酶联免疫吸附试验的原理及分类
酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种广泛应用于生命科学领域的实验技术，用于检测和定量分析一系列分子，如蛋白质、抗体、荷尔蒙和细胞因子等。ELISA具有高灵敏度、高特异性和高通量的优势，被广泛应用于医学诊断、生物医药研发和农业科学等领域。
ELISA的核心是利用抗原与抗体结合的特异性反应，通过酶标记的系统，检测目标物质的存在量。具体步骤如下：
1.固相抗体：将特异性抗体（捕获抗体）固定在固相支持物上，例如多孔板或微球。这些抗体可以通过亲和层析、制备融合蛋白或是克隆单克隆抗体的方式获得。
2.样本孵育：将待测样本或控制样品加入到固相抗体包被的孔中，使得目标分子与固相抗体结合。
3.洗涤：通过洗涤，将未结合的物质从孔中清除，以减少背景信号的干扰。
4.二抗结合：加入标记有酶的二抗，即辅助抗体。这些二抗能够与固相抗体或捕获抗体上的抗原结合。
5.再次洗涤：洗去未结合的二抗。
6.底物添加：加入适当的底物，例如染色底物或荧光底物。底物将与酶反应，产生可视化的信号。
7.反应终止：通过添加特定的终止剂，停止酶的反应。
8.信号测量：测量底物反应产生的光学信号，例如吸光度或荧光强度。这些信号与目标分子在样本中的浓度成正相关。
根据标记的物质，酶联免疫吸附试验可以分为多种不同类型。常见的
分类有如下几种：
1.直接ELISA：在固相抗体上直接标记酶或检测物质，例如酶标化的
抗原或抗体。
2.间接ELISA：在固相抗体上结合与待测物质特异结合的二抗。这种
方法可以提高灵敏度。
3.竞争ELISA：待测物质与已知浓度的标准品竞争与固相抗体上结合
的二抗。
4.桥联ELISA：通过两种或两种以上的抗体与待测物质形成一个桥联
复合物，然后用标记物检测抗原或抗体。
5.双抗体ELISA：通过两种不同特异性的抗体与待测物质结合。一种
抗体被固定在固相上，另一种抗体被标记。
6.封闭ELISA：用于检测抗原结合位点或特定区域的特异性抗体。
7.拉普拉斯ELISA：将多个抗体标记在酶上，通过颜色和反应程度来
评估抗原浓度。
这些分类方式仅仅是ELISA方法的一部分，ELISA在实验操作方面有
非常丰富的发展，可以根据实际需要进行改进和创新。
实验三酶联免疫吸附试验（ELISA） 一、实验目的 了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。 二、实验原理 将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。 常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） RZ>3.1 碱性磷酸酶（AP） 邻苯二胺（OPD） 四甲基联苯胺（TMB） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 橙黄色 蓝色 黄色 棕黄色 黄色 黄色 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型： 1、间接法测抗体（间接ELISA）
间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。 2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA） 双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。 3、竞争ELISA 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。 三、主要仪器及试材 以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。 使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含: 1、包被抗原的微孔板； 2、阴、阳性对照血清； 3、抗猪IgG-HRP结合物； 4、洗涤液； 5、底物A液、B液； 6、终止液； 7、样品稀释液 本实验所需仪器和试剂： 1、酶联免疫测定仪 2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白） 3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清 4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP 5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO 3，2.93g NaHCO 3 ，加 ddH 2 O至1000mL 6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na 2HPO 4 ·12H 2 O，0.2g KH 2 PO 4 ，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH 2 O至1000mL。 7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL
讨论报告： 酶联免疫吸附试验（ELISA ） 一．简介 1.定义：指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。 2.基本原理：（1）抗原或抗体的固相化（2）抗原或抗体的酶标记（3）加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 大致流程： 3.测定类型 3.1 酶联免疫吸附试验在酶免疫技术中所处的位置 这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定 （Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ），简称ELISA 。 3.2 ELISA 实际是一种抗原抗体反应和酶催化反应具有以下性质： 3.2.1 可逆性 3.2.2 特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学 结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此测定某一特定的物质， 而不需先分离待检物。 3.2.3 存在最适比例 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 可用左图表示，即抗 原抗体比例高于或低于某一特定适宜值，二者结合效果都会降低。
