一、选择题 1下图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意图，下列叙述不正确的是( ) 图1 图2 A．刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液B．图1中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠C．图2发酵过程中搅拌的目的是为了使培养液与酵母菌充分接触D．图1中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图2装置中 解析：刚溶化的海藻酸钠应冷却后再与酵母菌混合，否则温度过高会导致酵母菌死亡。 答案：A 2．如下图所示，下列4支试管内加入3 mL浆糊。另外A、C内分别注入2 mL清水，B、D内分别注入2 mL新鲜的唾液淀粉酶。甲、乙两水槽水温分别为35 ℃、55 ℃。保温5 min，再向4支试管内分别滴入碘液，不变蓝色的是( ) 解析：该题考查的是温度对酶活性的影响，利用碘遇淀粉变蓝色的特性来鉴定酶是否将淀粉水解。A、C两支试管中没有淀粉酶，所以淀粉还存在，加碘后会变蓝色；D试管中虽然有酶，但由于唾液淀粉酶催化的最佳温度在35 ℃左右，温度55 ℃太高，已经使唾液淀粉酶失去了活性，不能水解淀粉，所以D试管也会变蓝色；只有B 试管中的酶能将淀粉水解，所以加入碘液不变蓝色。 答案：B 3．研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将从大肠杆菌中得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与微生物降解相比，其作用需要适宜的( ) ①温度②酸碱度③水分④营养
A．①②③ B．①②④ C．②③④ D．①③④ 解析：本题考查了固定化酶的条件。大肠杆菌中的三酯磷酸酶可以催化有机磷农药分解，需要适宜的温度和pH，同时反应离不开水，但是不需要提供营养。 答案：A 4．下列关于酶制剂的叙述正确的是( ) A．需依次经过提纯、沉淀、过滤等过程 B．经过固定化的酶才能称为酶制剂 C．酶制剂活性的维持需要提供营养物质 D．酶制剂中的酶最终来源于活细胞 解析：获取酶制剂要将细胞破碎，释放出细胞内的酶分子；提取到的酶即可称为酶制剂；酶不是活细胞，活性的维持不需提供营养物质。 答案：D 5．下列有关果胶酶及与果胶酶实验探究的有关叙述正确的是( ) A．探究果胶酶的用量时，pH、温度不影响实验结果 B．果胶酶包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和葡萄糖异构酶等C．探究温度对果胶酶活性影响时，温度、苹果泥、果胶酶用量及反应时间等都是变量 D．可以用相同时间内过滤得到的果汁体积来确定果胶酶的用量 解析：本题考查了果胶酶及其相关实验，探究果胶酶用量时，pH、温度会影响实验结果；葡萄糖异构酶不属于果胶酶；探究温度对果胶酶活性影响的实验中，温度为单一变量，其他因素保持不变。 答案：D 二、非选择题 6．生物柴油是一种可再生的清洁能源，其应用在一定程度上能够减缓人类对化石燃料的消耗。科学家发现，在微生物M产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油(如下图)。
植酸酶在饲料中的应用及其研究进展 植酸酶是一种新型的、可作为动物饲料添加剂的重要酶制剂。它对提高饲料中磷利用率，提高动物的生产性能，以及减轻高磷粪便对环境水域的磷污染有重要意义。本文综述了植酸酶在饲料中的应用现状及工业化生产方法，讨论了其进一步的研究发展方向。 植酸酶是一种水解酶，它能将植酸磷（六磷酸肌醇）降解为肌醇和无机磷酸。此酶分两类：3-植酸酶和6-植酸酶。植酸酶广泛存在于植物和微生物中。磷在植物中的主要存在形式为植酸磷，由于植酸磷不能被单胃动物直接利用，从而造成磷源浪费和形成高磷粪便污染环境。另外，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化吸收过程中会与多种金属离子如Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白质螯合成不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的利用。因此，开展饲用植酸酶的研究，对提高畜禽业生产效益及降低磷对环境的污染有重要意义。１植酸酶的来源及酶学性质 早在1907年Suzuki等就在谷粮中发现了具有植酸酶活性的磷酸酶。第一个纯化的植酸来源于麸皮，研究发现它虽具有植酸酶活性，但植酸并不是它特异性底物。来源于植物的植酸酶均属于６－植酸酶，最适pH范围在5.0~7.5，在单胃动物酸性的胃环境中不起作用。60年代末植酸酶的研究转向最适pH为酸性、酶含量较高的微生物来源的植酸酶。 许多微生物都能产生植酸酶，尤其在曲霉属中。1968年Shien等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所用的22株黑霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于Aspergillus terreus NO.9A-1,它的最适pH为 ４.5，最适反应温度为70℃,此酶在pH1.2~9.0均能稳定维持活性。从此以后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶，其中来源于Ａ.ficcum NR-RL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶phyA具有较好的耐热性，在酸性的条件下有较高酶活性，被认为是目前最具应用前景的饲用植酸梅，其酶学性质的研究也较为深入。 植酸酶phyA属于３－植酸酶，是一种糖基化蛋白，表观分子量为85KD。它的最适pH为2.5和5.5,最适反应温度为55℃。在37℃、pH2.5的条件下，以植酸为底物的Ｋm值为50mmol,Ca2+、Fe2+对酶活性无影响,Mn2+、Co2+有激活作用，能使酶活性分别提高30%和13%。Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cu+对酶活性有抑制作用，其中前两种为非竞争性抑制，后两种为竞争性抑制。对酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如Ｌ（＋）－酒石酸对它却没有抑制作用。它是目前发现的比活性最高的植酸酶之一，它降解植酸磷形成的终产物是单磷酸肌醇和无机正磷酸。 ２植酸酶在饲料中的应用效果
