者的注重1，细胞体积和内环境稳态的调节对氯离子转运起着决定性作用。其内环境 条件包含了诸多形式的调节，如：电生理调节、膜上离子及物质转运、胞内体积及酸碱性（pH值）调节等。从功能上看，Cl-Ionchannel(氯 离子通道)在很大水准上影响了细胞的功能，如：细胞的免疫应答、细 胞增殖与分化都有氯离子通道的参与，现阶段很多研究发现，细胞的 凋亡（Apoptosis）与氯离子通道存有很多相互依存关系。氯离子膜通 道的功能与特性直接影响细胞的活性状态，更进一步推动我们对疾病 的生理及病理发生发展的全过程的了解。很多膜上蛋白通道参与细胞 的电压门控等功能活动。研究表明,人类骨骼肌ClC家族区域对阴离子 选择性传导通道结构有较大贡献2，所有的氯通道蛋白的ClC家族成员在相对应的阴离子通道上都包含一个相对保守的模序GKxGPxxH.3Cl-的跨膜转运是非常重要的生理功能之一，在生物体内，Cl-的数量相对较多，广泛存有于原、真核生物细胞及卵母细胞上的一种阴离子通道上，近几年来，相关的通道基因表达及分布功能研究都在一定水准上取得 了重大突破性进展。其中在卵母细胞中，组氨酸残基37是野生型M2 离子通道起始激活的主要因素之一4，在细胞膜上，阴离子通道是允许阴离子顺电化学梯度被动扩散的蛋白通道，因为Cl-在生物体内数量较多，分布广泛，其通透性作用最佳。大量的生物物理学研究发现，在 很多蛋白通道中，都存有具有特征性的门控现象3，就通道本身来说，Cl-通道主要是电压门控通道，主要有细胞肿胀依赖性、信号分子偶联性、相关离子依赖性、胞内多种蛋白激酶磷酸化依赖性以及ATP的水 解反应相偶联等诸多特性。 从电生理角度看，Cl-通道平衡电位与静息电位相似，其功能与K+通 道相类似，抑制细胞的兴奋性，同时促动去极化后复极，进而维持细 胞静息膜电位。在胞膜及胞内细胞器上的Cl-通道的功能主要表现为电转运和物质转运，尤其在神经和肌肉细胞的细胞膜上，Cl-电流是参与
昆虫谷氨酸门控氯离子通道研究进展 昆虫谷氨酸门控氯离子通道是昆虫神经元信号传导的关键组成部分。该通道通过门控 机制调节氯离子的通透性，从而调节神经元的兴奋性和抑制性。随着分子生物学和生物物 理学研究的深入，对昆虫谷氨酸门控氯离子通道机制的认识也不断深化。本文将从结构、 功能及其调控等方面综述该通道相关研究进展。 一、通道结构 目前已揭示的昆虫谷氨酸门控氯离子通道结构分为两类：GluCls和pLGICs。GluCls 是一类典型的带有谷氨酸门控结构的离子通道蛋白，它们是Cys-loop离子通道家族的一员，包括抗草酸蝗草蛉、布氏酵母果蝇、黄盘蚊和美洲锥虫等。pLGICs是另一类类似口感受器的离子通道蛋白，它们是谷氨酸门控离子通道的变异品种，包括黄素受体和甘氨酸受体 等。 以抗草酸蝗草蛉的GluCls为例，其通道的亚基组成为五个，每个亚基包含N末端细胞外区、三个跨膜区和一个C末端胞内区。N末端细胞外区存在一个抑制性谷氨酸协同位点，细胞外环状区域与细胞内区域在跨膜区之间紧密相连。C末端胞内区存在一个磷酸化位点 和许多拓扑结构域（如螺旋状纽带、阳离子环）。 二、通道功能 昆虫谷氨酸门控氯离子通道的通道功能主要分为两类：兴奋性和抑制性。它们都能够 形成氯离子通道，但不同的是，兴奋性氯离子通道在谷氨酸的存在下被激活，从而引起兴 奋性电流的增加；而抑制性氯离子通道则是在γ-氨基丁酸（GABA）的存在下被激活，从而引起抑制性电流的增加。 三、通道调控 昆虫谷氨酸门控氯离子通道的调控机制主要包括三个方面：药理调节、磷酸化与蛋白 质相互作用。其中，药理调节是通道调控的主要手段，包括谷氨酸及其类似物、GABA及其类似物、氟乙酸乙酯等药物。 磷酸化是一种广泛存在于细胞中的调控方式，通过直接或间接改变蛋白质相互作用来 调节蛋白质活性。研究表明，抗草酸蝗草蛉的GluCls通道可以通过C末端胞内区的磷酸化而获得附加的调控能力。经实验证明，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和蛋白激酶A（PKA）等激酶的作用可以磷酸化GluCls通道的C末端胞内区，并进一步影响通道的开放和关闭状态。
