第一章基因工程
第一节基因工程概述
由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。
二．基因工程的基本工具
（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（二）“分子针线”——DNA连接酶
1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类
2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键
②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；
T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。
(三)“分子运输车”——载体
1.载体具备的条件：
①能在受体细胞中复制并稳定保存；
②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
2.基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。
最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。
三．基因工程的基本过程
(一) 获得目的基因（目的基因的获取）
1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。
②用人工的方法合成。
★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
2.利用PCR技术扩增目的基因
（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
（2）目的：获取大量的目的基因
（3）原理：DNA双链复制
（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；
第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。（5）特点：指数形式扩增
(二) 制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）
1．重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。
★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。
(三)转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）
1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法：
①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法），其次
还有基因枪介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉
管通道法）。
②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
③将目的基因导入微生物细胞：Ca＋处理法。
(四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）
1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。
3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。
第二节基因工程的应用
1．运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。2．基因工程的应用
（1）植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
（2）动物基因工程：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体等。
（3）基因诊断和基因治疗：
基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。
基因治疗：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。
实例：ADA基因缺陷症的基因治疗
第三节蛋白质工程
1．蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。
2．蛋白质工程的基本原理
预期蛋白质功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）→具有预期功能的蛋白质
3.蛋白质工程的应用
（1）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。
（2）合成嵌合抗体。（3）改变蛋白质的活性。
细胞工程
（一）植物细胞工程
1.理论基础（原理）：细胞全能性
全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；
植物细胞＞动物细胞
2.植物组织培养技术
（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试
管苗―→植物体
（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、
细胞产物的工厂化生产。
（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种
的最后一道工序。
3.植物细胞培养（苏教版）
（1）概念：在实验室工厂化生产的条件下，将组织培养过程中
形成的愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行悬
浮培养，得到分散游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，
从而获得大量的细胞群体的一种技术。
（2）与植物组织培养的关系
①植物组织培养是基础。
②目的不同：植物组织培养的目的是得到更多的植物体，植
物细胞培养的目的是获得人类所需的细胞
（3）实例：成功地培养红豆杉的细胞，从中提取出重要的抗
肿瘤药物——紫杉醇。
4.植物体细胞杂交技术
（1）过程：
（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。
（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
（二）动物细胞工程
1. 动物细胞培养
（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
（4）动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防
培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞
自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、
血浆等天然成分。
③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研
究的各种细胞。
2.动物组织培养（苏教版）：动物细胞培养与动物组织培养方法类似，主要区别是动物细胞培养过程中需要用胰蛋白酶等使组织块中的细胞离散，而动物组织培养过程中不需要使用胰蛋白酶等。
3.动物体细胞核移植技术和克隆动物
（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。
（3）体细胞核移植的大致过程是：
核移植
胚胎移植
（4）体细胞核移植技术的应用：
①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；②保护濒危物种，增大存活数量；
③生产珍贵的医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植等。