植物、动物以及微生物中都有酶，它们对细胞的功能具有重要的作用。酶已在啤酒、葡萄酒酿造业及食品加工业中应用了很多年。在这些行业中，它们被用来加工奶酪、改良人类消费所需的豆类及谷物、清洁柑橘类水果、制造稳定的浓缩果汁等。在纺织工业中，较为著名的是酶在传统的退浆工艺中的应用，而随着生物技术的发展，在纺织生产中酶的应用越来越多，从对纤维的改性到织物的漂白都有相应的酶制剂的使用。 1酶的认识 1．1酶的特性 催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点, 而且反应完成后其本身不发生变化的物质。酶是一种特殊的催化剂，作为催化剂它有一定的特点。 （1）高催化效率：在与无机或有机催化剂相比的情况下，酶的催化效率高达107 ~ 1012倍，某些酶甚至可加快反应速率高达1014倍。酶的这种高催化效率是因为酶能够显著降低反应过渡态能量。 （2）高度的专一性：酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。催化反应的专一性是酶最重要的特性之一, 是酶与其它非酶催化剂最主要的不同之处，这种原理通过图1所示的锁-钥匙原理可以形象的表达。 图1 锁-玥匙原理 （3）反应条件温和：酶来自生物体，因而一般酶催化反应均可在常温常压条件下进行，有利于生产控制，并可节约能源，降低设备成本。另外，酶催化反应都在弱酸、弱碱或中性条件下进行，对环境污染小，对设备的腐蚀小，生产安全性高。 1.2酶的作用机理和过程 酶和底物的作用机理和过程如下表示：酶与底物作用→形成酶和底物的复合物→生化作用→形成酶与底物过度态络合物→酶和生成物分离而释放反应生成物和原来的酶。这样可使整个反应的活化能降低, 从而加快了反应速度。生化反应完成后, 酶和生成物分离, 酶又可重新催化反应。 1.3影响酶活性的因素 酶催化反应的效率取决于以下因素：酶的浓度、反应物浓度、保温或反应时间、反应温度、系统的PH值、所存在的活化剂及阻化剂。 在最佳的温度和PH值下，酶的催化水解反应总的反应速度取决于形成酶反应复合物的时间和生成产物的时间。要使复合物易于形成, 酶的浓度应足够高。且在酶附近的反应物浓度也应较高。反应物的浓度太高,反而不利于反应进行。这是因为过多的反应集中于酶的连接点或反应点上, 形成瓶颈其中的一种或两种情况发生都会降低反应速率。若反应时间较长, 酶的用量应低一些，较高用量的酶可降低总的反应时间, 但也不能过高。
考点二固定化酶和固定化细胞 基础点 1固定化酶 (1)应用实例——果糖生产：葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖。 (2)固定化酶技术：将酶固定在颗粒状的载体上，再将酶颗粒装到反应柱内，反应柱底端的孔应满足酶颗粒无法通过而反应溶液可以自由通过。 2固定化细胞技术 (1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 (2)方法：包埋法、化学结合法和物理吸附法。 (3)制备固定化酵母细胞的操作流程：酵母细胞的活化→配制0.05 mol/L CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞→冲洗→发酵。 重难点 1制备固定化酵母细胞及用固定化酵母细胞发酵 2直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较
易错警示(1)固定化技术对酶的影响：固定化酶改变了酶的存在状态，不改变酶的特性，因此利用固定化酶仍要严格控制温度、pH 等环境条件，以利于酶发挥作用。 (2)正确理解固定化酶的优点：固定化酶能够连续使用，但不是永久使用。酶是具有生物活性的大分子，因此随着使用次数的增多，酶活性也会降低，如果酶活性降低到一定程度，就会失去使用价值。 1．思维辨析 (1)反应产物对固定化酶的活性没有影响。( ) (2)固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应。( ) (3)从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小。( ) (4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl 2和杂菌。( ) (5)刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液。( ) (6)利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物。( ) 答案 (1)× (2)× (3)√ (4)√ (5)× (6)× 2．酶在大规模产业化应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有( ) A ．热稳定性 B ．催化高效性 C ．催化特异性 D ．可反复使用性 答案 D 解析 固定化酶是利用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。
