水稻DNA提取，扩增与电泳实验
一、1掌握DNA的提取技术2掌握PCR的相关操作3掌握了解电泳操作方法和步骤
二、实验原理：1、提取DNA一般用水稻幼叶，先用机械方法液氮研磨植物组织使组织细胞破碎，然后加TPS抽提液水浴提取DNA，最后用无水乙醇沉淀DNA即可。（DNA提取原理）2、DNA在高温时可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。（PCR原理）3、琼脂糖凝胶电泳：借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。
三、实验仪器和药品
液氮、镊子、手套、移液枪、枪头2ML和1.5ML离心管、水稻幼叶、研磨棒、琼脂糖、天平、PCR仪、Loading Buffer染色剂、灭菌双蒸水、摇床、离心仪、Taq酶、Mg2+Buffer、dNTP 溶液、引物、TPS抽提液、无水乙醇、电泳槽、GoldView、TBE溶液、微波炉、锥形瓶、量筒、PCR板、PCR盖、水浴箱、Marker
四、实验步骤
1、DNA提取
（1）取水稻叶子少量置于2ML离心管内，加入液氮研磨，带磨成粉状后，加1MLTPS抽提液，然后将离心管放入75℃恒温水浴箱中至少半小时。同时将无水乙醇放入-40℃下冷冻（2）水域结束后，取出离心管放入离心仪中，13600r/min离心12min，然后小心的取出离心管，将上清液转移到1.5ml离心管中0.5ml，加入600ul冷冻的无水乙醇，放入-80℃下冻10min，拿出放入离心仪13600r/min离心5min
（3）到处上清液，倒置，晾干约3h
（4）加入双灭菌水60ml，放入摇床中振荡一夜。
2、PCR
（1）按所需配料表，向PCR板中加入双蒸水,mix,前引物，后引物，然后加入提取的DNA，混匀
（2）将PCR板放入PCR仪中运行SSR程序
3、电泳
（1）称取0.3g琼脂糖和30mlTBE溶液。混匀倒入锥形瓶中，加热溶解混匀。待冷却至不烫手时加入GoldView，混匀，倒入已经插好梳子的配胶槽中，冷却30min至1h
（2）将冷却好的凝胶拔掉梳子后放入电泳槽中（将有点样孔的一端靠近负极）然后按照顺序点样，每个样的用来那个为4ul，在中间的空上点Marker溶液3ul
（3）打开电泳开关，电泳32min左右
（4）电泳结束后，将胶取出，放入透视镜下照射，拍照，读带
五注意事项
1、提取dna的时候用乙醇是沉淀时，必须将乙醇冰冻
2、在PCR之前加2ulDNA时要将枪头插入液面下
毛细管电泳实验报告 高乃群S0 实验目的 1.了解毛细管电泳实验的原理 2.掌握毛细管电泳仪的操作方法,并设计样品组分的分析过程. 3.学会处理实验数据,分析实验结果. 实验原理C E所用的石英毛细管柱, 在pH>3情况下, 其内表面带负电, 和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下, 双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗, 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和, 正离子的运动方向和电渗流一致, 故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反, 但因电渗流速度一般都大于电泳流速度, 故它将在中性粒子之后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。 电渗是CE中推动流体前进的驱动力, 它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动, 使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。 一般来说温度每提高1℃, 将使淌度增加2% (所谓淌度, 即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离)。降低缓冲液浓度可降低电流强度, 使温差变化减小。高离子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁, 并可产生柱上浓度聚焦效应, 防止峰扩张, 改善峰形。减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚, 但细管径使进样量减少, 造成进样、检测等技术上的困难。因此, 加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。
实验设备：电泳仪。仪器及试剂： 缓冲溶液(buffer)：20 mmol/L Na 2B 4 O 7 缓冲溶液。1mol/L NaOH溶液，二次 去离子水。未知样饮料（雪碧和醒目） 1．实验步骤仪器的预热和毛细管的冲洗：打开仪器和配套的工作站。工作温度设置为30℃，不加电压，冲洗毛细管，顺序依次是：1 mol/L NaOH溶液5 min， 二次水5 min，10 mmol/L NaH 2PO 4 -Na 2 HPO 4 1:1缓冲溶液5 min，冲洗过程中出 口(outlet)对准废液的位置，并不要升高托架。 2．混合标样的配制：毛细管冲洗的同时，配制标样苯甲酸浓度依次为、、、、1 mg/ml。 3．做标准曲线：待毛细管冲洗完毕，取1 ml混合标样，置于塑料样品管，放在电泳仪进口(Inlet)托架上sample的位置，然后调整出口(outlet)对准缓冲溶液(buffer)，升高托架并固定，然后开始进样。进样压力30 mbar，进样时间5 s。进样后将进口(Inlet)托架的位置换回缓冲溶液(buffer)，切记换回buffer 的位置！选择方法，修改合适的文件说明，然后开始分析，电压25 kV，时间约10 min。 4．未知浓度混合样品的测定：方法与条件同上，测试未知浓度混合样品，分析时间约25min，据苯甲酸钠标准曲线测雪碧与醒目这两种饮料中的苯甲酸钠的
XXX有限公司SDS-PAGE 电泳的测定方法 文件编号XXXX-02 制定部门研发部 版本A/0 页码1/3 生效日期2014/4/9 一、目的 建立SDS-PAGE电泳的测定方法,确保电泳检测的准确性，保证电泳的安全性、有效性。 二、范围与权责 适用于本公司的所有成品以及中间体的分析，由化验员负责采样检测。 品控主管负责审核。 三、原理 SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMw=k-bX。式中：Mw为分子量；X为迁移率；k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对数分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 四、实验仪器及试剂 1.DYCZ-24DN 双垂直电泳仪 2.DYY-8C 电泳仪电源 3.STS-2A 脱色摇床（水平） 4.标准蛋白Marker 5.平皿：直径150mm 6.TEMED:四甲基乙二胺 7.DTT:二硫苏糖醇 8.储存液 ①2M Tris-HCl缓冲液：称取24.2g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至8.8， 待室温，加蒸馏水至100ml。 ②1 M Tris-HCl缓冲液：称取12.1g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至6.8， 待室温，加蒸馏水至100ml。 ③10%SDS溶液：称取10g SDS ，加蒸馏水溶解至100ml。 ④50%甘油：50ml甘油加50ml蒸馏水，混合均匀。 ⑤1%溴酚蓝：100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌至完全溶解，水相针式过滤器过滤除去聚 合的染料。 9. 工作液 ①A液：30%丙烯酰胺储存液，丙烯酰胺是一种神经毒素，可通过皮肤被人体吸收并富集。操 作时要避免皮肤接触，并带合适的口罩于通风橱中进行。 ②B液—分离胶缓冲液：取75ml 2M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，加21ml蒸馏水，混 合均匀，4℃保存数月。 ③C液—浓缩胶缓冲液：取50ml 1M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，，加46ml蒸馏水，混 合均匀，4℃保存数月。 ④10%APS：称取1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解后，水相针式过滤器过滤分装到EP管中，
R T-P C R的实验原理与 操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 (一) 反转录酶的选择 1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。 (二) 合成cDNA引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小。 3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。生物科研https://www.doczj.com/doc/4c9818697.html, 二、实验耗材与试剂 1．RNA提取" target="_blank" >RNA取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒
血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告 实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验日期实验地点xx实验室 合作者xxx 指导老师xxx 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法； 1.2.了解电泳技术的一般原理； 1.3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。 二、实验原理 2.1.血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。 血清蛋白质等电点分子量占总蛋白的％ 清蛋白 4.64 69,000 57～72 α1－球蛋白 5.06 200,000 2～5 α2－球蛋白 5.06 300,000 4～9 β－球蛋白 5.12 90,000～150,000 6.5～12 γ－球蛋白 6.85～7.3 156,000～950,000 12～20 缓冲液pH=8.6，pI＜pH。
