综述·
肿瘤相关基因分析方法
同济医科大学附属协和医院《武汉430030)胡慈综述易粹琼王家耽审校
肿瘤的发生发展是多因素多基因长期作用的结果。克隆
肿瘤相关荃因的方法有多种，且根据不同的分类有不同的侧重
点。本文以研究对象水平的不同概括为三大类:第一类从DNA
水平入手;第二类以mRNA水平为基础;第三类以蛋白质水平
为基础。
以DNA水平为甚础
肿瘤相关基因改变的类型多种多样。有的基因在基因组
结构上发生改变，如发生基因重排，抗癌基因丢失，原癌基因突
变等。从DNA水平入手即可克隆这类基因。方法分述于下。
1.1定位克隆 定位克隆是当前克隆肿瘤
易感基因的一条主要途径。它的一般程序包括:首先采用分离
分析确定疾病的遗传方式，然后通过对家系进行连锁分析把遗
传易感基因定位在染色体的特定区带，再通过染色体步移或染
色体跳步获取覆盖这一区域的DNA克隆群并在此基础上获得
候选基因的cDNA片段，最后分析这些候选基因在患者和其它
家系成员中体细胞和生殖细胞的突变情况以找到真正的肿瘤
易感基因。
1.1.1基因在染色体上的定位这是关键性的步骤，工作量
较大，周期也较长。大部分类型肿瘤为多基因疾病，基因之间
相互作用方式难以预测，需大量精确的家系资料。
基因定位的主要手段是连锁分析，即通过基因与染色
体上多态性DNA标记之间的重组系数来估计两者之间的距
离。用于定位克隆的DNA标记包括限制性片段长度多态性
(RFLP)、可变数目窜联重复闭、徽卫星DNA等。这是经典的遗传学方法，得出的定位结果较精细，
但要求两代以上的系谱材料为基础，且不适合研究微效基因，
于是关联分析方法应运而生。该方法不要求大的家系，只需在
患者和他们的双亲中进行研究，也适合微效基因的定位，如
PTC基因的定位。
1.1，2获取覆盖候选区域的cDNA片段cDNAR的筛选可先
通过计算机预测然后进行实验确定。将肿瘤相关基因定位在
染色体上某一局限位置后检索GENBANK核酸和蛋白质数据库
并与其它种类生物同很序列相比较以寻找候选的cDNA序列。
另外也可直接通过实验确定有关的表达序列，如杂交吸附筛选
法、外显子捕获法、CpG岛筛选法、直接用
基因组DNA与cDNA文库杂交法、外显子扩增法、种间同镇序
列杂文法、筛选剪接位点法、编码序列富集法、直接筛选PCR
法等。每种方法各有长处也各有缺陷，需联合使用几种方法
才能完全筛选到候选区域存在的。DNA序列。
1.1.3基因功能的鉴定
在获取候选区域的cDNA后要逐个
检测它们在患者及其它家系成员中体细胞和生殖细胞改变的
情况，对
基因编码蛋白质的氮基酸序列进行分析，以进一步鉴
定其功能，并可行转基因或基因敲除来分析与肿瘤的关系。
1.2代表性差异分析
RDA采用识别六碱基的限制性内切酶消化基因组DNA，
将其复杂性降低，再通过多轮消减杂交结合PCR反应使差异性
的靶基因片段得以大量富集。
1.2.1接头和引物的设计需设计几对一长一短的两个寡核
苷酸片段连接于酶切后的DNA片段的末端。其中长的作为相
应的PCR引物，一对制备扩增子，另外2一4对用于杂交和扩增
过程之中。相连的两轮PcR反应中不能用相同的一对接头。
1.2.2制备扩增子 扩增子是DNA经限制性内切酶消化后
连上接头并经PcR扩增的片段。它具有两个特点:其一，大大
降低了基因组的复杂性，使扩增效率提高;其二，将驱赶子于检
测子之间的差异转化为限制性内切酶位点之间的差异，从而可
将制备的探针用于遗传学分析或基因定位等方面。
1.2.3差异性富集它是动力性富集和PcR两方面的结合。
反应开始时检测子和过量的驱赶子变性杂文，在这一过程中靶
序列即成动力性富集。然后进行PCR反应，驱赶子中缺乏存在
于检测子中的靶序列，反应的结果是同聚体两端由于有两个接
头故呈指数扩增，而杂交体只有单链有接头故呈线性扩增。这
样经过多富集靶序列得以显著增加。
1.3比较基因组杂文
它是一种荧光原位杂交技术。它采用等量肿瘤基因组DNA和正常对照基因组DNA作为探针与正常人中期染色体标本进行原位杂交，然后根据荧光信号强度差异找出基因组中差异区域，将荧光显微镜与电脑彩色图象分析系统连接，对两种萤光比值进行定量。它对于实体瘤基因组水平上的研究有重要价值。然而，CGH不能检测平衡易位、重排及其它没有拷贝数变化的异常，而且依赖于扩增水平的高低及受累区域的大小，因此需同其它
