扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。文章主要讲述该技术的原理、流程及特点，并从以下三个方面讲述该技术的应用情况：动物学方面，讲述其在动物遗传学，动物系统学，性别鉴定与繁殖行为研究上的应用；植物学方面，讲述其在种质资源鉴定，作物育种上的应用；医学方面，讲述其在肿瘤，遗传病，流行病学方面的进展。文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。
关键词：AFLP，分子标记技术，应用
目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Mo1ecular Markers) [1]。分子标记一般指DNA标记。分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类：(Ⅰ)以电泳技术
（Ⅱ）和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。
以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。（Ⅲ）基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。其中，扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法，已获欧洲专利局的发明专利。该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点，近年来广泛应用于生命科学各项研究中。
1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点
1.1. AFLP分子标记技术原理
AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。
进行AFLP分析时，一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切，一种为低频剪切酶，识别位点为六碱基的rare cutter；另一种为高频剪切酶，识别位点为四碱基的frequent cutter。双酶切产生的DNA片段长度一般小于500bp，在AFLP反应
中可被优先扩增，扩增产物可被很好地分离，因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切。目前常用的两种酶是4个识别位点的Mse I和6个
识别位点的EcoR I。
AFLP接头和引物都是由人工合成的双链核苷酸序列。接头(Artificial adapter)一般长14～18个碱基对，由一个核心序列(Core sequence)和一个酶专化序列(Enzyme-specific sequence)组成。常用的多为EcoR I和Mse I接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物
的结合位点。AFLP引物包括三部分：5′端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence，CORE)，限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence，ENZ)和3′端的带有选择性碱基的粘性末(selective extension，EXT)。
1.2. AFLP分子标记技术流程
AFLP分子标记技术包括3个步骤：(Ⅰ)DNA的准备。即DNA的酶切以及与人工合成的寡
聚核甘酸接头(artificial oligonucleotide adapter)连接。为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用双酶酶切，在基因组上分别产生低频切口和高频切口。(Ⅱ)选择性扩增酶切片段。AFLP 引物包括与人工接头互补的核心序列(CORE)、限制性内切酶识别序列(ENZ)和3′端选择性
碱基三部分。一般用不带或带1个选择性碱基的引物进行预扩增，然后用带2～3个选择性碱基的引物进行再扩增。所用引物可用放射性或荧光标记。(Ⅲ)AFLP标记的统计。AFLP
产物通过聚丙酰胺变性凝胶电泳(SDS—PAGE)检测样品的多态性，可灵敏地分辨只有一个
碱基差异的不同DNA片段。[6](图1)
图1. AFLP分子标记技术流程图
1.3. AFLP分子标记的特点
（1）DNA需要量少，检测效率高，理论上可产生无限多的AFLP标记。一个0.5mg的DNA 样品可做4 000个反应。由于AFLP分析可采用多种不同类型的限制性内切酶及不同数目的选择性碱基，因此理论上AFLP可产生无限多的标记数并可覆盖整个基因组。
（2）多态性高。AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，具有较强的多态分辨能力。每个反应产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到的标记数为50～100个，能够在遗传关系十分相近的材料间产生多态性，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。Becker等(1995)对多态性很差的大麦进行AFLP 分析，仅用16个引物就定位了118个位点[7]。
（3）)可靠性好，重复性高。AFLP分析采用特定引物扩增，退火温度高，使假阳性降低，可靠性增高。AFLP标记在后代中的遗传和分离中遵守孟德尔定律；种群中的AFLP标记位点遵循Hardy—Weinberg平衡。
（4）对DNA模板质量要求高，对其浓度变化不敏感。AFLP反应对模板浓度要求不高，在浓度相差1000倍的范围内仍可得到基本一致的结果。但该反应对模板DNA的质量要求较为严格，DNA的质量影响酶切、连接扩增反应的顺利进行。
2. AFLP分子标记技术的应用
AFLP作为一种较新的分子标记，近10年来，AFLP技术获得了很大进步，并展示出良好的发展前景，已经广泛应用于生命科学研究的诸多领域，如动物学、植物学、医学等方面。
AFLP技术自发明以来，作为一种重复性好、分辨力高的DNA标记，已经成为生命科学各领域，尤其是分子遗传学研究的一种重要工具和手段。近年来，随着技术的不断改进和完善，该方法更加方便和易于操作，应用范围也在不断扩展。该技术也存在着一些不足之处，如对样本DNA的质量要求很高从而易于导致偏差，设备费用较高等，但AFLP技术与microsatellites技术、序列信息的综合分析可作为遗传变异分析的主要工具。因此，研究者应综合考虑AFLP技术的优点和局限，根据特定的研究内容和需要加以选择。