（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。4.动物细胞融合
（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。
（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。
（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
（2）单克隆抗体的制备过程：
（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
（5）单克隆抗体的作用：
①作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准
确、高效、简易、快速的优点。
②用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治
疗其它疾病。
基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。 质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。 从细胞中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 溶菌酶：破坏菌体细胞壁；SDS和Triton X-100：使细胞膜裂解。 染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。 基因组DNA的提取 植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，异丙醇—沉淀DNA（提染色体），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加盐，70%乙醇—漂洗。 细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。 总RNA制备 mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。 RNA酶抑制剂：DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）SDS, 尿素等。 细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先将组织在液氮中研磨成粉末） 异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。 酚/SDS法：用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA 和其它不纯物。 Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。 mRNA提取 制备mRNA原理：分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。 琼脂糖凝胶电泳 DNA凝胶电泳：琼脂糖-- 分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
高中生物选修三基因工程知识点 基因工程：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果： 经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 （2）与DNA聚合酶作用的异同：
（2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程： 第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数(2^n)形式扩增 第二步：基因表达载体的构建(核心) 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法：
第二章Enzymes 第四节DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。 三、连接反应的机理 1、A TP（NAD+)提供激活的AMP。 2、A TP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口” 四. 两种DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端） 2. T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！ 五.Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端； 2. 平末端； 3. 平末端加尾； 4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1．粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍！ 解决方法：化平末端为粘性末端 3. 平末端连接---同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶 功能：5’至3’单链聚合 作用特点：单链；无模版 作用机理： a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dA TP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。缺点： 当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接 ---衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA 接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用： 寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA） 连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR） 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理: 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 精品文档
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。 同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点： 相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶 第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源DNA的载装能力； 具有多克隆位点（MCS）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
第一章基因克隆 基因工程的基本技术有哪些？ 答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。 构建基因文库一般使用什么作为载体？ 答：一般使用大肠杆菌作为载体 克隆与亚克隆？ 答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？ 答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。 第二章分子克隆工具酶 限制与修饰系统？ 答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。 使用最广泛的限制酶？ 答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶 限制性内切酶的命名？ 答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。 如：HindIII 限制与修饰系统分类？ 答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。 限制酶识别的序列长度？结构？
