第十四章病毒和病毒成份的提纯
一、病毒的提纯
(一)沉淀法
(二)层析法
(三)两相溶剂间分配系数法
(四)红细胞吸附法
(五)电泳法
(六)超速离心法
(七)超滤法
二、病毒蛋白亚单位的分离
三、病毒脂质的抽提
四、病毒糖类的抽提
一、病毒的提纯
所谓病毒提纯,就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。
病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。
1.物理均一性
测定病毒样品的物理均一性,是证明其纯度的常用方法,包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。
2.病毒滴度与蛋白含量的比例
测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高,说明病毒的纯度越高。
3.免疫学反应
免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。
4.结晶形成
病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。
病毒提纯的主要依据和条件有:
(1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖, 要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。
(2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。
(3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子,可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。
(一)沉淀法
主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。
1.中性盐沉淀法
病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。
2.聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG
加于毒悬液中, 使其达到所需浓度,通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年)成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。
3.有机溶剂沉淀法
甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。
4.等电点沉淀法
病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在pH4.5～5.5之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。
5.皂土法
Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5)吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（pH 8.5），又使其洗脱下来,从而达到纯化目的。
6.鱼精蛋白沉淀法
鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl时,病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。
(二)层析法
病毒粒子表面携带特定的电荷群，因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种，一种是正吸附法，即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附，然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收；另一种是负吸附法，即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白，而让病毒粒子通过。收集滤液后经差速离心沉淀法回收病毒。由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同，因此对吸附剂的亲和性也有显著的差异。
1.萄聚糖柱层析法
将初步浓缩的材料，通过葡聚糖G-150或G-200柱层析，然后用0.02～0.15mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)洗脱，分部收集，测定280nm波长处的OD值，将含病毒的各部分相混合，再浓缩，透析之后，即可得到比较纯净的病毒，Nagano(1989年)用Sephacryls-1000 柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒。
2.凝胶层析法
①磷酸钙凝胶:这是病毒吸附层析法中较为常用的凝胶，由0. 5mol/L CaCl2和
0.5mol/L Na2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物。在中性条件下生成的凝胶称为“brushite”，在碱性条件下生成的凝胶称为羟基磷灰石(hydroxypatite)。两者均用0.001mol/L磷酸盐缓冲液悬浮，置于4℃4～5天，使它充分沉淀后应用。
②氢氧化锌凝胶:是由7mol/L氨水与0.1mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH8.5) 而制备的，在制备后数小时内较稳定，可作为吸附剂。Newton和Beris等将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合，使其形成复合体后沉淀，然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5) 解离病毒，获得较好的回收量。
③焦磷酸镁凝胶:是由0.1mol/L焦磷酸钠和0.1mol/L mol/MgCl2，以2：10(体积)比例在室温中缓慢滴加混合而获得的较稳定的焦磷酸镁凝胶。西村等将牛痘病毒悬液同此凝胶混合，使病毒吸附于凝胶，然后用0.1mol/L盐水洗2次，最后用0.3mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒，将病毒较好地回收于水相中。
3.离子交换纤维素柱层析法
离子交换层析适于分离几乎所有带电荷的分子。通常有阴离子交换剂和阳离子交换剂两种。
某些病毒可以被离子交换剂经离子键作用而吸附，通过改变平衡液的离子强度, 使其再洗脱下来而达到纯化目的。腺病毒和口蹄疫病毒被DEAE纤维素吸附，可分别再用0.5mol/L和0.15mol/L NaCl溶液洗脱下来，从而得以纯化。
4.亲和层析法
亲和层析是一种特殊的吸附层析,基质与待分离物具有特异的生物亲和力。通常是将特异的抗体经共价偶联作用结合在配基上组成一种不溶性配基。当相应的抗原物质通过固定配基装成的层析柱时，即被吸附。随后再改变实验条件，将其洗脱下来，达到纯化的目的。该法是于80年代初期开始用于病毒的分离提纯，不仅纯度好，敏感，而且回收率高。
Njayou(1991年)应用此法成功地提纯了麻疹病毒。他们应用猴抗麻疹病毒的IgG进行共价偶联，获得了高纯度而有活性的病毒，回收率可达总回收成份的30％。Rimmelzwaan (1987年)应用犬细小病毒的中和性单克隆抗体亲和层析，纯化了细小病毒，经SDS—PAGE 和ELISA鉴定，99％以上的杂蛋白被洗除，收获了70～90％的病毒抗原成份。
(三)两相溶剂间分配系数法
该法主要原理就是高分子物质以溶质形式存在于两相溶剂中，根据其分配系数的不同而选择性地分配于其中的一方，从而达到纯化的目的。所采用的溶剂主要有: 葡聚糖硫酸盐(Dextran Sulphate,DS)和聚乙二醇(PEG)或甲基纤维素(MC)和聚乙烯醇(PVA)，形成Ds —PEG系、Ds—PVA系和Ds—MC系。利用病毒在有机溶剂中的分配原理，在适当的溶剂系统和葡聚糖层之间进行多次反复转换，不仅能够浓缩病毒，而且还可以纯化病毒。
