基因沉默
摘要随着基因技术的迅速发展和广泛应用，在转基因技术实践中首先暴露出来的外源基因不能按照预期设想进行表达的问题越来越显得普遍，而人们对基因沉默现象的不断深入研究和探索，不仅揭示出了基因沉默的发生机制，也在一定程度上推动了新技术的产生和应用，这不仅推动了基因研究领域的发展，更在遗传群体构建、疾病治疗等方面建立了新方法、新体系，为生物学技术的发展做出了贡献。
关键字基因沉默分类机理应用
1.引言
基因沉默（Gene Silencing），又称为基因沉寂，是真核生物细胞基因表达调节过程中的一种特殊生理现象，是指细胞基因在表达过程中受到各种因素的综合作用而导致基因部分区段发生“沉寂”现象，从而失去转录活性并不予表达或表达减少。该现象最先于1986年Peerbolte在转基因植物研究中所发现，随后科学家在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现了基因沉默现象的存在。
转基因沉默是基因沉默现象最为频发和常见的，这也是转基因为何在受体难以百分之百全部表达的因素之一，其基本特征是导入并整合到受体基因组的外源基因在当代或后代中表达活性受到抑制。研究发现，其主要原因是由于转基因之间或转基因与内源基因之间存在着序列同源性，因此转基因沉默又被称为同源性依赖的基因沉默（homology-dependent gene silencing）。
根据沃森-克里克的核酸碱基互补配对模型，基因沉默可能涉及到DNA-DNA、DNA-RNA以及RNA-RNA三种不同形式的核酸分子之间的互作，简单地说就是插入的外源DNA或自身基因区段在核内高浓度的RNA作用下，能够与内源反向DNA 或者RNA进行碱基互补配对，并且在核内被重新甲基化，进而导致基因沉默；而另一种可能则是内源基因与转基因转录生成的RNA之间互补配对生成可被RNases酶性降解的双链RNA（dsRNA），其水解直接导致基因的不表达，即基因沉默效果。从染色体水平上看，基因沉默现象的实质是形成异染色质（Heterochromation）的过程，检查发现被沉寂的基因区段往往呈现出高浓缩状态，显然，这在一定程度上也决定了被沉寂基因的难表达性。实验早已证明，在高度浓缩的基因区段，正常的DNA转录活动是难以进行并维持的，换言之，即一旦形成异染色质进入高度浓缩状态，那么相应区段的基因片段就必然因为不能被
转录而表现无活性。然而看似简单的这一点变化，其中的分子机理却错综复杂，有些至今依旧是生物学研究中难以解答的。
事实上，由于现代转基因技术以及遗传学研究领域的飞速发展和扩张，以此为代表的基因表达高效性和特殊遗传样本的构建，基因沉默的现象及生理学意义正逐渐成为基因技术的前沿，乃至分子遗传学研究的热点。基于此，了解和掌握相应的基因沉默机制对于每一个生物科学研究者而言都具有显而易见的优势，尤其是在转基因以及遗传学领域。
2.基因沉默的分类
根据现有实验或理论表明，基因的沉默多发生在转录水平和转录后水平，据此，部分文献将基因沉默分为两类，即转录水平的基因沉默（transcription gene silencing, TGS）以及转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。然而有些基因沉默类型显然是难以服从上述两种分类的，例如转基因沉默中的位置效应（position effect），其沉默机制简言之可以表述为转基因导入位点处于异染色质状态或外源基因与受体基因区段存在显著差异进而被细胞防御免疫系统所识别并消除，这两种情况都是发生在转录前的染色体DNA自身的变异或效应，并不具备转录水平基因沉默定义中在转录水平上发生沉寂的条件。因此，基因沉默又可以划分为三类，除了上述两种外，还有染色体DNA水平的基因沉默。在现有实验技术手段下，可以利用DNA免疫印迹（Northern blotting）、RNA酶保护分析（RNase protection assay）和细胞核进行转录分析（Nuclear run-on assay）对上述基因沉默层次加以区分和判断。
不过鉴于基因沉默现象用于人工操纵这一事实，基因沉默又可以根据沉默的发生是否处在人为控制或操纵之下，可以简单划分为被动基因沉默和主动基因沉默。根据这一划分原则，目前所知的任意沉默机制均可包含其中，例如转基因技术中目的基因常由于内源性因子的干扰而不能按预期设想进行相应表达的现象归入前者，但诸如RNA干扰技术（RNAi）、基因敲除等人工干预手段导致的基因沉默则应划归为后者，即主动基因沉默。
2.1被动基因沉默
在基因沉默研究最为深刻的转基因领域，在实验中常常会发生导入的目的基因在受体细胞中不能够按照实验预期进行表达，亦或是表达减少的情况，研究上可以将这种受受体细胞内源性因子影响而导致的基因沉默称为被动沉默。实验表明，转基因沉默发生的层次水平具有多样性和特殊性，不过总结起来可以划分为染色体DNA、转录和转录后三种不同的层次。在已知的理论或实验依据下，染色体DNA水平的基因沉默包含位置效应、DNA甲基修饰以及组蛋白乙酰化；在转录
水平上，基因沉默的可能类型包含基因启动子甲基化、同源基因反义失活、后成
修饰作用（epigenetic effect）以及多拷贝重复序列等；而转录后水平的基因沉默，则分为基因共抑制（co-suppression）以及基因压制。除此之外，由生物
自我保护机制引发的基因沉默也属于被动基因沉默范畴。
2.1.1染色体DNA水平
外源基因所整合到的目的基因组的特性将直接决定外源基因的表达情况，这种效应称之为位置效应。位置效应大体上可由两种情况所引发，一是目的基因整合位点或基因区段处于受体基因组中高度甲基化或异染色质化的异染色质区和重复序列区，由于这些基因区段的特殊性和高度不可表达性，由此外源基因在整合到相应区段时就不可避免地陷入沉默。事实上，这种情况下的转基因仍是完整和可表达的，只限于所整合位点的特殊性而丧失表达的可能。二是外源转基因在碱基组成上和整合区段有着显著的差异，进而被受体细胞的防御免疫系统所识别并做出相应反应，由此该区段被限制表达或不表达。不过细胞防御系统究竟是如何做出反应并对相应区段限制表达的机理现在并无确凿证据说明，结合X染色体随机失活现象和基因组印记研究，酶性识别或是失活中心假说均可以在一定程度上解释并预测某些现象，但实验上还没有给出相关研究说明。
DNA甲基化修饰和组蛋白乙酰化是基因沉默在染色体DNA水平上的另一种机制。很早以前研究就已经证明了DNA甲基化参与了染色质凝聚状态的形成，事实上，这也是最早发现的基因修饰途径之一，几乎存在于所有高等生物的基因表达调控中。其主要作用机理是通过甲基化来改变位点DNA的构象，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。至于组蛋白乙酰化的分子机制也大体类似，即组蛋白在完成翻译后，其氨基末端常发生包括乙酰化在内的多种共价修饰，并最终相互联合或依次被特定蛋白酶或其它复合体所识别、结合，为激活或抑制相应基因转录的染色质相关蛋白提供结合位点。