氯离子通道异常引发的肌强直(一) 【摘要】细胞膜离子通道结构和功能正常是细胞进行生理活动的基础。钠、钾离子通道在肌肉收缩中的作用一直受人关注。最近的研究表明，氯离子通道在肌肉收缩中也占有很重要的地位，甚至比钠、钾通道更具有决定性的意义。 【关键词】肌强直；CLC；突变 骨骼肌的收缩的整个生理过程是以膜的电位变化为特征的兴奋过程和以肌丝滑动为基础的收缩过程，不同的离子通道共同完成这一过程(兴奋-收缩偶联)。肌强直是因为离子通道的功能异常而导致的一种疾病。它的特征是突发自主收缩后肌肉松弛延缓。这是因为离子通道的功能障碍影响了细胞膜的静息电位，从而使骨骼肌纤维浆膜过度兴奋，造成了动作电位的重复产生。 由两种基因独立编码的电压门控氯离子通道和钠离子通道的突变是形成单纯遗传性肌强直的基础。氯离子通道和钠离子通道对细胞膜的作用是相反的：氯离子通道主要是抑制细胞膜的兴奋，稳定静息电位，而钠离子通道主要是兴奋细胞膜，使之产生动作电位〔1〕。 事实上，肌强直的诱发原因是多样的：一方面可以是氯离子通道失去性功能突变降低了氯离子的电导；另一方面，也可以是钠离子通道获得性功能突变导致的多余的离子通道的开放。本文仅就氯离子通道异常所引发的肌强直做一总结论述。 1 CLC氯通道 氯离子在体内含量极为丰富多种细胞存在氯离子浓度梯度。CLC是氯通道家族的一大类，Mw 约75～110kU, 均有12个跨膜区和相同的离子选择顺序(Cl->Br->I-) 及较低的单位电导值。 CLC基因存在于几乎所有的生物体中，在哺乳动物中发现了9种CLC同源体。根据它们简单的序列将CLC通道分成三组，其中CLC-0、CLC-1、CLC-Ka和CLC-Kb属于细胞跨膜通道，其他两组可能构成细胞膜内的通道〔2〕。氯离子通道在功能和结构上与其他离子通道有很大不同，它独一无二的结构特征是双筒型构造〔3〕，CLC可能是由两种完全相同但是相互独立的protopore构成，它们能在开放一段时间后不约而同的关闭。最近的克隆CLC实验证明，这种双筒构造实际上是同源蛋白的两种形态的分化传导通路〔4〕。相比而言，钠通道是一种蛋白四聚体，四个亚单位沿中央的孔道对称分布，其中每个亚单位在其中行使相同的功能，通道直接垂直于细胞膜表面。而氯离子通道没有这种对称性，既不垂直于膜也不弯曲于膜内。一种更远的关于不对称的推测是一些在空间上相互接近但是在蛋白质一级结构上相隔甚远的区域构成了孔道。这种特殊的构造决定了它在细胞活动中的特殊地位和作用。CLC氯离子通道和其他常规通道的不同点是在通透和门控上的相互影响。阴离子的通透需要通道的开放，这个通透过程又反馈性的调节通道的开放〔5〕。
氯离子通道研究进展 刘雅妮;张会然;赵晨;黄东阳;杜雨薇;张海林 【摘要】氯离子是体内最重要最丰富的阴离子，它进出细胞的过程，除了与氯离子相关的一些转运体主动转运有关外，经过阴离子通道进行转运是重要方式之一。氯离子通道组织分布广泛，参与了众多的生理过程：包括细胞体积的调节、膜电位的稳定性调节、信号转导以及跨上皮运输等。该文重点综述了钙激活氯通道和容积调节氯通道的生理功能及分子基础，简单介绍了电压门控氯通道、囊性纤维跨膜电导转运体及配体门控氯通道。%Chloride is the most abundant anion in all organisms. Chloride channel,besides some active transporters,is one of the important pathways which allow chloride to go through the cell membrane. Chloride channels are probably present in every cell,from bacteria to mammals. Their physiological tasks include but not limited to cell volume regulation,stabilization of the membrane potential,signal transduction and transepithelial transporting. This review focus on the physiological functions and molecular identity of calcium activated chloride channels and volume regulated chloride channels,and also review briefly on voltage gated chloride channels, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and ligand gated chloride channels. 【期刊名称】《神经药理学报》 【年(卷),期】2015(005)004 【总页数】10页(P33-42)