遗传学技术相结合。
1.4AP.PCR
它是在对所扩增的基因序列一无所知的情
况下，采用随机设计的一或两个非特异性引物，在高镁离子浓
度、低复性温度条件下使引物与模板DNA中许多序列通过错
配而复性。如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物
存在则可使二者之间的DNA片段得以扩增。扩增产物经电泳
分离可得到DNA指纹图。通过对不同来源基因指纹图的比较
即可找出差异片段。AP.PcR是一种半定量的方法，不仅可用
于检测基因结构的变化，而且能检测出多倍体及杂合性变化。
运用它已成功地分离出结直肠相关基因、食管癌相关基
因。Ap-pcR依赖于遗传物质改变的性质和程度，它很难检
测单一染色体上的断裂位点，而一个染色体臂的缺失就易于检
测。
2从RNA水
平出发
某些肿瘤相关基因在结构上并未发生改变，而是在表达上
发生改变。表现在n1RNA水平上的过度表达或表达量降低。
从mRNA水平出发可能发现这些基因的异常。
2.1消减杂交
2，1.1经典的cDNA消减杂交
cDNA消减杂交是分离差异表达基因的一种有效途径。
通常将Tester与过量的加DRIvermRNA(cDNA)杂交，然后用经基
磷灰石亲和层析、扰生物素蛋白一生物素结合、
OLIGO(dT)-乳汁磁
珠等方法分离未杂交上的成分。该方法的缺点是对低丰度转
录本的分离效率很低，且步骤多，工作量大。
2.1.2cDNA.RDA RDA也可用于克隆差异表达的CDNA。它采用识别四碱基的限制性内切酶代替识别六碱基的限制性内切酶，这样可以彻底消化基因组DNA，使同源序列彻
底消减，降低假阳性率。它还便于迅速克隆和分离全长。DNA
序列。它可根据表型的差异来确定引起差异的基因，从而建立
一个相对完整的表达图谱。然而它不能解决各类mRNA丰度
差别问题，仍需进行多轮消减。
2.1.3抑制性消减杂交(s叩p~onsubtractivehyb‘dizateon，
骆H)邓H是一种新的以PCR反应为基础的cDNA消减杂交
方法。它通过合成两个不同的接头(该接头含有一段反向末端
重复序列)，接于经限制性内切酶消化后的。DNA片段5’末端，
以选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA扩增。
这种抑制PCR反应是由于相同的接头因为末端的长反向重复
序列形成回柄状结构而不被扩增，只有不同的接头才可能呈指
数扩增。该方法的另一优点是归一化过程。在第一次杂交过
程中由于杂交二级动力学的原因，高丰度的转录物易退火，从
而使序列丰度标准化。实验证明只需一轮消减即可对稀少转
录物富集1000一5000倍。Lud。〕atchenko等运用该方法分
离出组织特异性CDNA〔’8]。其基本实验过程如下:
(l)合成dscDNA:提取待比较的两组织的mR队，用01190
(dT)将其反转录为。DNA。体系中加入几DNA聚合酶以产生
平头cDNA。
(2)准备Tester:用RSal或Haelll限制性内切酶将dsDNA
切成短片段并分为两组，分别连上接头1、2o
(3)准备Driver:只需用上述酶切，不需添加接头。
(4)消减杂交:分别向两个Tester样品中加入过量的加ver
进行杂交。第一轮杂交完毕后将二者混合，再加入份ver继续
杂文以获得差异表达序列。
(5)PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是
要找的差异表达基因。第一次PCR反应以两个接头的5’端作
引物扩增，然后再用两个接头的3’端作引物再次扩增以进一步
消除背景序列的干扰。
(6)以PCR与对比组织的n1RNA进行Northern印迹，或与
cDNA文库进行氏unthern印迹杂交以确定差异片段的特异性。
对阳性片段进行测序分析并鉴定
其身分。
该方法简便易行，灵敏度高，假阳性率低，周期短，而且可
利用非克隆的消减cDNA混合物作为杂交探针筛选YAC、BAC
或005重叠群，快速识别可能的差异表达基因。将SSH与高
效地差异筛选结合可以快速有效克隆稀有差异表达基因。
2.2差异杂交(〕11erentialh如ridization)基本原理是将不同
来源的cDNA固定于一定载体上，用同一种mRNA探针杂交后
