上海复星医学科技发展有限公司
呼吸道病毒 7 项检测
试剂
2011-1-10
呼吸道病毒 7 项检测试剂
目录
1．概述 (1)
2．D3 Ultra DFA试剂 (2)
2.1D 3
Ultra DFA试剂规格 (2)
2.2
3
Ultra DFA试剂用途 (2)
D
2.3D 3
Ultra DFA试剂特点和优势 (2)
2.4D 3
Ultra DFA试剂实验操作步骤 (3)
2.5
3
Ultra DFA试剂实验结果判读 (4)
D
3．D3 Ultra DFA试剂竞争优
势 (5)
3.1检验的特异性和灵敏度 (5)
3.2市场竞争 (5)
附录 1七种病毒检测的临床意义 (7)
附录 2实验室所需设备清单（试剂盒中不含） (8)
附录 3进口荧光显微镜参数 (9)
1．概述
日常生活中，几种常见的呼吸道病毒往往给人们的工作和生活带来极大的不
便，有些甚至威胁到人们的健康和生命。 在医院和急诊室中， 这些呼吸道病毒也
常常是诊断和治疗的难题。
常见的呼吸道病毒包括： A 型（甲型）流感病毒， B 型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（ RSV ），腺病毒，副流感病毒 1 型，副流感病毒 2 型和副流感病毒 3 型。在病毒检测方法中， 抗原检测 有其无法比拟的优势： 1. 可以用于病
毒的早期诊断，这对治疗非常重要； 2. 快速、简便的诊断方法，短时间内得出结果，节省实验室的劳动力和成本。 DHI 公司的 D 3
Ultra DFA 试剂属于抗原检测
中的直接免疫荧光法 。该试剂可以同时筛查和鉴定出常见的
7 种呼吸道病毒。
D 3
Ultra DFA 试剂主要的测试对象为婴幼儿和儿童，所以目标客户群体为：
儿童医院、妇幼保健院和有儿科的三甲医院。
2．D3 Ultra DFA试剂
2.1 D3 Ultra DFA试剂规格
D3 Ultra DFA试剂分为 7 项呼吸道病毒筛查试剂和 7 项呼吸道病毒鉴定试剂。检测病毒种类： A 型（甲型）流感病毒， B 型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病
毒（ RSV），腺病毒， 1、2、3 型副流感病毒。具体规格如下：
筛查试剂： 10 mL，可用于 400 次测试
鉴定试剂：每项鉴定试剂 2 mL X 7，可用于 80 次测试
另外，每盒试剂中含有40x 浓缩洗液 25 mL，固定液 15 mL，正常鼠丙种球
蛋白试剂 10 mL（用于阴性质控），含有 7 种呼吸道病毒抗原的阳性质控板 5 块。
2.2 D3 Ultra DFA试剂用途
D3 Ultra DFA试剂能对疑似呼吸道病毒感染的患者进行快速的病毒筛查和鉴
定。及时、准确地诊断对于病人的治疗非常重要，这主要体现在以下几点：
1、病毒治疗针对性强
金刚烷乙胺、瑞乐沙、奥司他韦（达菲）等是抗流感病毒的特效药。
RSV和副流感病毒可以使用利巴韦林和免疫球蛋白进行治疗。
目前没有专门的抗腺病毒药物，主要采取支持疗法。
2、病毒治疗有时效性
大部分呼吸道病毒越早治疗效果越好。
比如，奥司他韦在体内的活性形式是一种强效的高选择性的流感病毒NA 抑制剂，它主要通过干扰病毒从被感染的宿主细胞中释放，从而减少甲型或乙型流感病毒的传播。因此，在出现流感症状的48 小时内使用奥司他韦才有用，过了
这个时间段后疗效甚微。
3、避免抗生素的滥用
病毒不同于细菌、衣原体、支原体等原核生物，其对抗生素不敏感，不能使
用抗生素进行治疗。准确的诊断能帮助医生确定是否使用抗生素来治疗病人。
2.3 D3 Ultra DFA试剂特点和优势
1、产品几乎覆盖了所有常见呼吸道病毒的诊断
2、采用直接免疫荧光法，较其他检测方法有较大优势（详见表一）
3、实验步骤较简便，在短时间内能得出结果，从而帮助医生更好地治疗病人
4、使用质量优异的抗体，染色步骤仅需 15 分钟，大大节省了实验室的劳动力和成本，同时提高了临床诊断的成功率，减少重复实验
5、可以监控感染的大规模流行
6、拥有强大的科研团队，不断研制和改进单克隆抗体
表 1、几种常用检测方法的比较
检测方法优点缺点
病毒分离培养特异性高耗时耗力，灵敏度较低
酶联免疫吸附法较快速、简便有非特异性反应
间接免疫荧光法较快速有非特异性反应抗原检测
D3快速、简便，灵敏度需要使用荧光显直接免疫荧光法（
Ultra DFA试剂）和特异性均较高微镜
血清学检测快速、特异性较高对疾病初期诊断没有太大帮助
分子生物学方法较快速，灵敏度和特操作繁琐，价格昂异性均较高贵
2.4 D3 Ultra DFA试剂实验操作步骤
1、样品准备步骤：
①将样本充分震荡混匀约10-15 秒。
②在 400-600xg 转速下离心 5-10 分钟。
③ 弃上清（如果预留上清可用于细胞培养）。
④在沉淀中加 5 mL PBS缓冲液（请使用普通PBS，不要使用试剂盒内配套的浓缩洗液），充分震荡混匀约 10-15 秒。
⑤在 400-600xg 转速下离心 5-10 分钟。
⑥ 吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀。
⑦重复步骤 4 到 6，直至黏液层被完全去除。
注意：一定要将黏液去除干净，否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。
⑧在沉淀中加 0.5 到 1 mL的 PBS缓冲液。
⑨ 用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。这个悬浊液
可用于直接样本测试。
2、直接样本测试步骤：
①在 2 孔或 8 孔板上的每孔内滴加25 μL 的细胞悬浊液。
② 样本完全风干。
③在 20oC 到 25oC，用预冷的 100%丙酮固定细胞约 5 到 10 分钟。注意：丙酮是易挥发、可燃性物质，使用时请远离明火。
④ 从丙酮中取出载玻片并风干。
⑤在固定并风干的细胞上滴加一滴DFA染色试剂（如图1），使其完全覆盖细胞（注意： 2 孔或 8 孔板上有一孔是阴性对照孔，请勿滴加DFA染色试剂）。
⑥在呼吸道病毒抗原对照板的每孔内也要滴加DFA 染色试剂。抗原对照板包含了被病毒感染的细胞和未感染的细胞，只能一次性使用。
⑦ 在阴性对照孔内滴加正常鼠丙种球蛋白试剂，使其完全覆盖细胞。
⑧将载玻片放于 35oC 到 37oC 的恒温箱内孵育15 到 30 分钟，为保持其湿润最好放置于带盖的盒子内。
⑨ 用事先稀释好的洗液漂洗染色细胞。为了更有效地洗涤，请将玻片在洗液
中反复浸蘸 4 次左右。
⑩使用新的 1X 洗液再洗一次。
?用去离子水再洗一遍。