2.1.2转录水平
启动子甲基化是转录水平上的基因沉默中较为常见的一种，比之于上述的DNA甲基化实质上并没有区别，只是发生的区段和在基因表达的先后时间顺序上有所差异。研究发现，转录水平上的甲基化多发生在基因5，端的启动子区域，基因的表达水平与其整合位点的甲基化程度密切相关，而这种甲基化的发生条件则依赖于一种被称之为从头甲基化转移酶（de novo DNA methytransferase, DNMT）的识别和加工。这种基因区段性的甲基化是通过核酸碱基互补配对实现传递的，现有实验证明这种甲基化是可以由基因5，端的启动子区域延伸到基因3，端，而核苷酸配对过程得以使甲基化在基因组中自由传递，进而导致整合区域的基因均不表达或随机表达，这与基因转座子相类似，去甲基化试剂可以逆转转基因沉寂现象即可说明这一理论。
而同源基因间的反式失活是近年来新发现的一种基因沉默机制，是一种由于
拥有同源序列的沉默位点和其他位点的DNA的互作而引起的基因沉默。其作用原理是通过顺式作用甲基化失活的基因作为一种“沉默子”，并对其他与之分离且具有同源性的靶基因施加反式作用使之甲基化失活，从而达到沉默基因的目的。
后成修饰作用是一类比较特殊的基因沉默，与其他类型不同的在于后成修饰作用并不改变基因的序列或碱基组成，基因沉默的方式表现在细胞内因子对功能的即时关闭和解除的控制上。显然，这种转基因沉默与受体植物的核型构成有关。此外，外源基因如果通过PCR技术扩增并以多拷贝的形式整合到受体基因组DNA 的同一位点上，则导入的基因会发生自身重复序列间的相互配对，形成可被甲基化酶特异性识别的结构，进而发生甲基化作用，抑制基因的表达，由此转录失活，这种的基因沉默称为重复序列间基因沉默，其作用机理可能与异染色质化相关蛋白质结合体的识别配对序列结构有关。但有研究认为，重复序列很可能是通过一位配对，即多拷贝重复基因序列之间以及外源基因与转录产物之间的配对，使整整合位点的染色质发生异染色质化或DNA的甲基化，在空间上形成位阻，进而阻碍了转录因子与外源基因的接触，这与实验相吻合，也是大多数研究者所共同持
有的观点。
2.1.3转录后水平
转录后水平的基因沉默是指基因在细胞核里能够稳定转录，但在细胞质里却无相应的稳定mRNA存在的现象，简言之即转录后沉默发生在细胞质中，转录产物能在细胞核中积累但在细胞质mRNA被迅速降解或不能正常被加工。
在植物基因研究中上述现象称为共抑制，但事实上，共抑制是最常见的转录后水平基因沉默，该现象最先由Napoli在CHS基因的矮牵牛花中发现，并普遍存在于转基因植物中。与TGS相比，PTGS显得更为普遍和常见。转录后水平的基因沉默是指导入的外源基因引起内源基因或外源与内源基因两者共同的沉默，本质上是由基因转录本（转录本：由一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟mRNA）过量引起的。由反转录酶—聚合酶连锁反应（Reverse Transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）实验，在出现共抑制现象的转基因受体细胞中积累着高浓度的正常mRNA，但细胞质中却几乎检测不到mRNA，由此说明这类基因沉默不是发生在转录水平，而是属于转录后的调控过程。
而在真菌领域，上述基因沉默则被称为基因压制（quelling），并由Cogoni 等人最先在粗糙链孢霉的转化实验中所发现，其特征是外源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达。作为转录后水平的基因沉默，该发现有力的证据是在实验中发现已获得的稳定态mRNA的大量减少。相较于转基因植物中的共抑制，亦或是真菌中的基因压制，在动物中这类基因沉默则以RNA干扰（RNA interference，RNAi）的形式出现，但三者在本质上具有极大的相似性和可比较性，事实上，后
者正作为遗传学研究中的一种常规基因操纵手段，在遗传材料制备和遗传信息改良等方面正发挥着
基于以上的若干事实，人们提出了许多假设和模型试图来解释和验证共抑制现象存在的分子机理，但无论是RNA阈值模型（Dougherty和Park，1995）、异常RNA模型（Jorgensen等，1998）、RNA介导的病毒抗性模型（Mueller、Lindbo 等，1993）还是现在较为学术界所接受和认同的反义RNA模型（Lee等，1997），也只是能够在一定程度上部分解释了实验中的共抑制现象，并无法圆满阐述清楚这一基因沉默现象的本质。
2.1.4生物自我保护机制
相对于受体细胞的完整基因组而言，导入的经人工修饰的外源基因无疑使具有相当显著外来特征的入侵者。实验证明转导的外源基因在受体中很容易被受体基因组中存在的重组和修复系统所识别，进而引发不同程度的排斥反应，以自我保护基因组的独立和完整性。在受体的自发性基因保护中，导入的外源基因将有极大的可能性在基因自发修复下发生重组，而且这样的外源基因重组是随机的，由其导致的转基因结构异常也将可能致其失活，并最终表现为基因的沉默。
2.2主动基因沉默
在现代分子生物学研究中，无论是转基因还是分子遗传学，都不可避免地需要构建特殊的、非天然的人工实验材料，因此，研究者为了能够获取所能够满足实验要求的样本，常常会有目的地对实验材料进行基因干预改造，并迫使其中部分基因不予表达或激活表达。在这种条件下发生的基因沉默由于是由于人的主观意愿，因而划归为主动基因沉默。事实上，目前研究上使用的主动式基因沉默手段多为RNA干扰技术，在分子水平上并没有改变基因序列本身，而是部分属于转录后水平基因沉默范畴，但在另一类主动基因沉默中，基因敲除作为基因沉默中最为激烈的手段，在相关研究领域也拥有着许多重要应用。
在主动基因沉默技术中，RNAi是一种较为常用的转录后水平的基因阻断技术。其作用机理可简述成通过人为导入与靶基因具有同源性的双链RNA（dsRNA），在dsRNA特异性核酸内切酶（dsRNA specific endonuclease, Dicer）的作用下将dsRNA断裂形成若干个干扰性小RNA（small interfering RNA, siRNA），而后siRNA中的反义链指导合成具有靶向介导能力的RNA诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex, RISC），RISC再切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，并最终通过酶性降解达到干扰基因表达的作用。
基因敲除技术是在20世纪80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的基因打靶技术，是指从分子水平上将一个基因去除或代替，通过改变DNA序列达到基因功能缺失的表象。基因敲除技术主要包含下列技术：构建重组载体，重组
