内毒素知识介绍
(2010-01-16 10:00:17)
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细菌内毒素，英文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A
细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin 最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。
细菌英文叫Bacteria ：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌
分为G+菌和G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表：
关于细菌细胞壁结构，尤其G+/G-菌不同之处见下图所示：
由以上结构模式图可以发现，G+菌与G-菌有不同之处，其中对于G-菌来说：
细胞壁较薄，厚约10－15nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。
（1）脂蛋白（lipoprotein）由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。
（2）外膜（outer membrane）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成（图1-8），位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。
细菌内毒素即：许多病原性细菌所产生的毒素。
一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。加一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
细菌外毒素与内毒素性质的比较
（1）外毒素（exotoxin）有些细菌在其生命活动过程中产生毒素能释放到周围环境中，称为外毒素。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。如痢疾杆菌、霍乱弧菌等。细菌外毒素有以下特点：
①毒性强，如纯化肉毒杆菌外毒素结晶1mg可杀死2,000万只小白鼠，对人的最小致死量约为10-4mg，破伤风毒素对小白鼠的致死量为10-6mg，白喉毒素对豚鼠的致死量为10-3mg。②对机体组织有选择性的毒性，如白喉杆菌外毒素主要抑制蛋白质合成，特别是影响肽链延长，引发心肌炎、肾上腺出血及神经麻痹等；破伤风外毒素主要毒害脊髓前角运动神经细胞，引起所属肌肉的痉挛强直。
③具有抗原性，外毒素的化学成分为蛋白质，有抗原性，即以外毒素刺激机体可产生大量的抗毒素，抗毒
素能中和外毒素使其无毒。外毒素用甲醛处理后，脱毒变成类毒素，但仍保持抗原性。
（2）内毒素（exotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死
亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
内毒素的致病作用无特异性，即各种革兰氏阴性菌对人类引起基本相同的反应。少量内毒素可引起机体发热反应；大量内毒素进入血液，可使血管透性改变，局部出血，颗粒性白细胞增多或减少和体重下降，
严惩毒时能导致内毒素性休克。内毒素毒性比外毒素小得多。
内毒素是外源性致热原，它可能激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。
细菌内毒素化学结构及化学组份
到目前为止，我们知道细菌内毒素作为G－菌细胞壁外表层结构的一部分脂多糖（lipopolysacch aride,LPS）主要是由多糖O抗原，核心多糖和类脂A(Lipid A)三部分组成。见图所示：
类脂A位于最多层。多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，具有特异性，核心多糖分为内核心及外核心，外核心由数种已糖，包括葡萄糖，半乳糖，乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及
特殊的KDO (3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖)。KDO以不耐酸的酮糖键与类脂A的氨基葡萄糖连接。所有G-菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位。通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物。具有致热作用。是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。
细菌内毒素生物活性
类脂A作为内毒素生物活性的主要部分。也是近年来研究报道最多的。由氨基葡萄糖，磷酸，10-18碳的
长链脂肪酸组成，它与可溶性的O-特异性链及核心分离后。即有难溶于水的特性。游离后的类脂A。可自身凝聚成高分子的复合体，其分子量大小不等。同时它也含有疏水性的中心及亲水性的边沿。是一种双相
分子，又是酸碱两性分子，因此类脂A的独特结构使细菌内毒素具有多种的生物活性。
细菌内毒素不同水平上的生物活性
细菌内毒素的耐热性
我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为180℃2小时或250℃30分钟以上，而日本药局方第十三改正为250℃1小时以上。其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒素的稀水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发现其内毒素活性在200℃1小时时还能检测出来。而只有当加热到250℃1小时才能完全灭活，国内细菌内毒素
标准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃1小时以上的干烤处理。
细菌内毒素的除去方法
由于细菌内毒素具有很强的耐热性，因此对于它的去除采用一般的灭菌方法是无法达到的，尤其是制药行业注射剂中内毒素的除去，对于临床用药的安全性意义重大，因此对于药品中内毒素去除可以使用过滤及高压灭菌方法，而对于一般水溶液，则普通采用薄膜过滤后高压法，对于实验中所用器具可使用干热或射线给予灭活，其它也可使用酸、碱破坏的方法。对于细菌内毒素检查法中所用实验用具的外源性内毒素除去方法，最好采用250℃2hr以上的干热灭菌方法。
各种外界因素对细菌内毒素活性的影响
细菌内毒素的生物活性随外界因素的影响变化很大。目前已经知道。一些金属离子、超声波以及温度等都会对细菌内毒素的生物活性产生很大影响，据国外文献报导，铁离子、铝离子和镓离子等会引起细菌内毒素活性的降低。因此在试验过程中最好使用玻璃用具，以必免这些因素，另外温度的高低对细菌内毒素水溶液活性影响很大，根据国内外文献的报道：内毒素水溶液活性随着环境温度的升高而降低，因此对于内毒素水溶液一定要在低温处保存，而且对已经稀释好的内毒素水溶液，要尽可能的在2小时内用完。以免活性降低。
细菌内毒素致病机理
（1）致热性
内毒素可使人体和动物致热，人体对内毒素致热原敏感。在正常情况下，人体内内毒素的正常阈值保持在0.001-0.05ng/ml之间，一旦人体免疫力下降或遭受某种致病菌侵袭时，细菌便在机体内繁殖崩解，释放出大量的内毒素，当体内内毒素的浓度高于这个阈值时，即可启动内外源致热原引起机体发热。
（2）内毒素对糖代谢的影响及其机理
内毒素直接或间接损害肝脏，引起糖代谢紊乱及酶学、蛋白代谢的改变。
①致病机理：脂多糖能刺激肾上腺素的分泌和释放，使磷酸环化酶活性增强，加速糖分解，使血糖浓度表现为暂时性升高。
②低血糖症的主要机理：脂多糖进入机体数小时后，始作用于肝细胞，引起肝细胞的损伤，使糖元异生的关键酶活性降低，抑制糖原的异生和分解，激活丙酮酸激酶，加速葡萄糖的分解氧化，并产生大量的热量，在临床上表现为发烧症或持续低血糖症。内毒素致肝脏枯否氏细胞功能受到抑制，进而影响对内毒素的消除及对胰岛素的分解代谢。