通常是将两相溶剂如Ds—PEG以适当的重量百分比混合，然后加入病毒液，数次激烈振荡混合，置于4℃24～36小时，即可分离为两层，病毒将特异地分布于其中一方(如Ds层中)。适当改变溶剂的混合比例时，分配于Ds层中的病毒可由Ds层转入PEG中，而得以浓缩。若调节适当，一步就可浓缩100倍，两步浓缩就可以达到10000倍。
非病毒物质通常以不同的方式进行分配，从而达到浓缩纯化的目的。Nammar(1991年) 应用Ds—PVA系纯化了反转录病毒。两相溶剂间分配系数法简单、温和，并能使病毒得到较高的浓缩和纯化。但是为了获得高度纯化的病毒，还需配合应用其它方法。
(四)红细胞吸附法
所谓病毒的红细胞凝集反应，就是指病毒被红细胞表面粘蛋白吸附的现象。自Hirst 发现流感病毒的红细胞凝集性质以来，随后相继发现其它一些动物病毒也有红细胞凝集性。Stanley证明，流感病毒在0℃时被红细胞吸附，而在37℃时却从红细胞上脱离下来的性质，从而将此方法应用于病毒提纯。
我们实验室应用醛化鸡红细胞吸附马流感病毒，取得较好效果。具体方法是:
采取鸡血，以无菌生理盐水洗涤3次后制成压积红细胞。另取福尔马林和生理盐水等量混合，制成福尔马林盐水。在2份福尔马林盐水中加入1份压积红细胞，充分振荡15min，置2～8℃冰箱内48h，每天振荡2～3次。届时取出，再振荡1次，后用700r/min 离心5 ～10min，弃上清，再加20倍量生理盐水，振荡混合后置2～8℃冰箱过夜。弃上清，加入20倍量生理盐水，如上洗涤3次。取沉淀红细胞，加入相当于初次压积红细胞量的生理盐水，混匀后即可应用。
将马流感病毒感染的鸡胚尿囊液，作2500r/min离心10min，吸取上清液。取保存于2～8℃的病毒液100ml，加入2～8℃的醛化红细胞悬液6ml，充分振荡15min，立即放入冰箱内每2h振荡1次，共2～3次，随后置冰箱中过夜，待其自然沉淀。次日吸出上清，如其血凝价在1:15以下，则证明已经充分吸附，此时即可进行释放，否则需再补加醛化
红细胞悬液继续吸附。在已充分吸附病毒的醛化红细胞沉淀中，加入相当于原病毒液1/10量的5mol/L NaCl溶液,充分振荡，置37℃水浴中4h，每隔30～60min振荡1次。取出后立即以700r/min 离心10min。吸取上清液，即为浓缩病毒液，必要时可对已释放过病毒的醛化红细胞作第二次释放，方法同前。
上述吸附-释放方法，可将病毒浓度提高10倍左右(以血凝效价表示)。
(五)电泳法
先将病毒悬液对缓冲液透析。根据病毒的种类不同，选择适当的缓冲液，但离子强度不能超过0.3mol/L以上。病毒粒子依据其所携带的电荷，在电场中或向正极，或向负极移动，因此电泳结束后，分段收集病毒区带部分，就能达到提纯的目的。
(六)超速离心法
病毒粒子经过初步浓缩之后，要进一步纯化，通常采用超速离心法，它是分离提纯不同大小的病毒的有效方法之一。在应用超速离心法沉淀病毒时，必须了解所用离心机的离心力。离心机由于转头的回转产生了强大的离心力, 这种离心力是随转头的大小和离心管至转轴中心的距离而变化的。高速和超速离心机的离心条件，有的以每分钟速度(r/min)表示，有的则以离心力——重力加速度g.(980cm/S2)为单位来表示。离心沉淀时，沉降速度与离心力有关。
离心机转速在4000r/min左右的称为低速(普通)离心机；转速至25000r/min左右的称为高速离心机；转速25000r/min以上的称为超速离心机。高速和超速离心机装有冷冻装置和抽真空装置，以保持离心腔中恒定的低温，并减少转头运转时空气的摩擦力。超速离心机有制备和分析用两类，最近又生产出制备、分析及区带连续离心三用装置在一起的离心机，有的还带扫描装置。
使用超速离心机的分离提纯方法有三种:(1)差速离心法；(2)速度区带离心法；(3)平衡密度梯度离心法(或等密度梯度离心法)。
1.差速离心法
这是应用较早的简单方法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差别的基础上。具体做法是将被分离的样品交替进行低速离心与高速(或超速)离心。沉降速度差别在一个或几个数量级的粒子，可用本法分离提取。粒子大小、转速与离心沉淀时间的关系，差速离心适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放的病毒悬液中提纯病毒。在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时，由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在，提纯效果不理想。差速离心法的优点是能迅速处理大量样品，故常作为病毒精制的第一个阶段，或者用于病毒样品的浓缩和粗提。
以差速离心法分离提纯病毒时，经常以低速(2000～3000r/min，20～30min) 及中速(10000r/min，20～30min)去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其他较大的杂质。然后，选择在60min内能够沉淀80%以上的病毒粒子的较高速度，离心1～2h，使病毒沉淀。对中、大型病毒如流行性感冒病毒，在经红细胞吸附-释放后，于25000r/min离心60min，即可达到目的。小型病毒如脊髓灰质炎病毒、披膜病毒，则需以35000～45000r/min离心1～2h。高速或超速离心沉淀物，可用研磨和超声波振荡等方法打碎后悬浮于缓冲液中。对于非病毒杂质较多的样品进行差速离心，由于病毒对沉淀物的非特异性吸附而有较多损失。
2.速度区带离心法
是根据被分离物质在强大离心力中沉降速度不同而进行的分离方法。该法使用的介质密度应该小于被分离物质的密度。介质可以为均一密度，也可以为梯度密度。当被分离的物质沉降到与介质密度相等的区域时就不再沉降。不同分子形成不同的区带，而称为速度区带。该法要求样品浓度为顶端浓度梯度的1/10，样品体积为离心管体积的5%。常用的介质有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒纯化时，将病毒样品溶液层加于密度梯度层的顶部，借助病毒粒子或其亚单位成分本身的浮密度差别，在离心力作用下降到密度相等的介质层内，最后排列成带状停留不动。密度较小的粒子或成分停留在上面的几层内，密度较大的粒子或成分沉降于下面几层内。应用密度梯度法，可以获得相当纯净的病毒样品。病毒粒子或成分的沉降速度取决于其大小、形状及比重，也取决于离心力及悬液介质的密度和粘度。蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分离时最常应用的材料，因其易溶于水，且对核酸及蛋白质呈化学惰性。常用的梯度范围从5～20%或10～60%。
除蔗糖浓度连续梯度离心外，近来有人在两层浓度梯度上层加病毒浓缩样品，经超速离心后将病毒收集于两层界面处；也有人在单层蔗糖浓度溶液上层加病毒浓缩样品，经超速离心，使病毒沉淀于蔗糖溶液底部。这两种方法比较简单，但浓缩提纯的效果远远不如多层连续梯度法。
3.平衡密度梯度离心法
平衡密度梯度离心法是根据粒子的浮密度不同而加以分离。所谓浮密度就是物质的质量减去在一定介质中所受的浮力, 亦称有效密度。
制备梯度的方法有两种：一种是在饱和的CsCl溶液上面层加病毒样品(容量比1: 4)；另一种是将病毒样品与CsCl浓溶液均匀地混合。一般用水平转头，经较长时间的超速离心，在离心管中形成CsCl的浓度梯度，并由于离心力的作用，样品中的病毒粒子分布于相应密度的区域内。这种方法在分析离心中是最常用的。应用本法时，离心转头的回转数越高，离心时间越长，越能接近平衡状态。
平衡密度梯度离心法广泛应用于病毒和核酸的提纯上。用平衡密度梯度离心法提纯
的动物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒和马传贫病毒等。有的病毒在这些无机盐类溶液中被破坏，可加入0.2～0.5%牛血清白蛋白，或用0.5～3.0%甲醛先将病毒粒子固定，然后进行平衡密度梯度离心，常能较好地回收病毒。大多数病毒的浮密度在1.10～1.40范围内。所以制备密度范围为1.0～1.7的悬浮介质，便可满足大多数病毒密度梯度离心的需要。
4.密度梯度离心法的操作程序
(1)密度梯度的制备:制备密度梯度的方法有不连续的(即人工操作)和连续的( 即机械操作)密度梯度两种。
不连续的或分层的密度梯度的制备不连续的密度梯度是以人工操作法制备的，在一定温度下(一般在20℃或在25℃)配制一系列浓度差为5%的梯度溶液,例如蔗糖可配制成5、10、15、20、25、30、35、40%(W/V)等溶液(用蒸馏水或适宜的缓冲液配制)，用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取浓度最大的溶液注入离心管底，然后依次加入较低的各个浓度(40%→5%)，一层覆盖着一层地层加于离心管中，注意避免产生气泡。假如各层界面被冲动破坏，则应重新制备。也可以将长针头插入管底，依次从浓度低到高加入各溶液。