DNA转入受体细胞核内，中靶阳性细胞的筛选以及转基因动物。作为性状消失的极端手段，对于遗传基因功能研究和性状判定具有不可替代的作用。但鉴于基因敲除具有的低成功率前提，故在实践操作上也具有繁琐和高花费的缺点。
3.总结
基因沉默，尤其是主动基因沉默现象及其原理的发现，给现代转基因技术和遗传研究带来了巨大的进步空间，而如何有效得在受体转基因研究和遗传群体构建中应用相应的主动基因沉默技术则是一个极具价值的科研热点。
在上述中可知，RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来的迅速发展使之很快成为功能基因组、转基因和遗传研究的有力工具。通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA，封闭内源基因的表达，从反向遗传的角度研究基因组中未知的基因功能，并在转基因研究中加以有效利用，将极大消除转基因的被动沉默可能。再者，RNAi技术与传统的基因敲除技术相比，其特异性更高，作用也更为迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对受体细胞本身的调控系统却影响不大。在遗传群体构建研究中，已经可以利用RNAi技术对植株定向遗传改造从而得到能够稳定遗传的有利性状实验已经得到了初步成果，对水稻低蛋白质含量试验和拟南芥稳定性状遗传研究的成功即是新技术应用的成果。
基因的沉默是基因表达调控的一种重要的方式，是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制，在外源DNA侵入、病毒侵染和转基因等外源实验中具有相当的普遍性。对基因沉默进行深入研究，可帮助人们进一步揭示生物体基因遗传表达调控的本质，在基因克服沉默现象，从而使外源基因能够更好的按照人们的需要进行有效表达；利用基因沉默在基因改造中有效抑制有害基因的表达，达到获取有利遗传特征的目的，所以研究基因沉默具有极其重要的理论和实践意义。
而在研究基因沉默现象时产生的新技术、新方法，不仅推动了遗传学本领域研究的发展，更是对生物学相关研究领域做出着巨大的贡献，由此产生和带动的经济和科研价值将不可估计。RNAi技术的诞生与应用，不仅能大大推动蛋白质工程的发展，还将可能在未来设计出具有高度特异性地RNAi芯片，通过高通量地筛选药物靶基因，逐条检测基因组的表达抑制情况来明确基因的具体功能。而利用RNAi技术靶向抑制基因的表达，则为改良作物遗传特征开辟了新途径。
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基因沉默与RNAi技术 定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA 与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。 RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 基因沉默是一种RNA干扰技术。 RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA ，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex ，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制. 一、基因沉默的分类及其机制 （一）转录水平基因沉默 转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核 ＲＮＡ合成的失活， 它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种： １．基因及其启动子甲基化 甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率 在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。［４］ 近来的研究表明，发生在转基因启动子５'端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的３'端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。 ２．同源基因间的反式失活 反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种"沉默子"，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 ３．后成修饰作用导致的基因沉默 后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。 ４．重复序列 外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基
利用表达分析和基因沉默方法研究硫代硫酸硫转移酶基因TaTST与小麦抗白粉病反应的关系 作者：贺洋;岳洁瑜;王华忠 作者机构：天津师范大学生命科学学院/细胞遗传与分子调控天津市重点实验室,天津300387;天津师范大学生命科学学院/细胞遗传与分子调控天津市重点实验室,天津300387;天津师范大学生命科学学院/细胞遗传与分子调控天津市重点实验室,天津300387 来源：作物学报 ISSN：0496-3490 年：2012 卷：038 期：002 页码：231-239 页数：9 正文语种：chi 关键词：小麦;白粉菌;硫代硫酸硫转移酶;VIGS 摘要：硫代硫酸硫转移酶参与植物体内的硫代谢、氰化物的清除以及活性氧的生成与清除,与植物抗病反应密切相关.小麦抗、感白粉病近等基因系材料在接种白粉菌后均诱导表达硫代硫酸硫转移酶基因TaTST,并在接种后0～48h内呈现2次诱导峰值,分别与白粉菌初次接触识别和附着胞侵入、吸器形成时间相对应,也与2次氧突发时间对应.TaTST在感病材料上的诱导表达水平明显高于在抗病材料上,由此导致的活性氧过度清除可能是导致感病反应的原因之一.TaTST也参与抗病反应过程.利用病毒诱导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing,VIGS)创造了TaTST 基因沉默的抗病植株.尽管充分发病时间后沉默植株叶片上并未观察到肉眼可见的病斑,但侵染早期白粉菌成功侵入频率的增加和次级菌丝的有限伸长说明TaTST沉默植株抗病水平下降.TaTST沉默导致乳
突致密度下降和H2O2在细胞内的扩散时间延迟.因此,TaTST可能通过调节活性氧的积累和扩散、乳突的形成等小麦-白粉菌互作早期的寄主细胞反应而参与小麦对白粉菌的抗侵入过程.