（3）内毒素对血液循环系统的影响及机理：
内毒素可引起白细胞和血小板减少，激活凝血、纤溶系统，产生出血倾向，可导致弥漫性血管内凝血（DIC）的发生。DIC严重时，可导致严重的休克症状。
①内毒素（脂多糖）对中性粒细胞的作用及机理：内毒素（脂多糖）能引起人体血液中中性粒细胞的增多，这是人体对内毒素反应最敏感的指标之一，亚致热量即可引起中性粒细胞的减少，并伴之以粘连性增加，数小时后，中性粒细胞明显增多。
②脂多糖对血小板的影响：对实验动物注射足量的脂多糖后，均能导致动物血液中血小板明显减少。
③脂多糖对淋巴细胞的作用：脂多糖作用于B淋巴细胞，可增强B淋巴细胞DNA的合成。脂多糖能提高人体体液免疫功能，革兰氏阴性菌感染后引发的机体发热是人体自我防御功能的表现，是积极的。
④脂多糖对单核细胞和巨噬细胞的作用：增强吞噬和巨噬细胞的杀菌能力。同时，脂多糖作用于巨噬细胞和单核细胞后，能产生多种中介物质，参与外源性凝血过程，脂多糖能刺激单核细胞和巨噬细胞产生集落刺激因子（GSF）。
⑤对红细胞和血清铁的影响：脂多糖能抑制红细胞的生成，脂多糖直接作用于骨髓造血干细胞，抑制骨髓的造血功能。内毒素可导致血清铁浓度的降低，内毒素血症的另一病症就是缺铁性贫血。
⑥内毒素可经C3旁路或经典途径激活补体系统，最终导致血压下降和血液动力学的改变，出现局部或全身性shwartzman（炎症症状），并伴有轻微的发热症状。
细菌内毒素作用机理
(1-3)β-D-glucan概念、结构及活性
1) (1-3)β-D-glucan概念：
(1-3)β-D-glucan在自然界的分布很广，主要存在于担子菌、真菌、地衣类、高等植物以及酵母、藻类的菌体成分中，平均分子量在6800左右。分子结构具用多样性。另外，某些使用人造纤维制作的人工肾透析模上也含有类似物质。但它并不引起家兔的升温过程。关于(1-3)β-D-glucan旁反应系是否可以单独形成凝固蛋白，或是与ET反应系的共同作用形成凝固蛋白，目前国外学者尚有一定分歧。(1-3)β-D-glucan对热极为稳定，高压121、1小时不以使其全部灭活。需250℃2小时干热灭菌处理才能彻底去除。另外强酸、强碱以及一些酶类也能使其灭活。目前在日本，尤其是在药局方的各种解说书中，无热原的概念即灭菌后的用具除了无ET外，还要求无(1-3)β-D-glucan。这一点要引起足够重视。
2) (1-3)β-D-glucan结构：
由上可知：(1-3)β-D-glucan在自然界的分布很广，可以说明它同细菌内毒素一样，无处不在，无处不有。有关它的化学结构如下所示：
除此之外，它还有许多其它高一级的结构，如(1-4)β-D-glucan、(1-6)β-D-glucan结构等。
3) (1-3)β-D-glucan生物活性：
(1-3)β-D-glucan与细菌内毒素一样，除了结构的多样化外，它们也有许多共同特性。如对热的稳定性，不易去除，不同菌株所产生的结构差异性等。作为(1-3)β-D-glucan的生物活性主要表现在以下几个方面：(1-3)β-D-glucan类的生物活性：
1.刺激机体的（MQ）巨噬细胞产生各种细胞分裂素Cytikines(TNF IL-1 IL-6等)；
2.激活补体第二条经路；
3.抗肿瘤作用；
4.抗炎症作用；
5.抗放射线作用；
6.激活G因子旁路使鲎血细胞裂解液（LAL（TAL）试剂）产生凝集反应
细菌内毒素标准品
作为内毒素的研究和使用者对于高纯度的内毒素标准品的渴望是十分迫切的，我们知道，细菌内毒素的活性随着菌株来源不同，调制方法及分散状态等不同差异很大，因此作为一个好的标准内毒素必须有满足以下条件：
1）菌株来源要有很好的稳定性。
2）能够很好地确定其化学分析值。
3）强的发热性与鲎试验活性间要有很好的相关性。
4）反应曲线为直线型。
5）易溶、在冻冷状态下能长时间稳定贮存。
6）高纯度并能保证供应。
WHO在1950年开始就提出了热原标准品的问题，在1959年Shigella dysenteriae内毒素第一次作为WHO standard被采用由于这个标准品稳定性等问题，目前已不在使用，之后，随着内毒素的研究，尤其是鲎试验法的研究与应用，各种新的内毒素标准品已被制备出来，目送各国在内毒素标准品菌株的选择上，一般均使用发热活性比较强的大肠杆菌，除添加附形剂稍有不同处，其对家兔的性几乎都是一样的，各种内毒素标准品，除了发热性好外，还要求具有鲎试验活性，化学分析值安定性、均一等。目前WHO最新的细菌内毒素标准品为EC－6，以下为三国标准内毒素化学分析值，供参考：
细菌内毒素工作标准品：主要用于日常检验工作和实验研究，尤其在内毒素检查法中，用于阳性对照和样品的阳性对照，其力价要比参考内毒素标准品要低的多。由于制备工艺不同其对鲎试剂的反应性也存在很大差异，因此在实验中，为了保证实验有效和准确建立稳定统一的CSE是十分必要的。
另外，目前的内毒素标准品一般都是针对凝胶法而言的，虽说国外在定量法使用上已逐渐增多，但真正的定量法专用内毒素标准品还没有，因此定量法中使用的内毒素标准品的研究是十分重要的。
细菌内毒素量值
关于细菌内毒素的量值在80年代几乎都是以重量单位来表示它很不科学，相同重量的内毒素，由于菌株来源不同，提取方法各异而且所加附形剂不同，因此其生物活性相差很大。如EC-2和EC-5，其重量换算单位分别：5EU/ng 和10EU/ng，因此随着人们对内毒素生物活性的不断提高，以效价单位表示内毒素的量值是十分合理的。
目前，世界各国药典所收载的细菌内毒素标准品均是以效价单位来表示。由于各国所用菌种来源不同，加入的赋形剂不同，其效价也不尽相同，如美国药典内毒素参考标准品（EC-6）的效价为10000EU/瓶，JP 为16000EU/瓶，BP=WHO为14000EU/瓶，而中国药典内毒素参考标准品（Lot;981）的效价为9000EU/Amp。因此，建立统一的细菌标准品是目前各国所面临的一大问题。
内毒素血症
内毒素血症是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起。内毒素血症分为内源性和外源性两大类。
（1）内毒素血症发生的原因。
在严重创伤、感染等应激状态下可出现：
全身网状内皮系统功能障碍，免疫机能下降，肠道吸收的内毒素过多而超过机体清除能力；
胃肠道粘膜缺血、坏死、屏障破坏，大量内毒素释放入血；
肠道吸收的内毒素因肝功能障碍由侧枝循环直接入体循环；
某些组织、器官的感染引起外源性内毒素入血。
（2）内毒素血症的临床症状
内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克等。内毒素可引起组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等的释放，导致微循环扩张，静脉回流血量减少，血压下降，组织灌流不足，缺氧及酸中毒等。
（3）内毒素血症的后果
内毒素血症可以出现在多系统的多种疾病中，通常导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等，病死率极高。
内毒素血症可引起一系列病理生理改变：①发热反应：内毒素直接作用于下丘脑体温调节中枢，或作用于白细胞使之释放内原性致热原；②促使血管活性物质如缓激肽、组胺、5-羟色胺、血管紧张素等释放，使血压下降，导致微循环障碍；③引起白细胞和血小板减少，激活凝血、纤溶系统，产生出血倾向；弥漫性血管内凝血；④经C3旁路或经典途径激活补体；⑤直接或间接损害肝脏，引起糖代谢紊乱及酶学、蛋白代谢的改变；⑥激活白三烯、前列腺素、巨噬细胞、单核细胞及内皮细胞活性。
（4）各类疾病内毒素血症的发生率
急性肝炎37-64%；爆发性肝炎58-100%；丙肝61.54%；胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%；烧伤85%；败血症70%；多器官功能衰竭100%；急性胰腺炎90%；皮肤软组织感染70-81.1%；腹腔感染72-84%；尿路感染70-80%（肾炎）、癌症70%；肺炎100%；上感100%。
（5）内毒素血症的治疗
内毒素血症的治疗原则多主张：①减少内毒素的产生和吸收；②改善内毒素引起的微循环障碍。
肠源性内毒素血症
许多非革兰氏阴性菌感染的重症病人及处于应激状态的患者，绝大部分出现内毒素血症，血浆中内毒素血症主要来源于肠道内毒素的吸收，因此肠源性内毒素血症是病人死亡的主要原因。