图 1、在玻璃板上滴加D3 Ultra DFA染色试剂
3、观察实验结果
滴加 2 到 3 滴固定液，并加盖盖玻片（20X50 mm），要注意避免产生气泡。在 200 倍放大荧光显微镜下观察结果。
2.5 D3 Ultra DFA试剂实验结果判读
带 FITC 标记的抗体在荧光显微镜下会呈现明亮的绿色，如果细胞表面存在病毒抗原，染色后就会显绿色。 在荧光显微镜下， 感染不同病毒的细胞会呈现独有的特征（如图 2）。
图 2、显微镜下观察染色细胞 （注：根据不同荧光显微镜， 背景色不一定为红色）
3．D 3
Ultra DFA 试剂竞争优势
3.1 检验的特异性和灵敏度
检验的特异性 : 用 D 3
Ultra DFA 呼吸道病毒筛查和鉴定试剂对多种细胞和微生物进行交叉反应测试。对 64 种病毒、 18 种细胞、 19 种细菌均没有交叉反应。
检验的灵敏度：荧光标记的单克隆抗体平均能检测出病毒的最低浓度约为
1.0 PFU 。
3.2 市场竞争
主要竞争对手为西班牙 Vircell 公司的 9 项呼吸道产品。 D 3
Ultra DFA 试剂与
其主要有两点不同： 1. 检测项目不同； 2. 检测原理不同
1、Vircell 产品检测项目除了以上 7 种病毒外，还包含肺炎衣原体、支原体等原
核生物检测项目。但是， 90%的感冒是由病毒引起的。如果是细菌、衣原体、支
原体等感染，一般白细胞和 C-反应蛋白（ CRP ）都会显著升高，而病毒感染，这
两项指标一般不会升高。 我们建议医生可以先做血常规或者
CRP 检测，这样就能
区分是病毒还是细菌感染，而这两项测试不仅快速（一般
20-30 分钟），而且价
格相对便宜。
2、D 3
Ultra DFA 试剂的检测原理是用荧光（ FITC ）标记的单克隆抗体检测病毒抗原，属于直接荧光免疫法。 Vircell 产品的检测原理是用抗原检测抗体（ IgM ），使用的方法是间接免疫荧光法。虽然检测 IgM 能区分出是既往感染还是急性感染，但是抗体产生的个体差异较大，特别是 1 岁以下的婴幼儿和有免疫缺陷的人群，其抗体往往产生较慢。 短时间内，在体内抗体不足的情况下， 可能会出现假阴性，从而错过了治疗的最佳时期。 甲型流感病毒其表面抗原变异较快， 而人体往往不能及时产生针对新毒株的抗体， 这时也会造成假阴性。 间接免疫荧光法会增加非特异性反应的几率。
表 2、Vircell 与 D 3
Ultra DFA 试剂对比
Vircell
9 项呼吸道病原体，其中包含在我国 检测项目
发病率很低的 Q 热立克次氏体
需要体内产生抗体后才能检测出病原
检测原理
体，如果抗体产生较慢或者无抗体产生会有假阴性
作为回顾性诊断，对病例的早期诊断 临床意义 *
意义不大
检测灵敏度
不能很好地检测变异的病毒
间接免疫荧光法，二抗的使用会增加 检测方法
非特异性反应
3
D Ultra DFA
只检测呼吸道病毒，降低患者的看病成本，患者更易接受
只要有病原体存在即可检测，可在发病早期进行快速诊断
可用于疾病早期诊断，对患者的治疗有重大意义
将多种抗体进行组合，能更好地应对变异的病毒，在多项检测项目中灵敏度达到 100%
直接免疫荧光法，特异性提高
实验步骤
二抗的使用让实验步骤变得较为繁琐
一步染色，不易交叉污染
* 备注：引用自《流行性感冒诊断与治疗指南（
2011 年版）》
附录 1 七种病毒检测的临床意义
流感病毒侵入呼吸道，经1-2 天的潜伏期，感染者即可出现流感症状。病毒
在上皮细胞内复制，很少入血，但可释放内毒素样物质入血，引起全身中毒症状：发热、头痛、全身酸痛、疲乏无力、白细胞数下降等。幼儿或年老体弱病人感染
流感病毒易继发细菌感染，如合并肺炎等，病死率高。
婴幼儿特别是 2-6 个月的婴儿对 RSV特别敏感，常引起较为严重的呼吸道疾病，如细支气管炎、肺炎等，患儿常出现呼吸暂停，气管或细支气管坏死物与粘
液、纤维蛋白等结集在一起，极易阻塞患儿的呼吸道，严重者造成死亡。在我国RSV还是引发流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起婴幼儿尤其是新生儿较高的
死率。
腺病毒主要引起呼吸道感染，症状有急性发烧、咽炎、扁桃体炎等。腺病毒
肺炎约占儿童期肺炎的10%，多由腺病毒 3、7 型引起；婴幼儿腺病毒肺炎的病
死率为 8%-10%。除呼吸道疾病外，腺病毒亦可引起其他疾病，如流行性角膜炎、出血性结膜炎、急性滤泡性结膜炎等。腺病毒与婴幼儿胃肠道疾病也有可能相关，
包括阑尾炎、急性胃肠炎，有时可引起脑炎和脑膜炎、出血性膀胱炎等。
副流感病毒是引起小儿急性呼吸道感染的常见病因，仅次于 RSV。副流感 1、2 型是哮喘的主要病因，以 2-4 岁儿童中最为严重。副流感 3 型，亦可引起哮喘，但主要易引起婴幼儿支气管炎、肺炎，并以 1 岁以内的婴儿较为严重。
病毒及其对应抗病毒药
病毒种类抗病毒药物
流感病毒金刚烷乙胺、瑞乐沙、奥司他韦（达菲）
呼吸道合胞病毒利巴韦林喷雾剂
副流感病毒病情严重者可使用利巴韦林
腺病毒没有专门的抗病毒药物，主要采取支持疗法
附录 2 实验室所需设备清单（试剂盒中不含）
此列表中的器材和试剂是实验所必需的，但是未包含在试剂盒中，需要单独购买。
器材和试剂规格
1鼻咽拭子建议使用 DHI 配套鼻咽拭子
2载玻片约 70 mm X 20 mm
3盖玻片约 50 mm X 20 mm
4生物安全柜 2 级
5恒温培养箱35oC-37oC
6离心机管式
7荧光显微镜可以看（），总
200倍光学变焦
FITC490/520 nm 8烧杯多种，用于洗玻片
9量筒（配置洗液）
1 L
10带盖瓶 1 L（储存稀释洗液）
11加样枪和枪头多种
12丙酮纯度 100%
13普通 PBS溶液0.01 M (Na2HPO4, KH2PO4)， pH 7.4 14去离子水
15乳胶手套
16镊子
附录 3 进口荧光显微镜参数
生产厂商Digital Bio
产地韩国
电源AC 100-240 V，50-60 Hz
CPU AMD AU1250
放大倍数约200倍
光源白色 / 蓝色 LED，寿命达 40,000 小时
激发波长 488 nm，发射波长 520 nm 摄像头130 万像素 CMOS（ 1280 X 1024）显示器7 寸 TFT-LCD，分辨率 800 X 480
重量<5 kg
体积240 X 350 X 320 mm
数据储存8G SD卡