基因沉默 摘要随着基因技术的迅速发展和广泛应用，在转基因技术实践中首先暴露出来的外源基因不能按照预期设想进行表达的问题越来越显得普遍，而人们对基因沉默现象的不断深入研究和探索，不仅揭示出了基因沉默的发生机制，也在一定程度上推动了新技术的产生和应用，这不仅推动了基因研究领域的发展，更在遗传群体构建、疾病治疗等方面建立了新方法、新体系，为生物学技术的发展做出了贡献。 关键字基因沉默分类机理应用 1.引言 基因沉默（Gene Silencing），又称为基因沉寂，是真核生物细胞基因表达调节过程中的一种特殊生理现象，是指细胞基因在表达过程中受到各种因素的综合作用而导致基因部分区段发生“沉寂”现象，从而失去转录活性并不予表达或表达减少。该现象最先于1986年Peerbolte在转基因植物研究中所发现，随后科学家在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现了基因沉默现象的存在。 转基因沉默是基因沉默现象最为频发和常见的，这也是转基因为何在受体难以百分之百全部表达的因素之一，其基本特征是导入并整合到受体基因组的外源基因在当代或后代中表达活性受到抑制。研究发现，其主要原因是由于转基因之间或转基因与内源基因之间存在着序列同源性，因此转基因沉默又被称为同源性依赖的基因沉默（homology-dependent gene silencing）。 根据沃森-克里克的核酸碱基互补配对模型，基因沉默可能涉及到DNA-DNA、DNA-RNA以及RNA-RNA三种不同形式的核酸分子之间的互作，简单地说就是插入的外源DNA或自身基因区段在核内高浓度的RNA作用下，能够与内源反向DNA 或者RNA进行碱基互补配对，并且在核内被重新甲基化，进而导致基因沉默；而另一种可能则是内源基因与转基因转录生成的RNA之间互补配对生成可被RNases酶性降解的双链RNA（dsRNA），其水解直接导致基因的不表达，即基因沉默效果。从染色体水平上看，基因沉默现象的实质是形成异染色质（Heterochromation）的过程，检查发现被沉寂的基因区段往往呈现出高浓缩状态，显然，这在一定程度上也决定了被沉寂基因的难表达性。实验早已证明，在高度浓缩的基因区段，正常的DNA转录活动是难以进行并维持的，换言之，即一旦形成异染色质进入高度浓缩状态，那么相应区段的基因片段就必然因为不能被
植物转基因沉默的机制及克服方法 专业：植物学学号：220100905010 姓名：潘婷 摘要：植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用，转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。 关键词：转基因沉默；外源基因；DNA甲基化；共抑制 1986年Peerbotte发现转基因烟草中出现转基因沉默(transgene silencing)现象后，研究者对转基因沉默进行了许多深入探索，以期阐明转基因沉默的机制和获得克服手段。 1 转基因沉默机制 转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，现在也把位置效应引起的沉默归到转录水平。 1.1 转录水平基因沉默(TGS)机制 1．1．1 甲基化作用从目前报道看，几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关，DNA甲基化都是从启动子区域开始的，主要发生在基因5’端启动子区域。甲基化通常发生在DNA的GC 和CNG序列的C碱基上，C碱基甲基化不是转基因沉默前提，但对维持基因沉默是必需的。甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白的结合进而抑制转录。 1．1．2 位置效应转基因在宿主细胞基因组中的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。研究发现，转基因烟草中稳定表达的T-DNA
至少有一侧和基因组DNA富含AT的核基质附着区相邻，并且位于端粒附近。而不能稳定表达的T-DNA则位于异染色质及着丝粒旁。1．1．3 重复序列、同源序列等引起的TGS Assaad等对自交转基因(潮霉素抗性基因)植株后代进行分析时发现了重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。它有顺式失活和反式失活2种作用方式。进行多个基因转化时，基因启动子间同源序列相互作用也能引起反式失活。 1．2 转录后水平基因沉默(PTGS)机制 1．2．1 RNA阈值模型 1994年Dougherty等提出RNA阈值模型，认为在细胞质中可能存在mRNA的监控系统。监控系统能促使超量表达的mRNA降解，使细胞内转基因转录物不超过一个特定的阈值。 1．2．2 异常RNA模型鉴于转录后基因沉默并不总是表现出较高的转录水平，而是有一种不同于正常mRNA的异常的RNA(aRNA)存在，English等1996年提出了异常RNA模型，该模型认为aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的活性，RdRp 再以aRNA为模板合成大量约25bp的互补RNA (cRNA)。这些cRNA如果与同源的mRNA相遇就会结合上去形成部分双链结构一dsRNA，而后被双链特异性的Rnase识别、降解。在该过程中，内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合，并被同时降解。这样外源基因的导入，会最终导致内源和外源基因的表达共同受阻，即出现共抑制现象。 1．2．3 双链RNA模型 Waterhouse认为转基因沉默原因在于外源基
《细胞》：不依赖于RNAi的基因沉默机制被发现 来自瑞士日内瓦大学细胞生物学系的研究人员发现了一种不依赖于RNAi（RNA干扰）的基因沉默机制，这为进一步揭示生物体中基因沉默的多样化，以及功能作用提供了重要信息。这一研究成果公布在最新一期的《细胞》（Cell）杂志上。 RNA沉默存在两种既有联系又有区别的途径：siRNA(small interference RNA)途径和miRNA(microRNA)途径。siRNA途径是由dsRNA(double-stranded RNA)引发的，dsRNA被一种RNaseⅢ家族的内切核酸酶(RNA- induced silencing complex，Dicer)切割成21－26nt长的siRNA，通过siRNA指导形成RISC蛋白复合物(RNA-induced silencing complex)降解与siRNA序列互补的mRNA而引发RNA沉默。而miRNA途径中miRNA是含量丰富的不编码小RNA(21－24个核苷酸)，由Dicer酶切割内源性表达的短发夹结构RNA(hairpin RNA，hpRNA)形成。miRNA同样可以与蛋白因子形成RISC蛋白复合物，可以结合并切割特异的mRNA而引发RNA沉默。尽管引发沉默的来源不同，但siRNA 和miRNA都参与构成结构相似的RISC，在作用方式上二者有很大的相似性。 在最近的一项研究中，来自加州大学河畔分校的研究人员发现了一种新的小RNAs分子，而这些小RNAs与近期的研究热点PIWI-interacting RNAs （piRNAs）和repeat-associated siRNAs (rasiRNAs）也不相同，这说明了小RNA家族和小RNA介导的基因调控远比之前预想的复杂。同样在这篇文章中，研究人员也发现基因沉默机制包含有多种途径，他们最新发现酿酒酵母中，反义RNA稳定（Antisense RNA Stabilization）能通过组蛋白去乙酰化引起转录基因沉默。在之前的研究中，酿酒酵母全基因组研究分析揭示出其转录本中包含了大量的反义RNA（antisense RNAs），以及由外切酶体元件（exosome component）Rrp6调控的基因间转录（intergenic transcripts）。通过进一步研究，瑞士的研究人员发现当缺失了Rrp6的功能后，两个PHO84反义转录就会变得稳定，并且抑制了PHO84基因的转录。有趣的是，研究人员在野生型中也发现了同样的现象：在时间性老化（chronological aging）的过程中Rrp6功能缺失也能稳定PHO84反义转录。