连续的密度梯度的制备为了产生一个连续的密度梯度，常用梯度混合装置来制备梯度。
梯度混合装置由A和B管组成。两管之间用双通活塞联结。在活塞关闭的状态下，向A管中加入低浓度蔗糖溶液，向B管中加入高浓度的蔗糖溶液，两管中容量要相等。在B管出口处用一根聚乙烯小管连接到离心管。在给B管充液时，可将聚乙烯小管的流出口向上转动，使之超过液体的水平面，从而阻止液体流出。充液后可将小管接到离心管中使之贴着管壁，然后开动小搅拌器，使搅拌棒转动，同时打开两管间活塞。这三个操作要同时进行，以保证梯度的连续性。当梯度液体自B管流出时不允许移动离心管，待离心管中所盛的梯度溶液的体积达到需要量之后，将离心管小心地静止于4℃1～2h ，以平衡之。
现在不少“制备用超速离心机”携带有“密度梯度制备自动装置”。按照这个方法制备的蔗糖浓度梯度，理论上按公式计算。
这些浓度梯度是根据样品和实验目的而专门选用的。一般使用的浓度梯度范围为20%→5% ，40%→10%，或60%→10%等。
(2)加入样品:用如上所述注射器或微量吸管吸取悬浮于适宜缓冲液中的病毒或核酸样品( 约梯度介质体积的1/10容量)，从液面上方1mm处，紧贴着离心管壁轻轻层加于梯度介质面上。
(3)高速或超速离心:将加入样品的离心管装入套管内，也可将离心管置于转头的套管内，以免在装进套管时震动液体。拧紧套管螺帽，将套管吊在水平转头上，置于离心机内。梯度离心一般用高速或超速离心机。离心速度和时间，根据所分离的样品选定。离心开始，样品中各种粒子逐渐分离，分布于相应的密度梯度层中成为带状( 如为透明的聚碳酸酯离
心管，则可以清楚地见到带状分离，并拍照)。离心时间到时，使离心机自然停止，不许制动，以免破坏梯度。
(4)梯度的分段收集(取样):在离心完了以后，为了把已分离物质的各条带分开，必须取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集方法有如下几种。
①取代法：从离心管底部穿刺或将带长针头的注射器插入离心管底，使一种稠密的介质，如60～70%(W/V)蔗糖溶液，缓慢地注入于离心管底部。然后用一个注射器或移液管，从上面逐一移出各部分。或者在离心管的颈部加上一个塞子，这个塞子附着一根收集导管，通向一个部分收集器，收取各部分。
②穿刺法：将离心管固定于特制的固定架上，在其底部装上一个垂直向上的空心针穿刺，使梯度溶液自由滴出，可用部分收集器或用小试管分段收集。超速离心机一般都带有此装置。此装置的缺点是离心管在用一次后即废弃。
③虹吸法：此法的优点是不必穿刺离心管，离心管可反复使用。经我们多次试验，此法简便易行，对梯度密度无破坏。用一根大穿刺针截两段做虹吸管，以接上50 ～100ml 玻璃注射器进行送气的方法，分段收集梯度溶液。
④注射器吸取法：用弯曲的针头(J状)接在注射器上，从梯度最上层开始向下逐层小心吸取液体。
5.梯度各层液体的密度测定
(1)称重量法：用10ul微量注射器吸取样品，加入于已知重量的毛细管中，在1/10万分析天秤上称重，计算重量(g/ml)，即为梯度溶液的密度。
(2)测定折射率法：用阿贝氏折光仪测定各梯度层溶液的折射率(25℃)。
(3)浮漂法：向已制备好的各种密度溶液中滴入一滴样品，找出相应的样品浮密度溶液，即为该梯度层的密度。
6.各梯度分层液中病毒分布的鉴定
(1)以紫外分光光度计测定蛋白质和核酸吸收峰。吸取各层梯度溶液，用蒸馏水或缓冲液适当稀释后，测定波长280和260nm的OD值。然后以各梯度层管号为横坐标，其OD值为纵坐标画曲线，即为各梯度层中蛋白质-病毒含量图，有些病毒260nm OD值较高。
(2)以各种血清学方法测定各梯度层中病毒的抗原效价或用组织培养法测定病毒滴度，证实病毒分布区域。
(3)用电子显微镜负染法观察病毒粒子及其纯度。将各梯度层样品装入透析袋中，置于适宜的溶液中透析去盐，然后取一滴样品用蒸馏水稀释，滴附于铜网膜上，用磷钨酸负染后电镜下观察病毒粒子。
(七)超滤法
超滤法是利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩的一种方法。超滤膜的孔径有多种，可根据被截留的分子大小而选择。超滤法是浓缩大容量的病毒样品的一种非常有效的方法，其优点是可以在室温或低温下操作；对被浓缩的产物损害很小；浓缩的同时可达到部分纯化；如选择合适的膜和操作参数，可达到很高的回收率；此外，超滤系统可密封以防止外来污染。超滤系统目前主要有三种，即搅拌池式，浅道流动系统和中空纤维系统。搅拌池式是一种最简单的超滤系统，由超滤室及磁力搅拌器组成，通过正压而使液体通过滤膜。此方法简单，但浓缩样品量有限，一般在2000ml以内，而且滤膜孔易于堵塞。浅道流动系统的特点是液体在膜表面的螺旋形浅道中流动，液体与膜的接触面积也大于搅拌池系统，因而滤过速度大为提高。中空纤维系统是由很多根空心纤维成束装配而成，每根纤维即为一个微细管型膜，因此，其有效的膜面积远远大于前二个系统，滤过速度很快，适用于大体积的浓缩。
二、病毒蛋白亚单位的分离
病毒具有几种以上的蛋白质,每一种蛋白质通常都由分子量较小的许多相同的亚单位组成。病毒的结构蛋白决定着病毒粒子的结构及其与细胞受体部位结合的特异性。病毒的血清学特异性和酶活性也决定于蛋白质。结构蛋白还有保护病毒核酸的作用——核酸处于蛋白外壳的内部，或与蛋白质互相缠绕而成核蛋白。因此病毒基因组受到有关蛋白质的保护，从而可以抵抗理化学因素的降解作用。
蛋白质构成病毒质量的大部分，病毒粒子内的蛋白质可以单独地或与糖、脂类结合在一起，成为糖蛋白或脂蛋白。病毒结构蛋白可以从提纯的病毒制品中通过与核酸和其它蛋白分离, 而又不打断肽键的处理方法得到。分离时须用中性去污剂、极性试剂或阻止蛋白聚合的保护剂如尿素、盐酸胍、去氧胆酸钠和SDS等,或改变pH值等方法加以处理。
三、病毒脂质的抽提
病毒中有许多种脂类化合物，包括磷脂、中性脂肪、脂肪酸、脂肪醛及胆固醇等。病毒脂质的主要成分是磷脂，它在许多病毒中具有结构上的功能。病毒的磷脂就在囊膜中，它对病毒颗粒的结构完整性是很重要的。这是因为当这类病毒用脂溶剂或某些磷脂酶处理后就显著地丧失了感染性。
病毒脂质大部分来源于感染前就存在于宿主细胞的脂质。病毒的有些脂质与糖结合形成糖脂，有些脂质与蛋白结合形成脂蛋白。
抽提病毒脂类时最常用的溶剂系统是氯仿－甲醇。有人应用此溶剂系统抽提SV5的病毒脂质,其方法是:
(1)取冻干的病毒样品,用氯仿：甲醇：水=65：25：5的溶剂,在室温下抽提二次,每次
20 min,接着在氮气下用沸腾的溶剂抽提一次20min。
(2)合并抽提物,加入其1/6体积的水,混合后分为水相和有机相。如存在神经节甙脂,则进入到水相中,而其它全部脂质仍留在有机相中。
(3)将这一部分溶剂移到旋转器或蒸发器中,在氮气下驱除有机溶剂,即获得总的脂质。
四、病毒糖类的提取
糖是所有病毒核酸的组成成份之一,有些病毒还含有葡萄糖基嘧啶,另一些病毒则含有糖蛋白。病毒囊膜的主要成份是糖蛋白,通常位于病毒粒子的表面,使它们具有血清学活性。
下面是Lai提纯禽肿瘤病毒糖类的方法：
(1) 用1%SDS(内含0.05mol/L 2-巯基乙醇)在37℃裂解提纯病毒30min,在此裂解物中加入5倍体积的乙醇,沉淀病毒的糖蛋白,将此沉淀物溶于0.1%SDS,0.1mol/L Tris(pH8.0)中;
(2) 用饱和酚抽提病毒糖蛋白,取水相加入5倍体积的乙醇(内含2mol/L NH4Ac)沉淀回收病毒糖蛋白,再用75%的乙醇洗一次,溶于0.1%SDS,0.1mol/L Tris中；
(3) 用灰色链丝菌酶1mg/ml处理48h,再用0.05mg/ml的浓度处理48h,以水解糖蛋白;
(4) 水解的糖蛋白通过Sephadex-G50凝胶层析过滤法,分离获得糖类。
蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由
于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应
用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和
RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广
的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性。
推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