肠源性内毒素血症的发病机制与如下几方面有关：
（1）肠道内毒素生成和摄取增多（肠道微生物移位）
机体免疫功能受损和肠粘膜免疫屏障的破坏，内毒素移位，进入血循环；
肠粘膜屏障功能障碍，粘膜缺血、萎缩、破损、脱落均可造成内毒素移位，发生肠源性内毒素血症；
肠道微生态环境破坏，广谱抗生素的长期应用减少了对抗生素敏感的厌氧菌的数量，导致革兰氏阴性菌大
量繁殖，突破粘膜屏障而移位进入血循环。
（2）肝脏对内毒素的清除功能减退，大量内毒素在肝脏未经解毒溢入体循环。
（3）门体系统功能障碍，出现门体分流，来自肠道的内毒素绕过肝脏，未经灭活解毒，涌入体循环，形成内毒素血症。
（4）淋巴液生成增加，腹腔淋巴管--胸导管是内毒素进入体循环的重要替代途径。
（5）外周血内毒素灭活功能降低，各种原因造成的外周血灭活内毒素能力下降，易发生肠源性内毒素血症。
鲎的种属及分布
鲎，又称作王蟹，是一种栖生于海洋中的低等无脊椎动物，大约出现在古生代泥盆纪，距今已明几亿年的历史，但直到现在它的形态并无重大变化故有＂活化石＂之称，在国外普通受到保护。
鲎试剂，即利用美州鲎或新鲎的血细胞裂解物提取而来，分别为 LAL试剂和TAL试剂两种
鲎，在动物学分类上，隶属于节肢动物门（Arfhropoda），有螯肢亚门（chelicerata），肢口纲（Merostomata），剑尾目（Xiphosura）。出现在4亿年前的古生代泥盆纪俗称＂活化石＂，鲎是从古生代的三叶虫演化而来。
鲎的种属很少，目前全世界仅存三属4种，分别为：
1. 美洲鲎 Limulus polyphemus LinnaEUs分布在北美西洋岸
2. 东方鲎TachyplEUs tridentatus Leach分布在中国、日本、菲律宾等
3. 巨鲎 TachyplEUs gigas Muller分布在泰国、印度尼西亚等
4. 园尾鲎 Car cinoscorpius rotundi cauda pocock分布马来半岛、印尼等
其中能够用于制备鲎试剂的主要有：1.美洲鲎和 2.东方鲎。
鲎的地理分布狭隘，仅限于北美与东南亚一带，欧洲虽发现过鲎的化石，但目前未发现有活鲎的存在，而分布在我国沿海一带的鲎，都属于同一种，取名为中国鲎，从浙江乍浦以南至福建、台湾广东均有分布，但以福建、广东产的鲎个体大、数量多。
鲎试剂的制备
鲎试剂：即从鲎的血细胞裂解物中提取而来，用于制备鲎试剂的鲎主要为美洲鲎和东方鲎，所以目前国际上只有中、美、日、德等少数国家生产。鲎试剂分类在鲎的来源不同可分为 LAL试剂和TAL试剂，若按使用方法分类又可分为：凝胶法用鲎试剂，浊度法用试剂，显色法用试剂三大类，目前在日本又开发出一种用于测定β-D-Gluean的试剂，象Gluspecy和由蚕的体液中提取出来的一种SLP试剂。关于鲎试剂的制备见下所示：
对于生产过程要严格按照无菌操作进行。
随着鲎试剂制备工艺的不断完善，以及生物化学的发展，人们已逐渐认清了鲎试剂中各种组份，并已分离提取出来，到目前为止，鲎试剂中的主要组份包括有：C.B.G.凝固原，凝固蛋白酶以及适量的Ca z +Mg+Na+等。
论文关键词: 抗菌药内毒素青霉素结合蛋白 论文摘要: 一些实验研究及临床资料证明,有些抗菌药尤其是β-内酰胺类抗生素在治疗革兰氏阴性菌感染时,有诱导大量内毒素释放的副作用,在临床上可能引起或加重内毒素血症。不同类型抗菌药诱导内毒素释放的程度与其对不同类型青霉素结合蛋白(pbp)的亲和性有关,抗菌药与pbp3或pbp2结合所造成的内毒素释放的量较高。因此在抗菌药的研究设计中,除了要考虑其杀菌效力外,还应考虑可能诱导内毒素释放的问题。在败血症治疗中也应采取合理的治疗方案,以防止或减轻内毒素血症的发生。 内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖成分,具有广泛的生物活性。内毒素对机体造成双重影响:少量内毒素刺激机体时,能增强特异性及非特异性免疫力,诱导产生干扰素等;而大量内毒素进入机体循环时,可造成广泛而强烈的病理反应,如弥漫性血管内凝血、多器官功能衰竭及休克等。内毒素在革兰氏阴性杆菌引起的感染性休克中起着关键作用[1－3]。对于革兰氏阴性菌败血症病人,有些广谱抗菌药能有效地控制菌血症,但是临床资料证明病人的死亡率仍然很高,其原因可能与抗菌药诱导细菌释放内毒素有关[4,5]。由于在抗菌药治疗的过程中,随着细菌的裂解,内毒素从细菌的细胞壁外膜释放后进入血液循环,因而可能加重内毒素血症,从而促进一系列的炎症反应,造成机体严重而广泛的病理损伤。 1 抗菌药诱导的内毒素释放 在体外细菌培养系统中,已发现多种抗菌药如β-内酰胺类[6~8]、氨基糖苷类[9]、氟喹诺酮类药物[10]等均能引起不同程度的内毒素释放,其中β-内酰胺类抗生素(如氨苄西林,头孢噻肟,头孢他啶,氨曲南等)能诱导多种细菌包括野生菌和突变菌(如大肠埃希氏菌,铜绿假单胞菌[6~8],肺炎克雷伯氏菌[11],流感嗜血菌[12]等)释放大量的内毒素,在这些抗菌药处理的细菌培养上清液中能检测到内毒素含量比无抗菌药处理者高几倍甚至几十倍。β-内酰胺类抗生素诱导的内毒素释放常常与其造成的细菌溶解伴随发生,并与细菌溶解程度有一定关系。内毒素-细胞因子级联反应所造成的全身炎症过程是发生内毒素休克的重要环节。抗菌药作用于细菌后,由于细菌裂解及伴随的内毒素释放到培养上清液中,其上清液可刺激巨噬细胞及血管内皮细胞等产生大量的肿瘤坏死因子(tnf)和白细胞介素-6(il-6)[13~15],这些炎性因子的大量产生可促进内毒素休克的发生。 有些动物体内实验可观察到与体外实验一致的结果。给大肠埃希氏菌性腹膜炎家兔注射庆大霉素后,动物血液中细菌数量急剧减少,但血浆中内毒素含量较未治疗者明显增高[9]。用氨苄西林治疗幼年大鼠流感嗜血菌性腹膜炎,造成较多的内毒素释放入血液循环[12]。烧伤后感染肺炎克雷伯氏菌的败血症小鼠,经头孢他啶、氨曲南、亚胺培南治疗后,小鼠血液中内毒素含量明显增高,同时内毒素激活巨噬细胞产生大量的il-6[16]。大肠埃希氏菌性脑膜炎家兔,经美罗培南和头孢噻肟治疗后,在脑脊液中可检测到高含量的内毒素,同时脑脊液中tnf 浓度也增高[17]。不同类型的抗菌药所诱导的内毒素释放水平有所不同,如拉氧头孢对菌血症的清除作用与庆大霉素相似,但其诱导内毒素释放的量比庆大霉素高20倍[18]。用d-半乳糖胺处理小鼠后,再造成大肠埃希氏菌性腹膜炎模型,发现用头孢他啶治疗比用亚胺培南治疗引起更多的小鼠死亡,推测头孢他啶诱导更多的内毒素释放[19]。 虽然动物体内的研究结果不能外推到人,但这些研究证据提示了抗菌药促进内毒素释放,加重内毒素血症的可能性。有些革兰氏阴性菌败血症患者在接受抗菌药治疗后,尽管血液中细菌数减少或消失,但大部分病人呈现血浆中游离及总内毒素含量增高(游离内毒素含量升高2~50倍)[5,20]。流感嗜血菌感染的脑膜炎患儿,在接受头孢他啶治疗后,所有患儿脑脊液中游 离内毒素含量均增高,同时脑脊液中乳酸盐及乳酸脱氢酶增高及葡萄糖下降,提示内毒素增高导致炎症加重[21]。用抗菌药治疗泌尿系感染后,尿液培养显示细菌数下降,但尿中内毒素含量却明显增高。内毒素释放的程度与所用的抗菌药种类有关,其中β-内酰胺类抗生素所
内毒素和外毒素
