蛋白质提取常用试剂及操作方法
一、原料选择和前处理
（一）原料的选择
早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
（二）前处理
1.细胞的破碎
材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法
主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。
⑵物理方法
主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
Ⅰ.反复冻融法
于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。
Ⅱ.冷热变替法
将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。
Ⅲ.超声波法
暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些
超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。
Ⅳ.加压破碎法
加一定气压或水压也可使细胞破碎。
⑶化学及生物化学方法
Ⅰ.有机溶媒法
粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10 倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。
Ⅱ.自溶法
将待破碎的鲜材料在一定pH 和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。自体融解过程中PH 显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。
Ⅲ.酶法
与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出的是溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1g 菌体加1～10mg 溶菌酶，pH6.2～7.01h 内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol 蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。
表面活性剂处理：较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。
此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。
2.细胞器的分离
制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。DNA 几乎全部集中在细胞核内。RNA 则大部分分布于细胞质。各种酶在细胞内分布也有一定位置。因此制备细胞器上的生物大分子时，预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。以肝细胞为例整理如表1。
表1 蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况
细胞器名称主要蛋白质及酶类核酸类
细胞核：精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系RNA占总量10%左右，DNA 几乎全部。
粒线体：电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶系RNA 占总量5%左右，DNA 微量。
内质网（微粒体）：蛋白质合成酶系、羟化酶系RNA占总量50%左右。
溶酶体：水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等）。
高尔基氏体：糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系。
细胞膜：载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP 酶、环化腺苷酶、5’-核苷酸酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶等。
细胞液：嘧啶和嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白类RNA（主要为tRNA）占总量30%。
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得
以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
三、浓缩、干燥及保存
（一）样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置
形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：
膜名称分子量截留值孔的大的平均直径
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－3030，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10
用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。
（二）干燥
生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。
（三）贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。
细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、Ficoll（一种蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。
水溶液提取：
大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。
盐溶液提取：
以盐溶液及缓冲液提取蛋白质进常注意下面几个因素。
1. 盐浓度