植酸酶的作用及其应用 摘要：磷是畜禽营养物质中功能最多的营养素之一。家畜必须从饲料中得到充足的磷才能维持正常生命和生产活动。本文简要的介绍了植酸酶的来源、作用，并阐明了植酸酶在不同动物不同生长阶段添加植酸酶对其生产性能、饲料利用率的影响，以及植酸磷影响植酸磷作用的因素 关键词：植酸酶生产性能饲料利用率 磷是畜禽营养物质中功能最多的营养素之一。畜禽必须从饲料中得到充足的磷才能维持正常生命和生产活动,单胃动物(猪、鸡)饲料中植物性饲料所占比例很大,虽然饲料中总磷含量较高,但可被单胃动物利用的有效磷却不足。谷物饲料中磷的主要以植酸和植酸盐的形式存在,绝大多数单胃动物不能充分消化、利用植酸和植酸盐中的磷, 这不仅增加了饲养成本而且,未被动物消化吸收的磷还会对环境造成污染。此外,植酸盐能络合某些营养物质,降低其在动物体内的消化吸收率, 是一种抗营养因子。 因此，因此就需要在畜禽的饲料中需要添加一种易于被肠道消化的磷饲料。通常添加无机态的磷酸氢钙。但是磷酸氢钙是不可再生的矿物资源，并且在市场上的价格很昂贵，最近的研究表明,日粮中添加植酸酶可取代磷酸氢钙，他可分解植酸和植酸盐，促进饲料中植酸和植酸盐的分解，使与磷及磷酸根结合的内源性酶和其他营养素得以释放和利用，减少粪磷对环境的污染，节省无机磷酸盐的添加。提高植物性饲料中磷的利用率。[1] 1植酸酶 1.1植酸酶的来源 在自然界中,植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物中。相对于植物和动物来源的植酸酶说，来源于微生物的植酸酶作用范围广和稳定性较好，易规模化生产，畜禽日粮中植酸酶的来源主要有两个途径： 1) 有些植物及其加工副产品本身含有较高活性的植酸酶，如小麦和小麦麸本身
植酸酶及其生产应用 植酸即肌醇六磷酸，作为磷酸的储存库，广泛存在于植物中。植物组织中的磷主要是以肌醇六磷酸钠的形式存在，难以被单胃动物吸收。而且，肌醇六磷酸分子可以螯合金属离子，其作用相当于抗营养因子，抑制了营养的吸收。没有被充分的利用磷，通过动物排泄进入水体最终导致水体富营养化。 植酸酶是水解植酸及其盐类生成肌醇和磷酸的一类酶的总称，破坏了植酸对矿物元素强烈的亲和力。因而，在动物饲料中添加微生物植酸酶正在逐渐被推广和应用，可以解决磷的利用问题。 一、植酸酶及其分类 植酸酶是对可水解植酸磷释放磷酸基团形成肌醇衍生物的一类酶的总称，属于磷酸单酯水解酶。 广义植酸酶包括三种类型：肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶（3-植酸酶），肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶（6-植酸酶）及非特异性的正磷酸酯磷酸水解酶（酸性磷酸酶），该类酶可将肌醇磷酸脂彻底分解成肌醇和磷酸。 根据植酸酶结构上的差异将植酸酶分为组氨酸酸性磷酸酶、β-螺旋植酸酶和紫色酸性磷酸酶。同时植酸酶还可根据酶的最适pH可分为酸性植酸酶、中性植酸酶、碱性植酸酶。 二、植酸酶来源 植酸酶是一种胞外酶，广泛存在于自然界中，在动物、植物、微生物中均有发现。在植物组织如谷物、豆类、蔬菜,特别是萌发的种子和花粉中都发现了植酸酶。此外，自然界中产植酸酶的微生物种类繁多,如细菌、霉菌、真菌等。 1．植物源植酸酶
1907年，Suzuki等在米糠内首次发现具有植酸酶活性的磷酸酶。到目前为止，已经从小麦、大豆、玉米、水稻分离纯化得到植酸酶。 研究表明，当温度在47~62℃时植物源植酸酶酶活较稳定，但当温度达到70℃以上，酶活几乎完全丧失。而在饲料的加工过程中制粒温度高（80~90℃），显然植物源植酸酶不适合应用到饲料添加剂中。 2．动物源植酸酶 动物源植酸酶主要存在于哺乳动物的小肠和脊椎动物的红细胞中，其活性一般较低。 研究表明，鼠、牛、鸡、人肠道黏膜中的植酸酶最适pH分别为7.0、8.2~8.4、7.5~7.8、7.4，且体内或体外条件对动物源植酸酶活性影响较大，可能和碱性磷酸酶是属于同种酶，但对该酶亚基结构了解甚少。 3．微生物源植酸酶 目前，陆续发现各种产植酸酶的微生物，如枯草芽胞杆菌、假单孢杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、克雷伯氏菌、黑曲霉、米曲霉、根霉、酵母等。不同菌种产植酸酶能力不同，研究表明，在土样产植酸酶的菌株中，真菌代谢磷的能力比细菌更高效。由于来源于微生物的植酸酶作用范围广，且微生物源植酸酶较适用于胃pH呈酸性的单胃动物及一些鱼类等，稳定性好，易规模化生产，使其成为研究的集中点。以下主要讨论关于微生物源植酸酶的生产及分离纯化技术。 三、植酸酶的应用 植酸酶作为一种新型饲料添加剂，在动物营养及环境保护等领域具有很大的应用潜力。植酸酶最主要的应用是作为饲料添加剂提高磷的利用率，减少环境中磷的排放。当前，植酸酶正被大量运用到不同的生物技术领域。 中国植酸酶产业在饲料添加剂领域的发展日渐成熟，在科研、创新和应用等方面也形成了较完整的体系，已经发展成为最为完善的饲用酶制剂产业。 1．饲料工业中的应用 植酸酶一般只适于在单胃动物中使用。反刍动物由于瘤胃微生物能合成植酸酶，因此在饲料中一般不需要使用植酸酶。植酸酶作为饲料添加剂已经广泛应用到猪、家禽、鱼饲料中，多数研究中发现，植酸酶可以释放磷酸盐中的磷。同时因其可提高不同营养物质的利用度，不同来源的植酸酶常被单独或混合使用在饲料工业领域中。饲用植酸酶已经成为工业酶产业中增长势头最快的一类且正呈逐年上升之势。 Simons等的研究已经表明在玉米、豆粕日粮中添加植酸酶，可使磷的利用率提升60％，粪便中磷的排出量减少了50%。值得注意的是，2009年由中国农业科学院生物技术研究所培育的转植酸酶基因玉米获得生产应用的安全证书，是世界第一例获得生产应用许可的转植酸酶基因玉米。