1．外毒素产生菌主要是革兰阳性菌中的破伤风梭菌、肉毒梭菌、白喉杆菌、产气荚膜梭菌、A群链球菌、金黄色葡萄球菌等。某些革兰阴性菌中的痢疾志贺菌、鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌、肠产毒素型大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等也能产生外毒素。大多数外毒素是在菌细胞内合成后分泌至细胞外；也有存在于菌体内，待菌溶溃后才释放出来的，痢疾志贺菌和肠产毒素型大肠埃希菌的外毒素属此。 外毒素的毒性强。1mg肉毒毒素纯品能杀死2亿只小鼠，毒性比KCN大1万倍。不同细菌产生的外毒素，对机体的组织器官具有选择作用，各引起特殊的病变。例如肉毒毒素能阻断胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱，使眼和咽肌等麻痹，引起眼睑下垂、复视、斜视、吞咽困难等，严重者可因呼吸麻痹而死。又如白喉毒素对外周神经末梢、心肌等有亲和性，通过抑制靶细胞蛋白质的合成而导致外周神经麻痹和心肌炎等。 多数外毒素不耐热。例如白喉外毒素在58—60℃经1—2h，破伤风外毒素在60℃经20min可被破坏。但葡萄球菌肠毒素是例外，能耐100℃30min。大多外毒素是蛋白质，具有良好的抗原性。在0.3%—0.4%甲醛液作用下，经一定时间，可以脱去毒性，但仍保有免疫原性，是为类毒素（toxoid）。类毒素注入机体后，可刺激机体产生具有中和外毒素作用的抗毒素抗体。类毒素和抗毒素在防治一些传染病中有实际意义，前者主要用于人工主动免疫，后者常用于治疗和紧急预防。 多数外毒素的分子结构为A-B模式，即由A和B两种亚单位组成。A亚单位是外毒素活性部分，决定其毒性效应。B亚单位无毒，能与宿主靶细胞表面的特殊受体结合，介导A亚单位进入靶细胞。A或B亚单独对宿主无致病作用，因而外毒素分子的完整性是致病的必要条件。利用B亚单位能与靶细胞受体结合后阻止受体再与完整外毒素分子结合，且B亚单位抗原性强；将B亚单位提纯制成疫苗，有可能预防相关的外毒素性疾病。 根据外毒素对宿主细胞的亲和性及作用方式等，可分成神经毒素、细胞毒
For personal use only in study and research; not for commercial use 内毒素和外毒素
1．外毒素产生菌主要是革兰阳性菌中的破伤风梭菌、肉毒梭菌、白喉杆菌、产气荚膜梭菌、A群链球菌、金黄色葡萄球菌等。某些革兰阴性菌中的痢疾志贺菌、鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌、肠产毒素型大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等也能产生外毒素。大多数外毒素是在菌细胞内合成后分泌至细胞外；也有存在于菌体内，待菌溶溃后才释放出来的，痢疾志贺菌和肠产毒素型大肠埃希菌的外毒素属此。 外毒素的毒性强。1mg肉毒毒素纯品能杀死2亿只小鼠，毒性比KCN大1万倍。不同细菌产生的外毒素，对机体的组织器官具有选择作用，各引起特殊的病变。例如肉毒毒素能阻断胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱，使眼和咽肌等麻痹，引起眼睑下垂、复视、斜视、吞咽困难等，严重者可因呼吸麻痹而死。又如白喉毒素对外周神经末梢、心肌等有亲和性，通过抑制靶细胞蛋白质的合成而导致外周神经麻痹和心肌炎等。多数外毒素不耐热。例如白喉外毒素在58—60℃经1—2h，破伤风外毒素在60℃经20min可被破坏。但葡萄球菌肠毒素是例外，能耐100℃30min。大多外毒素是蛋白质，具有良好的抗原性。在0.3%—0.4%甲醛液作用下，经一定时间，可以脱去毒性，但仍保有免疫原性，是为类毒素（toxoid）。类毒素注入机体后，可刺激机体产生具有中和外毒素作用的抗毒素抗体。类毒素和抗毒素在防治一些传染病中有实际意义，前者主要用于人工主动免疫，后者常用于治疗和紧急预防。多数外毒素的分子结构为A-B模式，即由A和B两种亚单位组成。A亚单位是外毒素活性部分，决定其毒性效应。B 亚单位无毒，能与宿主靶细胞表面的特殊受体结合，介导A亚单位进入靶细胞。A或B亚单独对宿主无致病作用，因而外毒素分子的完整性是致病的必要条件。利用B亚单位能与靶细胞受体结合后阻止受体再与完整外毒素分子结合，且B 亚单位抗原性强；将B亚单位提纯制成疫苗，有可能预防相关的外毒素性疾病。 根据外毒素对宿主细胞的亲和性及作用方式等，可分成神经毒素、细胞毒素和肠毒素三大类。细菌的外毒素多数为A-B型分子结构，这类外毒素的作用机制不完全相同，又可分为几种类型：（1）具腺苷二磷酸核糖基转
纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL 准备工作： 1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1) 2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water) 3.可选：加 LyseBlue 试剂于 Buffer P1 4.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解 5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill 6.细菌扩增培养 补充： 1.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液，2个用于接下来 的菌块重悬和与buffer混合 2.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯，因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离 心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA 3.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制 4.准备1个冰浴盒用于步骤6 5.准备室温下的异丙醇10.5ml 6.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳 步骤：peocedure A.细菌培养、收获和裂解bacterial culture,harvest & lysis 1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min 从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落，2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm，注意孵化容器容积至少4倍于培养液） 抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。(孵化容器容积至少4倍于培养液，培养至细菌密度约3-4×109/ml，即离心后菌块湿重约3g/L培养基) 培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水，用1 N NaOH 调pH值至7.0，用蒸馏水调整至1L。 可将离心后菌块-20摄氏度下冰冻保存暂时终止实验。
3.2.1原本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。将玻璃器皿置于烤箱中，加热到250℃，持续30min，即可去除内毒素。 3.2.2方法与步骤1、内毒素去除效率的评估（1）制备浓度分别为1000和1000EU/mL 的CSE溶液。按内毒素测量方法检测这些溶液。（2）向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1mL的CSE溶液。（每种类型的玻璃器皿至少有3EU的CSE）。（3）将玻璃器皿置放烤箱中，在60℃下，干烤持续30min，烘干，然后在烤箱中，250℃下，干烤30min。（4）加入适量的LAL水，剧烈振荡5min，以清洗玻璃器皿，然后测量清洗后的LAL水中的内毒素的浓度。（5）比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。当内毒素含量至少减少了3—log时，该方法有效。必要时，重复操作，去除内毒素。用鲎度验法计算内毒素去除的百分比。2、去除实验玻璃器皿上的内毒素确定可使内毒素玻璃器皿上的内毒素对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿，重复操作，直至内毒素含量下降3—log。（例如，1000 IEU和10000 10EU）数个加热循环后，用前述的鲎试验法，测定内毒素含量。3、对照阴性对照：用只盛有LAL水的玻璃器皿，在250℃下，干烤30min并用LAL法测量内毒素的含量。阳性对照：干燥（60℃，30min）每种玻璃器皿中的内毒素溶液，不经过干烤（250℃，30min）去内毒素的操作，然后测定其内毒素质量。 3.2.3质控与提示（1）保烤箱散热均匀，为此，在操作过程中，可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上，当温度在250℃后，温度的波动不要超过±15℃。（2）用含100EU的内毒素过行的检测，可用来确定去内毒素的效率。用含10000EU的内毒素进行的检测，可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。（3）如果如果不理想，可增加每一次操作的时间和操作次数。（4）其他技术适用于培养基的内毒素，例如，超滤，反向渗透，但比较昂贵。选取有效的滤过膜，确保去内毒素后，培养基的营养成分不丢失并且内毒素含量下降3—log。