九项呼吸道病毒检查 一、呼吸道九联检主要检测病原体的IgM抗体,包括嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体(COX)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)和副流感病毒1、2和3型(PIVS)。 二、采用间接免疫荧光法，主要针对九项病原体的IgM 检测。由于机体受到抗原刺激后最早产生的抗体是IgM，但是IgM的半衰期短（约5天）若血清中特异性IgM类抗体含量增高，表明有近期感染，这有助于感染性疾病的早期诊断。以下是关于九项病原体名称及其潜伏期和产生IgM的时间。 九项病原体IgM抗体产生时间
三、临床意义 嗜肺军团菌 是社区获得性肺炎的重要致病菌。在欧洲和北美军团军肺炎占社区获得性肺炎前3,4位，ICU重症社区获得性肺炎的第三位，而医院获得性肺炎的1～5 %也由嗜肺军团菌所致。对人致病的嗜肺军团菌有16个血清型，80%军团菌肺炎有嗜肺军团菌血清Ⅰ型引起。然而军团菌细菌培养检出率低, 只有50%左右, 目前临床上血清特异性抗体检查是常用的诊断军团菌感染的主要手段。
肺炎支原体 是目前儿童呼吸道感染的重要病原体之一，占儿童肺炎感染病原体的15%左右，由于肺炎支原体传统培养难度大，单纯凭借患儿的临床症状不易确诊是否感染，支原体抗体于感染后7～9d出现，3～4周达高峰，可持续4～6月，采用血清特异性抗体检查是常用的诊断肺炎支原体感染的主要手段。 Q热立克次体 可引起Q热等全身疾病，会造成发热、非典型性肺炎、肝炎或心内膜炎等。血清学诊断中，IFA检测是最灵敏和最具指示性的血清学诊断方法。 肺炎衣原体 广泛存在于世界范围内，人类是其唯一的宿主，仅1个血清型。实验室检测方法有分离培养、血清学检测、核酸扩增技术等，目前临床主要使用血清学检测方法。肺炎衣原体是呼吸道感染主要病原之一，人与人之间的传
第26章呼吸道病毒测试题 填空 1.呼吸道病毒包括流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、风疹病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠病毒等。 2.流感病毒根据流感病毒核糖核蛋白和M抗原（NP和MP）抗原的不同,可分为甲、乙、丙三型。 3.决定流感病毒亚型的特异性抗原是HA（血凝素）和NA（神经氨酸酶）. 4.流感病毒的核酸类型是单股负链RNA, 其显著特点是分7～8个节段且容易发生基因重组 . 5.流感病毒的核心由RNA,核蛋白和RNA聚合酶组成. 6.流感病毒的结构由核心,内膜和外膜组成. 其吸附细胞的结构是HA , 成熟病毒自细胞膜上的释放依赖NA的水解作用. 7.流感病毒的包膜镶嵌着2种糖蛋白刺突,即呈柱状的 HA 和呈蘑菇状的 NA. 8.麻疹病毒感染除引起麻疹外,少数患者尚可并发严重中枢神经系统疾病,即麻疹迟发性脑炎和 SSPE亚急性硬化性全脑炎 . 9.腮腺炎病毒除引起患者双侧或单侧腮腺肿大炎症外,20%男性患者并发睾丸炎 ,5%女性患者并发卵巢炎. 10.孕妇在妊娠5个月内感染风疹病毒后临床表现多为轻微 ,而其胎儿或新生儿易患先天性风疹综合征. 11.腺病毒为双链线状DNA,无包膜病毒,其蛋白衣壳由240个六邻体壳粒和12个五邻体壳粒共同构成20面立体对称球状体,并在20面体每一顶角壳粒各伸出一纤维隆起. 12.少年儿童和成人普通感冒及上呼吸道感染大多由鼻病毒或冠状病毒感染引起. 三. 单选题 １.流行性感冒的病原体是 A.流行性感冒杆菌 B.流感病毒 C.副流感病毒 D.呼吸道合胞病毒 E.鼻病毒 ２.普通感冒的最常见病原是 A.流感病毒 B.副流感病毒 C.腺病毒 D.风疹病毒 E.鼻病毒和冠状病毒
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
呼吸道病毒项检测试剂 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012
上海复星医学科技发展有限公司 呼吸道病毒7项检测试 剂 2011-1-10
呼吸道病毒7项检测试剂目录
1．概述 日常生活中，几种常见的呼吸道病毒往往给人们的工作和生活带来极大的不便，有些甚至威胁到人们的健康和生命。在医院和急诊室中，这些呼吸道病毒也常常是诊断和治疗的难题。 常见的呼吸道病毒包括：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型和副流感病毒3型。在病毒检测方法中，抗原检测有其无法比拟的优势：1.可以用于病毒的早期诊断，这对治疗非常重要；2.快速、简便的诊断方法，短时间内得出结果，节省实验室的劳动力和成本。DHI公司的D3Ultra DFA试剂属于抗原检测中的直接免疫荧光法。该试剂可以同时筛查和鉴定出常见的7种呼吸道病毒。 D3Ultra DFA试剂主要的测试对象为婴幼儿和儿童，所以目标客户群体为：儿童医院、妇幼保健院和有儿科的三甲医院。
2．D3Ultra DFA试剂 2.1D3Ultra DFA试剂规格 D3Ultra DFA试剂分为7项呼吸道病毒筛查试剂和7项呼吸道病毒鉴定试剂。检测病毒种类：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，1、2、3型副流感病毒。具体规格如下：筛查试剂：10mL，可用于400次测试 鉴定试剂：每项鉴定试剂2mLX7，可用于80次测试 另外，每盒试剂中含有40x浓缩洗液25mL，固定液15mL，正常鼠丙种球蛋白试剂10mL（用于阴性质控），含有7种呼吸道病毒抗原的阳性质控板5块。 2.2D3Ultra DFA试剂用途 D3Ultra DFA试剂能对疑似呼吸道病毒感染的患者进行快速的病毒筛查和鉴定。及时、准确地诊断对于病人的治疗非常重要，这主要体现在以下几点：1、病毒治疗针对性强 金刚烷乙胺、瑞乐沙、奥司他韦（达菲）等是抗流感病毒的特效药。 RSV和副流感病毒可以使用利巴韦林和免疫球蛋白进行治疗。 目前没有专门的抗腺病毒药物，主要采取支持疗法。 2、病毒治疗有时效性 大部分呼吸道病毒越早治疗效果越好。 比如，奥司他韦在体内的活性形式是一种强效的高选择性的流感病毒NA抑制剂，它主要通过干扰病毒从被感染的宿主细胞中释放，从而减少甲型或乙型流感病毒的传播。因此，在出现流感症状的48小时内使用奥司他韦才有用，过了这个时间段后疗效甚微。 3、避免抗生素的滥用 病毒不同于细菌、衣原体、支原体等原核生物，其对抗生素不敏感，不能使用抗生素进行治疗。准确的诊断能帮助医生确定是否使用抗生素来治疗病人。 2.3D3Ultra DFA试剂特点和优势 1、产品几乎覆盖了所有常见呼吸道病毒的诊断