3.2.4 敏感性高 由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 3.3 ELISA 的主要测定方法 ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体，各种那个测定方法中均有三个 必要试剂： （1）故乡的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（2）酶标记的抗原或抗体，称“结 合物”（3）酶反应的底物 3.3.1双抗体夹心法 3.3.1.1双抗体夹心法测抗原 3.3.1.2双抗体夹心法测抗体 3.3.2 间接法测抗体 3.3.3 竞争法 3.3.3.1 竞争法测抗体 此法适用于检验各种蛋白 质等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg 、AFP 等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。步骤如图： 用特异性抗原进行包被和制备酶 结合物。此法中受检标本不需稀释， 可直接用于测定，因此其敏感度相对 高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg 的检测常采用本法。本法关键在于酶 标抗原的制备，应根据抗原结构的不 同，寻找合适的标记方法。 多用于传染病的诊断。 间接法的优点是只要变换 包被抗原就可利用同一酶 标抗抗体建立检测相应抗 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
酶联免疫吸附试验的原理及分类 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种广泛应用于生命科学领域的实验技术，用于检测和定量分析一系列分子，如蛋白质、抗体、荷尔蒙和细胞因子等。ELISA具有高灵敏度、高特异性和高通量的优势，被广泛应用于医学诊断、生物医药研发和农业科学等领域。 ELISA的核心是利用抗原与抗体结合的特异性反应，通过酶标记的系统，检测目标物质的存在量。具体步骤如下： 1.固相抗体：将特异性抗体（捕获抗体）固定在固相支持物上，例如多孔板或微球。这些抗体可以通过亲和层析、制备融合蛋白或是克隆单克隆抗体的方式获得。 2.样本孵育：将待测样本或控制样品加入到固相抗体包被的孔中，使得目标分子与固相抗体结合。 3.洗涤：通过洗涤，将未结合的物质从孔中清除，以减少背景信号的干扰。 4.二抗结合：加入标记有酶的二抗，即辅助抗体。这些二抗能够与固相抗体或捕获抗体上的抗原结合。 5.再次洗涤：洗去未结合的二抗。 6.底物添加：加入适当的底物，例如染色底物或荧光底物。底物将与酶反应，产生可视化的信号。 7.反应终止：通过添加特定的终止剂，停止酶的反应。
8.信号测量：测量底物反应产生的光学信号，例如吸光度或荧光强度。这些信号与目标分子在样本中的浓度成正相关。 根据标记的物质，酶联免疫吸附试验可以分为多种不同类型。常见的 分类有如下几种： 1.直接ELISA：在固相抗体上直接标记酶或检测物质，例如酶标化的 抗原或抗体。 2.间接ELISA：在固相抗体上结合与待测物质特异结合的二抗。这种 方法可以提高灵敏度。 3.竞争ELISA：待测物质与已知浓度的标准品竞争与固相抗体上结合 的二抗。 4.桥联ELISA：通过两种或两种以上的抗体与待测物质形成一个桥联 复合物，然后用标记物检测抗原或抗体。 5.双抗体ELISA：通过两种不同特异性的抗体与待测物质结合。一种 抗体被固定在固相上，另一种抗体被标记。 6.封闭ELISA：用于检测抗原结合位点或特定区域的特异性抗体。 7.拉普拉斯ELISA：将多个抗体标记在酶上，通过颜色和反应程度来 评估抗原浓度。 这些分类方式仅仅是ELISA方法的一部分，ELISA在实验操作方面有 非常丰富的发展，可以根据实际需要进行改进和创新。
酶联免疫吸附法原理 酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高效、敏感 和特异性强的免疫学检测方法，通常用于检测血清或其他生物体液中的蛋白质和多肽类化 合物。该技术基于免疫反应的原理，利用具有高亲合力的特异性抗体与待检测样品中的分 子相互作用来实现检测目标分子的定量分析。ELISA法的原理是将样品加入已经预先涂有 抗体的微孔板中，通过特异性抗体与待检测样品中的蛋白质结合，形成免疫复合物。然后 将酶标记的二抗加入到反应体系中，与前一步形成的免疫复合物结合。通过添加底物和酶 的作用在复合体表面形成可定量测的色素反应产物，通过读数器测定产色的强度来确定待 测样品中的目标物质浓度。 ELISA法涵盖了多种免疫反应模式，通常根据反应的成像过程一共分为4种类型：间 接ELISA法、直接ELISA法、竞争ELISA法和间接混合ELISA法。下文将针对这四种模式 进行介绍。 1. 间接ELISA法 间接ELISA法属于免疫活性物质与样品物质之间的非竞争性检测方法，其原理是将待 测样品加入到已经预先涂有抗原的微孔板中，待样品中的抗体与预包被的抗原结合形成免 疫复合物。然后添加酶标记的二抗，在复合物表面形成二级免疫复合物，最后加入底物， 酶标记的二抗与底物的反应在微孔板表面形成发色产物，通过读数器测定产色的强度来定 量检测待测样品中的抗体浓度。