钙激活氯通道与哮喘黏液过度分泌及气道炎症的关系 姜轶飞;沈华浩 【摘要】@@ 哮喘的一个重要特征是杯状细胞增生和黏液过度分泌,大量黏液难以清除引起小气道阻塞并导致气道高反应性,急性哮喘死亡患者尸检显示大小气道均有杯状细胞增生和黏液过度分泌,这种黏液过度分泌导致的气道阻塞是重症哮喘主要死因之一,有研究证实黏液过度分泌是第1秒用力呼气容积(FEV1)下降加速的独立危险因素[1]. 【期刊名称】《中国病理生理杂志》 【年(卷),期】2010(026)009 【总页数】4页(P1863-1866) 【关键词】钙激活氯通道;小鼠;哮喘 【作者】姜轶飞;沈华浩 【作者单位】浙江省嘉兴市第二医院呼吸科,浙江,嘉兴,314000;浙江大学医学院附属第二医院呼吸科,浙江,杭州,310009 【正文语种】中文 【中图分类】R562.2+5 哮喘的一个重要特征是杯状细胞增生和黏液过度分泌，大量黏液难以清除引起小气道阻塞并导致气道高反应性，急性哮喘死亡患者尸检显示大小气道均有杯状细胞增生和黏液过度分泌，这种黏液过度分泌导致的气道阻塞是重症哮喘主要死因之一，
有研究证实黏液过度分泌是第1秒用力呼气容积(FEV1)下降加速的独立危险因素［1］。一直以来黏蛋白(mucin，MUC)基因被认为是哮喘患者中调控杯状细胞黏液分泌的主要基因，但近年来一个新的基因－钙激活氯离子通道基因在哮喘黏液分泌中的作用逐渐被人们认识，进一步的研究还发现其与哮喘的气道炎症形成有相关性。抑制该基因调控的钙激活氯离子通道不仅能控制哮喘的黏液分泌还能抑制血管旁气道组织炎症。现在有大量文献通过描述该基因的表达来反映气道杯状细胞的黏液高分泌状态，该基因与哮喘致病性的相关研究也取得了很大进展，但也有研究从不同角度指出不同观点。本文简要介绍钙激活氯离子通道的结构和特点，及该通道与哮喘黏液分泌和气道炎症的相关性和一些最新研究进展。 1 钙激活氯离子通道的结构和特点 氯离子是体内含量最大的负离子，氯离子通道是指分布于细胞膜和细胞器质膜上的一种跨膜蛋白，一般是由几个结构域组成的多次跨膜结构，对氯离子和其它阴离子如碘离子(iodide ion，I－)、硝酸根离子(nitrate ion，NO3－)、硫氰酸根离子(thiocyanate ion，SCN－)、氟离子(fluoride ion，F－)有通透性，有时运转其它阴离子反而更有效。按照氯离子通道开启关闭的调节因素差异可分为以下几类:电压门控氯通道家族、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophostate，cAMP)/蛋白激酶A激活的氯通道、钙激活氯通道、容量调节氯通道、配体激活氯通道和细胞内氯通道家族。它参与细胞的电荷和离子传输，有调节pH值、细胞容量大小、细胞兴奋性和细胞发育凋亡的功能。 钙激活氯通道(calcium－activated chloride channels，CaCC;或 chloride channels，calcium activated，CLCA)广泛分布于自然界各种生物中，在人体和小鼠的多种组织中介导钙离子来激活氯通道，由国际基因命名系统(international system for gene nomencalture，ISGN)命名，是一个近年来发现的新的蛋白家族。目前这一家族在6个哺乳动物中有15个成员［2］，其中bCLCA1和
《生物化学》课程论文 姓名：曹SS 学号：11310300SS 专业：SS教育 成绩： SS学院生命科学学院 2015年 1 月 1 日 文献综述 蛋白质结构与功能的研究进展 学生：曹SS 指导老师：杜SS 【摘要】人类基因组计划即将完成。虽然基因组的序列作为信息库拥有大量的、重要的生物信息资源，但并不是基因本身,而是基因组所编码的蛋白质才能够直接参与和指导绝大多数的生物学过程。毫无疑问，只有阐明蛋白质的作用机理，才能够真正理解基因的功能。蛋白质结构与功能关系的揭示将有助于人类对于如生殖、发育、疾病等生命活动的基本机理的了解。同时，将对于人类疾病的防治和药物的发明具有重要的指导意义。 【关键词】蛋白质；结构；功能 1.引言 在人类进人21世纪新纪元之际,生命科学也迎来一个崭新的时代,即“后基因组时代(Post一genome era)”。