等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L 磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L 氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L 碳酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L 以上氯化钠液提取。总之，只要能溶解在水溶液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及PH，一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。
2.PH 值：
蛋白质提取液的PH 值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。如细胞色素C 属碱性蛋白质，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取。某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在，选择PH3～6 范围对于分离提取是有利的。
3. 温度：
多数酶的提取温度在5℃以下。少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择37～50℃条件下提取，效果比低温提取更好。此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取效果。
4. 有机溶剂提取：
有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。从一些粒线体（Mitochondria)及微粒体（Microsome)等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton 的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH 及温度选择范围较广（pH3～10，温度-2℃至40℃）。丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。
(1) 表面活性剂的利用：
对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、TirtonX-114、吐温60 及吐温80）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。
(2)对提取物的保护：
在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶，提取时要注意防止由它引起的水解。前面所讲的降低提取温度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多数蛋白水解酶的最适PH 在3～5 或更高些，因在较低PH 条件下可降低蛋白质水解酶引起的破坏程度。低pH可使许多酶的酶原在提取过程中不致激活而保留在酶原状态，不表现水解活力。加蛋白质水解酶的抑制剂也同样起保护作用，如以丝氨酸为活性中心的酶加二异丙基氟磷酸，以巯基为中心的酶加对氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有机溶剂时也能产生相类似的作用。蛋白水解酶的性质变化很
大，上述条件均视具体对象而变化。有一些蛋白含巯基，这些巯基可能是活性所必需。在提取这种蛋白不要带入金属离子和氧化剂。前者可往提取液中加金属螯合剂如EDTA，后者可加入还原剂如抗坏血酸。有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基。提取时要注意保护，不要使酸基丢失。
(3)操作步骤
①单层细胞的培养，用室温PBS洗细胞一次，然后甩干；悬浮培养的细胞，400g离心10min，收集细胞弃上清液。
②对于单层细胞培养，将培养瓶置于冰上，每lOOmm培养瓶加入1 mL溶解缓冲液(4℃预冷)；对于悬浮培养，将盛细胞团的试管置于冰上。按107个细胞加入1．0ml裂解液(4℃预冷)。保存在冰箱的裂解液可随时使用。
③冰上放置3min，不时敲击贴壁细胞培养瓶，或轻摇悬浮培养细胞。
④对于单层细胞培养，敲击培养瓶数次，混合均匀，在冰床上倾斜培养瓶使溶液集中于一侧，然后将裂解物移置另一支1．5mL圆锥形试管。有些研究者喜欢从瓶壁刮取细胞，但除特殊要求外此举并非必须。
⑤单层培养的细胞或悬浮培养的细胞均以10 000g，413离心10min，仔细吸取上清液盛于另一试管，不可搅动细胞团。置冰上。此时，上清液可用于下一步的预处理。
脑组织
RIPA液提脑组织中的胞浆蛋白做western。
RIPA母液（20ml配置示例）
Tris 0.158g Nacl 0.18g ddH2O 10ml浓Hcl 调PH至7.4（约加100ul）加40ul 0.5M 高压过的EDTA定容至20ml，4℃保存。
使用前加1mg/ml 的Aprotinin 100ul/100ml （-20℃保存）；1mg/ml 的Leupeptin 100ul/100ml （-20℃保存）；200mmol/L PMSF 500ul/100ml （4℃保存）；200mmol/L的Na3VO4 500ul/100ml （4℃保存），200mmol/L的NaF 500ul/100ml （4℃保存）。
因加完酶的RIPA液4℃只能保存五天，所以母液可以多配置，临用前再加酶。
脑组织蛋白提取步骤：
1.在冰上使玻璃平皿预冷。
2.把脑组织放在预冷的玻璃平皿上，用剪刀将脑组织剪碎。
3.用RIPA液悬浮脑组织。每250mg脑组织加1ml的RIPA。
4.冰上匀浆脑组织，直至匀浆光滑（大致用30min，多匀浆几次，每次匀浆间隔1min以上）。
5.将匀浆转移到预冷的Eppendorf管中。
6.4℃离心，8,2000 rpm 20min 留上清，弃沉淀。
7.转移上清至另一离心管中。
8.4℃离心，18,000 rpm 45min。
9.保存上清。
（含有胞浆蛋白和部分亚细胞结构中的膜蛋白）。
脂肪组织蛋白质的提取