呼吸道病毒抗原检测进院可行性报告 美国DIAGNOSTIC HYBRIDS公司睿信?呼吸道病毒抗原检测系统 在儿童群体中，呼吸道感染是一种极为常见的疾病之一。相关数据显示，90%的呼吸道感染均由病毒引起。呼吸道感染的发病率极高，该疾病的临床表现主要为呕吐、头痛、腹泻、流涕、低热、咳嗽轻喘、呼吸困难等，严重者还会产生肺感染、肺炎、中耳炎、支气管炎、鼻窦炎等并发症，从而使患儿的身心健康遭到严重危害。 呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，而上呼吸道感染基本上都是病毒感染，细菌性感染非常少。上呼吸道病毒感染发生比较频繁，儿童每年大约被感染6- -9次，青少年和成年人每年大约2-4次。目前，多数诊疗机构对呼吸道的感染未进行病毒检测，而直接使用抗生素进行治疗，而抗生素无法治疗病毒引起的呼吸道感染，造成抗生素滥用，同时造成相关细菌的抗药性增强。虽然下呼吸道感染发生的频率较少，但是这些感染对人体危害更加严重。患有下呼吸道病毒感染的1.8%学龄儿童和13%的学前儿童需要住院治疗，11%患有下呼吸道病毒感染的成年人需要住院，而且1.2%的感染者会导致死亡。同时，值得注意的是:RSV，细菌，腺病毒，和流感病毒是最大可能导致医生接触传染的病原体。因此，呼吸道病毒检测是非常必要和重要的。本产品采用免疫荧光法，直接检测病毒抗原，具有更好的临床意义。 公司介绍
DIAGNOSTIC HYBRIDS公司总部位于美国俄亥俄州，分支机构和合作伙伴遍布全球30多个国家。公司主要致力于研发,生产应用于检测呼吸道疾病,衣原体和疱疹感染,肠道病毒的细胞和分子诊断试剂。目前呼吸道病毒抗原荧光检测试剂占有美国55%到65%的市场，在全球28个国家得到广泛使用，比如澳大利亚(澳洲)，秘鲁(南美)，英国(欧洲)，加拿大(北美)，韩国(亚洲)等等。现已被美国Quidel 公司收购。Quidel China Ltd.是其在中国的全资子公司，营业地点设在中国（上海）自由贸易试验区盛荣路88弄1号3层315室。 DIAGNOSTIC HYBRIDS公司一贯秉承为客户提供优质产品和卓越服务的理念。在产品生产和服务中严格执行IS013485标准。每种产品生产都经过严格的质量验证，从抗体原材料、荧光标记抗体到最终成品都遵循质量第一的目标。自从上市以来，没有任何一次退货事件，没有任何一次回收或不良事件报告。 上海贝西生物科技有限公司是其中国区总代理，上海高新技术企业，公司具有专业且庞大技术团队，负责相关产品在中国的销售以及技术支持等工作。目前已开发医院客户超过80家，是国内最早做呼吸道病毒抗原检测产品的公司，与睿信产品生产企业美国DH公司保持长期有效合作。上海贝西生物科技有限公司对客户承诺承诺1小时之内情况响应，24小时赶到现场。 贝西生物与美国Quidel公司达成协议，任何未经过其中国子公司Quidel China Ltd公司授权的公司以及医院均无权销售以及使用睿信系列产品。任何未
上海复星医学科技发展有限公司 呼吸道病毒 7 项检测 试剂 2011-1-10
呼吸道病毒 7 项检测试剂 目录 1．概述 (1) 2．D3 Ultra DFA试剂 (2) 2.1D 3 Ultra DFA试剂规格 (2) 2.2 3 Ultra DFA试剂用途 (2) D 2.3D 3 Ultra DFA试剂特点和优势 (2) 2.4D 3 Ultra DFA试剂实验操作步骤 (3) 2.5 3 Ultra DFA试剂实验结果判读 (4) D 3．D3 Ultra DFA试剂竞争优 势 (5) 3.1检验的特异性和灵敏度 (5) 3.2市场竞争 (5) 附录 1七种病毒检测的临床意义 (7) 附录 2实验室所需设备清单（试剂盒中不含） (8) 附录 3进口荧光显微镜参数 (9)
1．概述 日常生活中，几种常见的呼吸道病毒往往给人们的工作和生活带来极大的不 便，有些甚至威胁到人们的健康和生命。 在医院和急诊室中， 这些呼吸道病毒也 常常是诊断和治疗的难题。 常见的呼吸道病毒包括： A 型（甲型）流感病毒， B 型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（ RSV ），腺病毒，副流感病毒 1 型，副流感病毒 2 型和副流感病毒 3 型。在病毒检测方法中， 抗原检测 有其无法比拟的优势： 1. 可以用于病 毒的早期诊断，这对治疗非常重要； 2. 快速、简便的诊断方法，短时间内得出结果，节省实验室的劳动力和成本。 DHI 公司的 D 3 Ultra DFA 试剂属于抗原检测 中的直接免疫荧光法 。该试剂可以同时筛查和鉴定出常见的 7 种呼吸道病毒。 D 3 Ultra DFA 试剂主要的测试对象为婴幼儿和儿童，所以目标客户群体为： 儿童医院、妇幼保健院和有儿科的三甲医院。
实验二十三病毒核酸检测常用技术 （Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in Common Use ） 近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。 实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸 【目的要求】 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。 【基本原理】 鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
某复星医学科技发展某 呼吸道病毒7项检测试 剂 2011-1-10 呼吸道病毒7项检测试剂 目录 1．概述1 2．D3Ultra DFA试剂1 2.1 D3Ultra DFA试剂规格1 2.2 D3Ultra DFA试剂用途2 2.3 D3Ultra DFA试剂特点和优势2 2.4 D3Ultra DFA试剂实验操作步骤3 2.5 D3Ultra DFA试剂实验结果判读4 3．D3Ultra DFA试剂竞争优势5
3.1 检验的特异性和灵敏度5 3.2 市场竞争5 附录1 七种病毒检测的临床意义6 附录2 实验室所需设备清单（试剂盒中不含）7 附录3 进口荧光显微镜参数8 1．概述 日常生活中，几种常见的呼吸道病毒往往给人们的工作和生活带来极大的不便，有些甚至威胁到人们的健康和生命。在医院和急诊室中，这些呼吸道病毒也常常是诊断和治疗的难题。 常见的呼吸道病毒包括：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型和副流感病毒3型。在病毒检测方法中，抗原检测有其无法比拟的优势：1. 可以用于病毒的早期诊断，这对治疗非常重要；2. 快速、简便的诊断方法，短时间内得出结果，节省实验室的劳动力和成本。DHI公司的D3Ultra DFA试剂属于抗原检测中的直接免疫荧光法。该试剂可以同时筛查和鉴定出常见的7种呼吸道病毒。 D3Ultra DFA试剂主要的测试对象为婴幼儿和儿童，所以目标客户群体为：儿童医院、妇幼保健院和有儿科的三甲医院。 2．D3Ultra DFA试剂 2.1 D3Ultra DFA试剂规格 D3Ultra DFA试剂分为7项呼吸道病毒筛查试剂和7项呼吸道病毒鉴定试剂。检测病毒种类：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，1、2、3型副流感病毒。具体规格如下：