比较其密度差，或将不同来源的探针与固定于载体上的同一
cDNA群杂交比较密度差异。将cDNA固定于滤膜又叫高密度
eDNA滤膜分析(Highdensity。nNAfilteranal”15，HDC-
以)L191。近年来发展起来的DNA芯片技术即建立在差异杂交
的基础上。将两种探针标上不同颇色的荧光素，与同一DNA
芯片杂交后可根据荧光颜色用计算机分析判断结果。平方厘
米大于1000个cDNA的排列密度使在一个杂交反应中定量估
计大量基因成为可能。
2.3R队指纹法(R漱fingerp对nting)RNA指纹法包括
MDn(叔队differenti以di即lay)[20]和RAp.咒R(RNAarbitr面-
lyprim记PcR){2飞1。
2.3.1MDD:该方法利用真核生物大多数mRNA的3’端都具
有Poly(A)尾，且紧靠Poly(A)的两个碱基除去倒数第一位A的
组合外只有12种组合的特点，与此相对应地设计出能与上述
12种组合互补的引物如5’一TllCA-3’等。该引物很盖1/12mR-
NA群体.能锚定于Poly(A)上游含有TG的mRNA亚群。若改
变引物3’端的两个碱基则可对不同的mRNA亚群进行反转
录。接着在有3’端引物存在的条件下，加入一个5’端的随机引
物对cDNA亚群进行PCR扩增，可得到来自同一mRNA亚群
中不同mRNA的扩增产物，但只能反录l/12的mRNA亚群。
1994年Liang等又设计出单碱基锚定的011沙dT引物如5’-
T12G3’，每种引物参与1/3的m只NA亚群的反转录从而减少
反转录次数，降低假阳性率。如果将扩增产物电泳分离即可得
到RNA的指纹图，并可从中找出差异显示的cDNA片段，从琼
脂凝胶上纯化这些cDNA片段，进行序列分析或作为探针杂文
基因文库可筛选到全长基因。
2.3.2R月井.PCR:该法采用随机引物进行逆转录。随机引物
选择性地与RNA内部某些区域结合，随后再进行PCR反应。
这一方法可针对RNA任何区域，包括开发阅读框(ORF)，还可
用于分析不带Poly(A)+的RNA如许多细菌RNA，但是稀有90
RNA的扩增产物可能不易观察。采用嵌套引物的RNA指纹法
可以提高获得稀有RNA的可能性〔川。它以第一次PcR产物
的一小部分作为模板，采用嵌套引物(比第一次扩增引物3’端
增加一个或数个随机碱基)再扩增，这样多出的碱基对原来的
产物进行选择，使那些配对较好但因丰度太低的成分可能被观
察到。为进一步提高其灵敏度，还可将cDNA结合在磁珠上进
行扩增
即固相差示PCR，它所需的mRNA量极少;为提高实验
特异性，可用不同浓度的同一样本作RNA指纹图，只有在多个
浓度下均存在的差异片段才值得考虑。
2.4基因表达的系列分析法(决‘alanalvsi，ofgeneexpre吧IOn，
SAGE)SAGE是最近发展起来的鉴定差异表达基因的方
法[231。HOpkins大学研究小组首先将sAGE用于分析在人类胰
腺表达的基因。他们先从胰腺组织中提取总m卫NA，继之得到
原腆腺基因的cDNA，同时用一种生物素分子标记cDNA的3’
末端，随后用一种限制性内切酶切割cDNA，接着用另一种限制
性内切酶将上述DNA片段切割成至少含9一10饰的DNA标
签片段，再用PCR扩增上述每一标签片段，将30一50个不同的
标签片段连成一个单一的DNA分子，最后克隆并测序这些分
子。该方法不仅可以显示哪些基因在该组织中表达，而且可以
显示它们表达水平的高低。每一个标签片段出现的次数是反
映该荃因表达水平高低的指数。该方法通过与自动测序及大
量表达序列标签相连，能够对大量基因的表达变化进行枪测，
具有经济准确的特点。
3从蛋白质水平出发
从已知功能的蛋白质入手是最早用于克隆基因的方法。
对于一些肿瘤相关基因，首先发现其蛋白质，通过推测的部分
核酸序列，利用计算机进行同源性比较和匹配分析，筛选cDNA
文库:或在已知扰体的情况下用杭体筛选表达序列标志数据库
(ExPr画on傲习encetag，EST);或采用cDNA末端快速扩增法
(RaPidam仙ficat汤ofcDNAends，RACE)以获得相应的CDNA，
进而筛选基因组文库以获得全长基因。
分析不同类型细胞中表达的蛋白质可通过ZD凝胶电泳来
实现。细胞抽提物在电泳过程中蛋白质个体首先依据所带电
荷，然后依据分子大小而被分离。电泳结果呈一幅由1000一