血清蛋白带负电荷，在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图 血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带 2.3.①膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带；②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①样品：健康人血清（新鲜、无溶血）；②巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L）；③氨基黑10B染色液；④漂洗液；⑤洗脱液：0.4mol/NaOH溶液。 3.1.2.实验器材：①V-1100分光光度计（×1）；②恒温水浴箱（×1）；③试管（×6）、试管架（×1）；④1000μL加样枪（×1）、加样枪架（×1）；⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）；⑥培养皿（×5）；⑦点样器或载玻片（×1）；⑧平头镊子（×2）；⑨剪刀（×1）；⑩电泳槽（×1）；?直流稳压电泳仪（×1） 3.2.实验步骤 1．准备与点样：①取2×8cm的膜条；②亚光面距一端1.5cm处取一点样线；③充分浸透在巴比妥缓冲液中；④取出膜条，用滤纸吸去多余的缓冲液；⑤点样器下端粘上薄层血清；⑥垂直点样。 点样示意图：
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合
对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker（分子量标准）(TaKaRa)；D2000(TianGen)；BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）；加样缓冲液（6x）：溴酚黄；电泳缓冲液（1×TAE）；溴化乙锭（EB）； 3、仪器及器具 （1）移液器、吸头、锥形瓶 （2）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。 （3）紫外透射仪、微波炉、电子天平 四、操作步骤 1.器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。 2.配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸，然后量取一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶中，再称取相应量的BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）倒入锥形瓶中，摇匀并
RT-PCR实验方法总结大全 RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。 要求: 1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng 或1ug。 2. RT按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA 存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须 在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上,还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?https://www.doczj.com/doc/4c9818697.html,问题: 在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?请高手指教! 解答: 1.RT-PCR有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE;引物的(最好产物短点;若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样;体系的均一性等。 3.RACE 我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico,但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法,而另一个基因的3’UTR 却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无 RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。 有关内参: RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些,最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。 问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍。请教mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度? 答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just
多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测 一、实验目的： 1、了解PCR技术的基本操作 2、理解PCR的原理 3、讨论PCR的应用 二、实验原理： PCR是一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增DNA片段的技术，这一技术需要模板、四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行DNA的解旋和聚 1、PCR反应组分 细胞内DNA复制条件分析： 2、PCR反应条件
PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR 仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。 (!)变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。 (2)复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 (3)延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。 3、PCR产物的检测 (1)紫外分光光度计 DNA在260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出DNA的含量。 (2)琼脂糖凝胶电泳 DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker（不同已知碱基
对大小的DNA片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。 三、实验仪器及试剂 7种PCR组分微量可调移液器离心管 PCR仪水平电泳槽电泳仪电源紫外分光光度计 250ml锥形瓶(封口膜) 记号笔卫生纸 四、实验步骤 1、DNA体外扩增 (1) 将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min），使管壁没有残留药品，在引物 I 和引物II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水（ddH2O），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。 (2)向装有Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分： 原有的Taq DNA 聚合酶有15ul，此时混合液体系共计500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行） (3)共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。 (4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCR仪上进行DNA扩增。 2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA （1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。 （2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取1g的琼脂糖粉，加入100ml 1x电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，
PCR扩增反应 一、实验原理 PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。 PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。 变性 退火 延伸 图反应历程