浅谈计算机病毒的检测技术 摘要：在互联网高速发展的今天，计算机病传染性越来越强，危害性也越来越大。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。本文对其特点以及优缺点逐一进行了叙述。 关键词：计算机病毒检测技术 一、引言 Internet改变了人们的生活方式和工作方式，改变了全球的经济结构、社会结构。它越来越成为人类物质社会的最重要组成部分。但在互联网高速发展的同时，计算机病毒的危害性也越来越大。在与计算机病毒的对抗中，早发现、早处置可以把损失降为最少。因此，本文对计算机病毒的主要检测技术逐一进行了讨论。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。这些方法依据原理不同，检测范围不同，各有其优缺点。 二、计算机病毒的检测方法 (1)长度检测法 病毒最基本特征是感染性，感染后的最明显症状是引起宿主程序增长，一般增长几百字节。在现今的计算机中，文件长度莫名其妙地增长是病毒感染的常见症状。长度检测法，就是记录文件的长度，运行中定期监视文件长度，从文件长度的非法增长现象中发现病毒。知道不同病毒使文件增长长度的准确数字后，由染毒文件长度增加大致可断定该程序已受感染，从文件增长的字节数可以大致断定文件感染了何种病毒。但是长度检测法不能区别程序的正常变化和病毒攻击引起的变化，不能识别保持宿主程序长度不变的病毒。 (2)病毒签名检测法 病毒签名(病毒感染标记)是宿主程序己被感染的标记。不同病毒感染宿主程序时，在宿主程序的不同位置放入特殊的感染标记。这些标记是一些数字串或字符串。不同病毒的病毒签名内容不同、位置不同。经过剖析病毒样本，掌握了病毒签名的内容和位置之后，可以在可疑程序的特定位置搜索病毒签名。如果找到了病毒签名，那么可以断定可疑程序中有病毒，是何种病毒。这种方法称为病毒签名检测方法。但是该方法必须预先知道病毒签名的内容和位置，要把握各种病毒的签名，必须解剖病毒。剖析一个病毒样本要花费很多时间，是一笔很大的开销。 (3)特征代码检测法
“呼吸道病原体抗原七项”检测的临床意义 一、呼吸道病毒简介 呼吸道病毒是指一大类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为侵入门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。据统计，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起。常见的呼吸道病毒包括：A型流感病毒（甲型流感病毒）、B型流感病毒（乙型流感病毒）、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1、2和3型,各种病毒在电镜下的形态见图1。 流感病毒呼吸道合胞病毒腺病毒副流感病毒 图1 各种病毒在电子显微镜下的形态 二、呼吸道病毒临床诊断 现有的主要方法：1、抗原检测；2、抗体检测；3、病毒分离培养；4、分子生物学方法等。现将上述检测方法的优劣小结于表1。目前临床上使用较多的是抗原检测和抗体检测。 表1 四种呼吸道病毒检测方法的比较 检测方法优点缺点 病毒分离培养特异性高，金标准培养条件要求高、灵敏度低，标本中病原体量少时，易致假阴性。 抗原检测 酶联免疫吸附法较快速有非特异性反应 间接免疫荧光法简便、快速 有非特异性反应需要使用荧光显微镜 直接免疫荧光法简便、快速、灵敏度和特异性均较高 且可用于疾病的早期诊断 需要使用荧光显微镜 抗体检测灵敏度、特异性较高对疾病早期诊断没有太大帮助 分子生物学方法灵敏度和特异性均很高操作繁琐，价格昂贵 三、呼吸道病原体抗原的优越性 1、从理论上讲，只要有病毒感染，通过抗原检测都能鉴定出，而抗体检测却要在人体产
生免疫应答以后才能进行鉴定。 2、机体产生IgM一般需要一周左右的时间，而有免疫缺陷或免疫系统不健全的个体如儿童，特别是3岁以下的小孩，其产生抗体往往需要更久，且抗体产生的水平也较低。若检测的是IgG，则不能很好地区分既往感染和急性感染。 因此，抗原检测的方法对婴幼儿和儿童的呼吸道感染的病因诊断、鉴别诊断和临床用药指导比抗体法更有优势（详见表2）。 表2 呼吸道病毒抗体检测和抗原检测的比较 病原体抗体IgM检测病原体抗原检测 检测最佳时间一般在感染一周左右病毒感染出现症状后即可检测出 临床意义 回顾性诊断，适用于疾病后期的诊断， 多用于循证医学可用于疾病早期诊断 对患者的治疗有重要指导意义 检测灵敏度不能很好地检测变异的病毒 将多种抗体进行组合，能更好地应对变异 的病毒 检测方法 一般使用酶联免疫（ELISA）或者间接免疫 荧光法，有非特异性荧光一般使用直接免疫荧光法，几乎没有非特异性反应 四、为什么要早期全面检测？ 1、病毒治疗针对性强 2、病毒治疗有时效性 3、避免抗生素的滥用 五、项目开展的价值和社会效益分析 本项目可用于呼吸道病原学的研究；提高医院对呼吸道病毒的诊疗水平；还可用于呼吸道传染病流行的监控等。 六、呼吸道病原体检测 我们检验中心/遗传所于3月20日正式开展了“呼吸道病原体抗原7项”。该检验组合包含了甲型流感、乙型流感、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1、2和3型7种抗原的检测。收费标准：326.0元/次，不接受单项申请。 临床意义：主要用于呼吸道感染病原体的早期诊断和鉴定诊断。 标本采集和报告时间：鼻咽拭子或下呼吸道分泌物。暂定于每周五4:30pm发出检验报告。 欢迎各临床保健科室踊跃开单，我们将竭诚地为临床服务。咨询电话：临床免疫学检验室，2313065（外线）；3065（内线）。 撰稿：罗桂香，编辑：周玉球