将脂肪组织样品置于玻璃匀浆器中，按每毫克样品2 μl 裂解液的比例分别加入相应体积的裂解液(9 mol/ L 尿素,4 %CHAPS ,65 mmol/ L DTT) ，冰浴中用玻璃匀浆器上下匀浆共15 次。将匀浆液置于eppendorf 管中，4 ℃、15 000 r/ min 离心1 h 后吸取少量上清液，用
Bradford 法测定总蛋白质浓度，其余上清液于- 78 ℃冻存备用。
肝脏组织蛋白的提取
1.断头处死大鼠，（尽量让血液流掉多些），取100-200毫克，冰生理盐水洗2 次。
2.将肝脏用剪刀煎碎，倒入加入3倍体积的Lysis buffer缓冲液：10 mmol/L Hepes2NaOH (pH
7. 8) 。15mmol/L KCl , 1 mmol/L MgCl2 。0. 1 mmol/L EDTA ,1 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF , l μg/ml Leupeptin
3.用玻璃匀浆器匀浆（冰上进行）后，充分匀浆。
4.12000rpm，4度，离心30分钟取上清。
肠黏膜组织蛋白的提取
目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤：
1.含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
2.倒转混匀，置室温10min。离心：12000 g，10min，4度，弃上清。
3.加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）。振荡，置室温20min，离心：7500g，5 min，4度，弃上清
4.重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次。
5.沉淀中加入100％乙醇2ml。充分振荡混匀，置室温20 min。
6.离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀。
7.1％SDS溶解沉淀。离心：10000g，10min，4度。取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）。
肌肉组织蛋白的提取
裂解液：7M尿素、2M硫脲、4% CHAPS、2%IPG Buffer pH 3-10、1% DTT 、Protease Inhibitor Cocktail
步骤：
1. 碾钵碾磨肌肉组织，加液氮3-4次，充分研磨。
2. 将适量肌肉粉末（80-100mg/ml）至加入适量裂解液的离心管（5ml），用匀浆器12000rpm 匀浆1-2min，彻底破碎细胞。
3. 加50ug/ml RNase 及200ug/ml DNase，在20℃放置60分钟，每10分钟涡旋一次，每次10-20s。
4.20000g，4℃离心60分钟（或40,000 g，4℃离心30 分钟）。
5. 收集上清。
6. 分装样品，冻存于－80℃。
酵母蛋白的提取方法
1.准备SD/-Leu或是YPD 培养基20ml，酵母过夜培养，30℃，230rpm。
2.测OD600 约1.0。
3.100ml过夜培养物，1000g，离心，5min，4℃。
4.弃上清，重悬于80ul抽提buffer：
0.1M Tris-Cl（PH7.5），0.2M NaCl，0.01Mβ-ME，20％甘油，5mM EDTA，1mM PMSF。(100×)：PMSF 0.1742g 溶于10ml 异戊醇（主要抑制丝氨酸蛋白激酶），RT保存。
5.转移上清到一预冷的玻璃管中，再加入玻璃珠33ul（425-600um）。冰上操作，涡流10min，但不包括样品的预冷时间。
6.回收玻璃珠，并尽可能取上清到另一预冷的玻璃管中。
7.40ul的抽提buffer，同上涡流。
8.离心后分离上清（回收玻璃珠）。
9.液氮快速冷冻，-70℃储存。
10.提取的蛋白量通常约10-20mg/ml, 2-5ul用于实验。
低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白 一、实验目的 利用低温乙醇法从人血清中分离出免疫球蛋白（Ig），并获得副产物血清白蛋白。 二、实验原理 （1）低温乙醇法Cohn6法：美国哈佛大学Ｅ·Ｊ·COHN教授研究组，在短短两年建立了低温乙醇分段提取法。 方法原理：往蛋白水溶液中加入中溶性有机溶剂，如乙醇、丙酮等，主要是降低水分子的活度，降低溶液的介电常数，从蛋白分子周围排斥水分子，使蛋白分子之间通过极性基团的相互作用，在范德华力作用下，发生凝聚。不过由于有机溶剂存在，降低了蛋白分子表面憎水基团的作用，因而引起蛋白分子聚集的主要极性基团的相互电荷之间的引力。（文献20） 分离过程中，二法通过五个因素的变动(五变系统)，使很多血浆蛋白质得以分离。这五个因素及其各自的作用是；①乙醇：使蛋白质分子“脱水”；⑦pH值；蛋白质在等电点时易于沉淀；②电解质浓度：在低离子浓度下，对蛋白质溶解度有较大影响；④蛋白质浓度：浓度越低，其沉淀作用越小；⑥温度：在低温下，可避免乙醇对蛋白质的变性作用。同时，蛋白质溶解为吸热反应，溶解度随温度上升而增高。 经实验得知，利用低温乙醇法能将血清蛋白分成六个组分（Ⅰ~Ⅵ），其中免疫球蛋白IgG主要存在于Ⅱ+Ⅲ中，白蛋白Alb主要存在于Ⅴ中。 (2) Cohn氏9法；该法对Cohn氏6法的组分Ⅱ+Ⅲ作进一步分离和提纯，可获得组分Ⅱ—l，2，3(Y—G)，组分Ⅲ一1(同种凝集素)，组分Ⅲ—2(凝血酶原)，组分Ⅲ—3(血浆酶原)等产品。其工艺流程见图:
算： 三、材料和试剂 3.1 血清：100 mL 3.2 相关试剂：95%乙醇，pH 4. 0醋酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液Ⅰ，磷酸盐缓冲液Ⅱ，3 mol/L NaCl溶液，1 mol/L NaHCO3，生理氯化钠溶液，麦芽糖， 3.3 实验仪器： 四、方法与步骤 基本思路：
蛋白质的提取的两种常用方法 ztwpierr… 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
、 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 > 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 # 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 - 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