该转植酸酶基因玉米加工成饲料后仍然保留了大部分植酸酶活性，可分解饲料中的植酸，不但可释放出无机磷，还可减少饲料中磷酸氢钙的添加量，减少动物排泄物中磷的排放。 2．食品工业中的应用 在人类食品中添加植酸酶，市场上还没有相关的食品开发报道。谷物中存在的植酸可抑制很多矿物的吸收，在人的小肠里植酸酶活性非常低，难以利用食物中的植酸盐。此外，虽然人的小肠黏膜中具有植酸酶和碱性磷酸酶，但在植酸盐的降解中却不起作用，所以食物中的植酸酶在水解植酸盐过程中扮演重要角色。体外模仿生理条件的实验表明，植酸酶通过对植酸的水解可使铁的利用率提高67％~98％。此外，植酸对锌的利用率也有影响。在体内，锌离子和植酸形成螯合物，降低了其利用率。谷物食粮中植酸存在是造成人体缺锌的因素之一。因而在食品中添加植酸酶可有效增强它们的营养价值。 3．作为土壤改良剂
植酸酶的来源与应用 1 植酸酶的来源 1. 1 植物来源的植酸酶植酸酶最早是在植物中发现的,早期的研究都集中在植物和动物器官中。尽管植酸酶存在于多种植物的种子和花粉中,其活性却因植物的种类不同而有很大差别, 如在豆类、谷类和油料作物中,植酸酶的活力一般都较低。许多谷物饲料中含有一定数量的植酸酶,如小麦来源的植酸酶可以使含小麦日粮中的植酸磷降解,但它们的酶活性变异很大。在机械制粒过程中小麦的植酸酶活性并未被破坏。在含豆科籽实的日粮中,鸡可以产生利用植酸的适应性,肉鸡降解植酸磷的能力受日粮钙[3]和磷[4]水平的影响,但玉米、高粱和油籽饼中的植酸酶活性很低[5] 。Viveros 等[6] 测定了24 种饲料的植酸酶活性,发现黑麦籽实的酶活性在所有谷物籽实中最高,其活性超过5 000 U/ kg ,黑小麦2 030 U/ kg ,小麦1 500 U/ kg ,而玉米胚、燕麦和高粱籽实几乎无植酸酶活性(小于100 U/ kg) 。此外,来源于植物的植酸酶多属于62植酸酶, 最适pH 值在5. 0～7. 5 , 不适合在单胃动物的酸性胃中起作用, 而且植酸酶在植物中含量较低,因而从应用角度出发,自20 世纪60 年代末植酸酶的研究转向最适pH值为酸性、酶含量较高的微生物来源的植酸酶。 1. 2 动物来源的植酸酶动物植酸酶存在于哺乳动物的红血球和血浆原生质中。比起植物和微生物植酸酶, 动物植酸酶方面的研究非常少,Patwardhan[7]首先证实小白鼠有从植酸磷释放磷的能力,从此,大量研究证实不同动物的小肠黏 膜具有植酸酶活性[8] 。植酸酶活性存在于小肠黏膜的刷状缘,十二指肠的酶活性最高。尽管在小鼠、鸡和牛的肠粘膜上植酸酶降解植酸盐的活性已得到证实,已测定了人体部分组织中植酸酶的活性,但仍不了解植酸酶在人胃和小肠中降解植酸盐的活性如何。有学者认为哺乳动物小肠中的植酸酶与碱性磷酸酶相同,因为碱性磷酸酶确实有水解植酸磷的作用,而且两种酶有类似的亚细胞分布,它们对镁、锌的依赖性以及最适pH 值也类似,两种酶的活性都受日粮因素如维生素D 或低磷水平的修饰。但是其他的一些证据又支持两种酶是不同的酶,如酶的底物依赖性不同,被苯丙氨酸和氟化钠的抑制特性不同。还有一个值得探讨的问题就是动物来源的酶是否是动物体内的微生物产生的。动物来源的植酸酶活性受动物的遗传特性和日粮营养因素的影响,如小白鼠的酶活性比兔的高[9] 。小白鼠成年后的酶活性比幼鼠的低,相反,猪和鸡则随年龄的
第二节固定化酶的制备和应用 学习导航明目标、知重点难点 固定化酶和固定化细胞的应用。(重点) 固定化酶与固定化细胞的制备方法。(难点) [学生用书P43] 一、阅读教材P63分析固定化酶 1．概念：是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用，且保持了酶的催化性能，可实现酶促反应的连续化和自动化。 3．制备固定化酶的常用方法 目前，制备固定化酶的方法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。 二、阅读教材P64～65分析固定化细胞技术的应用 1．应用：固定化细胞可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 2．优点 (1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。 (2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 (4)细胞生长停滞时间短，反应快等。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。 4．酵母菌细胞的固定化技术的主要流程 准备各种实验药品和器材 ↓ 制备麦芽汁 ↓
活化酵母菌细胞 ↓ 配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液 ↓ 制备固定化细胞 ↓ 浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤 ↓ 发酵麦芽汁 判一判 (1)酶在催化时会发生变化，不可反复利用。(×) (2)某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应。(×) (3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作用。(×) (4)制备固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。(×) 连一连 固定化酶技术[学生用书P44] 由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。人们针对酶的这种不足寻着改善的方法之一是固定化酶技术的应用。结合教材P63内容完成以下探究。 (1)图A为物理吸附法，它的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)图B为化学结合法，它是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中(如图C)，包埋成格子型；或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中(如图D)，包埋成微胶囊型。 各种固定化酶方法的比较