附件3 人类免疫缺陷病毒检测试剂临床研究 注册技术审查指导原则 一、前言 人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）检测试剂是指利用免疫学及分子生物学等方法原理对人血清、血浆或其他体液中的特定的HIV生物学标记物，包括HIV 1型（HIV-1 ）p24抗原、HIV抗体、HIV核酸、HIV基因耐药突变等进行定量或定性分析的试剂。据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）的分类原则，该类产品作为第三类体外诊断试剂（In Vitro Diagnostic,IVD）管理，属高风险管理产品。本指导原则制定的主要目的是让申请人明确在注册申报过程中对本类试剂在临床研究方面重点关注内容，同时规范注册申请人对于注册申报资料中有关临床研究资料的要求。 本指导原则是对HIV检测试剂临床研究的一般性要求，申请人应依据具体产品的特性对临床研究资料的内容进行充实和细化。申请人还应依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需具体阐述其理由及相应的科学依据。 本指导原则只是针对HIV检测试剂的特点，强调需重点考虑的问题，临床试验的基本要求应符合《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的规定，包括临床试验协议、方案、报告的撰写等。 本指导原则不包括行政审批要求，不作为法规强制执行。本指导原则是申请人和技术审评人员的指导文件，如果有能够满足适合的法规要
求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 HIV生物学标记物是指机体在感染HIV后，在不同的感染阶段出现的生物学标记物，包括：HIV抗体、HIV-1p24抗原、HIV核酸、HIV基因耐药突变等。 就方法学而言，本指导原则主要适用于利用免疫印迹法、化学发光法、时间分辨免疫荧光法和微粒子酶联免疫法、胶体金法等免疫学方法对HIV抗原和/或抗体进行定量或定性检测的体外诊断试剂，以及应用核酸检测的方法（如实时荧光聚合酶链反应等）对HIV 核酸（核糖核酸/脱氧核糖核酸）以及基因耐药突变等进行检测和分析的体外诊断试剂，适用于首次注册产品及申请许可事项变更的产品。 本指导原则不适用于国家法定血源筛查用HIV检测试剂。 三、基本要求 （一）临床试验方案及方案中应关注的问题 临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。各临床研究单
马铃薯是我国重要的粮食作物和经济作物,马铃薯在定西市种植也有200多年的历史,在保障全市粮食有效供给和繁荣城乡经济中发挥了十分重要的作用,已由过去的“救命粮”变成了现在的“致富薯”,是定西最具生产潜力、市场优势和开发前景的特色农产品,也是农业增效、农民增收的第一大优势产业。近年来,定西市委、市政府对马铃薯产业高度重视,作为全市农业和农村经济发展的战略性主导产业来扶持,制定了“全市马铃薯产业发展规划”,省上也制定下发了“关于进一步加快发展马铃薯产业的意见”,提出了工作思路和具体目标,促进了本市马铃薯产业的快速发展。2013年全市种植面积达到319.84万亩,总产量506万t,是全国三大马铃薯集中产区之一。但是由于定西经济条件落后,全市的马铃薯种薯的病毒检测并未随着种植面积的扩大而提高和普及,以至于马铃薯各种病每年在生长期发生,严重影响了全市马铃薯的产量和质量。马铃薯病毒已成为马铃薯生产中的重要制约因素,急需大力提高马铃薯种薯的病毒检测,为马铃薯产业的持续快速发展把好第一增长关。 马铃薯病毒检测包括：基础试管苗、马铃薯原原种、大田种薯的检测。严格的检测大大提高了种薯合格率,而种植合格的种薯,每亩可以提高产量500kg 以上。马铃薯的病毒有6种,分别是马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）。目前最常用的马铃薯病毒检测是用双抗体夹心酶免疫吸附测定法（DAS-ELISA）检测,是用于快速、灵敏、准确的血清学技术,是国际通用的检测方法之一。下面就本市引进的“马铃薯病毒DAS-ELISA检测”全套生产技术进行浅述。 1马铃薯病毒的概况 1.1马铃薯X病毒（PVX） 也称普通花叶病毒,是一种长520～550nm的线状病毒,有时在电镜下能看到病毒颗粒的中心孔。在病毒外壳由亚基形成时,可看到它的横纹,这一点是与马铃薯重花叶病毒在形态结构上的主要区别。一般减产5%～10%,症状是叶片从轻型花叶到叶片有较轻的皱缩。马铃薯X病毒靠汁液传播,也是传播最广泛的一种病毒。 1.2马铃薯Y病毒（PVY） 也称重花叶病毒,是马铃薯第二个重要病毒性病害,是一种长680～900nm的线状病毒,在电镜下找不到它的中心孔和外壳蛋白亚基的横纹,它比PVX更细一些、更长一些。通过感染的块茎长期存在并由蚜虫非持续性地传播,产量损失可达80%。症状随着病毒株系、马铃薯品种及环境条件变化很大。1.3马铃薯A病毒（PVA） 又称轻花叶病毒,在许多方面类似于马铃薯Y病毒。在某些品种中出现时,一般比马铃薯Y病毒轻,产量损失可达40%。马铃薯A病毒引起花叶(有时很严重),同时也发生脉缩和卷曲,叶片可能出现闪光。 1.4马铃薯S病毒（PVS） 也称潜隐性花叶病毒,感病块茎变小,一般减产 浅析马铃薯病毒检测技术 景彩艳 （甘肃省定西市农产品质量安全监督管理站定西743000） 摘要：随着科学技术的不断发展,马铃薯病毒检测技术在日益的完善,DAS-ELISA法已经成为马 铃薯病毒检测的常规方法。容易侵染马铃薯的病毒类型主要有6种,分别是马铃薯的PVX、PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA病毒。马铃薯在生长的过程中,因受到各种不同病害的侵染,容易造成减产 和退化。血清学技术是马铃薯病毒检测的主要手段。 关键词：马铃薯病毒；血清学技术；双抗体夹心酶联免疫吸附法 215 --