方法一：碱溶酸沉法 利用蛋白质可溶于稀碱，当pH接近等电点时沉淀析出的原理，先用碱性溶液来溶解蛋 白质，分离出澄清溶液，再将溶液的pH降到蛋白质的等电点使蛋白质沉淀析出，接下来分离沉淀下来的蛋白质。碱溶酸沉法是目前操作最成熟、应用最多的蛋白质提取方法，常用 的碱是氢氧化钠溶液。碱溶酸沉法具有操作简便、易于控制、成本低廉的优点，缺点是 提取操作时间长，蛋白质提取率低，易导致蛋自质变性，对某些原料提取出的蛋白质色泽 深等碱溶酸沉法提取蛋白质的影响因素包括碱液浓度、碱液用量、提取温度和提取时 间等提取时需要辅助适当的搅拌，以利于蛋白质的溶出。 方法二：盐溶酸沉法 盐溶酸沉法的原理是蛋白质可溶于低浓度的盐溶液中，调整溶液pH至蛋白质等电点 时，蛋白质则沉淀析出。浓度较低的中性盐溶液有促进蛋白质溶解、保护蛋白质活性的作用;浓度高则会导致蛋白质发生盐析作用。常用的盐溶液是氯化钠溶液和六偏磷酸钠溶液。和传统的碱溶酸沉法相比，盐溶酸沉法的蛋白质提取率较高，蛋白质变性差，但纯度低。 方法三：水酶法 该方法适用于提取油脂含量较高的植物蛋白，在获得高品质油脂的同时得到高质量的 蛋白质。在高油植物种子中，油脂存在于细胞内，常与蛋白质或碳水化合物等大分子结合 在一起，形成脂多糖或脂蛋白等复合体，必须将油料组织的细胞结构和油脂复合体破坏， 才能提出里面的油脂和蛋白质。水酶法以机械和酶解为手段，来降解细胞壁，分离出蛋白质。操作时先借助研磨、粉碎等辅助操作将种子组织破碎，再采用对细胞壁以及对脂多糖、脂蛋白等复合体有降解作用的酶(如纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等)来进行处理，使细 胞壁断裂，脂多糖、脂蛋白等复合体破坏，从而使蛋白质和油脂容易从细胞中释放出来， 再经离心处理即可将蛋白质与油脂分离，得到蛋白质[381。水酶法的特点是可同时提取油脂和蛋白质，反应条件温和，蛋白质不易变性，提取率高;缺点是酶的成本较高，用量大。水酶法操作的关键是酶的选择，根据原料细胞结构和化学成分选取恰当的酶，才能保 证提取的高效率。 方法四：反胶束萃取法 表面活性剂((surfactant)是一种具有固定的亲水亲油基团、在溶液表面能定向排列、并能使表面张力显著下降的物质，由亲水的极性头和亲油的非极性尾两部分组成。表面活性剂具有润湿或抗粘、乳化或破乳、起泡或消泡以及萃取、增溶、分散、洗涤、防腐、抗静电等物理化学作用，应用非常广泛。表面活性剂分子在水中缔合形成胶束的最低浓度为临界胶束浓度。表面活性剂在水中的浓度超过临界胶束浓度时，即可形成正常胶束，极性头向外，非极性尾向里。当表面活性剂溶到非极性有机溶剂中时，若浓度超过临界胶束浓度，将形成极性头向里、非极性尾向外的、与正常胶束相反的聚集体，即为反胶束，见图2。阴离子表面活性剂唬拍酸二醋磺酸钠(AOT)在异辛烷有机溶剂中可形成较大的反胶束，能溶解较多的蛋白质，是目前反胶束研究中常用的表面活性剂。李飞研究了用反胶束法提取玉米胚芽油和蛋白质，结果发现用反胶束法提取出的蛋白质的得率远高于碱溶酸沉法和水酶法的蛋白质得率，蛋白质的纯度也高于碱溶酸沉法和水酶法的纯度。郭晓歌等应用反胶束法提取葵花籽蛋白质，并对提取出的葵花蛋白进行功能特性研究，结果显示反胶束萃取法提取出葵花籽蛋白质的量比碱溶酸沉法所得的蛋白质的量稍低，蛋白质的持水性和吸油性也不及后者的好，但反胶束萃取出的蛋白质的溶解性、发泡性、乳化性和稳定性要比后者的好。可见，反胶束萃取法在蛋白质提取和分离方面具有一定的优势。反胶束法提取蛋白质的成本较高，操作复杂，萃取原理还不明朗，目前尚处于理论研究阶段。
蛋白质的十种提取方法 蛋白质是构成生物体重要组成部分的大分子有机化合物，对于生物研 究和工业生产具有重要意义。目前，蛋白质的提取方法多种多样，根据不 同的目的和实验要求可以选择合适的提取方法。下面将介绍蛋白质的十种 常用提取方法。 1.溶液渗透法：该方法利用溶液渗透作用，通过梯度离心或薄膜渗透，将蛋白质从混合物中分离出来。这种方法适用于体积较小且溶解度高的蛋 白质。 2.超声波破碎法：通过使用超声波的机械波作用，使得细胞膜破碎， 释放出蛋白质。这种方法操作简单，操作快速，适用于处理小体积的样品。 3.离心法：通过离心来分离混合物中的蛋白质。根据蛋白质的分子量 和比重差异，可以利用离心的力把蛋白质沉淀到离心管的底部。这种方法 适用于分离大分子量的蛋白质。 4.水解法：通过将蛋白质与水或酸性溶液共同处理，使蛋白质发生水 解反应，从而分离出目标蛋白质。这种方法对于含有多种蛋白质的混合物 有效。 5.超滤法：利用超滤膜的渗透性，将蛋白质从混合物中分离出来。根 据蛋白质的分子量大小，可以选择合适孔径的超滤膜。这种方法可以快速、高效地提取蛋白质。 6.毛细管电泳法：利用毛细管对溶液中的蛋白质进行分离。该方法可 以根据蛋白质的电荷、大小和形状来分离不同蛋白质。这种方法操作简单、实验时间短。
7.离子交换法：利用离子交换树脂或离子交换膜，根据蛋白质的电荷 特性来分离蛋白质。这种方法可以选择不同类型和大小的离子交换树脂， 以实现对不同蛋白质的选择性提取。 8.吸附法：通过特定配体与蛋白质之间的亲和作用，将蛋白质吸附到 固相材料上，并通过洗脱来分离蛋白质。这种方法可以用于高效地纯化蛋 白质。 9.柱层析法：利用固定相和流动相之间的亲和力或互斥力分离蛋白质。依据蛋白质的大小、形状和电荷特性，选择不同类型的柱层析材料，实现 对蛋白质的选择性提取。 10.电泳方法：通过电场驱动蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大 小和电荷来分离蛋白质。这种方法可以分离不同分子量和电荷的蛋白质， 并可用于纯化和定量分析。 以上是蛋白质的十种常用提取方法，根据不同的实验要求和目的，可 以选择合适的提取方法进行研究或生产。