在这一时代中,生命科学的中心任务是揭示基因组及其所包含的全部基因的功能,并在此基础上阐明遗传、发育、进化、功能调控等基本生物学问题,以及进一步解决与医学、环境保护、农业密切相关的问题。由于基因的功能最终总是通过其表达产物—蛋白质来实现的,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质分子上来。现已知道,以蛋白质为主体的生物大分子的功能主要决定于它们的三维结构,所以也有人认为当代生物学研究已经进人了“结构基因组时代(structural genomics era)”。目前,我们还不可能只用基因组DNA 的一维序列去确定生命活动的机理(mechanism)和途径(path-way),也难以仅用基因的信息去解释疾病发生与发展的分子机理。显然,在人类基因组之后的时代,在有关生命活动整合知识的指导下,以蛋白质及其复合物、组装体为主体的生物大分子的精细三维结构及其在分子、亚细胞、细胞和整体水平上的生物学功能的研究是生命科学的重大前沿课题,也是当前生物学领域中最具有挑战性的任务之一,在后基因组时代生物学发展中处于战略性的关键地位。因此,在从现在到今后的5到15年中,我国在重点基础研究发展的战略性规划中,不失时机地组织精干的结构生物学研究队伍,开展对重要功能基因表达产物—蛋白质及其复合物、组装体的结构与功能的研究具有重要的科学意义,是推动我国生物学研究在21世纪生物学领域占据一席之地的必要措施[1]。 另外，以蛋白质为主体的生物大分子及其复合物和组装体三维结构与功能关系研究是生命科学各分支学科深人发展的基础。蛋白质为主体的生物大分子及其复合物的精细三维结构信息是探索各种生命活动的分子机理的基础。几乎每一个重要生物大分子及其复合物高分辨率结构的阐明都揭示了一项基本的结构一功能相关机理。例如,钾离子通道复合体晶体结构[2]、T 细胞受体及其复合体晶体结构[3,4]、ATP酶F1晶体结构[5]、核小体晶体结构[6]、核糖体晶体结构[7]以及乙肝病毒核壳电镜结构[8]等研究结果已为其所在研究领域带来了巨大的突破。以下是近几年来几种蛋白质结构与功能的研究的几个事例。 2 蛋白质结构与功能的研究进展
ClC-3基因敲除不影响心肌细胞肿胀激活性氯通道的PKC敏 感性 龚卫琴;臧益民;王晓明;李源;Takahiro Shimizu;Yasunobu Okada 【期刊名称】《第四军医大学学报》 【年(卷),期】2004(025)011 【摘要】目的:探讨小鼠心室肌细胞肿胀激活性氯(VSOR Cl-)通道的蛋白激酶C (PKC)敏感性是否受ClC-3的影响.方法:采用基因打靶、RT-PCR、膜片钳全细胞记录技术分别获得ClC-3基因敲除小鼠(Clcn3-/-)、验证心肌ClC-3 mRNA表达、及记录VSOR Cl-电流.结果:①低渗条件下1μmol/L佛波酯(PMA)明显增大VSOR Cl-电流;②等渗条件下PMA-预处理不影响基础电流,随后低渗刺激性VSOR Cl-电流激活时程明显缩短;③PMA对VSOR Cl-电流的增强作用在野生型和Clcn3-/-小鼠无明显区别;④10 μmol/L白屈菜红硷(CHE)-预处理明显抑制低渗激活性VSOR Cl-电流,并消除PMA-后处理对VSOR Cl-通道的上调作用.结论:小鼠心室肌细胞VSOR Cl-通道激活主要依赖于内源性PKC活性,VSOR Cl-通道的PKC依赖性不受ClC-3的影响. 【总页数】5页(P982-986) 【作者】龚卫琴;臧益民;王晓明;李源;Takahiro Shimizu;Yasunobu Okada 【作者单位】第四军医大学,西京医院老年病科,陕西,西安,710033;第四军医大学,基础部生理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学,西京医院老年病科,陕西,西安,710033;第四军医大学,西京医院老年病科,陕西,西安,710033;Department of Cell Physiology,National Institute for Physiological Sciences,Okazaki