实验六■限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP） —、实验目的 学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP ）遗传标记的基本原理和检测方法。 二、实验原理 第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等,导致酶切片段大"俊生了变化,这种变化可以通过 PCR ,酶切及琼脂糖凝胶电泳逬行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因走位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。 三、仪器、材料与试別 （-）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统 （二）材料与试列：Hind JU限制性内切酶,10xM Buffer,待分析的PCR产物,DL2000 DNA Marker, 6xLoading Buffer （上样缓冲液），灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溟化乙锭EB ,致癌，请带手套操作）,0.5%TBE （电泳缓冲液1 四、实验步骤 1、Hind m限制性内切酶酶切 反应体积（10pl ）f在0.2ml Eppendorf管中依次加样： 10xM buffer i ML ddH2O 5.5 pL Hind 皿0.5 pL PCR产物 3 ML 37°C水浴消化2h ,消化产物全部用于琼脂糖检i则。 2、琼脂糖凝胶电泳 配置1.5%琼脂糖凝胶，取10pl酶切产物+1川上样缓冲液280V恒压电泳。DNA带负电荷, 电泳时
DNA从负极向正极泳动。待泳动至凝胶的1/2-2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。 五、作业 写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。（画图） M12 34 5678 9 10 Hind HI内切酶识别位点：AIAGCTT TTCGATA
限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP) 一基本原理 各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP). 二主要材料 DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。 三方法步骤(图1) 图1
(一) 样本DNA制备 采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。 (二) 限制性内切酶降解样本DNA 根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。该步骤必须保证酶解完全。如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。酶解的时间根据实际情况而定。 (三) 电泳 电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。时间由几小时到24小时不等。 (四) 转印 所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。转印的方法一般有三种。根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。 1 盐桥法；也叫毛细管转移法。先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×
基因多态性 多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。 基因多态性分类生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入。人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异，以及双等位基因的转换或替换。按引起关注和研究的先后，通常分为3大类：DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性、单核苷酸多态性。 DNA片段长度多态性DNA片段长度多态性（FLP），即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。又称限制性片段长度多态性，这是一类比较普遍的多态性。 DNA重复序列多态性DNA重复序列的多态性（RSP），特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，主要表现于重复序列拷贝数的变异。小卫星（minisatellite）DNA由15~65bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20kb，重复次数在人群中是高度变异的。这种可变数目串联重复序列（VNTR）决定了小卫星DNA长度的多态性。微卫星（microsatellite）DNA 的基本序列只有1~8bp，而且通常只重复10~60次。 单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNP），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，在CG序列上频繁出现。这是目前倍受关注的一类多态性。 SNP通常是一种双等位基因的（biallelic），或二态的变异。SNP大多数为转换，作为一种碱基的替换，在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是新一代的遗传标记。 遗传背景知识遗传和变异各种生物都能通过生殖产生子代，子代和亲代之间，不论在形态构造或生理功能的特点上都很相似，这种现象称为遗传（heredity）。但是，亲代和子代之间，子代的各个体之间不会完全相同，总会有所差异，这种现象叫变异（variation）。遗传和变异是生命的特征。遗传和变异的现象是多样而复杂的，正因为如此，才导致生物界的多种多样性。
扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。文章主要讲述该技术的原理、流程及特点，并从以下三个方面讲述该技术的应用情况：动物学方面，讲述其在动物遗传学，动物系统学，性别鉴定与繁殖行为研究上的应用；植物学方面，讲述其在种质资源鉴定，作物育种上的应用；医学方面，讲述其在肿瘤，遗传病，流行病学方面的进展。文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。 关键词：AFLP，分子标记技术，应用 目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Mo1ecular Markers) [1]。分子标记一般指DNA标记。分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类：(Ⅰ)以电泳技术 （Ⅱ）和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。 以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。（Ⅲ）基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。其中，扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法，已获欧洲专利局的发明专利。该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点，近年来广泛应用于生命科学各项研究中。 1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点 1.1. AFLP分子标记技术原理 AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。
1、朊粒病的共同特征中不包括（） 1.潜伏期长，达数月、数年甚至数十年 2.一旦发病呈慢性、进行性发展，以死亡告终 3.表现为海绵状脑病或蛋白质脑病 4.产生严重反应和免疫病理性损伤 2、下面哪种酶是在重组DNA技术中不常用到的酶（） 1.限制性核酸内切酶 2.DNA聚合酶 3.DNA连接酶 4.DNA解链酶 3、长期接触X射线的人群，后代遗传病发病率明显升高，主要原因是该人群生 殖细胞发生（） 1.基因重组 2.基因突变 3.基因互换 4.基因分离 4、抗VD佝偻病属于：（） 1.常染色体显性遗传病 2.常染色体隐性遗传病 3.X连锁显性遗传病 4.X连锁隐性遗传病 5、法医DNA技术中的三大基本技术指（） ①DNA 指纹技术②荧光显微技术③PCR 扩增片段长度多态性分析技术④线 粒体DNA 测序 1.①②③ 2.②③④ 3.①②④ 4.①③④ 6、相互连锁的两个基因位于（）上 1.同源染色体 2.同一染色体 3.非同源染色体 4.不同对染色体 7、关于核糖体的移位，叙述正确的是（） 1.空载tRNA的脱落发生在“A”位上
2.核糖体沿mRNA的3’→5’方向相对移动 3.核糖体沿mRNA的5’→3’方向相对移动 4.核糖体在mRNA上一次移动的距离相当于二个核苷酸的长度 8、Western blot是（） 1.检测DNA的方法 2.检测RNA的方法 3.检测蛋白的方法 4.检测酶的方法 9、针对耐药菌日益增多的情况,利用噬菌体作为一种新的抗菌治疗手段的研究 备受关注。下列有关噬菌体的叙述,正确的是（） 1.利用宿主菌的氨基酸合成子代噬菌体的蛋白质 2.以宿主菌DNA为模板合成子代噬菌体的核酸 3.外壳抑制了宿主菌的蛋白质合成,使该细菌死亡 4.能在宿主菌内以二分裂方式增殖,使该细菌裂解 10、a和b是不同顺反子的突变，基因型ab/++和a+/+b的表型分别为（） 1.野生型和野生型 2.野生型和突变型 3.突变型和野生型 4.突变型和突变型 11、法医DNA科学涉及的学科有（） 1.分子遗传学 2.生物化学 3.生物统计学 4.以上都是 12、下列哪种碱基不属于DNA/RNA的碱基（） 1.腺嘌呤 2.鸟嘌呤 3.次黄嘌呤 4.胸腺嘧啶 13、要使两对基因杂合体自交后代群体纯合率达到96%以上，至少应该连续自交 （） 1.4代 2.5代 3.6代 4.7代
. 人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂 . . ⑴口腔拭子DNA抽提试剂盒。 ⑵琼脂糖。 ⑶1×TAE电泳缓冲液：980ml蒸馏水中加入50×TAE母液20ml。 ⑷50×TAE母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸28.55ml，定容至500ml。
实验六、限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的 学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。 二、实验原理 第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。 三、仪器、材料与试剂 （一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统 （二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。 四、实验步骤 1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切 反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样： 10xM buffer 1 μL ddH2O 5.5 μL Hind Ⅲ0.5 μL PCR产物 3 μL 37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。 2、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。 五、作业 写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。（画图） M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTT TTCGA ↑A AB AA BB 2000 750 500 250 1000 100