蛋白酶k配制标准：20mg/ml蛋白酶K配制标准(proteinase K)：将200mg 的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡
旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。
蛋白酶K的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。
孵育温度为55至65℃，理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48小时;理想孵育时间为2小时。
作用：蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理，它具有消化
包围靶DNA蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果。EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用，解决上述出现的问题，并能达到理想的染色效果。
蛋白酶K的应用比较广泛，它可以消化包围靶DNA蛋白，因此使用蛋白酶K能够增加探针与靶核酸结合的机会增强杂交信号，但在使用蛋白酶K时要主要使用的浓度，过高或者过低都会破坏细胞的结构、核消失等影响试验结果。
填空题 1. 冠状病毒是_有包膜___的RNA病毒，呈皇冠状，其__单股正链__RNA约由30000多个碱基组成，为已知最大的RNA病毒。 2. __严重急性呼吸道综合症__（ Severe acute respiratory syndrome, SARS）在我国又被称为传染性非典型肺炎。 3. SARS冠状病毒包膜主要包括三种糖蛋白，分别为__S蛋白__、__M蛋白__ 和 E 蛋白。N 4. 病毒的大小以__nm___为单位量度刺突蛋白、膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白 5. 病毒含有的核酸通常是_DNA或RNA__ 6. 最先提纯的结晶病毒是__烟草花叶病毒__ 7. 病毒囊膜的组成成分是_脂类_ 8. RNA病毒突变率远高于DNA病毒，主要原因是_DNA是双链闭合环状结构较RNA单链线状比较稳定__ 9. 跨膜蛋白通过特定的_折叠__和_弯曲__方式，实现分子的跨生物膜的运输。 10._____受体___决定病毒的宿主谱以及其感染某种动物的能力。 11. ___允许细胞__指对病毒的增殖复制具有支持作用的细胞。 12. 大部分RNA病毒的基因组为__单一组分___ 13. RNA病毒启始RNA合成的两种机制为__de novo __启始和引物依赖启始。 11
14. 反转录酶具有四种不同的催化活性：RNA指导的或DNA指导的DNA多聚酶活性、DNA解旋活性和__ RNase H __活性。 15. 真核细胞基因的转录是由三种RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)来分别完成的，只有RNA聚合酶__Ⅱ__能转录生成mRNA。 16. mRNA输出的底物是由RNA与__蛋白质__共同组成的核蛋白。组蛋白、精蛋白等碱性蛋白 17.大多数有包膜病毒通过__出芽__方式释放病毒粒子。 18. 绝大多数病毒只能感染某些特定类型的细胞、组织和器官，这种特性称为病毒的_组织亲嗜___性。 19.受体介导的凋亡途径主要激活Caspase-8，线粒体介导的凋亡途径主要激活__ Caspase-9__，二者都激活__ Caspase-3__ 。 20. HIV的__env __ 基因所编码病毒包膜蛋白gag，核心蛋白；pol，酶 21. HIV感染靶细胞的第一步就是位于表面的__gp120__与靶细胞受体相结合。 22. 流感病毒结构自外而内可分为包膜、_核衣壳__以及核心三部分。 23. 流感病毒的包膜中除了磷脂分子之外，还有两种非常重要的糖蛋白：___基质蛋白___和___糖蛋白突起___。 24. “H1N1”是病毒名称的缩写，其“H”指的是__血凝素___、而“N”指的是__神经氨酸酶___。 25._机体细胞免疫应答__是HBV肝损伤的主要病理机制。HBV免疫介导肝损伤机制主要有固有免疫、T细胞免疫、与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用 26. IFN通过两种机制发挥抗病毒作用：直接抗病毒作用和__抑制病毒的复制__。 22
现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。 在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。 病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。现在我们讲解每个步骤的一些细节。 1.在大型装置中培养细菌。为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。每种病毒的培养都有不同的步骤。脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。 2.富含病毒培养液的去除。病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。低速离心除去大分子的细胞残骸。 3.通过沉淀将病毒物质浓缩。由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。 4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。在后者中，病毒在离心试管中成为一个分离带，这一过程与对DNA的分离相同，离心须要高速，即120000g,且要进行好几个小时，最好是一整夜。离心管中的液体通过试管底部的一点点滴出来，要检测每一滴的病毒滴度。在合适的离心条件下，所有的病毒分子都集聚在一或两个组分中，所以它们是非常纯的。结晶脊髓灰质炎病毒。如果能在合适的条件下浓缩大量且高纯度的病毒，就可以获得病毒晶体。这种晶体为化学分析提供了很好的材料，且易于通过X射线衍射技术进行结构分析。本章的部分讲到的脊髓灰质炎病毒的计算机拟合就是从这种高浓度脊髓灰质炎的病毒晶体获得的。
1.病毒的特性 2.病毒的本质： 病毒属于微生物界，其不同于其他微生物的特性包括： （1）病毒一般只含有一种核酸——DNA或RNA，而其他微生物，包括细菌、支原体、立克次氏体和衣原体，则都同时含有两种核酸。 （2）病毒通过基因组复制和表达，产生子代病毒的核酸和蛋白质，随后装配成完整的病毒粒子；而其他微生物，则是核酸和许多其他组成成分一起参与生长、增殖过程，并常以二 分裂或类似的方式进行。 （3）病毒缺乏完整的酶系统，不具备其他生物“产能”所需的遗传信息，因此必须利用宿主细胞的酶类和产能机构，并借助宿主细胞的生物合成机构复制其核酸以及合成由其核酸 编码的蛋白质，乃至直接利用细胞成分。可以这样认为，病毒的生物合成实质上是病毒 遗传信息控制下的细胞生物合成过程。 （4）某些RNA病毒（反转录病毒）的RNA经反转录合成互补DNA(cDN A1℃)与细胞基因组整合，并随细胞DNA的复制而增殖，这就是所谓的DNA前病毒。 （5）病毒没有细胞壁，也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动，因此对于因干扰微生物的这些代谢过程而影响微生物结构和功能的抗生素，具有明显的抵抗力。 病毒的定义： 病毒属于最小的生命形态，是只能在宿主细胞内才能复制的微生物。当然这是指自然状态的病毒而言，因在人工实验条件下，人们已经掌握在无细胞（cell-free）系统中复制病毒的技术。2．病毒的起源：是指病毒的来源及其演化 关于病毒的起源问题，众说纷纭，归纳起来主要有以下三种假说： （1）认为病毒是原始生物物种的后裔； （2）认为病毒来源于细胞核酸； （3）认为病毒是某些较高级微生物的退行性生命物质 3.病毒的形态结构： 病毒形态是指电子显微镜下观察到的病毒的大小、形态和结构。 一个简单的病毒粒子，实质上只是一团遗传物质（DNA或RNA）和它外围的一层蛋白外壳。这层蛋白外壳就是衣壳，具有保护病毒核酸的作用，同时也是病毒核酸有一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞的工具。衣壳和核酸一起总称为核衣壳。在某些病毒，核衣壳就是病毒粒子。但在结构比较复杂的病毒中，则衣窍外面还有一层（或多层）富含脂质的外膜，即囊膜。某些病毒，如流感病毒，在囊膜和核衣壳之间还有一层病毒特意的内膜蛋白，即M蛋白。囊膜的组成成分主要来自宿主细胞，大多是核衣壳在感染细胞内穿越核膜或在感染细胞表面“出芽”时有细胞获得。