组织蛋白提取 材料准备：组织、冰块、称、超声匀浆器、试剂 各种试剂比例： PMSF：Lysis Buffer = 1:100 1、将组织称重，减去EP管重量 2、每100mg组织加入1mL(1mg ,10ul)试剂，冰上裂解半小时 3、匀浆（注意低温操作），开20秒，关2秒，共打20次，每次用水冲洗，擦干，超声完后放冰上 4、将匀浆液移至1.5mL预冷离心管 5、离心，12000转，4℃，30分钟 6、取上清至新的预冷的EP管 7、BCA定量 8、放入—80℃ 线粒体蛋白提取 材料准备（放冰盒中）：线粒体试剂、EP管、EP管中的组织、枪头、PBS 1、用冷PBS清洗细胞2次，洗后吸干上清 2、加入A200uL，放冰上10分钟 3、匀浆30-40次，每次用清水清洗匀浆器头 4、离心500rpm，4℃，5分钟 5、将上清移至离心管 6、离心1100rpm，4℃，20分钟 7、沉淀中加入200uLB，混匀 8、离心1100rpm，4℃，20分钟 9、弃上清 10、加入80-150uL裂解液，放冰上20分钟，每隔5分钟高速震荡15秒， 11、得线粒体蛋白 12、定量后放-80℃冰箱。
细胞总蛋白提取 材料准备：试剂（—20℃）、细胞培养板、EP管（已标记）均放置于冰盒中操作，以防止蛋白降解。 1、吸掉培基 2、加入PBS，约1ml/孔左右，用手晃匀 3、约5min后倒去PBS，并用枪将PBS尽量吸尽 4、加入试剂，摇床振荡10分钟，再置冰上10分钟。 培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）细胞量裂解液（ul）96 孔培养板0.32 0.1 105 24孔培养板 2 1.0 5×105 12孔培养板 4.5 2.0 106 6孔培养板9.6 2.5 2.5×10680 3.5 cm 培养皿8 3.0 2×106 6 cm 培养皿21 5.0 5.2×106320 10 cm 培养皿55 10.0 13.7×106800 25cm2培养瓶25 5.0 5×106 75cm2培养瓶75 15～30 2×107 5、用黄色枪头将各孔中cell刮下，保证孔底部分都要刮到，根据分组将细胞悬液吸入各个EP管中。若不定量，在各个EP管中加入loading buffer（5×稀释成1×），冰上5分钟后，100度沸水中煮约5min，放入—80℃冰箱。 蛋白质定量：一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说明书。 蛋白质样品制备注意事项 1 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸、多糖、脂类等干扰分
提取蛋白质的具体步骤 全文共四篇示例，供读者参考 第一篇示例： 提取蛋白质是生物科学研究中非常重要的一个步骤，它能够帮助 研究人员深入了解蛋白质的结构和功能。下面将为您介绍一些常用的 提取蛋白质的具体步骤，希望能对您有所帮助。 1. 选择样本：在进行蛋白质提取前，首先需要选择合适的样本。 样本可以是动植物组织、微生物、细胞等。在选择样本时，需要考虑 到所需提取的蛋白质种类和含量。 2. 细胞破碎：将样本破碎是提取蛋白质的第一步。通过机械或化 学方法破碎细胞壁，释放出蛋白质。常用的方法包括超声波破碎、研 钵研磨、高压破碎等。 3. 细胞裂解：将破碎后的细胞溶液进行裂解是提取蛋白质的下一步。裂解可使蛋白质从细胞内释放出来。常用的裂解方法包括离心、 温度变化、酸碱处理等。 4. 蛋白质沉淀：裂解后的细胞溶液含有大量的蛋白质和其他杂质，需要进行沉淀分离。常用的方法包括盐析、醇沉、酸沉淀等。 5. 蛋白质纯化：通过进一步的分离和纯化步骤，可以得到纯度较 高的蛋白质。常用的方法包括柱层析、凝胶电泳、亲和纯化等。
6. 蛋白质鉴定：最后一步是对提取得到的蛋白质进行鉴定和分析。常用的鉴定方法包括质谱分析、Western blotting等。 以上就是提取蛋白质的具体步骤。通过这些步骤，研究人员可以 有效地提取并纯化蛋白质，为后续的实验和研究提供重要的支持。希 望以上内容对您有所帮助，谢谢！ 第二篇示例： 蛋白质是生物体中重要的基本分子，具有多种生物学功能，包括 结构支持、酶催化、信号传导等。提取蛋白质是生物学研究中常用的 实验方法之一。下面我将介绍提取蛋白质的具体步骤。 1. 样品的制备 首先要准备待提取的生物样品，可以是细胞、组织或者生物体。 样品的制备包括收集、洗涤、离心等步骤，确保样品的纯度和完整 性。 2. 细胞破碎 对于细胞样品，需要先将细胞破碎以释放蛋白质。常用的细胞破 碎方法包括超声波破碎、高压破碎、冻融破碎等，选择适合样品的方 法进行破碎。 3. 蛋白质溶解
蛋白质提取与纯化技术总结 蛋白质提取与纯化技术 1.蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 有机溶剂提取法：一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁提取法的pH 及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 2.蛋白质的分离纯化 亲和层析法： 亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物（S'）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E－S'）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价
细胞提取蛋白步骤 细胞提取蛋白是生物学研究中常用的实验方法之一，通过提取细胞内的蛋白质，可以进一步进行蛋白质分析、鉴定和功能研究。下面将详细介绍细胞提取蛋白的步骤。 一、细胞培养和采集 在进行细胞提取蛋白实验之前，首先需要进行细胞培养。常用的细胞培养基有DMEM、RPMI-1640等，根据实验需要选择合适的培养基。将细胞培养在含有适宜浓度的培养基中，放置在恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。当细胞生长到适当密度时，可以进行下一步的细胞采集。 二、细胞裂解 将培养好的细胞放入离心管中，用PBS或生理盐水进行洗涤，去除细胞外的干扰物。然后加入裂解缓冲液，常用的裂解缓冲液有RIPA 缓冲液、NP-40缓冲液等。裂解缓冲液中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂等，可以保护蛋白质不被降解。将细胞裂解液置于冰上，用超声波仪或搅拌器进行充分裂解，直至细胞完全破碎。 三、离心分离 将裂解后的细胞溶液离心，以去除细胞碎片、细胞核和细胞膜等残渣。离心分离的条件根据实验需要进行调整，一般在12000×g的条件下离心10-15分钟。离心后，上清液即为含有目标蛋白质的提