敲低 IK1钾通道抑制 ClC－3氯通道的表达和功能 邹丽莉;叶东;吕瑞玲;汪源;孙晓雪;朱林燕;陈丽新;王立伟 【摘要】目的：探讨ClC－3氯通道是否为IK1钾通道的调节靶点，重点研究鼻咽癌细胞IK1钾通道对ClC－3氯通道功能及蛋白表达的影响。方法：采用siRNA 转染技术抑制低分化鼻咽癌上皮细胞（ CNE－2Z） IK1基因的表达；real－time PCR技术检测ClC－3 mRNA的表达；Western blot检测ClC－3的蛋白表达；细胞免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术检测ClC－3和IK1蛋白在细胞内分布；全细胞膜片钳记录细胞氯电流。结果：IK1 siRNA可以成功转染CNE－2Z细胞，有效抑制鼻咽癌细胞IK1钾离子通道的表达；用IK1 siRNA抑制鼻咽癌细胞IK1钾离子通道的表达后， ClC－3的mRNA表达上调而ClC－3蛋白却表达减少：在低分化鼻咽癌上皮细胞，低渗刺激可激活氯通道，产生一个较大的氯电流，在成功转染IK1 siRNA的细胞，此氯电流明显减弱。结论：敲低IK1钾离子通道可抑制ClC－3氯离子通道的表达和功能。%[ ABSTRACT] AIM:To investigate whether the ClC-3 chloride channel is an acting target of the IK 1 potassium channel, and to study the action of IK1 potassium channel on the functional activities and expression of ClC-3 chloride channels.METHODS: IK1 gene was silenced by IK1 siRNA in poorly-differentiated nasopharyngeal carcinoma cells (CNE-2Z).Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression of ClC-3 at mRNA and protein levels.The distribution of ClC-3 protein in the cells was observed under confocal immunofluorescence microscope .The chloride current was recorded by the patch-clamp technique.RESULTS: IK1 siRNA was successfully transfected into the CNE-2Z cells and knocked down the
沉默 ClC-3氯通道基因对 HeLa 细胞周期分布的影响 叶东;邢德刚;曾志;陈丽新;王立伟 【期刊名称】《中国病理生理杂志》 【年(卷),期】2017(033)002 【摘要】目的：探讨沉默HeLa细胞的ClC-3氯通道基因后细胞周期分布的变化 及其作用机制。方法：依照siRNA设计原则构建沉默ClC-3基因的ClC-3 siRNA 并转染HeLa细胞；实验分为空白对照组（ control组）、转染试剂对照组 （ Lipo组）、阴性对照组（ negative siRNA组）和ClC-3 siRNA组。采用 real-time PCR检测ClC-3 siRNA的沉默效率；流式细胞术检测细胞周期分布情况；Western blot检测ClC-3蛋白及相关细胞周期蛋白（ cyclin ） D1、细胞周 期蛋白依赖激酶（cyclin-dependent kinase， CDK）4、CDK6、P21和P27等表达。结果：ClC-3 siRNA成功沉默HeLa细胞的ClC-3基因。和其它组相比，ClC-3 siRNA组的细胞周期被阻抑在G0／G1期。ClC-3 siRNA组的cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达水平明显下降，P21和P27蛋白表达水平明显上升。结论：沉默HeLa细胞ClC-3氯通道基因可影响cyclin D1、CDK4、CDK6、P21和27蛋白的表达水平，阻抑HeLa细胞周期停滞在G0／G1期。 【总页数】6页(P257-262) 【作者】叶东;邢德刚;曾志;陈丽新;王立伟 【作者单位】广东药科大学基础学院生理学系，广东广州510006;广东药科大学 基础学院生理学系，广东广州510006;广东药科大学基础学院生理学系，广东广