一、填空题（共10题，每题1分） 1，病毒核衣壳主要由核酸芯髓及蛋白质外壳两部份构成。 2，构成病毒体的主要化学成分是__核酸__和_蛋白质_。 3，可将自身基因整合在宿主细胞基因上的病毒主要有_逆转录病毒、乙型肝炎病毒、疱疹病毒。 4，鉴别病毒是否具有包膜，通常可采用_脂溶剂。 5，病毒的繁殖方式为__复制_，病毒在细胞内的增殖导致细胞的病理变化称为_致细胞病变效应（CPE）_。 6，病毒的穿入方式主要有_包膜和细胞膜融和病毒胞饮两种。 7，无包膜病毒体多数通过_细胞裂解_释放，有包膜病毒体主要通过_出芽_方式 释放。 8，病毒合成的蛋白质主要包括_结构蛋白和功能蛋白_两类 9，干扰素的主要功能有_抗病毒、抗肿瘤、免疫调节。 10，正链RNA病毒的RNA可直接作为_ mRNA _，在细胞的_核糖体上转译病毒 蛋白质。 二、正误判断题（共10题，每题1分） 1．多联苗是由不同血清型的同种病原微生物混合制成的。（错） 2，λ噬菌体和PI噬菌体都是温和噬菌体。（对） 3，DNA病毒以双联为多，而RNA病毒以单链为多。（对） 4，逆转录病毒RNA可以反转录为DNA。（对） 5，腺病毒是典型的20面体对称的病毒，其病毒粒子具有12个五邻体和240个六邻体。（对） 6，负链RNA病毒是指其病毒粒子中所携带核酸序列与mRNA序列一致的病毒。 （否） 7，温和噬菌体侵入寄主细胞后，始终不裂解寄主细胞。（否） 8，病毒都能通过细菌滤器。（是） 9，所有病毒在侵入寄主细胞后，在进行转录、复制前，其病毒核酸都以游离状 态存在于细胞中。（否） 10，逆转录病毒的+RNA分子具有侵染性。（否） 三、单项选择题（共10题，每题1分） 1，牛病毒性腹泻病毒与 A具有抗原交叉反应性。 A猪瘟病毒、B犬细小病毒、C麻疹病毒、D马立克氏病病毒 2，目前已知病毒5种核酸类型是A A. DNA、+DNA、 RNA、+RNA、－RNA； B. DNA、+DNA、－DNA、 RNA、＋RNA； C. DNA、+DNA、－DNA、 RNA、－RNA；
病毒的分离纯化 我设计了一套方案，请大家批评指正： 1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。 2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟 3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。 4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。 5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。 6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH 7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。 7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。 8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。 lf_12345
精品文档 一、名词解释 1. 复制周期 2. 顿挫感染 3. 缺陷病毒 4. 干扰现象 5. ts突变株 6. CPE 7. 包涵体 8. 干扰素 9．抗原性漂移 10．抗原性转变 二、简答题 1. 病毒有何主要特点？ 2. 病毒结构由哪几部分组成？各部分主要功能是什么？ 3. 简述ts突变株获得的条件及实际意义？ 4.病毒复制周期包括哪几个阶段？ 5. 举例列出5个与医学有关的DNA病毒科名称？ 6. 举例列出5个与医学有关的RNA病毒科名称？ 7. 病毒感染常用的血清学诊断方法有哪些？ 8.简答干扰素抗病毒的作用特点？ 三、论述题 1．试述病毒性疾病特异性预防措施和制剂。 2．举例说明病毒持续性感染的种类及其特点。 3．病毒感染对宿主细胞的致病作用是什么？ 4．试述病毒致病机制与细菌致病机制有何不同。 参考答案 一、名词解释 1．复制周期：病毒增殖是复制，必须在活细胞内增殖。病毒复制一般分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段，称为病毒的复制周期，经过复制产生大量的子代病毒。 2．顿挫感染：病毒进入细胞内，细胞不提供酶、能量及必要成分，则不能合成病毒本身成分，或虽能合成部分或全部成分，但不能装配与释放。 3．缺陷病毒：病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。如丁型肝炎病毒。 4．干扰现象：两种病毒共同感染同一细胞时，可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象，称为病毒的干扰现象。5．ts突变株：就是温度敏感性突变株。即在28℃~35℃条件下可增殖，而在37℃~40℃条件下则不能增殖。这是因为ts 变异的基因所编码的蛋白质或酶在较高温度下失去功能，故病毒不能增殖。 6．CPE：病毒在细胞内增殖造成细胞破坏死亡的作用称其为杀细胞效应，这种效应在体外组织培养时可观察到细胞变园、聚集、脱落等，称为致细胞病变作用（CPE）。主要见于无包膜病毒，如肠道病毒等。 7．包涵体：是某些受病毒感染的细胞内，用普通光学显微镜可见到与正常细胞结构和着色不同的斑块，一般呈园形或椭园形，称为包涵体。包涵体由病毒颗粒或成分组成，也可是增殖痕迹。 8．干扰素：是病毒或干扰素诱生剂作用下使人或动物细胞产生的－类糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多方面生物活性。 9．抗原性漂移：通常认为流感病毒基因发生了点突变，变异幅度小或连续变异，部分人群对新毒株没有免疫力，引起小规模流行。一般认为是属于量变，即亚型内变异。 10．抗原性转变：流感病毒株表面抗原结构一种或两钟发生变异，形成新亚型，由于与前一次流行株抗原结构相异，人们缺少对变异病毒株的免疫力，从而引起大流行。一般认为是变异幅度大，属于质变。 二、简答题 1．（1）体积微小；（2）结构简单，仅含有一种核酸；（3）严格寄生，只能在一定种类活细胞中增殖；（4）对抗生素不敏感而对干扰素敏感。 2．基本结构为核心和衣壳；辅助结构主要是包膜，有的病毒有其他辅助结构如触须样纤维。核心成分为核酸其功能：（1）决定病毒特性；（2）病毒复制；（3）具有感染性。总之核酸是主导病毒感染、增殖、遗传、变异的物质基础。衣壳的成分是蛋白其功能：（1）保护病毒核酸；（2）参与感染过程；（3）具有抗原性。包膜成分含蛋我糖和脂类，其功能：（1） 精品文档
肝炎 hepatitis 癌症 cancer 心脏病 heart disease/attack Acidosis 酸中毒 Adams-Stokes syndrome 亚－斯氏综合症 alcoholism, alcoholic intoxication 酒精中毒 alkalosis 碱中毒 anaphylaxis 过敏症 anemia 贫血 iron deficiency anemia 缺铁性贫血 megaloblastic anemia 巨幼红细胞性贫血 aplastic anemia 再生障碍性贫血 angiitis 脉管炎 angina pectoris 心绞痛 arteriosclerosis 动脉硬化 apoplexy 中风 auricular fibrillation 心房纤颤 auriculo-ventricular block 房室传导阻滞 bronchial asthma 支气管哮喘 bronchitis 支气管炎 bronchiectasis 支气管扩张 bronchopneumonia 支气管肺炎 carcinoma 癌 cardiac arrhythmia 心律紊乱 cardiac failure 心力衰竭 cardiomyopathy 心肌病 cirrhosis 肝硬化 coronary arteriosclerotic heart disease 冠状动脉硬化性心脏病 Crohn disease 克罗恩病 Cushing's syndrome 库欣综合症 diabetes 糖尿病 diffuse intravascular coagulation 弥散性血管凝血 dysentery 痢疾 enteritis 肠炎 gastric ulcer 胃溃疡 gastritis 胃炎 gout 痛风 hepatitis 肝炎 Hodgkin's disease 霍奇金病 hyperlipemia 高脂血症，血脂过多 hyperparathyroidism 甲状旁腺功能亢进 hypersplenism 脾功能亢进 hypertension 高血压