间接ELISA法的优点是检测灵敏度高，适用于检测低浓度 抗体，但也存在样品受到流变因素影响较大的缺点。 2. 直接ELISA法 直接ELISA法不同于其他的ELISA检测方法，其可以直接测定抗原在样品中的浓度， 原理是将样品加入已经预包被的抗体微孔板中，待检测抗原与包被的抗体结合形成免疫复 合物，然后添加酶标记的二抗，酶标记的二抗在复合物表面形成二级免疫复合物，最后加 入底物，酶标记的二抗与底物的反应在微孔板表面形成发色产物，通过读数器测定产色的 强度来定量检测待测样品中的抗原浓度。直接ELISA法的优点是检测时间短且操作简便， 缺点是检测灵敏度相对较低。 3. 竞争ELISA法 竞争ELISA法是指在一个系统中将酶标记的抗原和待测样品中的抗原共同与被标记的 抗体竞争结合，进而判断待测样品中抗原的浓度。在竞争ELISA法中，先将特异性抗体载 入微孔板中，待检测样品中的抗原与抗体结合形成免疫复合物，然后再加入酶标记的抗原，酶标记的抗原与已经结合的抗体竞争结合，通过测定反应体系中的酶标记的抗原量来确定
酶联免疫吸附试验（ELISA），又称酶联免疫吸附测定法，是目前广泛用于生物化学和免疫学领域的一种重要实验方法。该技术结合了免疫 学和生物化学的原理，能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，对临床诊断、生物医学研究以及生物制药等领域有着广泛的应用。在 本文中，我们将深入探讨酶联免疫吸附试验的原理、方法和应用。 一、酶联免疫吸附试验原理 酶联免疫吸附试验的原理主要是利用酶标记抗体、抗原和底物的相互 作用来检测特定物质的存在。在双抗夹心法中，试验基本步骤如下： 1. 用待测抗原溶液在固相酶标记抗体包被的微孔板上，充分接触和结合。 2. 经洗涤后，底物溶液被加入，并与酶标记抗体包被的复合物结合。 3. 底物受酶催化分解后，生成有色产物，通过比色法测定其光密度， 间接测定抗原的含量。 在实验过程中，我们不能忽视的是标本处理、试剂选用、仪器操作等 一系列实验细节，这些都对实验结果的准确性和重复性有着重要的影响。 二、酶联免疫吸附试验的方法 不同类型的酶联免疫吸附试验方法包括间接法、夹心法、竞争法和直 接法等。在这次我们重点讨论的是双抗夹心法。该方法通过将待测抗
原与固相酶标记抗体和液相抗体结合，从而提高了对待测抗原的灵敏度和特异性。这种方法在免疫学研究、传染病诊断和药物检测等方面具有重要的应用价值。 除了双抗夹心法，间接法通过检测待测抗体也是常用的酶联免疫吸附试验方法。在实验设计中，根据不同的研究目的和样本特性，我们可以选择不同的方法来进行实验设计和操作。 三、酶联免疫吸附试验的应用 酶联免疫吸附试验在临床诊断、疫苗研制、传染病监测、生物药品开发等领域有着广泛的应用。它能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，为疾病诊断和药物研发提供了重要的技术支持。 在临床诊断中，酶联免疫吸附试验被广泛应用于传染病的早期诊断和鉴定。HIV抗体检测、甲型肝炎抗原检测等都是通过酶联免疫吸附试验来完成的。酶联免疫吸附试验还被应用于药物和疫苗的开发和监控过程中，能够全面地评价新药和疫苗的免疫原性和保护效果。 四、个人观点和理解 酶联免疫吸附试验作为一种成熟的实验技术，其在生物医学领域的广泛应用为我们提供了便利。在未来的研究和实践中，我认为酶联免疫吸附试验会进一步得到发展，不仅在技术上实现更高的灵敏度和特异性，同时也会在实验设计和数据分析上做出更多的创新。
酶联免疫吸附试验 elisa原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的实验室技术，用于检测生物分子如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。ELISA技术基于抗原和抗体的特异性结合，通过酶标记物和底物的反应来检测分子的存在或浓度。 ELISA技术的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA 和夹心ELISA等几种。其中，间接ELISA是最常见的类型，下面将详细介绍其原理和步骤。 一、间接ELISA的原理 间接ELISA利用抗体与抗原的特异性结合来检测分子的存在或浓度。该方法需要用到两种抗体：第一种是特异性抗体，用于检测目标分子；第二种是酶标记抗体，用于检测第一种抗体的结合情况。 具体步骤如下： 1. 将抗原溶液加入微孔板中，并在室温下孵育一定时间，使抗原吸附于微孔板表面。 2. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗原和杂质。 3. 加入一定浓度的非特异性蛋白质，如牛血清蛋白或奶粉，以防止非特异性结合。 4. 加入一定浓度的特异性抗体，使其与抗原结合。 5. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗体和杂质。 6. 加入一定浓度的酶标记抗体，使其与第一种抗体结合。 7. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的酶标记抗体和杂质。
8. 加入底物，使酶标记抗体产生颜色反应。 9. 测量吸光度，来确定目标分子的存在或浓度。 二、间接ELISA的优缺点 间接ELISA具有以下优点： 1. 可以检测极低浓度的分子，如病毒和荷尔蒙。 2. 可以同时检测多个样本。 3. 可以检测多种类型的生物分子，如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。 4. 可以使用多种酶标记抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和过氧化物酶（POD）等。 5. 可以使用多种检测方法，如发光、荧光和色谱法等。 间接ELISA的缺点包括： 1. 检测过程需要多个步骤，比较繁琐。 2. 需要特异性抗体和酶标记抗体，成本较高。 3. 受到非特异性结合的影响，可能会出现假阳性结果。 三、间接ELISA的应用 间接ELISA广泛应用于医学、生物学、生物工程和食品安全等领域。其中，医学领域是最主要的应用方向，用于检测人体内的各种生物分子，如肿瘤标志物、病毒、抗体和荷尔蒙等。此外，间接ELISA 还可以用于检测食品中的有害物质、生物制品的质量控制和生物工程产品的纯度等。 总之，间接ELISA是一种常见的实验室技术，通过抗原和抗体的