二、实验材料 1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂 三、操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取（见上一组） 3·反应程序： 将RAPD反应试剂加入EP管中 轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子 打开PCR反应仪输入以下反应数据 ●94 摄氏度预变性5min ●94摄氏度变性40s ●40摄氏度退火40s ●72摄氏度延伸1min 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min 仪器为Model MyGene 25 Plus 三、注意事项 1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性 及全部放入反应体系中。 2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂 时都要换新的灭菌Tip尖。 3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚 体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
凝胶电泳实验报告模板
降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲，D N A 和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子( Polyanions ) 。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳；按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和PAGE凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类方法来学习的。 3.1.1琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他
电泳实验细节 实验步骤操作要点： ① 每组将2只50 mL 、2只100 mL 容量瓶，3只200ml 烧杯洗净待用。 ② 用100ml 的容量瓶准确配制0.10 mol/L 的KI 、AgNO 3各100 mL 待用，并配置0.010 mol/L 两种溶液各50 mL 备用。 ③ 用0.010 mol/L 的KI 和AgNO 3分别配制0.005mol/L 的KI 和AgNO 3新鲜溶液100 mL 待用。 ④ 在洗净的200 mL 烧杯中准确移入0.005 mol/L 的KI 26.0 mL ，在搅拌条件缓缓滴入22.0 ml 左右的0.005 mol/L 的AgNO 3，直至形成透明晶莹的AgI 溶胶。 ⑤ 将制备好的溶胶沿洗净的电泳管中央细管缓缓加入，使溶胶高度与电极管口插入的电极头部同高（图二中刻度6）。 ⑥ 沿电泳管的管壁（图中2）滴入0.005mol/L 的KNO 3辅助液，并且使辅助液要高出铂片约2 cm （图中刻度5），将滴加完KNO 3的溶液静置8-10分钟，观察辅助液与胶体间有无界面，无界面则重做。 ⑦ 打开电源之前,检查电源粗调旋钮是否在零位,若不在:一定要调至零点,然后再打开电源;再分别调节粗调 、细调两个旋钮,使电压稳定在160伏，电泳一段时间，使负极一端界面下降2.0 cm （即图中刻度5到刻度6）,记下移动所用时间（s ）.注意:关闭电源时, 电压粗调旋钮也必须调至零点,方可关掉电泳电源开关。 ⑧ 用导线测量两电极铂片间溶胶的长度。 相关公式：)]/(/[t /h 43002 L V E ）（πηζ?= h ：2cm ,E=81 ,V=160V , η：在试验温度下水的黏度80，L ：胶体的长度 ，t ：上升所用时间。
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在 固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻 璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝 胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动 到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存 实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。 实验材料和试剂 （一）实验样品 质粒pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 5．0.7% 琼脂糖凝胶
一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。 附： ⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)： Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。 ⑵加样缓冲液的配制： 0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制： 称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染
RT-PCR实验步骤 一、总RNA提取 1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。 2. 震荡30s。 3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。 4. 12000×g，4℃离心，15min。 5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。 6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。 7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀 8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。 9. 7500×g，4℃离心，10min。 10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。 11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280 12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。 二、逆转录合成cDNA第一链 反应体系如下
混匀快速离心一次反应条件如下 -20℃ 冰箱冻存三、PCR反应 混匀快速离心一次反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存 取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。 100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。 RT-PCR实验方法总结1,2 RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？https://www.doczj.com/doc/4c9818697.html, 问题： 在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！ 解答： 1.RT-PCR有两种做法： 条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR 的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应
琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 凝胶电泳操作注意事项： 1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
琼脂糖加样时候注意事项： 1、用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。 2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。 3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。 4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。 5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。 6、电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA 带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。 7、在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。 8、如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 （一）反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 （二）合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。 用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源 于 rRNA。 2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有