1泛素连接酶Cullin3的研究进展 李衍辉1，梁雅灵2，徐勇1* [摘要]泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-protesome system,UPS）是蛋白质翻译后修饰的重要调控途径，是生物体内最主要的蛋白质选择性降解方式。Cullin3以支架蛋白的形式通过跟具有BTB结构域的接头蛋白结合共同构成E3泛素连接酶复合体，特异性识别底物并介导底物蛋白的泛素化，可负性调控NF-κB,Nrf2在内的多条信号通路。最近研究发现，Cul3功能失调后将导致恶性肿瘤、高血压高血钾、糖尿病的发生。 [关键词]：Cullin蛋白质；泛素化；肿瘤；糖尿病 Research progress of Cullin3 ligases Li Yanhui1,liang Yaling2,Xu Yong1* 1:Department of Endocrinology,Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou,Sichuan 646000 [中图分类号]Q51；R7 [Abstract] The ubiquitin-protesome system is an important regulation pathway for post-translation modification and the main way of selective protein degradation in organism.Cullin3,as a scaffolding protein,constitutes the E3 ubiquitin ligase complex with containing the BTB domain protein in the Ubiqutination,Which has substrates specificity and negatively regulates singal ways,such as NF-κB and Nrf2.Recently studies have revealed dysregulation of Cul3 is related to malignant tumour、diabetes、hypertension and hypekalemia . Key words:Cullin proteins、Ubiquitination、Tumor、Diabetes 作者介绍：李衍辉，硕士研究生，Email：980402868@https://www.doczj.com/doc/2819348047.html,， 研究方向：糖尿病肾病。 通信作者：徐勇，教授，Email：xywyll@https://www.doczj.com/doc/2819348047.html,。 基金项目：四川省国际合作项目（14GH0003）.
心脏ClC-3容积感受性氯离子通道研究进展 作者：薄冰 来源：《科技资讯》 2014年第15期 薄冰 (河南大学体育学院运动人体科学教研室河南开封 475000) 摘要:本文对于ClC-3容积感受性氯离子通道在心血管疾病中的作用进行综述,该通道在心肌细胞容积稳定、心肌缺血再灌注、心肌肥厚及心力衰竭等状态下的电生理活动中发挥重要作用,并为多种心律失常的机制探讨及治疗提供理论依据。 关键词:ClC-3氯离子通道心脏细胞容积电生理 中图分类号:R541 文献标积码:A 文章编号:1672- 3791(2014)05(c)-0223-02 ClC-3是ClC电压门控氯离子(Cl-)通道基因家族成员之一[1],1994年,Kawasaki等[2]首 次应用聚合酶链反应技术在大鼠肾脏中克隆出ClC-3 cDNA,该基因可表达生成一种生物学及药 理学特性与心肌容积感受性氯离子通道(volume-regulated Cl- channels,VRCCs)一致的外向整流Cl-通道,随后的相关实验也证实ClC-3基因是构成心肌细胞容积感受性氯离子电流(ICl,vol)的主要分子结构基础[3～5]。应用ClC-3基因敲除小鼠(Clcn3-/-)的研究发现,Clcn3-/-小鼠心脏中VRCCs的特性发生明显变化,除ClC-3外的一些膜蛋白也发生了明显的变化。Xiong等[6] 对心脏ClC-3基因敲除小鼠研究发现,组成内源性VRCCs的ClC-3基因表达出现时间依赖性失活现象,并累及心脏功能。因此,本文将就ClC-3型Cl-通道在心脏功能活动中作用的近期研究进 行综述,为进一步探讨该通道在心肌缺血/再灌注、心肌肥大及心力衰竭等病理状态下的作用提 供理论依据。 