简述酶联免疫吸附实验的原理(ELISA) 酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析生物样品中特定的抗体或抗原。它的原理基于抗原与抗体之间的特异性结合，并利用酶的催化作用来产生可观测的信号。 ELISA实验通常分为直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA等几种类型，但它们的基本原理是相同的。 要进行ELISA实验，需要先将待检测的抗原或抗体溶液加到特定的固相材料上。常用的固相材料有多孔板、膜或微球等，其中多孔板是最常用的。这些固相材料表面往往被化学修饰，使其能够与抗原或抗体稳定结合。 接下来是特异性结合的步骤。如果待检测的是抗体，则将固相材料上的抗原与待检测抗体进行孵育。如果待检测的是抗原，则将固相材料上的抗体与待检测抗原进行孵育。在孵育过程中，抗原与抗体会发生特异性的结合，形成抗原-抗体复合物。 然后，需要添加能与抗体结合的二抗。二抗是一种特异性的抗体，它能够与待检测抗体结合并形成复合物。二抗通常被标记上酶，常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。这样，当二抗与抗体结合后，酶就会附着在抗原-抗体复合物上。
为了检测酶的活性，需要添加底物。底物与酶结合后会发生化学反应，产生可观测的信号。常用的底物有类似于TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二胺）的显色底物，它可以在酶的作用下生成蓝色或黄色产物。 通过比色或荧光等方法来测定反应的强度。可以使用光谱仪或酶标仪来测定底物的吸光度或荧光强度，进而确定样品中所含抗体或抗原的浓度。 ELISA具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围。它可以用于检测和定量分析血清中的抗体、细胞表面的受体、病原体的抗原以及各种生物分子的浓度等。ELISA在医学、生物学研究、临床诊断和药物开发等领域具有重要的应用价值。 酶联免疫吸附实验（ELISA）利用抗原与抗体之间的特异性结合以及酶的催化作用，通过添加底物来产生可观测的信号。ELISA具有高灵敏度和高特异性，可以广泛应用于抗体和抗原的检测与定量分析。
酶联免疫吸附实验的原理及分类 酶联免疫吸附实验的原理及分类如下 原理：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本形成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。多用于检测IgG类型抗体。 分类如下 1.间接法：最常用的方法，属非竞争性结合试验。原理：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本形成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。多用于检测IgG类型抗体。 2.双抗原夹心法 此法可检测各类抗体，因此双抗原夹心法的灵敏度和特异性要高于间接法。其原理及操作步骤类似双抗体夹心法，也可采用一步法。由于机体产生抗体IgG的效价有限，一般不会出现钩状效应。 临床上乙型肝炎表面抗体的测定常用此法。 3.竞争法 一般抗体检测是较少采用，当相应抗原材料中含有与抗人IgG 反应的物质，而且不易得到足够的纯化抗原或抗原的结合特异性不稳定时，可采用这种方法测定抗体，目前临床运用较多的是乙型肝
炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）的检测。 竞争抗体与待测抗体的特异性及亲和力越接近，则测定的可靠性越强。 4.捕获法又称反向间接法 主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定，最常用的是病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。原理：先将针对IgM的二抗包被于固相载体，加入待测标本，其中IgM类抗体可被固相抗体捕获，再加入特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标记特异性抗原的抗体，形成固相二抗-IgM-抗原-酶标记抗体复合物，加底物显色后，即可对待测标本中IgM是否存在及含量进行测定。
elisa的基本原理方法类型及应用 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种免疫学的诊断技术，属于发光免疫分析（ FIA） 的一种，它能判断待测物质是否含有某种抗原或抗体。ELISA 是由分子生物学家Peter Perlman在 1969 年发明的，它是由免疫学家和检验室专业人士经过不断改进和发展形成 的一种常见的检测工具。 ELISA 试验有三个主要步骤：配制板（Prepare Plate）、抗体配体结合 （Antibody-Antigen Binding）和检测（Dectection）。首先在特定医学实验室中将待测 抗原或抗体与其他分子结合在反应基片或其他特定容器上。随后，将特异性的抗体结合该 特定的抗原或其抗体，以形成特异性的蛋白质复合物；最后，将一种特定的发光抗体，经 过特定的化学或物理反应，与试剂相结合，从而检测到这种抗原和其抗体。 ELISA 有两种基本类型：一种是检测抗原的ELISA，也被称为酶免疫吸附法（EIA）；另一种是检测抗体的ELISA，也被称为免疫印迹分析（IIA）。酶免疫吸附法（EIA）的主 要特点是反应的时间比较短，因此可以快速地检测特定抗原。