荧光斑马鱼
荧光斑马鱼
2003年，科学家将绿色、黄色和红色荧光蛋白质植入斑马鱼的DNA分子结构中。
1999年，新加坡国立大学科学家开始研究斑马鱼和绿色荧光蛋白质，希望能够使斑马鱼在当前有毒化学物质水域中呈现荧光色，从而实现有效的可探测性。2003年，新加坡成为第一个被批准出售转基因鱼的国家之后，几年后第一批荧
光宠物进入市场。美国市场上也出现了金色荧光鱼，今年在宠物店中每条荧光鱼价格在5-10美元。
斑马鱼及其研究应用 作者：杜颖指导老师：张源淑 摘要：斑马鱼作为一种新兴的重要模式动物之一，体外受精、胚胎透明，因此可在显微镜下直接观察发育过程及检测药物引起的内脏组织变化，在生命科学领域中应用前景十分广阔。斑马鱼体型小,适合高通量研究,还具有生长繁殖周期短及其与人类高度相似的基因组等优点，已经广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选，此外，斑马鱼还被应用于毒理学、发育生物学和遗传学等的研究。因为斑马鱼对污染物反应灵敏，现已用于监测环境污染物及污水检测。本文主要从几个方面对斑马鱼的研究进展进行了整理和归纳。 关键字：斑马鱼模式动物科学研究发育感染药物 Zebrafish and Its Application Abstract:Zebrafish as an important model animal emerging, its in vitro fertilization, transparent embryo, internal organs can be directly observed during the development and testing organ change caused by drugs under the microscope, has very broad application prospects in the field of life sciences. zebrafish also has a live, high-throughput, growth and short reproduction cycles and highly similar to the human genome, etc., it is widely used in modeling human diseases, drug screening, and secondly, zebrafish also is applied in toxicology research, developmental biology and genetics, etc.. Because of its sensitivity, it has been used to monitor environmental pollutants and water testing.This paper mainly from several aspects of zebrafish research progress has been collated and summarized Key words:zebrafish Animal models Scientific research Development Infection Drug 斑马鱼(Danio rerio)又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼,产于孟加拉、印度东部、巴基斯坦、缅甸、尼泊尔等地,是一种常见的热带淡水硬骨鱼。属辐鳍鱼纲( Actinopterygii)鲤科( Cyprinidae)。斑马鱼身体细长,呈纺锤形，成鱼体长约4-6cm,因全身布满深蓝色条纹似斑马样而得名。斑马鱼雌雄鉴别容易,雄鱼体型细长，颜色偏黄，条纹较为显著，纵纹为柠檬色；雌鱼身体肥胖，颜色较淡，纵纹呈蓝色加银灰色，在性成熟后腹部肥大。雌鱼每次可产卵300多枚，鱼卵易收集，其胚胎透明,繁殖能力强且生长发育速度快，对饲养要求低，可高密度饲养，与其他实验动物相比有很大优势，是一种非常受欢迎的实验动物模型。近三十年来，已有约20个斑马鱼品系的基因数据库资料，全球已有超过1500个斑马鱼实验室，而我国也有超过250个实验室利用斑马鱼开展相关研究。英国桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）于2013年完成了斑马鱼的参考基因组，研究人员在此基础上比较了斑马鱼与人类基因组的异同，并进行了系统性的全基因组分析.在此综合近几十年的研究，在胚胎及遗传发育学、基因组学、药物筛选、疾病模型的建立等方向探讨斑马鱼的研究成果及进展。 1.胚胎及遗传生物学方向 斑马鱼的发育分为6个阶段：卵裂期，囊胚期，原肠胚期、分裂期、成形期
斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死
斑马鱼常见疾病 烂鳍病/病尾病（嗜水气单胞菌） 多由饲水不良，水质长期浑浊，受新水刺激过多，或鱼儿互相撕咬导致细菌感染。感染的迹象: 最初，鳍的边缘出现轻微的不透明的外观。然后膜一片片地脱落，暴露出鳍刺，鳍刺开始依次裂开。当裂缝到达身体时，受侵害的鱼通常都会死亡。感染详述: 引起烂鳍病的细菌可能经常出现，特别是嗜水气单胞菌，荧光假单胞菌和鳗弧菌，它们只在恶劣的环境里侵害不健康的鱼。这些细菌能引起一系列的症状，如斑点、区域发炎和溃疡。细菌传染引起的损伤使受侵害的鱼容易受到来自其他病原体如真菌、病毒和寄生虫的侵害。 推荐的治疗方法: A，在100千克的水中放呋喃西林粉0.2克进行浸洗消毒，多次用药后可缓解病情。 B，在100千克水中放痢特灵3~5片，浸洗病鱼30分钟。 C，在100千克水中放土霉素5~8片浸洗消毒，可预防感染此病。 D，用低浓度的高锰酸钾溶液浸洗消毒。 E，用庆大霉素浸洗，在100厘米X50厘米X35厘米的水族箱中放2支。 对于如此多的疾病，除非环境条件很满意，任何化学药物治疗都不是完全有效的。有几种以苯氧基乙醇、聚-氯-苯氧基乙醇或呋喃那斯为基础的专用处理剂，假如治疗不被耽误的话，它们可能有效。杀菌的化学药物如氯化苯甲烃胺（新洁尔灭），也能使用。对于冷水鱼类的治疗，水温至少应该升高到16度。 对付烂尾如果一时找不到鱼药，可到药店去买泻痢停（肤腩睉酮），找一小缸药浴，40CM缸加8片（慢慢搓溶于水），同时充气。若是热带鱼将水温升到30摄氏度，隔天补加一半药片，效果极佳。一般一周内会康复。 烂鳃病 患烂鳃病多由寄生虫寄生或细菌感染引起，故有寄生虫烂鳃病和细菌性烂鳃病两种。 （1）寄生虫烂鳃病：其病原体是指环虫或车轮虫，它们交互感染，鳃部明显浮肿，鳃盖张开困难，严重时，鳃丝局部溃烂，以至鳃软骨外露，鱼体呼吸困难，最终死亡。防治方法：可选用晶体敌百虫0.5-0.8克，放在10千克水中，浸洗病鱼10-15分钟。也可选用晶体敌百虫0.2克、硫酸铜0.2克、亚硫酸铁0.2克，混合放入10千克水中，浸洗病鱼10-15分钟。或选用晶体敌百虫0.2--0.3克溶于水中，泼洒在1吨饲水中，每周用药1-2次，可有效杀死水中的寄生虫。（2）细菌性烂鳃：其病原体是水霉菌,病鱼鳃丝严重失血,鳃丝发白,严重时有絮状菌丝粘附,死亡率极高。防治方法：可选用食盐50克、小苏打50克，混合放在10千克水中，浸洗病鱼15-20分钟。也可选用0.7克孔雀石绿，放在100克水中，浸洗病鱼15-30分钟。 （3）粘孢子虫性烂鳃：其病原体是粘孢子虫，鳃丝会出现许多肉眼可见的灰白色点状或胞囊，由小变大破坏鱼鳃，当胞囊一旦破裂，无数个孢子虫进入饲水，重新侵入健康鱼的鳃部，鳃丝失血导致大批死亡。粘孢子虫引起的烂鳃病比较少
它是发育生物学家的得力助手，是医学研究的后起之秀，是环境监测的哨兵，是指示兵，是药物研发的新宠，它就是脊椎类模式动物明星斑马鱼（zebrafish，Danio rario）。 一、斑马鱼基本特点： 原产地：热带淡水鱼，原产于喜马拉雅山南麓的印度、巴基斯坦、孟加拉和尼泊尔等南亚国家。成鱼体长3-100px，略呈纺锤形，头小而稍尖，吻较短，身躯玲珑而纤细，因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝色与银色相间的条纹而得名。 http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/ch03f09.jpg 斑马鱼是体外受精发育，胚体透明。胚胎发育快，受精后3天左右孵化出膜，天左右开口进食，约3个月达到性成熟，寿命可达2年以上。斑马鱼可常年产卵，繁殖周期3-4天，一对成年斑马鱼每次可产卵200-300枚，受精率通常在70%以上。养殖温度一般在23-31℃，15℃左右仍可存活，最佳养殖温度在25-28摄氏度之间，pH值在6.8~7.8，硬度在2~6之间。 二、斑马鱼作为模式生物的起源和发展 1938年，美国布朗大学Roosen-Rung教授首次报道斑马鱼发育形态学研究成果。1950年代，美国罗格斯大学K. Kenneth Hisaoka教授首次报道斑马鱼毒理学研究成果。1972年，美国俄勒冈大学George Streisinge教授开始斑马鱼发育生物学研究和模式动物建立工作。1989年，美国俄勒冈大学Monte Westerfield教授出版斑马鱼研究圣经The Zebrafish Book第一版。1998年，首个斑马鱼模式生物数据库ZFIN成立（https://www.doczj.com/doc/8b7383916.html,）。1998年，全球第一家斑马鱼药物研发