1 ClC-3氯离子通道与细胞容积稳定 细胞容积的急性增加可引起容积下降调节(regulatory volume decrease, RVD)机制的产生并引导细胞回归至正常体积,以防止细胞结构及功能的完整性遭受破坏。由ClC-3构成的内源性VRCCs在多种病理生理状态下细胞容积的调节中发挥重要作用[7～8]。研究发现,在心室肌细胞上,细胞肿胀可诱发一种不依赖时间和电压的电流,此电流对SITS、DIDS、NPPB敏感,但不被9-AC和NPPB阻断,其激活不依赖细胞内钙,对PKA的阻断剂也不敏感。1992年,Sorota[9]对犬心 房细胞上的一种对渗透压敏感的电流进行测量,发现胞外渗透压由293 mosm/kg降至221 mosm/kg时可产生这种电流,在心房肌细胞体积增加12%时,或当细胞的低渗而致肿胀时,可诱发 一种具有外向整流特性的电流,该通道的主要作用就是通过引发RVD而维持细胞容积的动态稳定。ICl,vol广泛表达于不同动物心脏中的几乎所有部位,在心房肌细胞中通道的密度较心室肌细胞 中的高,并且在人的心房和心室肌细胞中也有表达。生理条件下,ICl,vol可能承担力传导与容 积调节的中介作用,从而在牵拉和容积刺激下对心肌功能活动的调节中发挥重要作用。 2 ClC-3氯离子通道与缺血预适应诱导的心肌保护 缺血预适应(ischemic preconditioning, IPC)能够显著减少持续心肌缺血引发的心肌梗塞,这一保护过程包括早期阶段(持续1～2小时)和后期阶段(持续24～72小时)。Diaz等[10]研究 发现,阻断兔心肌细胞ICl,vol电流可导致短暂缺血及低渗压力引发的IPC保护效应缺失。
阻断CLC-3氯通道对结直肠癌细胞株生存率和侵袭转移能力 的影响及其分子机制 王艳萍;姬林松;樊宏伟;向晓辉;徐威 【摘要】目的：通过研究CLC-3在结直肠组织中的表达，探讨CLC-3对结直肠 癌细胞株SW480、SW620的细胞生存率、侵袭转移能力的影响及其潜在的机制。方法：采用RT-PCR方法测定不同分期结直肠癌组织和正常结直肠组织中CLC-3 的mRNA表达水平。运用CLC-3阻断剂DIDS、NPPB阻断SW480、SW620细胞的CLC-3表达后，采用CCK-8法实验检测细胞生存率，细胞侵袭实验检测细胞侵袭转移情况；并采用免疫印迹法测定阻断CLC-3表达后SW480、SW620细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达。结果：结直肠癌组织中CLC-3 mRNA表达水平高于结直肠炎黏膜组织和正常结直肠组织（P<0.05），且CLC-3 mRNA 表达和结直肠分期相关。抑制CLC-3表达后，SW480、SW620细胞的生存率和 侵袭转移能力降低（P<0.05），且β-catenin、C-myc、cyclin D1、Ki-67、survivin表达降低（P<0.05）。结论：CLC-3高表达与结直肠的发生发展有潜在 联系，其机制可能与Wnt/β-catenin有关，为CLC-3作为治疗结直肠癌的潜在新靶点提供实验基础。%Objective:To examine the expression of CLC-3 in colorectal tissues and the effect of CLC-3 on the viability and invasion of colorectal cancer (CRC) SW480 and SW620 cells. Methods:The mRNA levels of CLC-3 in CRC cell lines were determined by RT-PCR. CLC-3 expression was inhibited by adding DIDS or NPPB to the CRC cells. Subsequently, cell viability and invasion were assessed by CCK-8 assay and Transwell assay, respectively. In addition, the effects of DIDS and NPPB on the Wnt orβ-catenin signaling pathways were de-termined by Western blot analysis.