它的原理是将适当浓度的待 测抗原与抗原试剂相结合，然后将相互作用的悬液加到对应的孔板上，再将对应的特异性 抗体悬液加到孔板中，当抗体与抗原发生作用时，会形成一个抗体复合物，并产生一个抗 原复合物；最后，将作用到抗原复合物上的特异性发光强度肽或其他发光物质，最终显示 出抗原浓度水平，以便进行分析。而免疫印迹法（IIA）的主要特点是可以对相对浓度较 低的抗体进行检测，可以精确地评估特定的抗体水平。原理是将含有特定酶质的试剂加到 孔板上，然后将抗原悬液加入酶质中，将含有特定抗体的悬液加入酶质中，当与特定抗原 结合时，形成抗体复合物，将特定发光抗体结合到抗原复合物上，从而检测特定抗体水平。 ELISA 应用非常广泛，在生物学、药物学、流行病学等一些领域中都有应用，并且能 够检测出抗原和抗体的小量组分，能够准确的检测出抗原和抗体，从而更有效的同时体现 出检测的准确性。ELISA 艾滋病毒抗体试验用于检测艾滋病毒的感染，也可以用于检测癌 症抗原指数；另外，ELISA 也可用于检测某些微生物抗原指数，如耳部病原体检测等。除 此之外，ELISA 在食品学中也有一定应用，如蛋白质检测、甲反应检测等。 ELISA 技术具有灵敏度高，普遍可行性好以及重复性高，只需短时间就可完成试验， 是目前科学界用来研究和诊断免疫性疾病的主要手段，也是科学研究中最常用的技术和应 用最为广泛的技术之一。ELISA 受到了科学界的广泛关注，已被广泛应用，在临床诊断方 面也发挥了重要作用。
酶免疫测定技术的分类 一、非均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物作为抗体（抗原）的载体，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。 （一）酶联联免疫吸附试验（ELISA） 1.原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是固相酶免疫测定技术中的一种，其基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面，再用酶标记的抗原或抗体与已被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应，加入酶底物和色原后呈色，呈色程度（用A值表示）与待测抗体或抗原的水平呈相关关系。此法常用多孔聚苯乙烯反应板作为固相载体，读取结果需用酶联检测仪。 ELISA试验的结果判定分定性和定量两种。定性是参比阴、阳性对照根据有无呈色报告阴性或阳性，或根据呈色程度作出半定量（1+～4+）报告。这种方法常受操作者的主观因素影响，只适合于大批量体检标本的初筛。目前规定，临床标本的检测，均应用仪器测定后报告。用于定性和定量结果判定的方法主要有： （1）P/N比值： 即待测样本吸光度（A）值-空白对照A/阴性对照A-空白对照A。一般以P/N≥2.1为阳性。
（2）S/CO比值： S为待测样本吸光度（A）值，CO为Cutoff值，常以阴性对照平均A 值×2.1代表CO值。一般以S/ CO≥1.0为阳性，竞争法以S/CO ≤1.0为阳性。 （3）标准曲线单位： 将已知浓度或活性单位的标准抗原或抗体在试验系统中进行反应，分别测定A值，以A值为纵坐标，抗原或抗体水平为横坐标，绘制标准曲线，根据检样的A值由标准曲线获得定量单位。 2.方法 ELISA依据方法和步骤不同可分为以下几种基本反应模式。 （1）间接法： 用于检测样本中特异性抗体。将已知特异性抗原包被于聚苯乙烯板微孔，形成固相抗原；洗弃未交联的抗原（洗板，下同）；加稀释的待检样本，若其中含特异性抗体则与固相抗原结合形成抗原-抗体复合物；洗弃未反应的成分，加酶标记抗抗体（一般为酶标记抗人IgG、抗人IgM或葡萄球菌A蛋白），使在固相载体上形成抗原-待检抗体-酶标记抗体复合物；洗弃未反应的成分，加酶底物-色原呈色，在一定波长下测A值判定待测抗体的有无和水平。该法主要用于抗体的检测，其优点是酶标抗体具有通用性，具体实验步骤如下。
ELISA方法类型及原理 ELISA是一种重要的实验技术，用于检测和定量分析蛋白质、抗体、荷尔蒙、生物学分子等。ELISA的全称是酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），它通过将目标物（如抗原或抗体）与特定的酶标记物结合，然后利用染色反应来检测、定量或分析目标物。 根据目标物的不同，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、间接竞争ELISA和反向ELISA等方法。 1.直接ELISA 直接ELISA是最简单的一种ELISA方法。它将目标物直接吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标记抗体来检测目标物。具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性酶标记抗体，与目标物结合；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。 2.间接ELISA 间接ELISA是较常用的一种ELISA方法。它将目标物首先吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗来检测目标物。具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性的初级抗体，与目标物结合；加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。 3.竞争ELISA