上位性和染色质免疫共沉（Epistasis and chromatin immunoprecipitation）实验结果说明Rrp6功能的缺失与PHO84基因以及邻近基因的Hda1组蛋白去乙酰化的补充有关，但是组蛋白的去乙酰化受限于PHO84基因，这又说明Hda1活性依赖于反义RNA。因此敲除反义产物，即使是在缺失Rrp6的条件下也会阻碍PHO84基因抑制。这些数据表明反义转录的稳定通过不同于转录干扰的一种机制导致了PHO84基因抑制，而Rrp6功能调节则通过RNA依赖性表观遗传修饰调控基因。 基因沉寂 基因沉寂（Gene Silencing) 也可以被称为“基因沉默”。基因沉寂是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。在染色体水平，基因沉寂实际上是形成异染色质（Heterochromatin)的过程，被沉寂的基因区段呈高浓缩状态。 定义RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子层次上被证实是同一种现象。 原理基因沉寂需要经历不同的反应过程才能实现，包括组蛋白N端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰（由甲基转移酶催化，修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰，后者又被称为'过度’甲基化修饰（Hypermethylation) ) 、以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质（MBP）形成“异染色质”，在上述过程中，除了部分组蛋白的N端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外，有时也许要在其他的组蛋白N端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰，尽管各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉寂”失去转录活性。 作用这个“原则”就是目前尚没有真正完全清楚的“组蛋白密码”（Histone Code)。能够
DNA改性方法： CpG岛(CpG island)，CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛，在哺乳动物基因组中的1~2kb的DNA片段，它富含非甲基化的CpG双倍体。在哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种是分散于DNA序列中；另一种呈现高度聚集状态，人们称之为CpG岛（CpG island）。在正常组织里，70%～90%散在的CpG是被甲基修饰的，而CpG岛则是非甲基化的。正常情况下，人类基因组“垃圾”序列的CpG二核苷酸相对稀少，并且总是处于甲基化状态，与之相反，人类基因组中大小为100-1000bp左右，富含CpG二核苷酸的CpG岛则总是处于未甲基化状态，并且CpG岛常位于转录调控区附近，与56%的人类基因组编码基因相关，因此基因转录区CpG岛的甲基化状态的研究就显得十分重要。人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛约为28890个，大部分染色体每1Mb就有5-15个CpG岛，平均值为每Mb含10.5个CpG岛，CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。 CpG岛经常出现在真核生物的管家基因的调控区，在其它地方出现时会由于CpG中的C易被甲基化而形成5'-甲基胞嘧啶，脱氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身就会存在于DNA中，因此不易被修复，所以被淘汰。故CpG在基因组中是以岛的形式分布的。 CpG表示核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后。CpG对很少出现在人类基因中。然而，在许多基因的启动子（promotor）或“起始”区域周围，甲基化经常被抑制。这些区域包含浓度相对较高的CpG对，与此段区域对应的染色体区段一起被称作CpG岛，其长度通常在几百到几千核苷酸的长度内变化。 许多基因，尤其是管家基因的启动子区，基因的末端通常存在一些富含双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG 岛”（CpG island）。研究碱基G和C在整个基因组内的含量和分布有十分重要的意义。例如在人类基因组内，GC的含量大约为40%；这些GC并不是平均分布在基因组内，在某些DNA片段上其含量可高达60%以上，而在另一些区域则只有33%左右。这种GC含量的差别，在基因表达的调控和基因突变上都可能扮演着重要的角色。例如，在人类基因组内，存在有近3万个CpG岛；在大多数染色体上，平均每100万碱基含有5～15个CpG岛，其中有1.8万多个CpG岛的GC含量为60%～70%。通常，这些CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。例如，除定位于失活X染色体上的基因和印迹基因外，正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。全基因组低甲基化，维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象.。以往的研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一，而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制。 另外，原核生物细菌DNA含有高频率的CpG双核苷，约为1/16，细菌DNA和某些含非甲基化CpG双核苷的多聚核甘酸能够刺激鼠和人淋巴细胞。高等脊椎动物出现CpG双核苷频率为1/50，且多为甲基化，真核细胞和甲基化的多聚核甘酸则不能刺激鼠和人淋巴细胞。CpG结构与细菌DNA同源性要高于脊椎动物细胞。CpG DNA可直接刺激B细胞、巨噬细胞和DCs细胞分泌细胞因子。特别是TH1样细胞因子如IL-12和IL-18；细胞表达协同刺激因子分子，显示增强抗原递呈作用。CpG DNA可诱导强烈的TH1样应答提示这些分子可作为疫苗的佐剂，抵抗各种目标，包括感染性物质，肿瘤抗原，过敏原等。 基因的表现，受染色体上的染色质结构与异染色质（基因无表现或低表现）区域里的胞嘧啶甲基化所影响。举例而言，当胞嘧啶受到甲基化时，会转变成5-甲基胞嘧啶，此作用对于X染色体的去活化、铭印和保护脱氧核糖核酸分子不被内切酶所切断（存在例外）而言相当重要[52]。甲基化的程度在不同生物之间有所差异，如秀丽隐杆线虫便缺乏胞嘧啶甲基化，而在脊椎动物体内则较常出现，大约有1%的脱氧核糖核酸为5-甲基胞嘧啶[53]。5-甲基胞嘧啶容易因自然发生的脱氨作用而变成胸腺嘧啶，也因此使甲基化的胞嘧啶成为突变热点[54]，这也解释了为什么胞嘧啶和鸟嘌呤会集中出现在CpG岛里，因为那里的甲基化作用被压制，没有甲基化的胞嘧啶所产生的突变产物并非胸腺嘧啶，而是尿嘧啶。因为尿嘧啶会相对容易地被更正过来，所以CpG岛内胞嘧啶不易形成突变而会被保留下来。其他的碱基修饰还包括细菌的腺嘌呤甲基化，以及使动质体（一种生物）的尿嘧啶转变成“J-碱基”的糖基化等。 snRNA (smallnuclearRNA，小核RNA）。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的