取液。 四、蛋白质浓度测定 使用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法，测定蛋白质的浓度。根据实验需要，可以使用不同的测定方法。 五、蛋白质保存和分析 将提取的蛋白质分装到离心管中，并存储在-80摄氏度的冰箱中。根据实验需要，可以进行蛋白质的分析和鉴定。常用的方法有SDS-PAGE电泳、Western blotting、质谱分析等。这些方法可以用来确定蛋白质的分子量、表达量以及与其他蛋白质的相互作用等。 细胞提取蛋白是一项复杂的实验技术，需要注意以下几点： 1. 实验前要准备好所需的试剂和设备，确保实验过程的顺利进行。 2. 在细胞裂解过程中，要注意避免蛋白质的降解和氧化，可以添加蛋白酶抑制剂和抗氧化剂等。 3. 细胞裂解后的提取液要尽量避免冻融，以免对蛋白质的活性造成影响。 4. 在进行蛋白质浓度测定时，要注意选择合适的测定方法，避免误差。 5. 存储提取的蛋白质时，要注意避免蛋白质的降解和污染，可以添加蛋白酶抑制剂和保存液等。 细胞提取蛋白是一项重要的实验技术，在生物学研究中具有广泛的
细胞蛋白的提取与测定 蛋白提取原理：蛋白质是一切生命活动的承担者，为了研究及探索蛋白质的功能、特异性蛋白表达水平、翻译后修饰（甲基化磷酸化等）、蛋白-蛋白或蛋白-核酸之间相互作用的研究，进一步阐明众多疾病的机制，同时为疾病治疗提供理论依据，因此需要提取目的蛋白，由于蛋白质种类繁多，结构复杂，需要通过一些步骤使细胞裂解、杂志去除、蛋白纯化来得到目的蛋白。 一、贴壁细胞蛋白的提取：（所有操作均在冰上进行） 准备相应数量的EP管标记后放放冰上备用 1.裂解液制备：每1ml蛋白裂解液（RIPA）加入10ul蛋白酶抑制剂（如PMSF保护蛋白，使其免于被蛋白酶降解），配好后冰上备用； 2.此处以6孔板为例，吸掉培养基后每孔加入1-2ml冰PBS溶液，清洗 2-3次，吸净残余BPS（如果有残留的话有可能使提取的蛋白稀释）； 3.加入适当体积的裂解液，让裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min； 4.裂解完成后，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞及裂解液吸入离心管，放离心机4℃ 12000rpm 离心30min（离心机提前预冷），上清即为蛋白溶液，细胞碎片沉降于底部； 5.蛋白提取完成后a.可放置于-20℃保存（长期保存放于-80℃）；b.可取出部分进行BCA 定量分析；c.做western blot，需要对蛋白进行变性处理后储存于-20℃或-80℃的冰箱中保存（根据蛋白变性条件不同有所不同，例如在100℃的高温下水浴锅煮5-10分钟）。 二、组织中总蛋白的提取： 1.将已称重的冷冻组织（约50g）放入预冷好的研钵中，用研杵快速研磨组织，（有的需要加入液氮），直至组织被研磨成匀浆（无明显颗粒）； 2.裂解液制备：取250ulRIPA裂解液+2.5ul 100mmol/L蛋白酶抑制剂+2.5ul蛋白酶抑制剂复合物Cocktail(多种小分子组成的抑制剂混合物能更好的保护蛋白不被蛋白酶降解)； 3.取适量研磨的匀浆放入离心管，加入配好的裂解液，冰上孵育40min； 4.离心：4℃ 12000rpm 离心15min 保留上清； 5.将蛋白溶液防止于-20℃保存（长期保存放于-80℃）。 三、蛋白样品制备的原则： 1.蛋白提取过程需要冰上操作，尽可能减少蛋白降解； 2.尽可能采用简单方法，以避免蛋白丢失； 3.低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解； 蛋白浓度测定： 蛋白样品在进行SDS-PAGE电泳等实验研究之前要进行精确的定量，以保证同一实验中不同样品之间上样量的一致性以及结果可比性。因此，蛋白浓度测定是研究蛋白中最常用、最基本的分析技术之一。（此处主要介绍BCA检测法） 1.BCA原理：在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键结构能与Cu2+结合生成络合物，同 时将Cu2+还原为Cu+。BCA试剂可灵敏特异的与Cu+结合，形成稳定的紫色络合物，562nm 处有最高的吸收值，可在562nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 2.BCA配制：（认真看说明书，不同BCA检测试剂盒配置方法不一样，这里介绍碧云 天P0010）
几种溶液的配制方法 1、PBS: 取ZLI-9061 PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2~7.4之间，若偏离此范围，请用0.1N的HCL或NaOH调整。 2、TBS： 2.1 Tris缓冲液配方：（0.5 M pH7.6） Tris（三羟甲基氨基甲烷）60.57g 1N HCL 约420ml 双蒸水加至1000ml Tris缓冲液配制方法： 先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1N）或NaOH（1N）将pH调至7.6，最后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。 2.2 TBS配方： 100ml Tris-HCI缓冲液（0.5M pH7.6） NaCI 8.5~9g (0.15mol/L) 双蒸水加至1000ml TBS配制方法： 先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。 3、枸橼酸盐缓冲液（Citrate buffer）： 3.1 储存液： A. 0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸（C6H8O7·H20）溶于1000ml蒸馏水中。 B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸钠（C6H5Na3O7·2H20）溶于1000ml蒸馏水中。 3.2 工作液： 取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值应为6.0 0.1 4、胰酶（Trypsin）： 4.1 ZLI-9011胰蛋白酶消化液： 常用浓度为0.125%，即使用前将一滴试剂1胰酶溶液和三滴试剂2胰酶稀释液均匀混合（1:3稀释），则可直接滴加使用。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%（1:10稀释）至0.25%（1:1稀释）。 4.2 ZLI-9010胰蛋白酶： 取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或0.1% pH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。 5、胃酶（Pepsin）： 4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL配制。 （我公司备有ZLI-9013胃蛋白酶消化工作液，不需稀释直接滴加使用，欢迎选购） 6、DAB： 6.1 ZLI-9032/9033 DAB Kit：