政治 相关考点分析： 1.经济生活 (1) 建设“一带一路”是适应经济全球化趋势的客观要求。建设“丝绸之路经济带”，有利于促进生产要素在沿途各国间的流动、国际分工水平的提高、各国生产力的发展，为各国经济提供了更加广阔的发展空间。 (2) 建设““一带一路”是市场经济发展的内在要求。建设“丝绸之路经济带”，有利于沿途各国加强区域合作，充分利用国际国内两种资源、两个市场，实现资源的合理、优化配置。(3) 建设““一带一路”是我国坚持对外开放的基本国策，提高开放型经济水平的要求。建设“丝绸之路经济带”，有利于我国与中亚各国之间的相互开放、互利合作，把“引进来”和“走出去”更好结合起来。 2.政治生活 (1)国家间的共同利益是国家合作的基础，而利益对立则是引起国家冲突的根源。加强中国与中亚国家友好合作关系，促进互利共赢，符合中国与中亚各国的共同利益。 (2)和平与发展是当今时代的主题。中国倡议共同建设“丝绸之路经济带”，主张做和谐和睦的好邻居、真诚互信的好朋友、互利共赢的好伙伴，反映了当今时代的主题。 (3)我国的国家性质和国家利益，决定了我国一贯奉行独立自主的和平外交政策，坚持独立自主的基本立场，以维护世界和平、促进共同发展为宗旨，以维护我国的独立和主权、促进世界的和平与发展为基本目标，以和平共处五项原则作为发展对外关系的基本准则。中国发展与中亚国家友好合作关系的主张和政策，体现了我国的外交政策。 3.文化生活 (1)文化具有多样性。在文化交流过程中，尊重文化多样性，既要认同本民族文化，又要尊重其他民族的文化，相互借鉴，求同存异，尊重世界文化多样性，共同促进人类文明的繁荣进步;必须遵循各国文化一律平等的原则。在文化交流中，要尊重差异，理解个性，和睦相处，共同促进世界文化的繁荣。 (2)文化在交流中传播。文化交流的过程，就是文化传播的过程。商业贸易是文化交流和传播的重要途径，加强经济贸易往来，有利于促进文化的交流与传播。 (3)加强中外文化交流，有利于促进中华文化的传播，推动世界文化的繁荣，增进各国人民之间的友谊和相互了解，维护世界的和平与发展，建设和谐世界。 (4)在中外文化交流过程中，我们既热情欢迎世界各国优秀文化在中国传播，吸收和借鉴各国优秀文明成果，又要更加主动地推动中华文化走向世界，做传播中华文化的使者，不断增强中华文化国际影响力。 高考试题预测： 1.“一带一路”（丝绸之路经济带和21世纪海上丝绸之路）贯穿欧亚大陆。无论是发展经济、
一、信息技术基础知识 一、选择题 1.同一条新闻可以通过报纸、电视、网络等媒体传播，说明信息具有（） A.价值性 B.共享性 C.时效性 D.载体依附性 2. 一台计算机的配置为：Intel Core i5 1.7GHz／2GB／500GB／DVD／，其中 用来表示内存大小的是( ) A.Intel Core i5 B.1.7GHz C.2GB D.500GB 3.小涛同学电脑中的E盘出现了电脑病毒，下面方法不能有效地清除病毒的是（） A.将E盘中的文件手动全部删除后重新启动电脑 B.将E盘整个格式化后重新启动电脑 C.使用"木马查杀"工具或其他专业的病毒专杀工具 D.升级安装的杀毒软件后进行全面杀毒 4. 小明设计开发了一款音乐编辑软件，该软件属于（） A.系统软件 B.硬件系统 C.操作系统 D.应用软件 5.交通广播台将实时路况通过广播告知大家，这体现了信息的（） A.必要性 B.时效性 C.共享性 D.载体依附性 6. 在文字编辑软件中（）可以删除插入点光标左侧的字符。
A.退格键 B.Delete C.Enter D.空格 7. 下列做法正确的是（） A.在网上发布信息时，一定要用假身份 B.信息未经甄别，就随意在网上发布 C.在网上可以不受道德和法律的约束 D.收到别人转发的信息后，不随便转发 8. 下列叙述中，错误的是（） A.信息可以被多次接收并反复使用 B.信息具有可传递性 C.同一个信息可以依附于不同的载体 D.信息被获取后，它的价值将永远不变 9. 我们一般根据( )将计算机的发展过程分为四代。 A.体积的大小 B.速度的快慢 C.价格的高低 D.使用元器件的不同 10. 关于计算机木马病毒的叙述，正确的是（） A.正版的操作系统不会受到木马的侵害 B.计算机木马不会危害数据安全 C.计算机中的木马是一种计算机硬件
去内毒素质粒提取Protocol 内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性（如大肠杆菌，E.coli）胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS 分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。 图1. 内毒素结构图。 细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率，此外会激活造血细胞（如B细胞、巨噬细胞等）的非特异免疫反应，造成实验的假阳性，所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。 内毒素如何测定？ 历史上，内毒素测定主要是基于内毒素与鲎（一种海洋节支动物，也称马蹄型蟹）血液中的变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时可发生凝血反应。鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是：鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法，该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。 LPS污染通常用内毒素单位（Endotoxin Units, EU）表示，通常情况下，1ng LPS对应于1到10个EU。
Protocol 常用的试剂盒选择包括Qiagen、Sigma都挺好用的。或者omega、天根等。在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门，就是有的盒子上写着“Endofree”字样，这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS，可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。没有这个字样的试剂盒，对于常规的分子克隆实验，如，PCR，酶切，克隆等完全够用了。 如果不是特别的试验，建议采用手工方法，丁香园战友推荐以下的protocol提的质粒免疫动物没有问题，曾用于制备DNA疫苗，可进行大量的去内毒素质粒提取。 1）挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管，37℃培养8-12小时。 2）用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中，37℃培养12-16小时。 3）用500ml离心筒收集菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清。 4）用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支30ml离心管中，6000rpm 5分钟，弃上清。 5）用3ml预冷的溶液I重悬菌体，再加入6ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入4.5ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀。 6）4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移至另外的30ml管中。 7）加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃20分钟以上。 8）4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。 9）加入5ml TE使DNA溶解后，加入5mol/L的LiCl溶液5ml，轻轻混匀，-20℃放置5-10分钟。 10）4℃12000rpm离心15分钟，转移上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟以上。 11)4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。 12）用2ml TE溶解沉淀，并加入50μl/管的RNase（5mg/ml），37℃消化过夜。