植酸酶及其生产概述 李大刚 1 张秉胜 2 张广民 1 （ 1 东北农业大学动物营养研究所哈尔滨 150030 2 大连翔大科技股份有限公司 116620 ） 磷在畜禽营养中发挥着重要的作用，是机体重要的结构成分，同时参与机体诸多重要的生理、生化过程。例如，在能量代谢、碳水化合物代谢、氨基酸和脂肪代谢、神经组织代谢、骨骼生长以及脂肪和其他脂类运输方面起着重要作用。因此，如果日粮中磷缺乏或不足，会引起生长缓慢或停滞，出现骨病，甚至死亡等严重后果。饲料原料中含有大量的磷，但一般谷物中60%以上的磷以植酸磷形式存在而不能为单胃动物所利用。而植酸酶是一类催化植酸（肌醇六磷酸酯）及植酸盐水解成无机磷和肌醇的酶的总称。植酸酶不但可以使单胃动物利用有机磷，还可减少磷的排出，减轻环境污染，所以植酸酶引起众多科研工作者的广泛关注。 1 植酸酶的应用 猪、禽等单胃动物饲料的主要原料是玉米、豆粕、糠麸、棉籽粕、菜籽粕等，它们所含的磷大部分以植酸磷形式存在，占总磷的60%～90％。但是单胃动物的饲料中，植酸具有强烈的抗营养作用，其原因是：(1)单胃动物缺乏分解植酸的酶类，因而无法利用植酸中的磷。(2)由于植酸上的磷酸基团呈负电性，它与一些阳离子如Ca 2+ 、Mg 2+ 、Zn 2+ 、Cu 2+ 、Mn 2+ 、 Fe 2+ 和K +等有很强的螯合能力，形成不溶性盐，从而影响畜禽对这些矿物元素的吸收和利用，因而降低了这些矿质元素的生物效价。(3)植酸上的磷酸基团还可以与饲料中的蛋白质、氨基酸、淀粉和脂质等物质上的阳离子基团结合，使其溶解性降低，从而影响畜禽对这些营养物质的消化率，降低蛋白质的生物有效性。(4)植酸还可以与动物体内的蛋白质，如淀粉酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶和酸性磷酸酶等结合，降低这些酶的活性，使整个日粮的养分利用率降低。(5)植酸对维生素也存在不利影响。因此动物采食高植酸含量的饲料后常表现厌食、消瘦、繁殖机能衰退等。 表1 某些饲料原料中磷的含量及利用率(NRC，1994) 植酸酶用于饲料，可以提高饲料中植酸磷的利用率，减少磷的排放量，降低环境中磷的污染，并能解除植酸抗营养作用，从而提高饲料消化利用率。表1列举了几种常用动物饲料原料中磷的存在形式和畜禽利用情况，从表中可以看出这些原料中磷的利用率比较低。如果植酸磷能够被充分利用，则日粮中的磷含量已基本可满足畜禽营养需要，可较少甚至不用再额外添加无机磷。 2 植酸酶的分子生物学特性 植酸酶属于磷酸单酯水解酶，是磷酶的一种特殊类型。植酸酶广泛分布于自然界，存在于微
第2节酶在工业生产中的应用 (时间：30分钟满分：50分) 一、选择题(共6小题，每小题4分，共24分) 1．根据酶在生物体内存在的部位，可分为胞内酶和胞外酶，下列属于胞外酶的是 ()。 A．呼吸酶B．RNA聚合酶 C．DNA聚合酶D．胰蛋白酶 解析胰蛋白酶属于消化酶，存在于消化道内，其余的酶在细胞内发挥作用。 答案 D 2．下列属于氧化还原酶的是()。 ①乙醇脱氢酶②琥珀酸脱氢酶③淀粉酶④丙酮酸羧化酶⑤谷丙转氨 酶⑥葡萄糖磷酸异构酶 A．①③B．③④C．⑤⑥D．①② 解析脱氢酶属于氧化还原酶。 答案 D 3．酶工程中酶制剂的生产按顺序排列为()。 ①酶的分离纯化②酶的固定化③酶的生产④酶的提取 A．①③②④B．③②①④ C．③④①②D．④①②③ 解析酶制剂的生产包括酶的生产、提取、分离纯化和固定化等。人们提供必要的条件，利用微生物发酵来生产酶的过程，叫做酶的生产。微生物发酵生产的酶种类很多，但是每种酶在培养液中的含量却很低，因此需要提取。提取液中含有多种酶、细胞代谢产物和细胞碎片等，要想获得所需要的某一种酶，就必须再进行酶的分离和纯化。为防止反应结束后酶制剂与产物混合在一起，又可以反复使用酶制剂，可以将酶进行固定化。 答案 C 4．下列不属于固定化酶在利用时的特点的是()。 A．有利于酶与产物分离 B．可以被反复利用 C．能自由出入依附的载体
D．一种固定化酶一般情况下不能催化一系列酶促反应 解析固定化酶是采用包埋法、化学结合法或物理吸附法将酶固定在一定载体上，所以固定化酶不能自由出入依附的载体。 答案 C 5．在果汁生产中加入果胶酶的目的是()。 A．分解纤维素 B．增加果汁的营养成分 C．增加果汁的黏稠度 D．使榨取果汁变得更容易，并使果汁澄清 解析果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物，不溶于水。在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清。 答案 D 6．下列关于淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶的说法中，不正确的是()。 A．淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的化学本质均为蛋白质 B．淀粉酶生产的历史长，用途广，是工业生产中最重要的一类酶 C．在植物细胞杂交中需要应用纤维素酶 D．蛋白酶不能水解淀粉酶和纤维素酶 解析由于淀粉酶、纤维素酶的化学本质均为蛋白质，故蛋白酶能够水解淀粉酶和纤维素酶，因此D 项不正确。 答案 D 二、非选择题(共2小题，共26分) 7．(14分)为探究洗衣粉加酶后的洗涤效果，将一种无酶洗衣粉分成3等份，进行3组实验。甲、乙组在洗衣粉中加入1种或2种酶，丙组不加酶，在不同温度下清洗同种化纤布上的2种污渍，其他实验条件均相同，下表为实验记录。请回答下列问题。 水温/℃10 20 30 40 50 组别甲乙丙甲乙丙甲乙丙甲乙丙甲乙丙清除血渍 67 66 88 52 51 83 36 34 77 11 12 68 9 11 67 时间/min