人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂
06级研究生班分子生物学期终考试试卷（A卷）标准答案 一、名词解释： 1、基因家族：是指核昔酸序列或编码产物具有一定程度同源性的一组基因. 2、m RNA的选择剪接：是指真核细胞基因表达所转录出的前体mRNA的剪接过程中，参加拼接的外显子可以不按其在基因组的线性分布次序拼接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的mRNA中是可以选择的。这种剪接称mRNA选择剪接。 3、R NA干涉技术是指由短的双链RNA诱导的同源RNA降解的过程，可使基因的表达受到抑制。它是在基因的转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的方法。 4、基因定点诱变：指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程, 称为基因定点诱变. 5、错义突变：指DNA分子中碱基的取代，经转录产生的mRNA后，相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质屮的氨基酸组成和排列顺序发生改变。传基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中，通过外源基因与 细胞染色体DNA之间随机重组的发牛:而将外源基因插入到受体细胞染色体DNA 上的过程。 .填空题：每空1分，共25分 1、获得启动子、增强子；基因易位；原癌基因扩增；点突变 2、同义突变；错义突变；无义突变；移码突变 3、限制性片段长度多态性；微卫星序列；单核昔酸多态性 4、一条多肽链；编码序列；两侧的侧翼序列；插入序列
5、基因添加（增补）；基因干预；基因置换:导入白杀基因；基因修饰 6、点突变；DNA多态性 7、旁观者效应 8、核酸分子杂交；PCR技术 三?单项选择题（每题1分，共15分?） 1-5 （ABBBA）6-10 （ CACDC）11-15 （ ADDDA） 四、问答题 一、简述转座作用的遗传学效应（4分） 1、转座引起插入突变（1分） 当插入序列或转座子插入某个基因的操纵序列前时，可引起操纵子后的结构基因表达失活。 2、转座可产生新基因（1分） 如杲转座子上带有某些抗药性基因，它一方面会造成靶位点DNA突变，同吋会使该位点产生抗药性。 3、转座可出现染色体畸变发生（1分） 当转座发生在宿主DNA原有位点吋，往往导致转座子两个拷贝之间的同源重组，引起DNA的缺失或倒位。 4、转座可以引起生物进化（1分） 由于转座作用，使一些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，也可能产生上些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。
王义权老师（6题） 1、什么是DNA分子标记？ DNA是生物遗传信息的载体，任何生物的遗传信息都具有种属特异性。生物体一切具有其种属特异性的特征，均可作为标记。DNA分子标记是DNA分子中能够反映生物种属特异性的序列特征，这种特征可以用多种方法揭示。 2、DNA分子标记的种类有哪些？ DNA分子标记有：限制性长度多态性RFLP、PCR-RFLP、CAPS、DNA指纹、随机扩增多态性RAPD、序列特征扩增区SCAR、位点特异性PCR（AS-PCR）、单链构象多态性SSCP、扩增片段长度多态性AFLP、序列分析、单核苷酸多态性SNP、表达序列标签EST、序列标签位点STS、简单序列重复SSR、简单序列长度多态性SSLP、微卫星序列DNA、VNTR等。 3、DNA分子标记有哪些用途？ 在基因组研究中的作图； 动植物遗传育种中的应用； 医学遗传学和疾病的诊断； 传染病的病原生物检测：如SARS，禽流感病毒； 生物样品的检验如海关检疫、法医鉴定、中药材鉴定等； 在动物学研究中的应用。 4、简要说明RFLP的原理并举例说明其应用。 RFLP的原理是限制性内切酶（II型酶）对特定序列的识别，并在识别位点专一性地将双链DNA切开。多数限制性内切酶识别的是DNA分子中4~6 bp的特征序列，而基因组DNA分子中散布着多种内切酶的识别序列，故可将不同生物的DNA分子切成长短不一的DAN片段。每4n bp处有一切点，理论上切点的频率为基因组总长/ 4n bp，因此对某一特定基因组，识别位点碱基数多的限制酶，在该基因组中的识别位点数就少；反之就多。切点的多少可由酶切后的DNA片段长度检验。可以应用于物种遗传多样性分析。 5、举例说明DNA分子标记在动物学研究中的应用。 DNA分子标记在动物学研究中的应用包括估算遗传距离、重建系统发生树、分析种群结构及分子生态学、测定种群遗传多样性及应用于保护生物学、系统地理学、鉴定物种或种群等。 例：厦门海域文昌鱼的研究：通过设计Cytb和12S rRNA基因扩增引物，PCR扩增，测序和序列比对、MEGA数据分析，得出结论厦门有2种文昌鱼，二者的遗传距离达到21.13%；其中有一种(来自黄厝)与来自日本海域的文昌鱼的遗传距离只有0.56%；详细的观察、测量与比较，进一步确定其作为2个不同的物种在厦门海域的存在。 6、名词解释 随机扩增多态性RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)：根据在庞大的基因组DNA中存在的许多短的颠倒重复序列。用单一引物，在较低的复性温度下，可以将基因组中两个相邻的颠倒重复序列间的DNA片段扩增出。通过琼脂糖凝胶电泳等分离手段，可将扩增产物按片段大小分离，形成特定的电泳谱带。 单链构象多态性SSCP(Single Strand Conformational Polymorphism)：DNA单链在变性凝胶电泳中的迁移速率不仅与DNA片断长度有关，还与特定序列形成的特定空间构象有关。 扩增片段长度多态性AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)：用限制酶切基因组DNA后，装上适当接头，再用选择性引物扩增，可得到长度多态性很好的DNA片段。 表达序列标签EST(Expressed Sequence Tag)：从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端