基因沉默研究进展 摘要：基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者表达减少的现象。基因沉默是基因表达调控的一种重要方式 ,是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制 ,在外源 DNA 侵入、病毒侵染和DNA 转座、重排中有普遍性。对基因沉默进行深入研究 ,可帮助人们进一步揭示生物体基因遗传表达调控的本质 ,在基因工程中克服基因沉默现象 ,从而使外源基因能更好的按照人们的需要进行有效表达;利用基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的表达 ,达到治疗疾病的目的 ,所以研究基因沉默具有极其重要的理论和实践意义[1]。 关键词：基因沉默，转录水平基因沉默，转录后水平基因沉默，病毒介导的基因沉默. 基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。一方面,基因沉默是遗传修饰生物(genetically modified organisms )实用化和商品化的巨大障碍 ,另一方面 ,基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应 ,为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略—RNA介导的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance ,RMVR)[2～4]。 基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现。基因沉默主要发生在两种情况，一种是转录水平上的基因沉默（transcriptional gene silencing, TGS） ,另一种是转录后基因沉默（post- transcriptional gene silencing, PTGS）。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是近几年发展起来的转录后基因阻断技术，RNAi在2002年被Science评为全球十大科技突破之一,作为一种在细胞水平的基因敲除工具,RNAi 正在功能基因组学领域掀起一场革命[5]。 一、基因沉默的分类及其机制 （一）、转录水平基因沉默 转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核RNA合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的RNA而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：1.基因及其启动子甲基化。2. 同源基因间的反式失活。 3. 后成修饰作用导致的基因沉默。 4. 重复序列。 5. 位置效应。 （二）、转录后水平基因沉默 转录后水平基因沉默是指基因在细胞核内能稳定转录，但在细胞质里却无相应稳定态mRNA存在的现象。与转录水平基因沉默不同，转录后水平基因沉默具有逆转性，即受抑制基因通过减数分裂可以恢复表达活性，表现为减数分裂不可遗传性。目前发现主要有以下几种转录后水平基因沉默现象。1. 共抑制。2. 基因压制。3. RNA干扰。 二、植物基因沉默研究进展 基因沉默是普遍存在于植物界的一种防御反应．近年来,转录后水平上的基因沉默(PTGS)在植物中特别是在转基因植物中得到了广泛的研究.PTGS是植物的一种自然防御机制，是指基因能正常地转录，但所转录的mRNA在细胞质内积累量很低或根本检测不到．这是由于细胞核内转录mRNA进入细胞质后，与具
基因表达技术 https://www.doczj.com/doc/418607628.html, 2007年5月16日09:43 生物技术世界 目前，基因表达已经成为生物学、医学和药物开发研究中的主流技术。基因表达就是基因转录及翻译的过程。广义来说，基因表达有两类：分析型和功能型。前者是指检测和定量基因，尤其是在比较两个样本时，如处理/非处理，疾病/正常。功能型的基因表达，目的是获得一定数量的蛋白质。Invitrogen公司的JudyMacemon称，在她的顾客中，对研究基因功能的基因表达/敲除感兴趣的人是采用基因表达制造蛋白质的人的两倍。 cDNA过度表达优势大 经典的基因表达操作常对病变细胞或组织、以及用药治疗之后的情况进行比较。为了验证某种化合物对基因的效果，研究人员用siRNA或反义化合物返回去做敲除试验。这些技术可以让基因或者基因组表现出特殊的沉默现象。OpenBioSystems公司的PaulTodd博士指出，虽然基因敲除很流行，但它不是证实基因性能的唯一方法。 Todd博士把cDNA过度表达称之为基因敲除的“合理逆转”。siRNA是让基因沉默，以确定基因下游的效应，而cDNA 引入许多目标基因的复制样本，引起基因及其下游产物都超表达。很多时候，从cDNA获得的信息要比siRNA的信息要更好，Todd认为这与设计无关。 采用siRNA方法，研究人员必须确定短寡聚核苷酸序列，该方法可以最佳方式敲除目标基因。并非所有的寡聚物都能发挥效用，因此，就无法做到把所有基因的反应都准确预测出来。通常要敲除20~80%的序列，采用cDNA会出现过表达现象，这样就可以提供足够的目标基因用于插入。Todd认为，cDNA可以确保产生更多的信使RNA，也就会产生更多的蛋白质或下游产物。 cDNA优于siRNA的主要优势在于前者具有更广泛的潜在应用范围，可以用股票的短期销售或者是长期交易进行比喻。短期销售只可能赚到原来的股票价格，然而，长期购买，股票可能会翻两倍或者是三倍。siRNA试验的信号只限制于基因原始状态的性能，因为可能从最高水平降低为零。cDNA能正调节一个基因的性能，而且，把目标基因与绿色荧光蛋白相融合，可以直接观察到在活细胞中产生的蛋白质及其分布位置。 基因表达在药物发现上有许多应用。在最近纽约科学院的一次会议上，Avalon制药公司副总裁PaulYoung向大家
RNA干扰基因沉默 基因沉默（gene silencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。一方面，基因沉默是遗传修饰生物（genetically modified organisms）实用化和商品化的巨大障碍，另一方面，基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应，为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略——RNA介导的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance,RMVR）。
转基因植物和转基因动物中往往会遇到这样的情况，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低，这种现象称为基因沉默。 转基因沉默分为转录水平的沉默（TGS）和转录后水平的沉默（PTGS）。TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止导致基因沉默，PTGS是指 RNAi——基因沉默指南 基因沉寂（Gene Silencing) 也可以被称为“基因沉默”。基因沉寂是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。在染色体水平，基因沉寂实际上是形成以染色质（Heterochromatin)的过程，被沉寂的基因区段呈高浓缩状态。 基因沉寂需要经历不同的反应过程才能实现，包括组蛋白N端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰（由甲基转移酶催化，修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰，后者又被称为'过度’甲基化修饰（Hypermethylation) ) 、以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质（MBP）形成“异染色质”，在上述过程中，除了部分组蛋白的N端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外，有时也许要在其他的组蛋白N端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰，尽管各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉寂”失去转录活性。这个“原则”就是目前尚没有真正完全清楚的“组蛋白密码”（Histone Code)。