郑扬云
?植酸(肌醇六磷酸)具有强大的络合力，通常与钙、镁、锌、钾等矿 物质元素结合，形成不溶性盐类。 植酸(盐)广泛存在于农作物及农副 产品中，很多谷物、油料作物中的 植酸含量高达1％一3％，其中钙、镁、锌、钾等元素以植酸盐的形式 存在。因此植酸是一种抗营养因 子．大大降低了微量矿物质的营养 有效性。植酸的这种性质会导致人 和动物钙、镁、锌、钾等元素的不 平衡性。因此必须在动物的饲料中 掭加钙钾等以补充矿物质，这大大 提高了饲料成本。同时饲料中天然 磷的含量约为40％一70％，且以 植酸磷的形式存在，而猪、禽的饲 料中大量的植酸磷因不能被利用而 从粪便中排出，造成环境枵染(磷富集化污染)。
?植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇和磷酸的一 类酶的总称。将植酸酶添加 到动物性饲料中释放植酸中 的磷分。不但能提高食物及 饲料对磷的吸收利用率，还 可降解植酸蛋白质络合物， 减少植酸盐对傲量元素的螯 合，提高动物对植物蛋白的 利用率及其植物饲料的营养 价值。同时也减少动物排泄 物中有机磷的含量，减少对 大自然的污染。
一、植酸酶的作用机理 ?植酸酶能将肌醇六磷酸(植酸)分解成为肌醇和磷酸。植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐个切下，形成中间产物IP5，IP4，IP3，IP,.终产物为肌醇和磷酸。不同来源植酸酶作用机理有所不同。微生物产生的3一植酸酶作用于植酸时，首先从植酸的第3碳位点开始水解酯键而释放出无机磷，然后再依次释放出其他碳位点的磷，最终酯解整个植酸分子，此酶需要2价镁离子(Mg2+)参与催化过程。来源于植物的6-植酸酶，它首先在植酸的第6碳位点开始催化而释放出无机磷。1g植酸完全分解理论上可释放出无机磷281．6mg。植酸酶只能将植酸分解为肌醇磷酸酯，不能彻底分解成肌醇和磷酸，要彻底分解肌醇磷酸酯，需酸性磷酸酶的帮助，酸性磷酸酶可以将单磷酸酯、二磷酸酯彻底分解成肌醇和磷酸。大多数微生物来源的植酸酶的作用机理如下。 ?植酸→1,2,4,5-,6-五磷酸肌醇+D-1,2,3,4,5-五磷酸肌醇→1,,2,5,6-四磷酸肌醇→1,2,5-三磷酸肌醇或1,2,6-三磷酸肌醇→1,2-二磷酸肌醇→2-磷酸肌醇。
酶工程的资料 一、酶工程内容： （一）“产酶”模块，包括微生物发酵产酶、细胞工程产酶和现代分子技术产酶等； （二）“分离酶”模块，包括酶的酶学性质、酶的分离纯化等； （三）“改造酶”模块，包括酶的分子修饰、酶的固定化和酶的有机催化等； （四）“用酶”模块，包括酶在医药、食品、轻化工、环境保护和生物技术等方面的应用。 二、酶的基因工程与蛋白质工程 酶是具有催化功能的蛋白质，其催化的多样性已使其在生物产业中得到广泛应用。应用自然界酶分子进化原理，构建具有实际应用所需的高催化效率、高稳定性的酶是蛋白质工程研究的重要目标。随着人们对酶的三级结构了解的增加，越来越多的合理设计方法，比如定点突变和结构域重组，被用来改变酶的性质和功能。通过合理设计改造的酶，不仅在工业和医药等方面起着重要作用，也加深了人们对于蛋白质结构-功能关系的认识。结构域重组是自然界中蛋白质进化的一个重要途径，也是人工设计和改造酶蛋白的有效策略。天然存在的与多种功能和性质相关的蛋白质结构域为人们构建新型酶蛋白提供了重组素材。传统的结构域重组方法通过重组同源蛋白质的结构域，已经成功地构建出了许多嵌合酶。它们或具有新的催化活力，或改变了底物特异性，或在稳定性上获得了提高，等等。一般来讲，重组亲本的同源性越低，嵌合酶获得新功能的可能性越大。重组低同源性的亲本蛋白质的困难在于，来源于不同亲本的结构域在重组过程中往往会破坏结构域界面上的相互作用，导致无活力的嵌合酶。因此，蛋白质工程的合理设计需要加深对蛋白质进化机制的理解，以及有效地构建嵌合蛋白质的新策略。 蛋白质的合理设计是最早出现的蛋白质工程方法，它发展迅速并有着广泛的应用。合理设计是在对蛋白质结构-功能关系的认识的基础上，通过定点突变等技术对蛋白质的性质和功能进行改造的一种方法。应用合理设计改造蛋白质依赖于对蛋白质三级结构的了解。随着计算生物学的发展，即使目标蛋白质并没有获得解析的晶体结构，人们也可以通过与其同源的蛋白质结构进行计算机同源建模，获得其可能的结构。理论与实验相结合的特性使得合理设计成为研究蛋白质结构-功能关系的强有力的途径。根据设计所涉及的范围，合理设计可以分为如下几类： 1 定点突变（site-directed mutation） 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等技术向目的 DNA 片段中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等[5]。定点突变能迅速、高效地提高 DNA 所表达的目的蛋白的性质。