一、国家层面政策汇总与解读 （一）政策汇总 （二）重点政策解读 1、《关于进一步完善人民币跨境业务政策促进贸易投资便利化的通知》 2018年1月，中国人民银行发布《关于进一步完善人民币跨境业务政策促进贸易投资便利化的通知》（以下简称《通知》），进一步完善和优化人民币跨境业务政策。 《通知》明确，凡依法可使用外汇结算的跨境交易，企业都可以使用人民币结算。支持银行以服务实体经济、促进贸易投资便利化为导向，按照现有人民币跨境业务政策创新金融产品，提升金融服务能力，满足市场主体真实、合规的人民币跨境业务需求。 为服务“一带一路”建设，满足个人项下雇员报酬、社会福利、赡家款等人民币跨境结算需要，《通知》明确银行可在“展业三原则”的基础上，为个人办理其他经常项目人民币跨境收付业务，便利境内个人将境外合法收入汇回境内使用，以及境外个人将境内合法人民币收入汇出境外。 便利境外投资者以人民币进行直接投资。《通知》进一步优化了业务办理流程，取消了相关账户开立和资金使用等有关方面的限制，明确银行可在“展业三原则”的基础上，根据企业实际需要办理相关业务。《通知》要求银行应确保境外投资者的人民币利润、股息等投资收益依法自由汇出。 另外，《通知》还明确了境内企业境外发行债券、股票募集的人民币资金可按实际需要调回境内使用，进一步简化管理流程，便利企业日常运营。 点评：
自2009年推出跨境贸易人民币结算试点以来，人民银行根据市场主体需要不断完善人民币跨境业务政策，便利市场主体开展跨境贸易和投融资活动，帮助市场主体规避汇率风险，降低财务成本。《通知》的实施将有利于进一步提高贸易投资便利化水平，有利于提升金融机构服务实体经济、服务“一带一路”建设的能力，有利于我国推进更深层次更高水平的对外开放。从银行视角来看，《通知》的发布将进一步推动“走出去”企业及出口导向型企业的跨境金融需求，给银行的跨境金融业务带来良好的发展机遇。 2、《关于引导对外投融资基金健康发展的意见》 2018年4月，国家发展改革委、财政部、商务部、人民银行、银保监会、证监会等六部委联合发布《关于引导对外投融资基金健康发展的意见》（以下简称《意见》），引导对外投融资基金健康发展，加快培育国际经济合作和竞争新优势。 优化募资方式方面，《意见》重点对拓宽社会资本参与渠道、支持国内各类机构参与出资、加强与国际金融机构合作等方面提出了相关意见。其中，《意见》按照分类施策的原则对主权财富基金、商业性金融机构、开发性政策性金融机构出资参与对外投融资基金提出了明确要求，指导国内各类机构依法合规通过对外投融资基金开展境外投融资业务；同时，《意见》提出不得以信贷资金等方式违规出资、地方各级政府不得以财政性资金在境外出资设立对外投融资基金，旨在厘清对外投融资基金的募资来源，加强对地方财政性资金使用投向的引导，提升各类资本参与对外投融资基金的规范化程度。 提升运行效率方面，《意见》重点对推动基金业务创新、鼓励按政策导向开展业务、提升专业化管理水平等方面提出了相关意见。其中，《意见》提出鼓励对外投融资基金开展有利于推进“一带一路”建设，深化国际产能合作，带动国内优势产能、优质装备、适用技术输出，提升我国技术研发和生产制造能力，弥补我国能源资源短缺，推动我国相关产业提质升级的业务；严格限制对外投融资基金开展与国家外交方针、发展战略以及宏观调控政策不尽相符的业务；禁止对外投融资基金开展危害或可能危害国家利益和国家安全等的业务。 完善监管体系方面，《意见》重点对加强统筹管理、完善监管制度、建立健全激励惩戒机制等方面提出了相关意见。其中，《意见》明确要统筹做好对外投融资基金管理工作，提出境内投资者赴境外设立对外投融资基金，境内设立的对外投融资基金开展对外投融资，应按有关规定履行相关手续；有关职能部门通过事前和事中事后监管制度及时掌握境外设立的对外投融资基金运作情况。 点评：
去内毒素的方法及检查方法 注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。 热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。其中脂多糖具有很强的热原活性。由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。 【相关链接】热原的危害 一、热原的性质及除去热原的方法 1．高温法 热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。 2．吸附法 热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。 3．超滤法 热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法 热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。 5．酸碱法 热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。 6．其它 包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。 二、热原的检查方法 《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。 1．热原检查法 由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。 《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用
XX一带一路20个必考知识点 1、XX年9月7日，首次提出共建“丝绸之路经济带”的倡议。 2、XX年10月3日，首次提出共同建设21世纪“海上丝绸之路”的倡议。 3、“一带一路”的共建原则：恪守联合国宪章的宗旨和原则；坚持开放合作；坚持和谐包容；坚持市场运作；坚持互利共赢。 4、“一带一路”四大理念：和平合作；开放包容；互利共赢；互学互鉴。 5、“一带一路”三大共同体：责任共同体；利益共同体；命运共同体。 6、“一带一路”中打造的四大丝绸之路：绿色丝绸之路；健康丝绸之路；智力丝绸之路；和平丝绸之路。 7、“一带一路”中八项要求：切实推进思想统一；切实推进规划落实；切实推进协调统筹；切实推进关键项目落地；切实推进金融创新；切实推进民心相通；切实推进舆论宣传；切实推进安全保障。 8、“一带一路”建设的社会根基：民心相通 9、“一带一路”建设向前推进的必要前提和保障：边境地区的和平稳定。 10、“一带一路”合作重点：政策沟通；设施联通；贸
易畅通；资金融通；民心相通。 11、“一带一路”简称译为：theBeltandRoad。 12、“一带一路”四大资金池：丝路基金；亚洲基础设施投资银行；金砖国家开发银行；上合组织开发银行。 13、“一带一路”是实现共同繁荣、促进共同发展的共赢之路，是增进理解信任、加强全方位交流的和平友谊之路。 14、“一带一路”致力于打造文化包容、经济融合、政治互信的利益共同体、命运共同体和责任共同体。 15、“一带一路”的提出，肩负的三大使命是：探寻经济增长之道；实现全球化再平衡；开创地区新型合作。 16、推进“一带一路”建设，要积极利用现有双多边合作机制，促进区域合作蓬勃发展。 17、在“一带一路”建设中，要加强沿线国家之间的政治组织、立法机构、主要党派的友好往来。 18、“一带一路”建设的原则：共商、共享、共建。 19、“一带一路”建设的优先领域：基础设施互联互通。 20、通过共建“一带一路”，实现沿线各国多元、平衡、自主、可持续的发展。