答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列 限制酶产生的末端？ 答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端 什么是同裂酶？分类？ 答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他 限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？ 答： 什么是同尾酶？ 答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。 酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？ 答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。 酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。 什么星星活性？抑制其发生的办法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。 影响酶活性的因素有？ 答：可分为内因和外因 外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。 内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋） 原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？ 答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
基因工程基础知识梳理（二） 三、基因工程的应用 ．植物基因工程的成果 提高农作物的＿＿＿＿＿能力、改良农作物的品质、利用植物生产＿＿＿＿＿等。 （ ）抗虫转基因植物 ①方法：将＿＿＿＿＿导入植物体，使其具有抗虫性。 ②成果：各种抗虫作物，如抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米等。 ③意义：减少＿＿＿＿＿，降低生产成本，减少环境污染。 ④主要杀虫基因：＿＿＿＿＿、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。 （ ）抗病转基因植物 ①方法：将＿＿＿＿＿导入植物体中，使其具有抗病特性。 ②成果：多种抗病作物，如抗病的烟草、小麦、甜椒、番茄等。 ③意义：提高作物抗病力，增产。 ④主要抗病基因：抗病毒的＿＿＿＿＿和病毒的复制酶基因；抗真菌的＿＿＿＿＿ 基因和抗毒素合成基因。 （ ）抗逆转基因植物 ①方法：将＿＿＿＿＿基因导入植物体，获得抗逆作物。 ②成果：多种抗逆植物，如抗盐碱和干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂大豆和玉米等。 ③意义：提高作物抗逆能力，稳定高产。 ④主要抗逆基因：抗盐碱、抗干旱的＿＿＿＿＿基因、耐寒的＿＿＿＿＿基因、抗除草剂基因。 （ ）利用转基因改良植物的品质 ①方法：将优良性状基因导入植物体，获得＿＿＿＿＿。 ②成果：＿＿＿＿＿含量较高的玉米、耐储存番茄、新花色的矮牵牛。 ③意义：改良植物的某些品种。 ④主要优良性状基因：＿＿＿＿＿的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因、与植物花青素代谢有关的基因。 ．动物基因工程的成果
（ ）提高动物的生长速度 ①生长基因：外源＿＿＿＿＿基因。 ②成果：转基因绵羊、转基因鲤鱼。 （ ）改善畜产品的品质 ①优良基因：肠＿＿＿＿＿基因。 ②成果：转基因牛乳汁中＿＿＿＿＿含量少。 （ ）转基因动物生产药物 ①基因来源：药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的＿＿＿＿＿。 ②成果：乳腺生物反应器。 （ ）转基因动物作器官移植的供体 ①器官供体：抑制或除去＿＿＿＿＿。 ②成果：利用＿＿＿＿＿培育没有免疫排斥反应的猪器官。 ．基因工程药物 （ ）来源：转基因＿＿＿＿＿。 （ ）成果：＿＿＿＿＿、抗体、疫苗、激素等。 （ ）作用：预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、＿＿＿＿＿、类风湿等疾病。 ．基因治疗 （ ）特点：把 ＿＿＿＿＿导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。 （ ）成果：将腺苷酸脱氨酶基因导入患者的＿＿＿＿＿，治疗复合型免疫缺陷症。 （ ）方法：分为体外基因治疗法和＿＿＿＿＿基因治疗法。 四、蛋白质工程 ．蛋白质工程的崛起 （ ）实质：将一种生物的＿＿＿＿＿转移到另一种生物体内，后者产生它本不能产生的蛋白质，从而产生新性状。 （ ）目的：生产符合人们生活需要的、并非自然界已存在的＿＿＿＿＿。 （ ）实例：天冬氨酸激酶和＿＿＿＿＿＿＿＿的活性受细胞内＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的影响，当赖氨酸浓度达到一定量时会抑制这两种酶的活性，改变两种酶的特性后，玉米游离赖氨酸含量提高。 ．蛋白质工程原理
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做DNA重组技术。 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。
相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 (8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。 例1．限制酶MunⅠ和限制酶Eco RⅠ的识别序列及切割位点分别是－C↓AATTG－和－G↓AATTC－。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是（） A
《基因工程》专题中学生常问的十个“为什么” 人教版新课标教材选修3《基因工程》专题对基因工程进行了生动地介绍，让学生对一项生物技术有了一定的了解，在教学中我发现学生们对此内容很感兴趣，在和他们的交流过程中，他们经常会给我提出这样﹑那样的一些问题，我把它们总结成了十个“为什么”。一．为什么原核生物的限制酶不切割自己的DNA？ 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵如噬菌体,在长期的进化过程中原核生物形成了一套完善的防御机制，以保持自身遗传的相对稳定性。当外源DNA侵入后，限制酶就将其切割掉，使外源DNA不能发挥遗传效应，而且限制酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，它们具有相同的底物专一性，具有识别相同碱基序列能力。甲基化酶的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸，甲基受体为DNA上的腺嘌呤与胞嘧啶。当限制酶作用位点上的某一些碱基被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了。这样在含有某种限制酶的原核生物的细胞中，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。所以限制酶只降解外源入侵的异种DNA，而不分解自身DNA，在解除外源DNA遗传干扰的同时又保护了自身遗传特性的稳定。 二．为什么CDNA文库只有该物种部分基因？ 