竞争ELISA是一种用于定量测定样品中目标物含量的ELISA方法。它 将目标物预先包被在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标 记抗体和待测样品，测定抗体与固相载体表面的目标物竞争的程度来定量 目标物的含量。具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物 包被在载体表面；加入特异性酶标记抗体和待测样品；通过染色反应来检 测酶的活性和竞争程度来定量目标物的含量。 4.间接竞争ELISA 间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理。首先将目标 物吸附在固相载体上，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入 与初级抗体特异性结合的酶标记二抗和待测样品。酶标记二抗与初级抗体 竞争结合目标物，其竞争程度与目标物在样品中的浓度成反比。具体步骤 与间接ELISA类似，不同之处在于加入了待测样品和竞争反应。 5.反向ELISA 反向ELISA是一种用于检测抗体的ELISA方法。它将待测抗体吸附在 固相载体表面，然后加入与抗体特异性结合的抗原和酶标记的二抗。具体 步骤与直接ELISA类似，不同之处在于抗体和抗原的位置对调。 ELISA的原理基于抗原与抗体的特异性结合。在ELISA实验中，固相 载体通常采用多孔板、磁珠等物质，它们能够与抗原或抗体发生特异性结合。酶标记物一般选用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等，它们能够与抗体结合并产生染色反应。通过比色反应，可以测定酶的 活性，进而定量目标物的含量。ELISA的灵敏度高、操作简单、结果可靠，广泛应用于生物医学研究和临床诊断等领域。
简述酶联免疫吸附试验的原理 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 是一种常用的实验方法，用于检测体内或体外样品中特定抗原或抗体的存 在和浓度。它是一种间接的免疫检测方法，结合了酶检测技术和免疫学原理，具有高度的敏感性和特异性。ELISA 可以应用于医学、生物技术、农业、环境科学等领域，并且已经成为实验室中最常用的检测方法之一ELISA的原理是基于抗原与抗体的特异性结合和酶底物的催化作用。 一般来说，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA四种类型，其中最常用的是间接ELISA。 以下是间接ELISA的原理步骤： 1.表面修饰：将待测样品（可能含有抗原或抗体）加入到固相酶联免 疫吸附试验板（ELISA板）的孔中，让抗原或抗体与试验板表面的固定抗 体或抗原结合。 2.非特有结合位点的阻断：用一种非特异蛋白质（如牛血清蛋白，BSA）在试验板孔中进行非特异性结合位点的阻断。 3.抗原特异性结合：加入与抗原特异性结合的初级抗体，让其与待测 样品中的抗原发生结合，并使其与试验板表面的固定抗体结合。 4.洗涤：通过洗涤去除未结合的物质。 5.次级抗体的结合：加入与原初抗体特异性结合的酶标记的次级抗体，次级抗体与初级抗体结合。 6.洗涤：通过洗涤去除未结合的物质。
7.底物添加和反应：加入酶底物，允许酶与底物发生反应。酶催化底 物产生一种可观察的颜色变化或发光，反应的程度与抗原或抗体的浓度成 正比。 8.阻断反应：加入一种反应停止溶液，停止酶活性，防止进一步发色。通过观察吸光度或荧光信号的强度来测量酶的活性。 9.读板：使用ELISA阅读器测量吸光度或荧光信号，将结果转化为具 体的抗原或抗体浓度。 ELISA的结果可以通过测量吸光度或荧光信号来获得。吸光度的值与 样品中特定抗原或抗体的浓度成正比。ELISA能够非常准确地检测到非常 低浓度的抗原或抗体，具有高灵敏度和特异度。 总结起来，ELISA的原理包括将待测样品分别与固定抗原或抗体和酶 标记抗体进行特异性结合，用酶底物的催化反应产生可观察的信号，并通 过测量信号的强度来评估样品中特定物质的浓度。这种基于酶检测技术和 免疫学原理的结合使ELISA成为一种非常重要和有用的实验方法。
ELISA六种方法类型及原理 ELISA（酶标检测）是用于检测免疫学反应的一种技术，全称为酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA），该技术是测定抗体及抗原的特异性相互作用的一种常用的检测方法。ELISA通过酶联试验来灵敏地检测特异性抗体或抗原的含量。ELISA检测方法有很多种。常用的ELISA检测方法有以下六种： 一、双抗体沉淀反应ELISA（DAP-ELISA） 双抗体沉淀反应ELISA是一种比较简单的ELISA方法，该方法的原理是，在受体表面点涂两种类型的抗体，例如兔抗人IgG，而免疫反应物则是人IgG，受体与免疫反应物结合后，形成抗体-抗原复合物，其上自发形成特异性沉淀。随着浓度的增加，抗原越多，沉淀凝固物也越多，膜上形成沉淀下降，沉淀量可以通过酶标仪测定，或者免疫发光法检测，大体上，兔抗人IgG及抗原分别点涂及酶标探针可能以1:1:2的比例，也就是在100 L的反应液中加入到受体和兔抗人IgG各10 L，抗原20 L的条件下进行反应。 二、夹心ELISA（Sandwich ELISA） 夹心ELISA是一种常见的ELISA检测方法，它利用特殊的标记抗体完成免疫反应，以达到检测目的。以IgG为例，在受体表面点涂一种特异性抗体,如兔抗人IgG，受体与人IgG结合形成复合物，在这一抗原复合物上再添加第二种特异性抗体，如抗兔IgG，第二种抗体结合复合物，并将复合物结合在受体表面，形成抗原“夹心环”，该免疫反应体系可以通过酶标仪来检测指示物的夹心量，计算受体中抗原的含量。 三、竞争ELISA（Competitive ELISA） 竞争ELISA提高ELISA检测的灵敏度，竞争式ELISA也属ELISA技术范畴，该技术通过特异性抗体与抗原间竞争性结合而形成的结果来检测特异性抗原的浓度。竞争ELISA的原理是：将偶氮羟化物体表膜点涂含有特异性抗原区域的抗体，若添加一定量的抗原（相同的特异性抗原）至反应液，则可形成抗原-抗体复合物，受体与抗原的竞争性结合，而非特异性的抗体-抗原复合物。当反应一段时间时，抗原-抗体复合物及抗体-抗原复合物的比例可根据浓度的高低得出，这时可通过抗体的酶标检测，减检测结果即可计算抗原的添加量，也就是原有抗原的浓度值。 比色ELISA以色泽做为判断抗原浓度的参照标准，该技术与普通血清ELISA一样，也是利用特异性抗体与抗原结合，并且用受体-抗体复合物聚集的方法来检测特异抗原的浓度。但比色ELISA的指示物不是酶标探针，而是比色试剂，通过亚甲基蓝和青霉素等比色试剂，在抗原-抗体复合物形成后，可以与这些比色试剂在受体表面形成双氧酚或亚甲基蓝酸盐，再检测比色反应，用亮度来比较受体-抗原浓度的大小，最后可以采用图表比较以判断抗原的浓度。