ClC—3荧光真核表达载体的构建及表达 目的构建表达ClC-3的荧光真核表达载体，为研究其在肿瘤细胞中的作用提供分子工具。方法将ClC-3的编码序列亚克隆到pEGFP-N1质粒，构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3，利用脂质体介导将ClC-3基因导入人乳腺癌细胞MCF-7内，通过绿色荧光观察检测基因的表达。结果成功构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3，该载体转染MCF-7细胞后，可观察到绿色荧光。结论表达ClC-3的荧光真核表达载体构建成功，并在乳腺癌细胞中得到正确表达，为进一步研究ClC-3在乳腺癌中的作用奠定了基础。 标签：ClC-3；MCF-7细胞；荧光真核表达载体；转染 ClC-3是ClC氯离子通道家族成员之一，对维持细胞容积平衡、调节细胞电活动等多种生理功能发挥重要作用，是正常细胞生长和增殖必不可少的元件。近年有文献报道，在宫颈癌、乳腺癌和恶性胶质瘤中ClC-3的表达都远高于正常组织[1]，ClC-3可以通过参与细胞体积减小即凋亡性容积减小（apoptotic volume decrease，A VD）的过程来参与肿瘤细胞的凋亡调控[2]，而且还可能参与了肿瘤细胞周期依赖性的细胞迁移过程[3]。因此，ClC-3可能是与肿瘤的发生发展、转移和凋亡过程密切相关的关键分子之一。本研究采用基因重组技术构建ClC-3与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的融合蛋白ClC-3-EGFP，并检测其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达，为进一步探讨ClC-3在乳腺癌中的作用提供分子工具。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 携带ClC-3全长cDNA的质粒pcDNA3.1/ClC-3由芝加哥大学Deborah J.Nelson教授惠赠；真核表达质粒pEGFP-N1、大肠埃希菌DH5α、乳腺癌细胞株MCF-7为本实验室保存；内切酶BamHⅠ、SacⅠ，T4 DNA连接酶均购自NEB 公司；LA Taq酶购自大连宝生物公司；质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。 1.2 PCR扩增ClC-3的编码序列 以质粒pcDNA3.1/ClC-3为模板，用PCR扩增出ClC-3的编码序列，上游引物序列为5′-CTTAGAGCTCATGGAG-TCTGAGCAGCTGTT-3′，引入了Sac Ⅰ位点；下游引物序列为5′-CAGTGGATCCATGTTGAACATTATTGAAGCGG-3′，引入了BamH Ⅰ位点。PCR反应体系：50 μl体系中模板DNA 0.5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μl，LA Taq（5 U/μl）0.5 μl，2×GC Buffer Ⅰ25 μl，dNTP Mix 8 μl，ddH2O 12 μl。反应参数：94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，30个循环，最后72℃延伸10 min，产物2476 bp。反应结束后0.8%琼脂糖凝胶电泳观察结果及切胶回收目的DNA片段。
CAP／Cbl通路的研究进展 CAP/Cbl通路是胰岛素信号通路中的一个分支，由胰岛素受体、原癌基因蛋白Cbl及CAP衔接蛋白等组成，是参与葡萄糖转运的信号途径。本研究主要介绍了近年来关于CAP/Cbl信号通路的组成及对细胞葡萄糖摄取分子机制的研究进展，为糖类代谢调控的研究提供新的思路和途径。 标签：CAP/Cbl通路；CAP；Cbl；葡萄糖摄取 葡萄糖的摄入是细胞维持生命活动所必须的基本过程。胰岛素具有调控细胞葡萄糖的摄入能力。胰岛素与胰岛素受体结合通过胰岛素受体磷酸化启动CAP/Cbl通路（CAP/Cbl pathwayCAP/Cbl）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）三个信号代谢通路，从而影响细胞葡萄糖摄入能力（图1）。研究者对PI3K和MAPK信号通路报道较多，而关注CAP/Cbl通路的研究较少。CAP/Cbl通路作为胰岛素信号途径的分支之一，依赖于脂筏上的特定蛋白，参与细胞葡萄糖的摄取。本研究针对CAP/Cbl通路中的信号分子、介导机制等方面进行综述，为葡萄糖代谢的调控研究提供理论依据。 1CAP/Cb1信号通路 1.1胰岛素受体 胰岛素受体是一种跨膜糖蛋白，由两条α链和两条β链组成，中间有二硫键连接的异源四聚体。α亚基位于细胞膜外侧，含有胰岛素的结合位点，胰岛素与靶细胞膜上的胰岛素受体的α亚基结合，引起受体的构象发生改变。一旦受体的构象改变以后，β亚基便暴露出ATP的结合位点。β亚基是跨膜多肽，N-端在质膜外侧，与α-亚基结合，中间有一跨膜区段，胞内区域包含有酪氨酸蛋白激酶的活性区域。ATP与β亚基结合后，促使胰岛素受体的β亚基上的一些酪氨酸残基发生自我磷酸化，依次激活下游的信号蛋白[1]。