七项呼吸道病毒检测试剂盒（鉴定）使用说明书 【产品名称】 通用名称：七项呼吸道病毒检测试剂盒 英文名称：D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screen & ID Kit 【包装规格】 鉴定试剂：80人份/盒 【预期用途】 用于临床定性检测7种呼吸道病毒：甲型（A型）流感病毒，乙型（B型）流感病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒，副流感病毒1、2和3型。 【检验原理】 荧光素（FITC）标记的单克隆抗体与病毒抗原结合，形成稳定的抗原-抗体复合物，在荧光显微镜下观察，呈现特异性绿色荧光。 【主要组成成份】 组份名称规格主要成分 1 DFA染色试剂鉴定试剂流感A试剂： 2 mL 每试剂瓶为一项与病毒 抗原相对应的荧光单克 隆抗体 流感B试剂：2 mL 腺病毒试剂：2 mL 呼吸道合胞病毒试剂：2 mL 副流感1试剂：2 mL 副流感2试剂：2 mL 副流感3试剂：2 mL 2 40X浓缩洗液25 mL PBS 3 固定液15 mL 甘油 4 阳性质控板5块包被病毒抗原 【储存条件及有效期】 2oC-8oC避光保存18个月。 【适用仪器】 荧光显微镜，激发波长490 nm，发射波长520 nm。 【样本要求】 鼻咽部取样后保存于生理盐水中，应在24小时内送检。 【检验方法】 1、取样：用鼻咽拭子从病人的鼻咽部取样或者使用鼻腔灌洗液，将鼻咽拭子放入储存管中（含有生理盐水）。 2、样本准备步骤： ①将样本充分震荡混匀约10-15秒。 ②在400-600xg转速下离心5-10分钟。 ③弃上清。 ④在沉淀中加2-3 mL PBS缓冲液（不能使用试剂盒中的浓缩洗液），充分震荡混匀约10-15秒。 ⑤在400-600xg转速下离心5-10分钟。 ⑥吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀。 ⑦重复步骤4到6，直至黏液层被完全去除。 ⑧在沉淀中加0.5-1 mL的PBS缓冲液。 ⑨用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。 3、直接样本测试步骤： ①在8孔板上的孔内滴加25 μL的细胞悬浊液，每样本需滴加七孔。 ②样本完全风干。
病毒鉴定的方法有哪些？ 从培养的细胞中分离病毒，然后采用免疫荧光和分子生物学技术进行病毒核酸检测已被成功地用于病毒的鉴定。目前最常用的病毒定量检测方法有以下三大类：用于病毒感染力检测的技术，如病毒空斑形成试验，半数组织培养感染剂量TCID50测定和免疫荧光等；病毒核酸和病毒蛋白检测技术，如实时定量多聚酶链反应（qPCR），免疫印迹，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定（ELISA）和血凝试验等；还有就是那些直接对病毒颗粒进行计数的方法，如流式细胞分析或透射电镜技术。 病毒检测方法的局限性 病毒鉴定方法 1.培养细胞的显微学观察 材料和仪器 细胞生长培养基：含10% FBS(胎牛血清), 4-6 mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等 维持培养基：上述新鲜的细胞培养基，但血清FBS浓度减少至为2% 宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamber slides） PBS磷酸缓冲液 Bouin's固定液 吉姆萨（Giemsa）缓冲液 吉姆萨（Giemsa）染色液 丙酮，丙酮：二甲苯（2:1），丙酮：二甲苯（1:2），二甲苯 中性树胶 移液枪头(10 到100 微升) 移液管 生物安全柜（超净台） 二氧化碳培养箱 倒置显微镜
实验方案 接种宿主细胞至Chamber Slides：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔Chamber Slides，接种30,000细胞/孔），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamber slides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。 制备不同稀释度的病毒液：标记6支无菌离心管，第1管加入990 μl细胞生长培养基，剩下5管加入900μl细胞生长培养基。按以下方法进行梯度稀释：在第1管中加入10 μl 病毒原液（稀释度1:100）充分混匀，然后从第1管吸100 μl至第2管中混匀，依次类推，进行10倍梯度稀释。管1至管6的稀释度分别为10-3 到10-7。 感染细胞：吸去培养孔中的培养液，每孔加入0.5 mL维持培养液（2%FBS-DMEM），再加入100 μl不同稀释度（10-2 至10-7稀释）的病毒液至其中一孔，留一孔不加作为空白对照。将细胞置二氧化碳培养箱37oC 或34oC 培养1-4周，追踪观察致细胞病变效应（CPE）发生情况。 吉姆萨染色：一旦观察到细胞病变效应，轻轻地用PBS将细胞洗3次，每次5min，然后加入Bouin's固定液固定10 min。用吉姆萨缓冲液洗3次，然和加入Giemsa染液染色1 h，再用吉姆萨缓冲液清洗后依次用丙酮处理15s，2:1的丙酮-二甲苯处理30s，1:2的丙酮-二甲苯处理30s，最后用二甲苯处理10 min紧接着用中性树胶封片。显微镜下观察CPE，包涵体，细胞融合及病毒空泡形成情况。病毒感染细胞后形成的CPE图片范例可以在很多图谱，网站和博客上找到，例如ASM Microbe Library 2.免疫荧光(IF)检测方法 材料和仪器 细胞生长培养基：含10%FBS(胎牛血清), 4-6mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等 宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamber slides） PBS磷酸缓冲液 一抗 FITC标记的二抗 细胞核染料DAPI 5-4 %多聚甲醛（PFA，pH7.4），或者甲醇 移液枪头(10 到100 微升) 离心管 生物安全柜（超净台） 二氧化碳培养箱 荧光显微镜 实验方案 接种宿主细胞至Chamber Slides：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔Chamber Slides，接种30,000细胞/孔），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamber slides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。 病毒感染：每孔细胞加0.1 mL病毒储存液，留一孔不加作为阴性对照。将细胞放回CO2 培养箱，37°C 或34°C 培养48h。
附件1 呼吸道病毒多重核酸检测试剂 技术审查指导原则 （征求意见稿） 本指导原则旨在指导注册申请人对呼吸道病毒多重核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对呼吸道病毒核酸测定试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则未包含的研究内容，可自行补充。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是