植酸酶在饲料工业中的应用 大家都知道酶是具有催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。今天向我大家介绍的是饲料生产工业中非常重要的一种酶——植酸酶 植酸酶产品在动物和人类营养方面有非常广泛的应用，他可分解植酸(即肌醇六磷酸)，植酸是植物体内磷酸盐和肌醇的重要储存形式。植酸酶是一种新型的食品添加剂，能降低食物中的植酸而提高磷、锌、钙和铁等的利用率，改善动物对矿物质的吸收。其中磷是维持动物生长发育等生命活动必需的重要矿物质，同时也是饲料中最昂贵的组分之一，植酸酶可催化植酸盐水解，使植酸盐中的磷以磷酸根的形式分离出来从而被动物吸收，提高磷的利用率，降低环境污染。 1．1植酸酶的种类 1)按来源不同可分为微生物植酸酶、植物性植酸酶和动物性植酸酶。 2)按作用方式可分为3一植酸酶和6一植酸酶，其中3一植酸酶存在于 植物、霉菌和细菌中，需Mg2+参与反应，性质稳定，耐酸和耐高温，在饲料工业中已被广泛使用。而6一植酸酶只存在于植物中，适宜pH 5．0～5．5，对温度较敏感，超过60～65℃极易被破坏。 3)按加工工艺不同可分为粉状、颗粒状和液体状植酸酶。粉状植酸酶在 高温和高湿环境中易失活；脂肪包被颗粒型植酸酶在高温下脂肪膜易被融化，使植酸酶被释放出来而失活；因植酸酶在饲料中添加量极小，对喷涂精度要求高，故液体状植酸酶在饲料工业中较少使用；经特殊镶嵌的颗粒状植酸酶，热稳定性高，储存期长，在动物体内释放速度快，流动性好。 4)按酶促反应的pH有效作用范围可分为酸性植酸酶和中性植酸酶。适用 于畜禽的pH 2．5~5．5有效作用范围为酸性植酸酶，适用于鲤科鱼类的pH7．0～7．5有效作用范围为中性植酸酶。 1．2植酸酶的特性 植酸酶属于磷酸单酯水解酶，是一种特殊的酸性磷酸酶，适合pH为4～6，对温度的适应性要求较高，一般适宜温度在46～57℃，当超过60℃时，植酸
第四节酶的固定化 一、固定化酶 1．含义 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与不溶性的载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应。 2．方法 (1)共价键结合法：通过化学反应将酶以共价键结合到尼龙等载体上。 (2)包埋法：将酶包埋到多孔性凝胶中的固定化方法。 (3)物理吸附法。 3．优点 (1)固定化酶的活性稳定，可反复使用； (2)固定化酶能与反应液分开，制品较易纯化； (3)工业化生产可实现大批量、连续化、自动化； (4)极大地降低了生产成本。 4．缺点 需要制备纯净的酶，稍有不慎，酶就会失活。 二、固定化细胞 1．含义 用适当的载体将合成酶的细胞固定起来。 2．优点 比固定化酶更简捷，使用寿命更长。 三、木瓜蛋白酶的固定化操作技术 取尼龙布浸入等体积的CaCl2溶液和甲醇溶液中10 s左右―→盐酸溶液中室温下水解45 min―→蒸馏水冲洗至中性―→室温下放入戊二醛溶液中浸泡20 min―→磷酸缓冲液(pH为7.8)反复洗涤―→木瓜蛋白酶溶液中固定3.5 h，温度为4 ℃―→用NaCl溶液洗去多余的蛋白酶。
一、酶、固定化酶与固定化细胞的比较 直接使用酶固定化酶固定化细胞 缺点 ①对环境条件非常敏 感，易失活 ②难回收，成本高，影 响产品质量 不利于催化一系列的 酶促反应 反应物不易与酶接近， 尤其是大分子物质，反 应效率下降 优点 催化效率高、耗能低、 污染低 ①既能与反应物接 触，又能与产物分离 ②可以反复利用 成本低，操作容易、寿 命长 (1)固定化细胞使用的都是活细胞，因此应提供一定的营养物质。 (2)固定化细胞由于保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变较小，酶活性受外界影响也较小。 二、固定化酶的制备及利用 1．酶的固定化： (1)18.6%的CaCl2溶液和甲醇溶液处理(10 s)，冲洗、吸干。 (2)3.65 mol/L的盐酸水解(45 min)，蒸馏水冲洗至中性。 (3)在5%的戊二醛溶液中浸泡(20 min)。 (4)0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤，(多次)吸干。 (5)放入1 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中(4 ℃处理3.5 h)。 2．检验酶的活性： (1)用固定化酶在适宜温度下分解蛋白质(10 min) (2)用双缩脲试剂检验 3．酶的再利用：用取出的固定化酶再分解蛋白质
纤维素酶在纺织工业中的应用 报告人：张雨菲16300270102 一、技术原理 纤维素酶(Cellulase)是一种复合酶，是由降解纤维素的一组酶的总称。 将纤维素酶分离可分为C1酶、Cx酶、葡萄糖苷等三种组分。用纤维素酶降解纤维素，C1酶仅能作用于纤维素的结晶部分，主要分解产物为纤维素二果糖；Cx酶仅能作用于可溶性纤维素的衍生物和膨胀或部分降解纤维素；葡萄糖苷分为外切β-1，4-葡聚糖酶和内切β-1，4-葡聚糖酶。内切β-1，4-葡聚糖酶可以随机切断纤维素链的β-1，4-苷键；外切β-1，4-葡聚糖酶可从纤维素链的非还原性末端分解下葡萄糖单位。它们的水解产物为纤维素二糖、纤维素寡糖和葡萄糖。葡萄糖苷酸可使C1酶、Cx酶的水解产物转化为葡萄糖。三种酶各有专一性，但能相互协调。 由纤维素酶催化的三种类型的反应：内切酶、外切纤维素酶、β-葡糖苷酶 纤维素酶的β-葡糖苷酶活性的细节
纤维素酶的作用机制非常复杂，现在为止还没有完全弄清楚。除了各组分对纤维素分子的分解作用，目前越来越多的研究显示纤维素酶各组分之间有协同作用。不过，大体上它的水解作用可以分为以下几步:(1)酶分子从水相转移到纤维的表面；(2)酶分子与纤维表面结合，形成E+S的复合物；(3)把水分子转移到酶与底物复合物的激活位点；(4)在酶与底物的复合物催化下，水与纤维的接触表面发生发应；(5)产生的产物转移到水相中。 二、技术应用 ①减量处理 纤维素织物用纤维素酶处理都伴随着纤维的减量或失重，并引起许多性能变化。减量处理主要是改善织物的柔软、弹性和悬垂性。棉织物经过纤维素酶整理后，手感和外观可以有很大的改善。因为织物表面的绒毛被去除，处理后的织物更光洁、颜色更鲜艳。织物的硬挺度和刚性降低，光滑度和悬垂性提高，使织物获得更好的手感。 ②生物抛光处理 生物抛光是一种用纤维素酶改善棉织物表面的整理工艺，以达到持久的抗起毛起球并增加织物的光洁度和柔软度。