内毒素清除剂使用说明 货号：E1040 规格：20ml/100ml 保存：4℃半年有效，-20℃长期储存。 产品简介： 内毒素清除剂主要用于清除DNA、蛋白质或其他液体样品中的内毒素。在特定的pH值、盐浓度和温度条件下，内毒素清除剂能与DNA、重组蛋白以及液体样品中的内毒素特异性结合，经过室温高速离心后，DNA或蛋白质等保留在水相，而内毒素则被浓缩到极小体积的下层相而被清除。经过3次以上重复抽提后可将活性为5000～50000EU/ml的内毒素水平降低到5～0.5EU/ml以下，即降低1000～10000倍。 操作步骤： 提取前请将内毒素清除剂放在冰上冰浴5min，期间翻转瓶子数次使试剂均匀预冷。 1、a)已纯化的质粒DNA内毒素清除：吸取500μl DNA溶液于微型离心管，加入1/10体积3M NaAc pH5.2或1/20体积5M NaCl溶液，冰浴5min。 b)在提取质粒DNA过程中清除内毒素：以碱裂解法提取质粒为例，在加入裂解液和中和液并离心去除碎片之后，吸取含质粒DNA的上清于新离心管中，冰浴5min。 2、加入1/5体积预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊。
3、冰浴5min，溶液应变清亮。 4、37℃水浴5min，不时振荡，溶液又变浑浊。 5、12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含DNA，下层油状相含内毒素。 6、将含DNA的上层水相转移到新管，弃油状相，重复抽提三次，即重复步骤2-6三次。 7、加入 2.5体积无水乙醇，-20℃沉淀30min或过夜；12000rpm离心10min，弃上清；加入70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min弃上清；空气干燥沉淀，加入100～200μl无内毒素的高纯水或TE溶解沉淀。 8、用内毒素检测试剂测定样品中内毒素活性，并与初始样品比较。 注意事项： 1、DNA浓度>1mg/ml时清除内毒素效率降低。由于DNA和蛋白质本身的性质，清除程序可导致10-20％的DNA丢失，所幸的是与清除内毒素的艰难相比DNA更容易提取制备。 2、所有溶液应用无内毒素的高纯水配制，所有器械材料均应不含内毒素，玻璃器皿可高温烘烤，非挥发性水溶液可高压120℃高温处理。 相关试剂： D1140无内毒素质粒小量提取试剂盒 D1150无内毒素质粒大量提取试剂盒 12100DMEM(H)
内毒素知识介绍 (2010-01-16 10:00:17) 转载 分类：精彩推荐展示 标签： 抗体 细胞因子 蛋白 酶 试剂盒 信号转导 凋亡 生化 试剂 干细胞 生物 ips 细菌内毒素，英文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A 细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin 最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。 细菌英文叫Bacteria ：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌
分为G+菌和G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表： 关于细菌细胞壁结构，尤其G+/G-菌不同之处见下图所示： 由以上结构模式图可以发现，G+菌与G-菌有不同之处，其中对于G-菌来说： 细胞壁较薄，厚约10－15nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。 （1）脂蛋白（lipoprotein）由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。 （2）外膜（outer membrane）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成（图1-8），位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。
选修1第一章基础知识过关检测 1、糖类是绿色植物_____________的产物。由_____、______、_____三种元素组成的一类有机化合物，也叫_______________(通式为 ___________)。 2、葡萄糖分子式________，是一种___色晶体，有____味，___溶于水 3、3、葡萄糖具有还原性，能和________溶液反应，也能和________溶液反应。 4、蔗糖和麦芽糖是_____糖，它们水解的化学方程式分别是： 5、___________________________________________； ___________________________________________。 6、5、淀粉是一种重要的_____糖，分子式________，是一种相对分子质量很大的天然_________化合物，_____甜味，是一种___色粉末，它___水解。淀粉在酸的催化下逐步水解，其方程式 ________________________________________________________。7、淀粉的特性：_______能使淀粉溶液变成______色。这是实验室检验_____________存在的重要原理。 8、6、纤维素是_________通过_________生成的，是构成_________的基础物质，它是______色，______气味，______味道的物质，是一种______糖，属于____________。
高二化学选修1《化学与生活》 第一章关注营养平衡 1—1—生命的基础能源：糖类 人体必须的 六大营养素 糖类脂肪蛋白质维生素矿物质水 1单 糖 C6H 12 O6 葡萄 糖 多羟基 醛互为同分异构体果糖 多羟基 酮 2双 糖 C12 H22 O11 麦 芽 糖 有醛基 C12H22O11+H2O→C6H12O6+C6H12O6葡萄糖+葡萄 糖 蔗 糖 无醛基C12H22O11+H2O→C6H12O6+C6H12O6葡萄糖+果糖 3多 糖 （C6 H10O 5 ）n 淀 粉无醛基,属 高分子化 合物 遇碘变蓝（C6H10O5）n + n H2O→ nC6H12O6纤 维 素 （C6H10O5）n + n H2O→ nC6H12O6 1—2—重要的体内能源：油脂 1油 脂 植物油 液 态 含不饱和烃基 多 含 双 键 能加成、水解动物脂肪 固 态 含饱和烃基多水解 水 解 油脂+ 3H2O→高级脂肪酸+丙三醇（甘油） 皂 化 油脂在碱性条件下的水解油脂+ 3NaOH→高级脂肪酸钠（肥皂）+丙三醇（甘油） 在人体 内功能 供热储存能量 合成人体所需的化合 物 脂肪酸有生理功能 1—3—生命的基础：蛋白质 组成元 素 一定有C、H、O、N、S可能有P、Fe、Zn、Mo 性质盐析（可 逆） 变性（凝结不可逆） 遇浓硝酸显黄 色 灼烧有焦羽毛味 变性条 件 加热、加酸、碱、重金属盐、部分有机物、紫外线等等误服重金属盐 后 要服大量的新鲜的牛奶或豆浆等，加解毒剂、洗胃水解水解的产物是氨基酸