高中生物病毒有关知识点归纳 病毒是一类非细胞结构的生物。由于它的结构与高等动植物及其他生物完全不同，所以生物学家在分类时将它作为特殊的一类，单独列为病毒界。在高中生物学以及高考中也经常涉及有关病毒的知识点及考点。 一、大小 发现史：19世纪,伊万诺夫斯基在研究烟草花叶病的病因时，推想这种病是由细菌引起的。他将患花叶病的烟草榨出汁液，用能将细菌滤去的过滤器进行过滤，再用过滤后的汁液去感染正常的烟叶，结果发现正常的烟叶还能患病。 发现问题： 提出假说： 设计实验：（加法、减法） 得出结论：这表明烟草花叶病是由比细菌还小的病原体引起的，他把这种病原体叫做"滤过性病毒"。 病毒形体极其微小，必须在电子显微镜下才能观察到，一般可以通过细菌滤器(一般的直径为1-10μm，而多数病毒的直径在100 nm左右)。 二、成分和结构 1、成分 病毒没有细胞结构，主要成分仅为核酸和蛋白质两种。核酸位于病毒粒子的中心，构成了它的核心或基因组，蛋白质包围在核心周围，构成病毒粒子的衣壳。衣壳对核酸有保护作用，是病毒粒子的抗原成分。它们共同称为核衣壳，是任何病毒(指“真病毒”)所必需的基本结构。有些较复杂的病毒，在其核衣壳外还有一层囊膜包被。 2、结构 衣壳：蛋白质 髓部：DNA或RNA 特殊包膜 刺突 每一种病毒只含有一种核酸，不是DNA就是RNA，这也是病毒分类的依据之一。如DNA病毒有：噬菌体、疱疹病毒、各种腺病毒等。RNA病毒有：艾滋病毒、烟草花叶病毒、车前草病毒等。 三、生活方式 1、生活方式 病毒在宿主的活细胞内寄生生活。离开宿主细胞，病毒能以无生命的化学大分子状态存在，并可形成结晶 不同的病毒只能寄生在特定的宿主细胞内，具有专一性，这也是病毒分类的另一个重要依据。如专门寄生在动物细胞中的称为动物病毒(艾滋病毒等)，专门寄生在植物细胞中的称为植物病毒(烟草花叶病毒等)，专门寄生在细菌细胞中的称为细菌病毒(噬菌体)。 噬菌体的繁殖一般可分为五个阶段：即吸附一侵入→增殖(复制与生物合成)→成熟(装配)→裂解(释放)。整个过程必须在它的宿主活细胞中完成。 只有核酸进入宿主细胞，换言之，只提供了复制和表达的模板，其他的原料、能量、酶、
毒粒（virion）是病毒在复制过程中的一种完整的成熟的病毒颗粒，有固定的形态和大小，而且一般都有侵染性。所以说一般具有侵染性是因为有些病毒的基因组核酸是分节段的，如雀麦花叶病毒的基因组核酸有四种。而且RNA1、RNA2和RNA3、RNA4分装在大小形状相同的三种球形颗粒中，只有三种颗粒混合，才具有侵染性。 外壳（capsid）是由多个病毒蛋白亚基组成的包裹在病毒基因组核酸外面的结构。 壳粒（capsomer）组成外壳的结构亚基，并非总是均匀分布的，往往聚集成群体，二个、三个、五个甚至六个亚基聚在一起，用负染法在电镜下所分辨开的一个个亚基，可能并非单个结构亚基，而是它们的群体，实际上是形态亚基称之为壳粒。 包膜（envelop）大多数动物病毒，在毒粒外被有由糖蛋白，脂肪所形成的外膜，称之为包膜。糖蛋白在膜上往往形成各种形状的突起，包膜在识别寄主、侵入寄主细胞，病毒的抗原性方面起重要作用。 二十面体（icosahedron）一种有12个角顶及20个面的对成的多面体，其每一个面是一个等边三角形；经常用来描述病毒的结构。 亚病毒（subviruses）不具有完整的病毒结构的一类病毒称之为亚病毒，包括类病毒、卫星RNA、朊病毒。 株系（strain）病毒经过生物化学物理等因素的作用后，是病毒致病力、寄主范围、抗原特异性、传播特性甚至粒体形状发生了改变，这些性状变异了的病毒粒体称为株系。 准种（quasispecies）RNA复制酶的低保真性决定了RNA病毒没有固定序列的基因组，由相关基因组构成的异质性群体为准种。 感染周期（infection cycle）病毒完成整个感染的过程，包括识别、吸附、入侵、生物大分子的合成、装配和释放。 流产性感染（abortive infection）是Productive infection（产毒感染）的反义词，是指在一定条件下，病毒感染导致毒粒的无效复制，常不生产感染性毒粒。 潜伏感染（latent infection）一种病毒的持续性感染状态，在此情况下，不产生病毒。一般来说，大部分转录和翻译过程被阻断。 慢性感染（chronic infection）一种病毒能在宿主或细胞培养上继续复制而不杀死宿主或整个细胞培养。 包含体（inclusion body）在显微镜下可以识别的病毒合成和积贮的部位，常是细胞内的病毒晶体。 交叉保护作用（cross protection）两种病毒感染一种寄主时先入侵的病毒能够保护寄主不再受第二种病毒的侵染。
A single- generation study 单项包括两代(生殖毒性)的研究 Acentric fragment 无着丝点片段Acridine orange 吖啶橙 Active metabolite 活性代谢产物 Additional test 附加试验 Adduct 加合物 ADME 吸引、分布、代谢、排泄 Administration period 给药期 Advers effect 不良反应 Against humanized proteins serum antibodies 抗人源蛋白血清抗体 Aginal smear 阴道涂片 Air righting reflex 空中翻正反射 Alkylating electrophilic cernter 浣化亲电子中心Allele 基因突变产生的遗传因子 Allergic reactions 过敏性反应(变应性反应) Altenative validated test 有效替代试验 Altered growth 生长改变 Ammoniun sulphide staining of the uterus 子宫硫化胺染色 Analogue 类似物(同系物) Analogue series of substance 同系物Analytical method 分析方法 Anaphase 分裂后期 Aneuploidy 非整倍体 Aneuploidy inducer 非整倍体诱导剂 Antigenic specificity 抗原特异性Art and ethical standards 技术和伦理标准Assessment of genotoxicity 遗传毒性评价 AUC 曲线下面积Auditory startle reflex 惊愕反射(听觉惊跳反射) Autoimmune 自身免疫 Autoradiographic assessment 放射自显影评价Autoradiography 放射自显影 Bacterial mutagenicity test 细菌致突变试验 Bacterial reverse mutation test 细菌回复突变试验 Bacterial strains 菌株 Bacterial test organisms 微生物试验菌 Base pairs 碱基对Base set of strains 基本菌株 Base substitution 碱基置换 Bioanalytical method 生物学分析方法 Bioavailability 生物利用度 Biological method 生物学意义Biotechnological products 生物技术产品 Biotechnoloty-derived pharmaceuticals 生物技术药物 Body burden 机体负担 Bone marrow cell 骨髓细胞 Bouin's fixation 包氏液固定Breakage of chromatid 染色单体断裂 Brealage of chromosome 染色体断裂 Bridging character 桥梁作用 C(time) 一定剂量、某一时间的浓度 Carcinogen 致癌物质Carcinogenesis 致癌性 Carcinogenic hazard 致癌性危害 Carcinogenicity bioassay 致癌性生物检测 Carcinogenicity potential of chemical 化合物的潜在致癌性 Carcinoginicity (oncogenicity) 致癌(致瘤) Cardiovascular 心血管 Case-by-case 个例 Cell proliferation 细胞增殖 Cell cultures 细胞培养 Cell line 细胞系 Cell membrane lipid 细胞膜脂质层 Cell replication system 细胞复制系统 Cell suspension 细胞悬液 Cell-mediated immunity 细胞介导的免疫 Cellular therapy 细胞治疗 Central nervous systems 中枢神经系统 Cerebral spinal fluid 脑脊液 Chemical nature 化学性质 Chinese hamster V79 cell 中国仓鼠V79细胞Chromatide 染色单体 Chromosomal aberration 染色体畸变 Chromosomal damage 染色体损伤 Chromosomal integrity 染色体完整性 Chronic toxicity testing 慢性毒性试验 Classfical biotransformation studies 经典的生物转化试验 Clastogen 染色体断裂剂 Clastogenic 致染色