细胞或组织总蛋白提取与浓度测定（BCA法） 实验步骤 细胞或组织总蛋白提取与浓度测定 1 细胞总蛋白提取（冰上防止蛋白裂解） 1）吸去培养皿中的培养基，加入1 ml预冷PBS缓冲液洗3次。 2）加入适量含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（10 cm培养皿中一般加入500 μl,六孔板一般100微）。 3）冰上裂解15-30 min，将裂解后的细胞用细胞刮子刮下，吸入1.5ml离心管中。 （这个裂解时间的长短有没有影响不清楚，本人之前刮细胞太慢，常常最后一个刮完后第一个已经裂解了好久，可能都要一个小时了，应该问题不大）4）在4℃条件下，12,000 rpm离心15 min，收集上清，即为细胞总蛋白。 2 小鼠组织总蛋白提取 1）取小鼠组织约50-200 mg，加入500 µl预冷的含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。 2）将小鼠组织剪碎，并用组织匀浆器匀浆。 3）冰上静置30 min。 4）在4℃条件下，12,000 rpm离心30 min。收集上清，即为组织总蛋白。 3 蛋白浓度测定（BCA法） 利用北京普利莱的BCA蛋白定量试剂盒（P1511）进行蛋白浓度测定，具体操作步骤如下： 1）将BCA蛋白定量试剂盒中的BCA Reagent和Cu Reagent按照50:1的比例配制成BCA工作液。 2）将4 mg/ml的BSA溶液倍比稀释，配置成浓度为4、2、1、0.5、0.25及0.125 mg/ml的BSA溶液作为蛋白标准品。 3）在96孔板中每孔加入100 µl BCA工作液，再加入5 µl蛋白样品或标准品，每个蛋白样品需设两个平行孔，充分混匀，注意尽量避免出现气泡，37℃孵育30 min。（这个时间说明书写的可室温俩小时，我在37度也放过很久，吃完饭回来就去测） 以BCA溶液作为空白对照，使用酶标仪测定595nm处的吸光度值。通过酶标仪自带软件拟
质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法 携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 一、试剂准备 1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。 2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。 3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。 4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。 5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于 100ml ddH2O中,0.22 um滤膜抽滤，-20℃保存。 二、获得目的基因 1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 三、构建重组表达载体 1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2. PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 四、获得含重组表达质粒的表达菌种
蛋白提取方法 抽取蛋白质是生物学家常用的方法，它不仅可以用于表征蛋白质的结构或功能，而且也可以用于进行相应分析中研究材料的表现。因此，蛋白质抽取法被广泛应用于生物学研究中。下面介绍蛋白质提取的几种常见方法。 第一种是化学抽提方法，它包括乙醇抽提和碱抽提两个方法。在使用这种方法时，研究者通常先将蛋白质从细胞或细胞悬液中抽取出来，然后再施加不同的化学抽提剂，如乙醇或碱，把蛋白质从细胞质中抽取出来，最后把抽取的蛋白质纯化，方法简单，但是处理效果不太理想。 第二种是物理抽提方法，目前主要有超音波萃取法和膜分离法。超音波萃取法主要是利用超音波的波动在细胞内产生的离子扩散和压力效应，使细胞内的分子溶解，从而从细胞内萃取出蛋白质，此方法操作简单，萃取速度快，也经常被应用于抽提生物体内的蛋白质。膜分离法主要是通过由支撑层和选择层构成的膜诱导细胞内蛋白质的沉淀，然后将沉淀物洗涤或围膜，从而抽取蛋白质，这种方法处理效果好，但操作复杂，需要一定的技术条件。 第三种是生物学抽提方法，通常是指采用活细胞体系或活酶体系进行的研究，这种方法的基本原理是利用特定的酶作用于蛋白质，使抽取的蛋白质有序排列，从而获得有效的蛋白质抽提手段。此外，研究者还可以利用建立的活细胞系统来抽取蛋白质，利用蛋白质质谱、蛋白修饰、蛋白下游产物和蛋白结合同源性等来抽取蛋
白质，从而获得更高效率、更好的结果。 此外，还有一些最新的蛋白质抽取技术，如荧光抽提法、非细胞性抽提法、高效液相色谱抽提法、重组蛋白抽提法等，这些抽提技术具有提取效率高、成本低等优点，可以满足不同研究需求。 总之，蛋白质的抽取是生物学研究中的重要方法，通过上述介绍，相信读者都能更清楚地了解蛋白质抽取的方法。当然，在实际应用这些技术时，研究者还需要根据实际情况，综合考虑以上多种抽取技术的优点以及适合于具体研究的特性，然后确定最佳蛋白质抽取方法，以确保抽取效果最佳。