外毒素和内毒素是细菌产生的两大类毒素物质。 外毒素是病原菌在代谢过程中分泌到菌体外的物质。外毒素的化学成分是蛋白质。毒性极不稳定，对热和某些化学物质敏感，容易受到破坏。用3％～4％的甲醛溶液处理，其毒性完全消失。外毒素的抗原性较强，能刺激机体产生抗毒素。 内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁(cell wall)的组成成分、细菌在生活时不能释放出来，当细胞死亡而溶解或用人工方法破坏菌体时才释放出来，因而称为内毒素。 内毒素是磷脂-多糖-蛋白质（phospholid-polysaccharide-protein）复合物，主要成份为脂多糖(lipopolysaccharide,lps)。是细胞壁(cell wall)的最外层成分，覆盖在坚韧细胞壁(cell wall)的粘肽上。内毒素脂多糖分子由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A三部分构成。其性质较稳定、耐热、毒性比外毒素低、其作用没有组织器官选择性，不同病原菌所产生的内毒素引起的症状大致相同，都能引起机体体温升高、腹泻和出现出血性休克和其他组织损伤现象。内毒素不是蛋白质，因此非常耐热。在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2到4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。 内毒素的毒性作用：较弱，毒性作用大致相同，可引起发热，微 循环障碍，感染性休克，DIC等 内毒素在研究中的一大弊端是降低转染的效率，所以在做细胞转染试验时，要注意质粒中内毒素的含量。 Qiagen公司EndoFree Plasmid Kit 关于内毒素的介绍： Endotoxin levels in plasmid preparations*
内毒素知识介绍 内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。 内毒素不是蛋白质，因此非常耐热。在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏，只有在250℃的温度下加热1个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。与外毒素不同之处，还有：内毒素不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒素；把内毒素注射到机体内虽可产生一定量的特异免疫产物（称为抗体），但这种抗体抵消内毒素毒性的作用微弱。 内毒素脂多糖分子由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A三部分构成。脂质A是内毒素的主要毒性组分。不同革兰氏阴性细菌的脂质A结构基本相似。因此，凡是由革兰氏阴性菌引起的感染，虽菌种不一，其内毒素导致的毒性效应大致类同。这些毒性反应主要有： 发热反应。人体对细菌内毒素极为敏感。极微量（1-5纳克/公斤体重）内毒素就能引起体温上升，发热反应持续约4小时后逐渐消退。自然感染时，因革兰氏阴性菌不断生长繁殖，同时伴有陆续死亡、释出内毒素，故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。内毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞等，使之产生白细胞介素1、6和肿瘤坏死因子α等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热。 白细胞反应。细菌内毒素进入宿主体内以后，血流中占白细胞总数60-70%的中性粒细胞数量迅速减少，这是因为细胞发生移动并粘附到组织毛细血管上了。不过1-2小时后，由内毒素诱生的中性细胞释放因子刺激骨髓释放其中的中性粒细胞进入血流，使其数量显著增加，有部分不成熟的中性粒细胞也被释放出来。革兰氏阴性菌的伤寒沙门菌是例外，其内毒素使白细胞总数始终是减少状态，目前还不清楚是什么原因。由于绝大多数被革兰氏阴性菌感染的患者血流中白细胞总数都会增加，所以现在医生在诊断前，为了初步区别是细菌性感染还是病毒性感染，常常要化验病人的血液，对白细胞进行总数测定和分类计数。被病毒感染的病人，其白细胞总数和中性粒细胞百分比基本在正常值范围内。 内毒素血症与内毒素休克。当病灶或血流中革兰氏阴性病原菌大量死亡，释放出来的大量内毒素进入血液时，可发生内毒素血症。大量内毒素作用于机体的巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板，以及补体系统和凝血系统等，便会产生白细胞介素1、6、8和肿瘤坏死因子α、组胺、5羟色胺、前列腺素、激肽等生物活性物质。这些物质作用于小血管造成功能紊乱而导致微循环障碍，临床表现为微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等，于是导致病人休克，这种病理反应叫做内毒素休克。 关于内毒素休克，过去曾有过惨痛的教训。20世纪40年代青毒素刚问世的时候，医生发现青霉素对脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑膜炎疗效非常显著。因此，凡发现这类病人，一律优选青霉素进行治疗；且按照一般规律，用药剂量随病情严重程度而递增。结果发生了意外，用大剂量青霉素治疗重症脑膜炎患者时，不少发生了内毒素休克而死亡。后来经过研究分析，发现了其中的原委。病情严重的患者，体内存在的病原菌数量多，医生采用大剂量“轰炸”，意欲“一举歼敌”。快速、彻底杀灭病原体，这种战略无可非议，但有些医生忽略了另一方面，即流行性脑膜炎的病原菌是属革兰氏阴性菌的脑膜炎奈瑟菌，其致病物质是内毒素，而内毒素是要在病菌死亡后再放出的。如今用大剂量青霉素一下子将全部病菌杀死，也就是使大量内毒素一次放出，促成了内毒素休克，加速了患者的死亡。随着医学的进步，现在医生遇到这类病人，一方面仍然要用大剂量的有效抗菌药物去对付，同时要加用激素类药物，以保护对内毒素敏感的细胞不对内毒素诱生的细胞因子发生反应，从而度过“休克”难关。犹如外科手术时，采用麻醉药使病人丧失痛觉一样。 内毒素或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在酒精性肝病（ALD）所致的肝损害中起重要作用[1]。LPS要发挥生理作用，必须与血循环中的载体结合，脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein, LBP）是近年发现的一种LPS载体蛋白，它能与LPS结合形成LPS-LBP复合物，并将LPS运送到效应靶器官或靶细胞发挥生理或病理生理作用。单核/巨噬细胞表面存在一种膜蛋白CD14，其分子量为5.5×104，主要功能是识别LPS，被认为是LPS的受体，在LPS介导单核/巨噬细胞激活中起重要作用[2]。LPS-LBP与CD14的结合能促使单核/巨噬细胞激活并释放多种细胞因子，诱导肝脏损害[3]。LPS、LBP及CD14三者在ALD中的确切作用机制及相互关系尚不清楚。本研究用乙醇喂养大鼠建立酒精性肝病动物模型，观察LBP和CD14 mRNA的表达及其在肝损害中的作用。 结果 1. 血中内毒素和ALT含量变化：乙醇喂养组大鼠喂养4周和8周时血浆LPS浓度分别为(129±21) pg/ml 和（187±35）pg/ml, 明显高于对照组的（48±9）pg/ml 和（53±11）pg/ml（t值分别为11.2和11.6，P＜0.05）；乙醇组血清ALT浓度分别为（112±15）U/L 和（147±22）U/L，也明显高于对照组的（31±12）U/L和（33±9）U/L（t值分别为5.9和20.6，P＜0.05)。 2. 肝组织中LBP和CD14 mRNA的表达：两组大鼠肝组织中LBP和CD14 mRNA的表达见图1～3。对照组大鼠4周和8周肝组织中LBP 和CD14 mRNA的表达均不明显。乙醇喂养组大鼠肝组织中LBP和CD14 mRNA在4周时已明显表达，8周时表达进一步增加，其中CD14 mRNA 表达最显著，与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）。 3. 肝脏形态学变化：对照组大鼠光、电镜下肝组织无明显的病理学变化。乙醇喂养组4周时光镜下见肝细胞内出现大小不等的空泡样变性，肝窦内有较多白细胞，但未见明显的炎性细胞浸润和坏死病灶形成；乙醇喂养8周后，肝细胞脂肪变性更加明显，并有较多的炎性细胞浸润及坏死灶出现（图4、5）。电镜下乙醇喂养组肝细胞内有较多局灶性的胞浆变性及髓鞘样结构形成，并可见坏死灶的出现（图6、7）。 讨论 酒精性肝病时肝脏损害的程度与乙醇的剂量和作用时间呈正相关，雌性大鼠比雄性大鼠对乙醇具有更高的敏感性，甘氨酸通过减少