因为CDNA是以mRNA为模板，经逆转录酶催化，在体外逆转录合成，如果与适当的载体如噬菌体或质粒连接后导入受体菌，则每个细菌含有一段CDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的CDNA集合称为该组织细胞的CDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以CDNA文库具有组织细胞特异性,当然CDNA文库也就比基因组DNA文库小得多。 三．为什么要扩增目的基因？ 因为基因工程中的每一个操作步骤的成功率都不高，要进行大量的筛选，这样就需要大量相同的目的基因，所以需要扩增目的基因。 四．为什么PCR技术中不使用解旋酶和ATP？ PCR技术是一种体外进行DNA复制的方法,通过在一定的条件下控制温度即高温变性、低温退火和适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增。在DNA 复制过程中是通过在高温条件实现DNA解旋，所以不需要解旋酶，而且如果使用了解旋酶会使DNA一直处在单链的状态，反而会破坏复制过程的循环性；复制的过程本来是需要能量的，但是在PCR反应体系中加入的并非是普通的4种脱氧核苷酸，而是4种脱氧核苷三磷酸即dATP，dTTP，dGTP，dCTP，它们分别由4种脱氧核苷酸在消耗ATP的基础上活化形成的，所以它们能提供PCR反应需要的能量，所以在PCR过程中，不需要加入ATP。 五．为什么用Ca2+处理大肠杆菌能增大转化率？
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
基因工程的基本工具 一、基因工程的概念： 二、基因工程的原理和优点： 三、基因工程的基本工具 1.分子手术刀： （1）来源： （2）作用： （3）不同类限制酶的区别： （4）与DNA连接酶的异同点： 相同点： 不同点： 2.分子缝合针： （1）分类： （2）作用： （3）区别： （4）与DNA聚合酶的异同点： 区别： 相同点： 3.分子运输车： （1）作用： （2）种类： （3）质粒是什么？ （4）质粒的特点及每一个特点的作用： <1>.特点： 作用： <2>.特点： 作用：
<3>.特点： 作用： 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的获取 1.目的基因指什么： 2.获取目的基因的来源： 3.获取目的基因的方法 1.条件： 2.基因文库的分类： 基因组文库： 部分基因文库（cDNA文库）： 3.基因文库的构建流程 4.两种基因文库的区别： 1.条件： 2.中文名称： 3.原理： 4.原料：
5.过程及每一步的作用： 第一步： 第二步： 第三步： 1.条件： 二、基因表达载体的构建（核心步骤） 1.基因表达载体的结构元件 1①目的基因 2启动子： 3终止子： 4标记基因： 5复制原点 2.构建基因表达载体的目的： 3.构建的方法：[理解单酶切和双酶切的区别] 三、将目的基因导入受体细胞（转化） 1.植物细胞（充当受体细胞）的转化 1农杆菌： 2Ti质粒： 3总体思路： 4农杆菌侵染植物时的机理： ⑤适用范围：
注意事项： 注意事项： 2.动物细胞（充当受体细胞）的转化 1技术： 2具体谁来充当受体细胞： 3.微生物细胞（充当受体细胞）的转化 Ca2+转化法： 四、目的基因的检测与鉴定 1.分子水平的检测 目的： 方法： 结果： 目的： 方法： 结果： 目的： 方法： 结果： 2.个体水平的检测
专题1 基因工程 知识体系构建 专题整合 一、基因工程的基本工具 A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、载体 B.为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞 C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D.只要目的基因进入了受体细胞就能成功表达 二、基因工程的操作程序 1.目的基因的获取 （1）目的基因：指编码蛋白质的结构基因。 （2）获取方法：从基因文库获取，原核基因也可直接分离获得；真核基因主要是人工合成，人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。 2.基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成：启动子＋目的基因＋标记基因＋终止子。 ①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 ②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 ③标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。 3.将目的基因导入受体细胞
A.提取目的基因→目的基因导入受体细胞→目的基因与载体结合→目的基因的检测与鉴定 B.目的基因的检测与鉴定→提取目的基因→目的基因与载体结合→目的基因导入受体细胞 C.提取目的基因→目的基因与载体结合→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 D.目的基因与载体结合→提取目的基因→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 三、蛋白质工程 1.蛋白质工程流程 2.蛋白质工程与基因工程的区别：蛋白质工程的本质是通过改造基因进而形成自然界不存在的蛋白质，所以被形象地称为第二代基因工程；基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 训练3 利用蛋白质工程改造天然蛋白质，进而改变其功能，可获得毒副作用减小，专一性、药效和稳定性都增强的理想的药物。如胰岛素是治疗依赖型糖尿病的特效药物，但是天然胰岛素在人体内寿命只有几小时，重症病人每天得注射好几次药物，给病人增加了不便和痛苦。通过蛋白质工程改变胰岛素的空间结构，以延长胰岛素的半衰期，得到长效胰岛素；还可以在不改变胰岛素活性部位结构的前提下，增强其他部位结合强度，使之难以被酶破坏，从而增强其稳定性。 （1）若要批量生产以上提到的长效胰岛素，根据所学知识，需要用到哪些生物工程（ ）
高三生物知识点归纳：基因工程及其应用 1.概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 高考生物知识点归纳 2.原理基因重组 3.工具： A.基因的”剪刀”：限制性内切酶 ①分布：主要在微生物中。 ②作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 ③结果：产生黏性未端(碱基互补配对)。 B.基因的”针线”：DNA连接酶 ①连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ②结果：两个相同的黏性未端的连接。 C.基因的”运载工具”：运载体 ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件：a、能在宿主细胞内复制并稳定地保存。b、具有多个限制酶切点。 c、有某些标记基因。 ③种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 ④质粒的特点：质粒是基因工程中最常用的运载体。 4.基因操作的基本步骤： ①提取目的基因：人们所需要的特定基因，如人的胰岛素基因、抗虫基因、抗病基因、干扰素基因等 ②目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)：用同一种限制酶分别切割目的基
因和质粒DNA(运载体)，使其产生相同的黏性末端，将切割下的目的基因与切割后的质粒混合，并加入适量的DNA连接酶，使之形成重组DNA分子(重组质粒) ③将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞 ④目的基因检测与表达 检测方法如：质粒中有抗菌素抗性基因的大肠杆菌细胞放入到相应的抗菌素中，如果正常生长，说明细胞中含有重组质粒。 表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因完成了表达过程。如：抗虫棉基因导入棉细胞后，棉铃虫食用棉的叶片时被杀死;胰岛素基因导入大肠杆菌后能合成出胰岛素等。