试题 1 一、选择题 【A型题】 1．关于病毒基本性状叙述错误的是： A ．体积微小，无细胞结构 B．只能在活细胞中增殖 D．对干扰素敏感 E．耐冷不耐热 2．用于测量病毒大小的单位是： A．微米(μm) C．微微米(pm) D．毫微微米(fm) E．微微微米(am) 3．关于病毒结构叙述错误的是： A．核酸和衣壳组成核衣壳 C．衣壳由壳粒构成 D．病毒包膜表面可有刺突 E．各种病毒壳粒数目不相同 4．可称为病毒体的结构是： B．核酸 C．衣壳 D．包膜 E．壳粒 5．呈二十面体立体对称的DNA病毒是： B．风疹病毒 C．正粘病毒 D．弹状病毒 E．脊髓灰质炎病毒 6．呈螺旋对称型的RNA病毒是： B．腺病毒 C．痘类病毒 D．疱疹病毒 E．脊髓灰质炎病毒 7．决定病毒具有感染性的是： B．衣壳 C．包膜 D．神经氨酸酶 E．血凝素 8．病毒的增殖方式是： B．二分裂 C．分枝 D．减数分裂 E．芽生 9．下述与病毒蛋白质无关的作用是： A．吸附作用 B．保护核酸作用 C．病毒包膜的成分 E．免疫原性 10．病毒所合成的晚期蛋白的功能是： A．抑制宿主细胞蛋白质的合成 B．合成包涵体的基质蛋白 D．抑制宿主细胞核酸的合成 E．合成子代核酸所需要的DNA多聚酶 11．以破胞方式从细胞向外释放的病毒是： A．流感病毒 B．麻疹 D．腮腺炎病毒 E．呼吸道合胞病毒 12．以“出芽”方式从细胞释放的病毒是： A．ECHO病毒 C．柯萨奇病毒 D．腺病毒 E．脊髓灰质炎病毒 13．对病毒抵抗力叙述错误的是： A．大多数病毒60℃30分钟可被灭活 B．大多数病毒在－70℃下可存活 C．紫外线能灭活病毒 D．甲醛能使病毒灭活，但保留抗原性 14．一种病毒所产生的衣壳或包膜包在另一种 病毒基因组外，这种变异称之为 A．突变 B．基因重组 C．加强作用 E．互补作用 15．下述哪种属于病毒基因突变： A．交叉复活 B．多重复活 D．互补作用 E．表型混合 16．病毒与立克次体相同的特点是： A．含有DNA和RNA C．含有核蛋白体 D．以二分裂方式进行繁殖 E．对抗生素敏感 17．病毒不同于衣原体的特点是： A．能通过细菌滤器 C．可引起机体多部位感染 D．严格地细胞内寄生 E．在感染细胞内可形成包涵体 18．无包膜的病毒是： A．疱疹病毒 B．披膜病毒 C．流感病毒 E．狂犬病病毒 【B型题】 A 衣壳 B 核酸 C 包膜 D 核衣壳 E 壳粒 19．储存病毒遗传信息的是：B 20．保护病毒核酸的是：A 21．无包膜病毒完整病毒体的是：D 22．电镜下可见的病毒形态学最小单位是：E 23．含有宿主细胞成分的是：C A 裸露20面体对称型 B 裸露螺旋对称型 C 有包膜20面体对称型 D 有包膜螺旋对称型 E 复合对称型 24．流感病毒是：D 25．肠道病毒是：A 26．噬菌体：E 27．单纯疱疹病毒：C A 有包膜RNA病毒 B 无包膜RNA病毒 C 有包膜DNA病毒 D 无包膜DNA病毒 E 缺陷病毒： 28．流行性乙型脑炎病毒： A 29．丁型肝炎病毒：E 30．乙型肝炎病毒：C 31．腺病毒： 32 戊型肝炎病毒：B A 正粘病毒科 B 副粘病毒科 C 披膜病毒科 D 肝DNA病毒科
病毒的主要成分 一、病毒的结构 包膜：蛋白质、多糖、脂类 是某些病毒在成熟过程中穿过宿主细胞，以出芽方式向宿主细胞外释放时获得的，含有宿主细胞膜或核膜成分。 有包膜的病毒体称为包膜病毒，无包膜的称为裸露病毒。 包膜的主要作用：维持病毒体结构的完整性。 核衣壳：1、核心：核酸 2、衣壳：包绕在核酸外面的蛋白质外壳。衣壳具有抗原性，是病毒的主要抗原成分，可保护病毒核酸免受环境中核酸酶或其他影响因素的破坏，并能介导病毒进入宿主细胞。有以下类型：螺旋对称性，20面体对称性，复合对称性。 二、病毒的化学组成和功能 1、病毒核酸：DNA或RNA，是主导病毒感染、增殖、遗传、变异的物质基础。部分核酸偶感染性。 2、病毒蛋白质：病毒的主要成分，约占病毒体总重量的70%，由病毒基因组编码，具有病毒的特异性。 3、脂类和糖：脂质主要存在包膜中。
病毒的致病作用 一、病毒感染的传播方式 病毒感染的传播方式有水平传播和垂直传播 二、病毒感染的致病机制 ㈠对宿主细胞的致病作用 1、杀细胞效应： 2、稳定状态感染：不具有杀细胞效应的病毒引起的感染 ⑴细胞融合：其结果是形成多核巨细胞或合胞体。 ⑵细胞表面出现病毒基因编码的抗原：病毒感染的细胞膜上常出现病毒基因编码的新抗原。 3、包涵体形成： 4、细胞凋亡： 5、基因整合与细胞转化： ㈡病毒感染的免疫病理作用 通过与免疫系统相互作用，诱发免疫反应损伤机体。 1、抗体介导的免疫病理作用：病毒的包膜蛋白、衣壳蛋白均为良好的抗原，能刺激机体产生相应抗体。 2、细胞介导的免疫病理作用： 3、致炎性细胞因子的病理作用： 4、免疫抑制作用：某些病毒感染可抑制免疫功能。 ㈢病毒的免疫逃逸
病毒学1-10章复习题 一、填空题： 1、病毒的最基本结构是由_病毒核酸__和_病毒蛋白_____构成，其辅助结构是_包膜及突起_____。 2、构成病毒体的主要化学成分是_核酸_____和___蛋白质___。 3、病毒体结构由__髓核____和___衣壳___组成，又称为__核衣壳____。 4、病毒衣壳的对称形式有__螺旋对称____、___二十面体对称___、___复合对称___。 5、病毒合成的蛋白质主要包括___结构蛋白____和___功能蛋白___两类。 6、通常将___mRNA___的碱基排列顺序规定为正链(+ RNA ), 其相应的___模板___链则为负链(- DNA )。 7、病毒复制周期中感染细胞的第一步是___吸附___，与隐蔽期有关的是__生物合成____。 8、病毒的增殖方式是__复制____，病毒在细胞内增殖导致的细胞病理变化称为__致细胞病变效应____。 10、病毒合成的蛋白质主要包括___结构蛋白____和___功能蛋白___两类。 11、无包膜病毒体多数通过___细胞裂解___释放，有包膜病毒体主要通过___出芽___方式释放。 12、病毒的复制周期包括__吸附____、__侵入____、___脱壳___、___生物合成___和___组织释放___五个阶段。 13、动物病毒的侵入主要通过___注射式侵入___、___细胞内吞___、___膜融合___和___直接侵入___四种方式。 14、病毒进化的基础包括___突变___、___重组___、___重排___和___基因重复___。 15、病毒的持续性感染包括___慢性感染___、___潜伏感染___和___慢发病毒感染___三种，水痘-带状疱疹病毒可发生__潜伏____感染，而亚急性硬化性全脑炎则属于___慢发病毒___感染。 16、从细胞受到凋亡诱导因素的作用到细胞死亡大致可分为__凋亡的信号转导___、__凋亡基因激活___、__凋亡的执行___和__凋亡细胞的清除___四个阶段。 17、杆状病毒编码的两种抗细胞凋亡基因分别为__IAP基因___和__p35基因___。 18、IAP家族蛋白的结构特征为__杆状病毒IAP重复___和__环锌指结构___。 19、免疫应答分为B细胞介导的__体液免疫___和T细胞介导的___细胞免疫__。 20、病毒感染动物后会出现干扰现象，其主要原因是____诱导细胞产生了干扰素_______ 。 21、病毒感染成功的基本条件包括__病毒的感染性___、 __合适的感染途径____和___宿主机体的易感性___。 22、动物对病毒感染的免疫方式包括___特异性免疫___和___非特异性免疫___，其中__特异性免疫___又包括___体液免疫___和___细胞免疫___。 