酶联免疫吸附实验 免疫酶技术是本世纪60年代末期发展起来的一种免疫检测方法，是目前最广泛应用的标记免疫技术。1966年Nakene和Pierce共同发表了《酶标抗体：制备和抗原定位中的应用》，首先提出了免疫酶技术的基本原理。1971年Engvall和Perlmann发表《酶联免疫吸附试验测定IgG含量》一文，使免疫酶技术成为一种实用的检测液体标本中微量物质的方法。目前免疫酶技术已广泛用于免疫学、微生物学、寄生虫学等。由于其具有灵敏度高、试剂稳定、设备简单、操作安全等优点，近几年也将其应用到食品领域中来检测某些食品中的生理活性物质。 一、基本概念 1、免疫：笼统地概括起来，免疫就是人和动物机体防御、排除外来物质(异物)进人体内，同时识别和清除体内死亡、变性物质和平定体内叛乱分子突变细胞，以保护和稳定自身的防护机制。 2、抗原：抗原是指那些能够诱导机体的免疫系统发生免疫应答，产生抗体和致敏效应淋巴细胞，并在体内外与之特异性结合，发生免疫反应的物质。 3、抗体：是能与相应的抗原专一性结合的蛋白质分子，和机体其他生物大分子一样是细胞的产物，分泌到体液中或表现在细胞表面上。 4、抗原、抗体反应：抗原和抗体在体外的反应亦称血清学反应。这类反应可借助免疫学方法进行检测。 二、抗体定量检测方法及其原理 定量分析抗体的常用方法有扩散法、酶联免疫吸附法和火箭免疫电泳法等。 1、免疫扩散法 1.1、单向免疫扩散法 原理：将待检抗原滴加于含相应抗体的琼脂板小孔中，经一定时间扩散后。形成乳白色的沉淀坏，在一定浓度范围内，抗原的含量与沉淀坏直径成正比。可以先用己知不同浓度的标准抗原制成标准曲线，再根据测试样品沉淀环直径的大小，从标准曲线上查出样品中抗原的相应含量。 1.2双向免疫扩散法 原理：可溶性抗原与已知可溶性抗体分别加入相邻的琼脂糖凝胶板上的小孔内，在电解质存在下让它们相互向对方扩散。当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据最大稀释度与已知标准品最大稀释度之比，可计算出抗体含量。
ELISA基础知识总结 酶联免疫吸附测定（ELISA）的由来：酶联免疫吸附测定（ELISA）是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)上发展起来的免疫测定技术。1971年，瑞典学者Eugvall和Perlmann、荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别发表了用固相免疫测定方法检测体液中微量物质的文章，从此以后，酶联免疫吸附测定（ELISA）技术诞生并且发展十分迅速。 酶联免疫吸附测定（ELISA）的基本原理：以免疫学反应为基础，将抗体(或抗原)结合到固相载体表面,并保持免疫活性；使抗体(或抗原)与某种酶结合成酶标抗体(或抗原)，并且酶标抗体(或抗原)既保留免疫活性，又保留酶活性，抗原（或抗体）间接标记上酶，洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗原（或抗体）的量；加入酶反应底物后，底物被酶催化形成有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析。ELISA既可以对抗原进行测定也可以对抗体进行测定。 ELISA必不可少的三种试剂： 免疫吸附剂（吸附于固相载体的抗原或抗体） 标记物（酶标抗原或抗体） 显色剂（酶反应底物） ELISA的基本流程： 包被或捕获：直接或间接（通过包被捕获的抗体）通过吸附将抗原或抗体固定到微量滴定板孔的内表面上。 封闭：添加无关蛋白质或分子以封闭微量滴定板孔内所有不饱和表面结合位点。 孵育：与固定抗原结合的抗原特异性抗体孵育。 检测：通过特异性抗体上结合的直接标记或二级标记检测产生的信号。
检测样品中抗原的操作流程（1、包被抗原2、加样品和一抗3、洗板4、加酶标二抗5、洗板6、加酶作用底物7、颜色的深浅与表抗原的量相关联） ELISA的操作流程是不是很简单?可是看似很简单的事情往往会有各种各样的幺蛾子出现, 不过咱们有妙计在手, 完全不用担心和害怕, 请看表1。 表1 ELISA中可能遇到的问题及其解决方案 问题可能原因解决办法 低信号（样本和标准曲线）1、旧涂层板或试剂 2、洗涤孔板过于剧烈 3、孔板内液体蒸发干了 4、反应不充分 5、波长不正确 1、准备新的板和试剂（检查pH 值），适当储存 2、洗涤孔板时应轻柔 3、采用密封膜封板 4、优化反应温度和时间 5、检查酶标仪上的过滤器和软 件 信号低（仅样 本）1、样品中待测抗原或抗 体低于检测水平 2、样本类型不匹配 1、减少样品稀释倍数或浓缩样 品 2、使用阳性对照确保匹配性 信号低/差（仅标准曲 线）1、标准品组合或存储不 恰当 2、标准品添加错误 3、稀释计算不正确 1、重新配置标准品，储存在-7 0ºC 2、检查移液是否错误 3、检查计算 阴性对照有阳性结果1、样品污染 2、洗涤不充分 3、检测抗体与包被抗体 交叉反应（在夹心ELISA 中） 1、小心使用新鲜试剂和移液器 2、增加洗涤次数 3、确保抗体不会发生交叉反应 高背景1、空白孔污染 2、洗涤不充分 1、小心移液，使用多通道移液 器 2、增加洗涤次数 高信号1、样品中含有高于测定 范围的抗原 2、洗涤不充分 3、样品颜色过深 1、稀释样品 2、增加洗涤次数 3、减少孵育时间或降低孵育温