基因多态性的检测方法 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性 (longth polymorphism)。 基因多态性的主要检测方法简述如下： 1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时， 钠 问 亢兔扛銎 蔚某ざ染筒煌 此 降南拗菩云 纬ざ榷嗵 裕 贾孪拗破 纬ざ确⑸ 谋涞拿盖形坏悖 殖莆 嗵 晕坏恪Ｗ钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。 3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR 扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。 4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。 5. PCR-SSP法：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出
1.限制性内切酶一般保存在（50%）浓度的甘油溶液中。 2.限制性图谱与限制性片段长度多态性（RFLP）图谱的最显着区别在于（A） 3.A.前者是物理图谱后者是连锁图 4.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（C） C.只能作用于双链DNA 5.已知某一内切酶在一个环状DNA上有4个切点，当用此酶切割该环状DNA，可以得到（4）个片段 6.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶星星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（5%）以下 7.在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制哪一项最好（D）D.酶量 8.DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太可能（C） A.蛋白质（如BSA）同DNA结合 B.有外切核酸酶污染 C.酶失活 D.酶切条件不适合 切口与gap缺口的区别在于（A） A.前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指DNA的单链中有较小的缺失 9.限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主），菌株或生物型。命名时（A） A.属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） 10.以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的（A） A.识别相同序列的限制酶称同裂酶 B.可以产生相同的粘性突出末端的限制酶称同裂酶 C.同裂酶的切割位点一定相同 D.同裂酶的切割位点不相同 11.下列哪一种酶作用时需要引物（B） A.末端转移酶 B.反转录酶连接酶D.限制酶 12.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下述描述中只有（C）不恰当 A.由作用于同一DNA序列的两种酶构成 B.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 C.不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 D.这一系统的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 13.限制性内切核酸酶可以特异性地识别（C.双链DNA的特定碱基序列） 14.在大肠杆菌中，大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶，以下选项中哪一种酶不包括在内（D） A.dam B.dcm（） C.EcoKⅠ D.SssⅠ 15.在大肠杆菌中，至少有3种依赖于甲基化的限制系统，以下选项中不属于这3种的为（C） A.mcrA B.mcrBC C.mcrD D.mrr 16.下面有关限制酶的叙述哪个是错误的（A） A..限制酶是外切酶而不是内切酶 B.同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的 C.一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生粘末端 D.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA，产生平末端 连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，下列对DNA连接酶的描述中，哪项是正确的（A） A.将双链DNA分子中的5'磷酸基团同3'－OH末端重新形成磷酸二酯键 B.作用时不消耗能量 C.需要Mn2+等二价辅助离子 D.也可以连接RNA分子 1.氨苄青霉素的工作原理为（A） A.可以抑制细胞壁肽聚糖的合成 3.载体所具备的特点中，以下描述不恰当的是（B） A.必须具备复制起点，能够自主复制 B.必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入 C.有一定的筛选标记，用于筛选 D.必须具有较高的拷贝数，便于制备 4.复制子由三部分组成，以下不属于的为（D）（）