天然纤维素的结构复杂，结晶度高，在一定酶浓度和时间条件下很难把纤维素完全水解成葡萄糖单体，仅对织物表面或伸出织物表面的茸毛状短小纤维作用。生物抛光也就是去除从纤维表面伸出的细微纤维，经纤维素酶处理后稍经机械加工就可以得到表面平滑而茸毛少的织物。生物抛光的主要功效是使服装和面料长久保持光鲜、手感更柔软。 ③水洗和石磨处理 纤维素酶还广泛应用于牛仔裤产品的洗涤加工，代替石洗加工工艺。最早应用在靛蓝牛仔服装的洗涤整理上，以获得与石磨相同的染料脱色，洗白等褪色防旧效果。这种加工的原理是，首先将牛仔服装上的浆料充分去除，充分发挥纤维素酶对牛仔服装表面的剥蚀作用；纤维素酶仅对牛仔服装表面部分水解，造成纤维在洗涤时发生脱落，在纤维素酶处理时，牛仔服装在转鼓中不断发生摩擦，加速服装表面纤维的脱落，并使吸附在纤维表面的靛蓝等染料一起去除，产生石磨洗涤的效果，并具有独特的外观和柔软的手感。 ④其它处理 除上述处理外，纤维素酶还与脂肪酶、果胶酶共同应用于棉织物的精练加工，去除棉纤维中的天然杂质，为后续染色、印花和整理加工创造条件。酶精练后的织物润湿性、强度保留率与碱精练相同，失重率较少，耗水率低。纤维素酶整理也用于粘胶、Lyocell和醋酸纤维织物，能改善织物的手感、悬垂性，去除织物表面的绒毛，减少了粘胶织物的起球倾向和Lyocell织物的原纤化倾向。苎麻织物存在手感粗糙性差、穿着刺痒感问题，严重影响了苎麻织物的服用性能，通过纤维素酶减量整理，能够使织物获得柔软的手感和光洁的布面，刺痒感消失或改善。 三、技术优缺点 优点：①纤维素酶处理具有环保、节能、高效、无毒等特点，其副产品和废液可以作为肥料, 对环境无害。②酶具有专一性, 特定的酶只能水解特定的化学键。③酶在温和的温度、pH 和压力下使用。 缺点：①使用酶会提高成本,。②且酶对温度、pH 、湿度和污染物敏感。 ③酶的货架期比化学药品短。
专题4 酶的研究和应用 （一）基础知识回顾 1、探究加酶洗衣粉的洗涤效果 （1）加酶洗衣粉是指含有_______________的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：___________________________________。其中应用最广泛，效果最明显的是______________和________________。（2）_______________能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的__________或_________________。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶分别能将大分子的_____________、________和_____________水解成小分子物质，这样洗衣粉就具有更好的去污能力。 （3）在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题： 二是探究在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好；在探究此问题时，_________是变量，不同实验组之间形成______________。 三是探究不同种类的加酶洗衣粉，其洗剂效果的区别。在探究此问题时，变量是_________，污渍应是完全相同的。 （4）.实验设计遵循_______________和________________原则（5）.普通洗衣粉中含有_______。含磷污水的排放可能导致______________________________，造成水体的污染。加酶洗衣 粉可以降低____________________的用量，使洗涤剂朝 ______________方向发展，减少__________________。 2、酵母细胞的固定化
（1）.固定化酶和固定化细胞是指利用________________将___________________固定在_________________内的技术，包括哪三种方法？___________________________________。 一般来说，酶更适合采用___________________，而细胞多采用________________方法。原因在于________________________________________________________ ________________。 其中包埋法固定化细胞是指将____________均匀地包摆在不溶于水的________________中，常用的载体有_______________________________________________________ ___________。 （2）.固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产：生产高果糖浆所需要的酶是_____________，所使用的反应柱上的孔应满足酶颗粒__________通过筛板上的小孔，而反应液却可以_______出入。 生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的________注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与________________接触，转化成___________，从反应柱_________流出。 （3）.固定化酶的优点是___________________________________________________________ __ 固定化酶存在的实际问题是______________________________________________________