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 是一种常用的生物化学分析方法，用于检测并定量测定生物样品中的抗体 或抗原。ELISA方法包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞 争ELISA等。下面将对这些方法的类型和反应原理进行详细介绍。 1.直接ELISA 直接ELISA是最简单的ELISA方法之一、在这种方法中，微孔板表面 上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。待检测样品中的抗体与 涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。然后加入特异性抗体，这些抗 体已标记有酶，比如辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），然后加入适当的底物。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与 待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。 2.间接ELISA 间接ELISA是常用的ELISA方法之一，比直接ELISA灵敏度更高。在 这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。然后加 入与待测抗体特异性的二抗，这些二抗已标记有酶，如HRP，再加入适当 的底物。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗 原或抗体的浓度成正比。 3.竞争ELISA 竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的ELISA方法。在 这种方法中，微孔板表面上涂覆有特异性抗体，然后加入待检测样品和已 标记的抗原或抗体。待检测样品中的抗原或抗体与涂覆的抗体竞争结合，
形成复合物。然后加入特异性的抗原或抗体，这些抗原或抗体已标记有酶，比如HRP，继续竞争与涂覆抗体结合。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成反比。 4.间接竞争ELISA 间接竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的高灵敏度ELISA方法。在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原。首先，加入待检 测样品和已标记的抗原或抗体。待检测样品中的抗原或抗体与特异性抗体 竞争结合，形成复合物。然后加入未标记的特异性抗体，再加入已标记的 二抗，如HRP，继续竞争与涂覆抗原结合。酶与底物反应产生比色或荧光 信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。 ELISA的反应原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应。ELISA 的微孔板表面通常涂覆有抗原或抗体，待检测样品中的抗体或抗原与涂覆 的物质结合形成复合物。经过清洗步骤，加入与样品中的抗体或抗原特异 性结合的二抗，这些二抗已标记有酶。然后加入适当的底物，底物与酶反 应产生比色或荧光信号。这些信号的强度与待测样品中抗体或抗原的浓度 成正比，通过比色或荧光检测设备可以定量测定待测样品中抗体或抗原的 浓度。 总的来说，ELISA是一种简单而有效的生物化学分析方法，广泛应用 于医学诊断、生物学研究、药物研发等领域。不同类型的ELISA方法有不 同的适用范围和优势，可以根据具体实验需求选择合适的方法进行检测和 分析。
酶联免疫吸附试验的原理及分类 一、引言 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种常用的生物化学分析技术，用于检测特定抗原或抗体在样本中 的存在量。ELISA技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点， 已广泛应用于医学、生物学等领域。本文将详细介绍ELISA的原理及 分类。 二、ELISA的原理 ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过标记化酶使 其可定量检测。通常情况下，ELISA试剂盒包括以下组分：微孔板、 标准品或样本、特异性抗体和标记化二抗。 1. 固相法 固相法是ELISA技术最常用的方法之一，其基本原理是将特异性抗体 固定在微孔板上，使其与待测物质发生结合反应，并通过标记化酶进 行检测。具体步骤如下：
（1）将特异性抗体加入微孔板孔中，并在37℃下孵育2小时，使其 与微孔壁表面结合。 （2）去除未结合的抗体，并加入待测物质或标准品，使其与抗体结合。 （3）去除未结合的待测物质或标准品，并加入标记化二抗，使其与抗体结合。 （4）去除未结合的标记化二抗，并加入底物，使其与酶发生反应并产生颜色。 （5）停止反应，并通过读板仪器检测吸光度值，计算出待测物质或标准品的浓度。 2. 液相法 液相法是ELISA技术中另一种常用的方法，其基本原理是将特异性抗 体与待测物质或标准品在溶液中进行反应，并通过标记化酶进行检测。具体步骤如下： （1）将特异性抗体加入试管中，并在37℃下孵育2小时，使其与待 测物质或标准品结合。
（2）去除未结合的待测物质或标准品，并加入标记化二抗，使其与抗体结合。 （3）去除未结合的标记化二抗，并加入底物，使其与酶发生反应并产生颜色。 （4）停止反应，并通过读板仪器检测吸光度值，计算出待测物质或标准品的浓度。 三、ELISA的分类 ELISA技术根据不同的检测目标和标记化酶种类，可分为以下几种分类。 1. 直接ELISA 直接ELISA是一种检测待测物质的方法，其基本原理是将特异性抗体固定在微孔板上，使其与待测物质直接发生结合反应，并通过标记化酶进行检测。直接ELISA具有操作简单、快速、灵敏度高等优点，但其缺点是特异性差，易产生假阳性结果。 2. 间接ELISA