23、干扰素诱导细胞产生的两种抗病毒翻译途径为___通过2’-5’寡A合成酶和RNaseL降解病毒mRNA ___和___借助蛋白激酶PKR，阻断病毒蛋白翻译的起始___。 二、选择题： 1、病毒囊膜的组成成分是__A___ 。 A. 脂类 B. 多糖 C. 蛋白质 2、病毒含有的核酸通常是__B___。 A. DNA和RNA B. DNA或RNA C. DNA D. RNA 3、对于病毒单链DNA而言，可直接作为转录模板的链是__B___。 A. 正链DNA B. 负链DNA C. 双义DNA 4、决定病毒体感染细胞的关键物质是__B___。 A．衣壳 B．包膜 C．核酸 D．刺突 E．核蛋白 5、病毒包膜的特点不包括__B___。 A．来源于宿主细胞 B．镶嵌有细胞编码的蛋白 C．可被脂溶剂溶解 D．决定病毒感染细胞的宿主特异性E．具有抗原性 6、在溶源细胞中, 原噬菌体以_C_状态存在于宿主细胞中。 A 游离于细胞质中 C 缺陷噬菌体 D 插入寄主染色体 7、逆转录RNA病毒的基因组是__B___。 A．单倍体 B. 双倍体 C. 三倍体 8、细胞融合有利于病毒的__C___。 A.吸附 B.脱壳 C.扩散 D.复制 E.释放 9、RNA病毒突变率远高于DNA病毒，主要原因是__C___。 A 病毒分子量小 B 病毒增殖快 C 宿主和病毒无校对修正机制 10、子代病毒释放的途径中不包括 __E___。
病毒学题库 一.填空题（10分） 1.第一个提出病毒概念的是：贝杰林克（Martinus Beijerink）。（病毒学之父） 2.病毒的特点有：没有细胞结构、仅有一种类型的核酸、特殊的繁殖方式、缺乏完整的酶系统和能量合成系统，也没有核糖体、绝对的细胞内寄生。 3.病毒的对称性有：螺旋对称、二十面体对称、复合对称、复杂对称。 4.病毒的复制过程有：吸附、侵入、脱壳、病毒生物大分子的合成、装配和释放。 5.肝炎病毒有：甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。 6.昆虫病毒杀虫剂的缺点有：杀虫速度缓慢、病毒特异性强，寄主范围窄。 ★7.第一个发现病毒的人是：法国人Adolf Mayer 。 ★8.病毒的宿主有：微生物、植物、动物。 ★9.病毒的核酸类型有：双链DNA（dsDNA）、单链DNA（ssDNA）、双链RNA（dsRNA）、单链RNA（ssRNA）。 ★10.病毒突变体的种类有：条件致死突变体、蚀斑突变体、抗原突变体、共变体、适应新宿主突变体。 ★11.人畜共患的病毒有：流感病毒、狂犬病毒、朊病毒。 ★12.艾滋病病毒的主要传播途径有：性传播、血液传播、垂直传播。 ★13.昆虫病毒杀虫剂的优点有：对人畜（人体、畜禽、鱼虾等）安全无害，不会造成环境污染问题、病毒的宿主特异性高、昆虫病毒使用后效果明显。 二.判断改错题（少了大约11题左右，10对10错，共15分） 1.判断（描述）病毒的大小常用的单位是微米。（×，微米→nm或?） 2.病毒分类系统中“种”作为最小的分类单位。（√） 3.病毒的突变只是指自发突变。（×，病毒的突变可分为自发突变和诱发突变） 4.病毒的非增殖性感染有流产感染，限制性感染和潜伏感染。（√） 5.HIV核心为两条单链DNA构成的双体结构，并含有反转录酶。（×，DNA→RNA） 6.传染性非典型肺炎又称为严重急性呼吸综合症，是一种由冠状病毒感染所引起的急性呼吸道传染病。（√） 7.流感病毒的宿主限制性不是很严格，能跨越种属传播。（√） 8.流感病毒主要通过呼吸道传播，且病毒极易变异，往往造成世界性大流行，甚至爆发流行。（√） 9. 狂犬病只发生在犬和人身上，其他动物很少发生。（×，狂犬病病毒感染所有温血动物）★10.HBsAg阳性，乙肝。（） 三.名词解释（共5题，每题4分，共20分） 1.病毒基因重组：两种不同病毒感染同一细胞时，发生遗传物质（核酸）的交换，称为（病毒）基因重组，其子代称为重组体。 ★2.病毒隐码:描述病毒性质的一系列符号。包括核酸的类型、链数、分子量大小，病毒粒子的形状，宿主传播介质等。【有四对符号，包括核酸类型/核酸链数，核酸分子量（×106）/病毒粒子中含核酸的百分率，病毒粒子的外形/病毒被壳的外形，寄主种类/传播介体种类（或传播方式）】 3.缺损病毒：是指基因组上一个或多个病毒自我复制必需基因功能缺乏，它的复制需依赖其它病毒基因或基因组的辅助活性，否则在活的允许细胞内也不能完成复制。有些病毒因基因
病毒学1-10 章复习题 一、填空题： 1、病毒的最基本结构是由_病毒核酸__和_病毒蛋白___ 构成，其辅助结构是_包膜及突起____ 。 2、构成病毒体的主要化学成分是_核酸____ 和___蛋白质___。 3、病毒体结构由__髓核__ 和___衣壳___组成，又称为__核衣壳_ 。 4、病毒衣壳的对称形式有__螺旋对称__ 、___二十面体对称___、___复合对称___。 5、病毒合成的蛋白质主要包括___结构蛋白___ 和___功能蛋白___两类。 6、通常将___mRNA___的碱基排列顺序规定为正链(+ RNA ), 其相应的___模板___链则为负链(- DNA ) 。 7、病毒复制周期中感染细胞的第一步是___吸附___，与隐蔽期有关的是__生物合成___ 。 8、病毒的增殖方式是__复制__ ，病毒在细胞内增殖导致的细胞病理变化称为__致细胞病变效应____ 。 10、病毒合成的蛋白质主要包括___结构蛋白__ 和___功能蛋白___两类。 11、无包膜病毒体多数通过___细胞裂解___释放，有包膜病毒体主要通过___出芽___方式释放。 12、病毒的复制周期包括__吸附____ 、__侵入___ 、___脱壳___、___生物合成___和___组织释放___五个阶段。 13、动物病毒的侵入主要通过___注射式侵入___、___细胞内吞___、___膜融合___和___直接侵入___四种方式。 14、病毒进化的基础包括___突变___、___重组___、___重排___和___基因重复___。 15、病毒的持续性感染包括___慢性感染___、___潜伏感染___和___慢发病毒感染___三种，水痘- 带状疱疹病毒可发生__潜伏感染，而亚急性硬化性全脑炎则属于___慢发病毒___感染。 16、从细胞受到凋亡诱导因素的作用到细胞死亡大致可分为__凋亡的信号转导___、__凋亡基因激活___、__凋亡的 执行___和__凋亡细胞的清除___四个阶段。 17、杆状病毒编码的两种抗细胞凋亡基因分别为__IAP 基因___和__p35 基因___。 18、IAP 家族蛋白的结构特征为__杆状病毒IAP 重复___和__环锌指结构___。 19、免疫应答分为B细胞介导的__体液免疫___和T 细胞介导的___细胞免疫__。 20、病毒感染动物后会出现干扰现象，其主要原因是_____ 诱导细胞产生了干扰素______ 。 21、病毒感染成功的基本条件包括__病毒的感染性___、__ 合适的感染途径___ 和___宿主机体的易感性___。 22、动物对病毒感染的免疫方式包括___特异性免疫___和___非特异性免疫___，其中__特异性免疫___又包括___体液免疫___和___细胞免疫___。 23、干扰素诱导细胞产生的两种抗病毒翻译途径为___通过2'-5 '寡A合成酶和RNaseL降解病毒mRNA_ __和___ 借助蛋白激酶PKR，阻断病毒蛋白翻译的起始___。 二、选择题： 1、病毒囊膜的组成成分是__A___ 。 A. 脂类 B. 多糖 C. 蛋白质 2、病毒含有的核酸通常是__B___。 A. DNA 和RNA B. DNA 或RNA C. DNA D. RNA 3、对于病毒单链DNA而言，可直接作为转录模板的链是__B___。 A. 正链DNA B. 负链DNA C. 双义DNA 4、决定病毒体感染细胞的关键物质是__B___。 A．衣壳 B ．包膜 C ．核酸 D ．刺突 E ．核蛋白 5、病毒包膜的特点不包括__B___。 A．来源于宿主细胞 B ．镶嵌有细胞编码的蛋白 C ．可被脂溶剂溶解 D ．决定病毒感染细胞的宿主特异性E．具有抗原性6、在溶源细胞中, 原噬菌体以_C_状态存在于宿主细胞中。 A 游离于细胞质中 C 缺陷噬菌体 D 插入寄主染色体7、逆转录RNA病毒的基因组是__B A．单倍体 B. 双倍体 C. 三倍体 8、细胞融合有利于病毒的__C A. 吸附 B. 脱壳 C. 扩散 D. 复制 E. 释放 9、RNA病毒突变率远高于DNA病毒，主要原因是__C A 病毒分子量小 B 病毒增殖快 C 宿主和病毒无校对修正机制 10、子代病毒释放的途径中不包括__E