引起基因沉默的原因 研究表明,引起基因沉默的原因很多,转基因的拷贝数和构型、在植物上的整合位点、转基因的转录水平等都与沉默有关,外界环境如过高的温度、过强的光照也会增加基因沉默发生的几率和产生时间,此外,外源基因的表达还受植物发育因子(如亲本年龄)的影响。因此,植物转基因沉默的作用机制可能不是单一的,而是各种机制共同作用的结果,是植物本身的防御系统和外界环境因素协同作用的产物。转基因沉默可以发生在染色体DNA水平、转录水平和转录后水平三种不同的层次上。 1.染色体DNA水平的转基因沉默 发生在染色体DNA水平的转基因沉默叫做位置效应(positioneffect)。当导入的外源基因随机地插入到宿主基因组时,如果被导入到转录活跃区,就有可能进行高水平的转录,如果外源基因插入转录不活跃区,则只能进行低水平的转录或不能转录。 按照染色质高级结构组织的环状结构模型,核基质结合区(matrixattachmentregions,MARs)作为边界元件与核基质结合,使两个MAR之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环(1oop),并作为隔离子(insulator)阻挡邻近染色质区的顺式调控元件对环内基因的影响,使位于染色体环内的基因可作为一独立的表达调控单位而存在。MAR可能使转基因在受体基因组整合
后形成独立的环状结构,从而提高转基因的表达水平并减少转基因在不同株系表达差异 2.转录水平的基因沉默 发生在转录水平上的转基因沉默叫做转录失活。反向重复的基因或转基因可以进行异位配对,配对的DNA作为信号,使DNA异染色质化或从头甲基化,这样转录过程就会受到抑制。此外,DNA-RNA协同(association)也是造成转录水平基因沉默的原因之一。 （1）转移基因及其启动子甲基化甲基化是活细胞中最常见的一种DNA其价修饰形式,它通常发生在DNA的GC和CN G序列的C碱基上,C甲基化的频率在哺乳动物及高等植物中部比较高。甲基化修饰在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。然而,从所报道的转基因沉默的例子来看,几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关。而发生在DNA的CG和CNG序列上的甲基化并不是植物中转基因转录水平沉默起始的前提,但C碱基甲基化对维持基因沉默是必需的。 （2）多拷贝重复基因多拷贝重复基因序列整合进基因组后,无论正、反都容易形成异位配对,引起基因组防御系统的识别而被甲基化或异染色质化失活。 （3）染色体包装转导基因在染色体上的遗传位点相同,但受染色体包装的影响,产生沉默。当转导基因由染色体区域的正常位点包装到另一区域的位点时,其与转录因子的接触机会就会发
人工miRNA定向基因沉默 摘要：描述一个基因的功能通常包括对功能丧失等位基因的详细的分析。在模式植物例如拟 南芥和水稻中，插入序列索引的收集为潜在无效等位基因分析提供了很大帮助，而这些都可以 通过网站(e.g., https://www.doczj.com/doc/418607628.html,)容易的获取。然而，这对于非模式生物是不可能的，要研 究非模式生物，需要敲除大量的同系物，而且部分缺失基因功能或者调节缺失基因功能不容易 应用，然而当无效等位基因是致死的时，这种方法却很有效。采用定向基因沉默技术的转基因 途径可以替换无效等位基因，也可以用于基因功能的精细研究，例如，通过组织特异性的和可 诱导的基因沉默。 这一章将阐述人工miRNA的产生以及人工miRNA(amiRNAs)作为基因沉默工具在不同植物定向 1.六寡核苷酸：两个是对载体普遍的（A 和B，表一），四个是特异修饰的。 它们的序列是amiRNA设计程序的输出结果。 2．模板质粒：PRS300（包括Arabidopsis athMIR319a）或者PNW55（包括水 稻osa-MIR528） 3.进行PCR，琼脂糖凝胶电泳，以及凝胶提取所需的装置和化学试剂。
图三，构建amiRNA前体的模版质粒——aMIRNA。（a）Plasmid pRS300包含pBluescript SK中的osa-MIR528前体（通过SmaI位点克隆）。（b）质粒pNW55包含pBluescript KS中的osa-MIR528前体（也是通过SmaI克隆）。质粒全部序列是在http://wmd3. https://www.doczj.com/doc/418607628.html,.可获取的。缩写：A,B,寡核苷酸结核位点；T3，T7 ：RNA聚合酶/寡核苷酸结合位点；Amp:氨苄青霉素抗性基因；MCS:多克隆位点。aMIRNA的大小和围绕区域在图四中指示。 图四，图示产生aMIRNA前体的PCR反应。（a）为有寡核苷酸结合位点的模版质粒（图三）；（b）PCR扩增（a）（b）（c）,（c）（a）（b）（c）通过PCR融合产生（d）(d)只有中央部分编码aMIRNA 前体，在底部的图中已列出。缩写：Ath：拟南芥；Osa：栽培稻；A, B, I, II, III, IV：寡核苷酸识别物；MCS：多克隆位点；a), (b), (c), (d)：PCR片段。 3.2.2寡核苷酸要产生一个aMIRNA的转基因，需要六个PCR寡核苷酸引物。四个引物
·综述· 基因功能研究的方法 李新枝,蔡佩玲,牟林春 (成都医学院基础医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室,四川成都 610083) 【中图分类号】 Q78 【文献标识码】 A 1985年在加利福尼亚大学Santa Cruz分校举行的一次会议上,有人第一次提出了共同努力测出人类基因组序列的可能性,虽然这个主意引起了许多人的兴趣,但几乎没有强的支持者[1]。1986年,诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco于《Science》上率先提出人类基因组计划(human geno me project,H GP),旨在阐明人类基因组的3×109个碱基对的序列,发现人类所有基因并阐明其在染色体上的位置,破译人类的全部遗传信息,使人类第一次在分子水平上全面认识自我[2]。自1990年正式启动以来,随着人类基因组计划和其它模式生物基因组研究的顺利进行,生命科学研究已进入后基因组时代。基因组学的研究也从结构基因组学转向功能基因组学的研究。基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步,更大的挑战在于如何确定基因的功能和弄清全部的遗传信息。因而基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题,它将是21世纪生命科学研究的重要领域。经典的扣除杂交(subtractive hybridization)、差示筛选(diferential screening)、cDNA替代差异分析(repre-sentative dife rential analy sis,RDA)以及m RNA差异显示(diferential display)等技术已广泛应用于差异表达基因的鉴定和克隆,但这些技术和策略对于从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究来说是远远不够的[3]。于是,随着后基因组时代的到来,一些能够对大量基因进行全面、系统分析的新技术应运而生。本文主要介绍近年来用于基因功能研究的较新方法。 1 微阵列分析[1] 微阵列(micro array)是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术。它包括cDNA微阵列(cD-NA microarray)和DNA芯片。 其基本原理是:将成千上万条DNA片段(cD-NA、表达序列标签(ex pressed sequence tag,EST)或特异的寡核苷酸片段)按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微阵列就称为DNA芯片。检测时,首先用来自不同生理状态和发育阶段的m RN A作为模板,以放射性同位素或荧光标记的dN TP为底物反转录合成cDNA,再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交,然后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达水平低[3]。 