全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。 本指导原则适用于呼吸道病毒多重核酸检测试剂，适用样本类型应为鼻咽拭子、咽拭子、肺泡灌洗液、痰液或其他呼吸道分泌物样本等。检测对象应可引发相似的临床表现，可包括但不限于： 甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道感染肠道病毒（肠道病毒/鼻病毒）、冠状病毒、博卡病毒。 本指导原则适用于利用荧光探针聚合酶链式反应（Real-time PCR）或其他分子生物学方法，以特定的呼吸道病毒基因序列为检测目标，对来源于人体样本中的呼吸道病毒核酸进行体外定性检测，临床用于辅助诊断呼吸道病毒感染相关性疾病。涉及其他临床用途的呼吸道病原体核酸检测试剂可参考本指导原则。 二、基本要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其他内容，其中其他包括同类产品在国内外批准上市的情况。与预期用途相关的临床适应症应重点描述呼吸道病毒型别与临床适应症的相关性及相关病毒在我国的流行特征；产品
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
成人呼吸道感染病毒病原学检测 摘要: 目的了解哈尔滨医科大学附属第二医院成人呼吸道病毒感染的流行特征。方法采用直接免疫荧光法（DIF），对2007年4月-2008年6月住院的399名16-87岁呼吸道疾病患者痰标本进行七种病毒检测。结果399例患者中病毒检测阳性者54例，病毒总体阳性率13.53％。首位病毒为呼吸道合胞病毒29例（7.27％）和流感病毒A型27例（6.77％），其次为副流感病毒3型17例（4.26％）、副流感病毒1型13例（3.26％）、腺病毒5例（1.25％）、流感病毒B型2例（0.50％）和副流感病毒2型2例（0.50％），混合感染22例（5.51％）。64-87岁年龄组病毒检出率最高（18.12％），32-47岁年龄组病毒检出率最低（6.94％）。肺炎、支气管炎、支气管扩张、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）均有病毒检出，其中以COPD检出率最高（16.67％），其次是哮喘（15.38％）。结论病毒在成人呼吸道感染中占有重要的地位，感染主要集中在48-87岁年龄阶段（15.38％），COPD 和哮喘病毒感染率最高，以呼吸道合胞病毒和流感病毒A型最为常见。 关键词呼吸道病毒感染；成人 Abstract: Objective To understand the epidemiologic feature of respiratory tract viral infection in the adults of Harbin Medical University The Second Affiliated Hospital.Methods From April 2007 to June 2008, a total of 399 hospitalized adults were studied.Sputum were screened for virus by direct immunofluorescent (DIF) assay.Results Virus was identified in 54 patients ( 13.53%) .The most prevalent was respiratory syncytial viruses (RSV) (29, 7.27%) , followed by influenza A (27, 6.77%) , parainfluenza 3(17,4.26%) , parainfluenza 1(13,3.26%) , adenovirus (5, 1.25 %) ，influenza B (2, 0.50 %) , parainfluenza 2 (2, 0.50%) , and mixed viral infection(22, 5.51%).The highest virus detection rate (18.12%) occur in adults between 64 and 87 years, virus detection rate of the lowest (6.94%) exist in 37-47-year-old.Pneumonia, bronchitis, bronchiectasis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) have detected the virus, with the highest detection rate of COPD (16.67%), followed by asthma (15.38%).Conclusions Viruses still play an important role in respiratory tract infections in adults and was concentrated in the 48-87 age group(15.38%), the infection rate of COPD and asthma was the highest. Respiratory syncytial virus and influenza A virus was the most common types. Key words Respiratory tract viral infection;Adults 材料和方法 1.研究对象2007年4月-2008年6月随机选择哈尔滨医科大学附属二院呼吸 科住院病人399例。其中年龄16岁-87岁，男性214例，女性185例。 2.设备及试剂荧光显微镜（TS100），离心机（TGL20LM），漩涡混合器（XH-B）， 37℃培养箱（SKP-02.500），直接免疫荧光试剂盒（3137，chemicon）。 3.病毒抗原检测 标本收集和处理由专职护士将塑料导管经鼻腔插入7-8cm达到咽部以下诱导吸取1-2ml分泌物于10ml无菌离心管中[1]，-40℃冻存。实验时取出标本，向离心管中加入4-8ml冷PBS,4℃放置3-4个小时，用漩涡混合器震荡3-5分钟后，标本液转移入1.5mlEP管中，1000-6000r/min离心5-10分钟，弃去上清液，如果有粘液也一并弃去。沉淀物再加入1ml冷PBS震荡3-5分钟，1000-6000r/min