3000个斑点组成的特征图，每一个斑点代表一个单一蛋白质。
它在大体上不仅显示了蛋白质的量而且显示了它们已经进行
的许多翻译后修饰。质谱仪可帮助人们将所研究的蛋白质与
数据库中的资料进行对比分析，还能给出部分肤链的序列。至
少从理论上来说，将每一茶ZD凝胶斑点与编码该斑点的基因
联系起来是可能的。通过密切研究这些基因的功能，可以寻找
出新的诊断工具，如针对某种肿瘤的标记蛋白质。
人类基因组计划(H~ngeDomeproject，HGP)的目的是破
译人类基因组3x109个核昔酸的序列，阐明所有人类基因及
其在染色体上的位置，是生物领域的一项重大工程。美国于
1990年正式启动，预计到2005年完成全部序列的测定。随着
各种新技术的诞生和运用，越来越多的疾病相关基因得到分
离。目前分辨率为0.7cm的遗传作图与分辨率为100kb的物
理图已提
前完成，现已进入大规模测序阶段。在测序完成以
后，主要任务便是功能荃因组的研究，即研究各基因的功能及
其表达规律，并将其运用于疾病的预防、诊断和治疗之中。
目前仍然没有一个学说可以完整地阐述HE的发生。普遍
认为HE的发生是体内多种毒素协同作用的结果，至少已有10
余种毒素被认为与HE的发生有关。其中氨毒性被认为起着关
键性的作用。但早在60年代人们就注意到血氮的水平与HE
的严重程度并不完全一致，甚至在某些肝昏迷患者中血氨水平
也并不升高。70年代末中枢苯二氮革受体的发现和该受体对
中枢神经系统作用的研究，以及80年代末内源性物质致病假
说的提出，使众多实验室致力于内源苯二氮类物质的提取与分
离，但直至目前仍无令人满意的结果。不少作者认为，HE的发
生是多因素协同作用的结果。
1.1天然苯二氮革类物质的作用有人认为，中枢笨二氮革
类物质的配体并不是在体内合成，而是存在于食物之中或由肠
道微生物合成的。在肝功能正常的情况下，这些外源性配体绝
大部分被肝脏代谢清除，极少通过血循环进入中枢神经系统，
但在肝脏严重受损时，这些物质积聚于血循环，进入中枢神经
系统刺激笨二氮革受体而导致HE的发生。血中的苯二氮革
类物质主要来源子胃肠道，这已为肠道非吸收抗生紊去污实验
所证实。最近户而皿场ne等川通过对90例健康志愿者和113例
肝硬化患者进行了血清苯二氮革类物质测定后发现，肝硬化不
伴有HE的59例患者在有49例阳性，而肝硬化伴有HE的54
例患者中49例阳性，仍有7%的患者低于可测定水平。作者认
为在肝硬化发生过程中伴有血清苯二氮革类物质的积聚，其升
高程度与肝功能减退程度相关，而与HE的程度无明显的相关
性，并认为该类物质对中枢神经系统的作用取决于中枢神经系
统的功能状态，同样的浓度对正常人可能无作用，但在其它毒
素对中枢神经系统已经易化的情况下则可导致HE的发生。
1.2氮与臼铂A协同作用氨毒性和GABA能神经传递功能
增强被认为是导致11E发生的两个主要因素。动物实验证实，
氨对中枢神经系统具有显著的兴奋作用，这虽然可以解释部分
HE患者有惊厥的发生，但临床大部分HE患者表现为中枢功
能的抑制而不是兴奋。
GABA是哺乳类动物脑内主要的抑制性神经递质，其受体
在神经细胞膜上与苯二氮革受体和氛离子通道蛋白相偶联存
在。GABA受体活化后导致氯离子通道的开放与抑例性突触后
电位的产生，进而引起中枢抑制，这被证实与于正时运动功能障
碍和意识状态低下有关。肝性脑病时引起G八卫A能神经元紧
张度
增加的机制有:①脑内天然笨二革类物质浓度增加;②血
脑屏障通透性增加和0铂A受体密度的降低，导致GABA在突
触间隙内积聚。神经电生理和行为测试显示，氨浓度在0.75一
2mM时可增强神经传导能力，相反，当氮浓度在0.15一0.75
mM时(通常见于甩昏迷前期)可:①促进培养神经细胞膜
GABA诱导的氧离子跨膜流动;②增强GABA与其受体的结
合;③增加星型细胞神经固醉的合成，而某些神经固醉可强化
GABA能神经元传导能力t2]。KanekO等[3]发现，当血氨浓度超
过0.1一。.5尸mo口L时即可以促进G八丑A门控抓离子通道的开
放而增强GAI认的中枢抑制作用，这种抑制作用并不能被苯二
氮革类受体拮抗剂所逆转。当血氮浓度在50一100尸咖口L时
可增强苯二氮革类物质与其受体的亲和力，间接增强其中枢抑
制作用，提示血氮浓度的升高可增强GABA的中枢抑制作用。