分子生物学复习范围 一．名词解释 1.基因组：一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。 2.回文结构：II类限制性内切酶的DNA识别位点通常为4,5或6个核苷酸长度的序列且 呈二元旋转对称称为回文结构。 3.基因重叠：基因组DNA中某些序列被两个或两个以上的基因所共用。基因重叠现象在 病毒基因组中普遍存在。 4.细胞癌基因：存在于正常细胞基因组中的癌基因，在正常情况下处于静止或低表达状态， 对维持细胞正常功能具有重要作用；但在异常表达时，其产物可使细胞无限分裂。 5.SNP：单个核苷酸的变异，人群中个体差异最具代表性的DNA多态性。 6.RFLP：限制性片段长度多态性多态性出现在限制性核酸内切酶的酶切位点序列中，用 某个内切酶水解基因组的某段序列时，在同种的不同个体之间该段序列可能被酶解成长短不等的几个DNA片段 7.转座元件：是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立 的DNA序列。 8.多基因家族：由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因 9.分子杂交：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链 杂交体的过程称核酸分子杂交 10.生物芯片：指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多 肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。 11.转化：是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的 基因型和表型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。 12.穿梭载体：是在原核生物载体上，构建出同时带有两种细胞的复制起始点，并可在两种 细胞中复制和存在的载体 13.多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。 能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 14.同功异源酶:来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 15.感受态细胞:经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞。如大肠杆菌经CaCl2处 理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。 16.基因组文库:把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子 群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。 17.克隆载体:通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体 上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，嗜菌粒，酵母人工染色体。 18.抑癌基因:存在于正常细胞内的一类可抑制细胞过度生长与增殖的基因，从而有潜在抑 癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生19.CDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载 体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA
检测基因多态性的方法 一种用于快速检测基因多态性的方法，具有如下特征：(a)根据所测样本靶序列设计两对引物，其中一对为锚定引物；(b)将上述两对引物及一个与锚定引物的锚定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR扩增反应试剂的溶液中，进行PCR扩增反应；(c)以适当的方法检测扩增产物中链长不同的DNA片断；(d)根据反应产物中DNA片断的多少及其长短判断基因多态性的类型。本发明涉及一种基因多态性检测方法，可用于单碱基多态性、基因突变、单碱基插入或缺失、微卫星分析等。本方法是首先设计两对引物，其中一对为通常PCR引物，用于扩增含有基因多态性位点的DNA片段；另一对为锚定引物，用于判断基因多态性的类型。再将上述两对引物及一个与锚定引物的锚定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR扩增反应试剂的溶液中，在单管中进行PCR扩增反应，并使扩增反应产生与基因多态性相对应的DNA扩增产物，然后以凝胶电泳法、或毛细管电泳法、或微流控芯片法，或高效液相色谱法等分离技术检测，根据扩增产物中DNA片段的多少及链长判断基因多态性的类型。为提高延伸反应的特异性，在锚定引物的3’端区域人为地引入一个与模板不互补的碱基。 用于检测遗传多态性的方法，包括：生成寡核苷酸探针和／或寡核苷酸引物，使得该寡核苷酸探针和／或引物包含在编码受体的基因或与其互补的序列中存在的多态位点，或者，当编码受体的所述基因和与其互补的所述序列至少其中之一得到扩增时，使得多态位点包含在扩增片段中；并使用由此生成的寡核苷酸探针和／或寡核苷酸引物检测编码靶受体的基因中的至少一种遗传多态性。 多态性是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因的多态性。这种多态性可以分为两类，即DNA 位点多态性和长度多态性。 基因多态性的主要检测方法： 1，限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）:由DNA的多态性，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2，单链构象多态性：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。 3，PCR-ASO探针法：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。 4，PCR-SSO法：原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。 5，PCR-SSP法：SSP（序列特异性引物）只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。 6，PCR-荧光法： 7，PCR-DNA测序：是诊断未知突变基因最直接的方法。 8，PCR指纹图法：实用于快速的同种异性DR/DW配型。 9，基因芯片法：又称为DNA微探针阵列。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核苷酸序列互不匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图像，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图像，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