植物全蛋白提取方法： TCA丙酮沉淀法、Tris-HCl法、Trizol沉淀法提取法。 1TCA丙酮沉淀法 基于蛋白在酸或疏水条件下变性使蛋白浓缩并去除污染物原理的TCA丙酮沉淀法，最早用于小麦蛋白的提取，是目前提取植物蛋白的常用方法之一。 具有降低次生代物质的干扰、减少蛋白降解等优点。 TCA能有效地抑制蛋白酶对蛋白质的水解作用，保证在制样过程中蛋白质不被降解；丙酮溶液能除去样品中的酚类及色素等干扰物质，同时实验过程中采用的高速离心办法能较好地去除多糖的影响。然而该方法的一个最大缺点是蛋白质很难重新溶解，而且样品中的非蛋白成分很难除去，可能会丢失膜蛋白和疏水性蛋白，导致2-DE图谱上有明显的横纵条纹。 在研磨样品时加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP )或交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP )用来吸附样品中富含的酚、醌类物质。它们能通过疏水键与酚类形成复合物，离心可以去除该复合物。然而，TCA丙酮沉淀法中与蛋白共沉淀的污染物在随后的有机溶剂清洗步骤常难以去除，可以通过振荡和延长蛋白沉淀在裂解缓冲液中温育时间的方法来增加蛋白的溶解能力。在提取的过程中同时加入了TCA、B-巯基乙醇及DTT 3种药剂可以更好的抑制蛋白质的水解及去除干扰物质。TCA丙酮提取法耗时少且容易操作，一般作为植物蛋白提取的初始方案，该方法常用于幼嫩组织中蛋白的提取，对更为复杂的植物组织该方法并非最佳选择。但该方法还是在植物蛋白的提取中占有重要位置，很多木本植物的样品应用该方法效果很好，如鹅掌楸叶片、巴东木莲的雌蕊柱头、槟榔叶片、银杏叶片及枝条、茶树叶片及芽、红豆杉的愈伤组织、石斛叶片等。草本植物中的大豆叶片、生菜叶片、黄瓜叶片、番茄子叶、龙胆花芽、灰木相思叶片等应用该方法都获得了较清晰的2-DE图谱。 TCA protein precipitation protocol Stock Solutions: 100% (w/v) Trichloroacetic acid (TCA) recipe: dissolve 500g TCA (as shipped) into 350 ml dH2O, store at RT. Precipitation Protocol: 1.Add 1 volume of TCA stock to 4 volumes of protein sample. 1. e. in 1.5ml tube with maximum vol., add 250讥TCA to 1.0ml sample. 2.Incubate 10 min at 4°C. 3.Spin tube in microcentrifuge at 14K rpm, 5 min. 4.Remove supernatant, leaving protein pellet intact. Pellet should be formed from whitish,fluffy ppt. 5.Wash pellet with 200^l cold acetone. 6.Spin tune in microfuge at 14K rpm, 5min. 7.Repeat steps 4-6 for a total of 2 acetone washes. 8.Dry pellet by placing tube in 95°C heat block for 5-10 min to drive off acetone. 9.For SDS-PAGE, add 2X or 4X sample buffer (with or without bME) and boil smaple for 10 min in 95°C herat block before loading smaple onto polyacrylamide gel. 2Trizol沉淀法 与TCA丙酮沉淀法相比，Trizol沉淀蛋白质的方法可有效地除去色素、酚类等干扰电泳的化学物质，特别是对植物样品中高丰度蛋白Rubisco1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/ 加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，通常简写为RuBisCO)。采用此方法能够减少高丰度蛋白对2-DE结果的干扰。植物样品中高丰度蛋白(如Rubisco) 的存在对其他蛋白质，尤其是低丰度蛋白的检测的影响也很大，因此，选择合适的蛋白质制备方法尤其重要。另外，使用聚乙二醇也可以去除该蛋白，效果较好。Trizol法相对于酚法蛋白质获得产率高，方法操作亦不复杂，但对试剂要求严格，大 量制备样品时成本较高。目前使用此方法的植物比较少，对野牛草的种子、幼苗叶片及黄花苜蓿幼苗 提取蛋白的效果很好。
蛋白质提取常用试剂及操作方法 一、原料选择和前处理 （一）原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 （二）前处理 1.细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 Ⅰ.反复冻融法 于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。 Ⅱ.冷热变替法 将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。 Ⅲ.超声波法 暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些
蛋白质的十种提取方法.txt大人物的悲哀在于他们需要不停地做出选择；而小人物的悲哀在于他们从来没有选择的机会。男人因沧桑而成熟，女人因成熟而沧桑。男人有了烟，有了酒，也就有了故事；女人有了钱，有了资色，也就有了悲剧。蛋白质提取方法-------列举10种方法 [ 来源：绿谷生物网点击数： 4587 更新时间： 2008年05月30日 ][ 收藏本文 ] 一、 植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、 植物组织蛋白质提取方法 (summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空 干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小 时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、 组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达