2基因转导技术 基因转导是将目的基因转入某一细胞中,然后观察该细胞生物学行为的变化,从而了解该基因的功能。这是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法之一。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响,故要慎重选择转导系统[4]。常用的基因转导系统有非病毒性和病毒性两种。 (1)非病毒性表达载体:通过DNA直接注射或与多聚赖氨酸、阳离子脂类混合,使目的基因穿过细胞膜。由于转录效率、m RN A的加工、m RNA的稳定性及翻译效率、目的基因的拷贝数以及目的蛋白翻译后加工等因素影响目的基因的表达,因此在选择表达载体时应注意:内含子序列、内部核糖体进入位点(Internal ribo some entry site,IRES)、选择强启动子和增强子及选择高效的多聚腺苷酸加尾信号(Poly A)。 (2)病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术因其转染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。目前已构建的多种病毒载体各有特点:逆转录病毒载体可携带外源基因并整合到靶细胞的基因组中,从而实现目的基因的稳定持久表达,某些亚型几乎能稳定转导100%靶细胞,但缺点是只能感染正在分裂的细胞,且有插入突变和激活癌基因的危险;人腺病毒载体具宿主范围广、装载量大(重组腺病毒最大包装容量为野生型的105%)等优点,是对分 · 57 · 四川解剖学杂志2007年 第15卷 第1期
RNA干扰 科技名词定义 中文名称：RNA干扰 英文名称：RNA interference;RNAi 定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA 被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科） 定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 RNA干扰模式图 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 目录
简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 展开 编辑本段简介 近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 编辑本段发现 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 RNAi实验图片 中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA（sense RNA）和反义RNA均能 有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。
沉默基因 定义：基因沉默（gene silencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。 一方面，基因沉默是遗传修饰生物（genetically modified organisms）实用化和商品化的巨大障碍，另一方面，基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应，为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略——RNA介导的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance,RMVR）。 转基因植物和转基因动物中往往会遇到这样的情况，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低，这种现象称为基因沉默。 基因沉寂（Gene Silencing) 也可以被称为“基因沉默”。基因沉寂是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。在染色体水平，基因沉寂实际上是形成以染色质（Heterochromatin)的过程，被沉寂的基因区段呈高浓缩状态。 基因沉寂需要经历不同的反应过程才能实现，包括组蛋白N端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰（由甲基转移酶催化，修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰，后者又被称为'过度?甲基化修饰（Hypermethylation) ) 、以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质（MBP）形成“异染色质”，在上述过程中，除了部分组蛋白的N端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外，有时也许要在其他的组蛋白N端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰，尽管各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉寂”失去转录活性。这个“原则”就是目前尚没有真正完全清楚的“组蛋白密码”（Histone Code)。能够与甲基化组蛋白结合的蛋白质有sir1/2/3/4，这是一组被称为"Silencing Informative Rep ressor"的蛋白，其中，Sir2就是上文中的“去乙酰化”酶，而Sir1/3/4则负责与甲基化修饰的组蛋白结合"沉寂”相应的染色质为异染色质。 此外，基因沉寂也和DNA的甲基化修饰有关，比如在真核生物基因组中的许多基因的5…端分布有长约1KB( 千碱基对）的“CpG"岛序列（CpG island),其中的“C"芳香环5位可被甲基化修饰，之后，与甲基化修饰的DNA结合蛋白形成“沉寂"区段，使其下游基因不能表达；另外，非编码的RNA分子（non-coding RNA)也参与“基因沉默”过程。这一类型常见于含有重复DNA序列的染色质区，如着丝粒部位的基因沉寂就需要非编码RNA分子的参与。简言之，基因沉寂或者基因沉默是涉及组蛋白甲基化、去乙酰化、乙酰化，DNA的甲基化修饰，甲基化修饰组蛋白结合蛋白Sir2/3/4，甲基化DNA结合蛋白，非编码RNA等等在内的一系列复杂组分的生理反应过程。基因沉寂导致相应区段内的遗传信息不能被转录。 分类：发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫做位置沉默； 发生在RNA转录水平上的转基因沉默叫做转录沉默； 发生在转录后水平的转基因沉默叫做共抑沉默。 发生因素：位置效应、DNA甲基化、重复序列诱发基因沉默、共抑制。 首次发现：基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着和线虫、真菌、昆虫、原生动物以及才鼠中陆续发现。大量的研究表明，环境因子、发育因子、DNA修饰、组蛋 白乙酰化程度、基因拷贝数、位置效应、生物的保护性限制修饰以及基因的过度转 录等都与基因沉默有关。 发生机制：基因沉默发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默（tran-scriptional gene silencing,TGS），另一种是转录后基因沉默(post-transcriptional gene silen-cing,PTGS)，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性降解而使基因失活。在这两种水平上引起的基因沉默都与基因的同源性有关，称为同源依赖性的基因沉默(homology-dependent gene silencing,HDGS)。PTGS在多种生物中有共性，对PTGS的激活和与其相关的RNA降解调控过程有了初步的认识。也发现植物病毒在转基因植物和非转基因植物中都能和转基因一样诱发转录后基因沉