基于斑马鱼的模式生物的关于人类疾病的最新研究进展 摘要：作为一种理想的生物实验模型，斑马鱼在生物学和人类疾病发面有着广泛的科研价值。参考以斑马鱼物生物模型所得的实验研究对于人类疾病的防治有重要的借鉴意义。 关键词：斑马鱼，模式生物，人类疾病 正文： 随着现代生物科学的不断发展，传统的以单一生物模型为研究模板的方式已经不能 满足日益丰富的研究内容，越来越多的生物学研究开始转向以模式生物为研究对象。由于 模式生物的基因在进化的保守性以及遗传密码的通用性，模式生物为其他的实验生物提供 了良好的实验模板，因此，选择合适的模式生物可以使实验祈祷事半功倍的效果。[1] 就目前所用于科学实验的模式生物而言，主要有果蝇，大肠杆菌，斑马鱼，小鼠， 酵母菌和拟南芥等。其中，斑马鱼以其容易捕获，易于饲养，生长周期短，繁殖能力强， 基因组与人类有高度保守性，使得斑马鱼及其胚胎在模式生物研究领域起着不可替代的重 要作用[2]。早在1981年，在Oregon带血的著名遗传学家Streisinger等就在Nature杂志 上发表了第一篇关于斑马鱼的科研论文。自此之后，斑马鱼就开始广泛的运用于发育与遗 传毒理学、生物学、医学、环境毒理学和药物研发等多个领域。[3]在这里主要介绍斑马鱼 及其胚胎在人类疾病模型构建中的研究应用。 一、关于造血疾病的模型研究 斑马鱼血小板和人类的有所差异，主要为带有稀疏细胞质巨大细胞核的有核细胞。但在电镜下表面较为光滑，染色质细密，较易于观察。不过最主要的是两者在生理功能上 具有某些相似性，包括血小板的黏附、激活聚集和释放反应等。所以斑马鱼作为模式生物 研究血小板具有较强的可行性。Gregory等[4]通过将斑马鱼幼鱼暴露在FeCl3中，利用激光损伤的方法损伤血管壁，构建血管闭塞模型。发展了激光介导血栓形成的方法，并通过这 个方法来了解斑马鱼血小板功能的变化。Langenau等[5]将源于小鼠的c-myc基因与斑马鱼 胚胎的Rag2基因融合，再在这个基因的尾部连接上GFP基因，之后植入到斑体细胞，从而影响了造血细胞的的基因表达，建立了斑马鱼白血病模型。 二、关于神经系统疾病的模型研究 在斑马鱼关于人类神经系统的疾病研究主要指关于阿尔茨海默病(AD)，帕金森综合 症(PD)，亨廷顿舞蹈症(HD)以及肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的疾病研究。
新型模式动物斑马鱼在分子生物学和医学中的应用举例 摘要：斑马鱼由于其独特的生物学特性作为一种新型的模式动物在医学、分子生物学、发育生物学、环境监测和毒性检测等方面在国内外得到了广泛的应用。本文概述了其在分子生物学和医学中的具体应用两例，展示了其在实验动物学中诱人的发展前景。 关键词：斑马鱼、模式动物 斑马鱼(又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，Brachydanio rerio)，鲤科，原产自印度、孟加拉国。体长为4-6cm。雌雄鉴别较容易，雄鱼的蓝色条纹偏黄，间以柠檬色条纹；雌鱼的蓝色条绞偏蓝而鲜艳，间以银灰色条纹，身体比雄鱼丰满粗壮，各鳍均比雄鱼短小。饲养容易，对水质要求不严，水质为中性，水温以22～26℃为宜。耐热性和耐寒性都很强，可在10℃以上的水中很好地生长，属低温低氧鱼。可与其他小型鱼混养，对食物不挑剔，各种动物性饲料，干饲料均可，很少患病。繁殖比较容易，繁殖水温以24℃为宜。每尾雌鱼每次产卵约300余粒，体型较大者有时可产上千粒。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。受精卵约经36h孵化，两天后仔鱼卵黄囊消失，可游动摄食。发育温度要求在25-31℃。幼鱼三个月可达性成熟。斑马鱼凭借自身优势，已成为理想的脊椎动物模型。 实例一：“绿色”胰岛β细胞发育转基因斑马鱼模型[1]。第一:克隆表达载体,挑选酶切鉴定后阳性的克隆作注射准备。第二：显微注射，即让外源性DNA片段进入斑马鱼基因组。第三：生殖系转基因系的筛选和建立，即蔡斯体视荧光显微镜下筛选胰岛位置特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)的胚胎．建立生殖系稳定遗传的Fl代胰岛β细胞转基因斑马鱼系。第四：应用PCR和WISH证实为转基因斑马鱼系。第五：形态学观察，荧光显微镜下观察荧光标记并拍摄得到荧光标记物于胚胎侧面和背面的整体分布图。第六：应用化学遗传学方法破坏斑马鱼胰岛β细胞，模型建立。斑马鱼的应用为高通量筛选具有胰岛β细胞保护和再生作用的药物(包括中药、草药、小分子化台物等)提供了理想的动物疾病模型，为糖尿病这一核心病机的治疗带来了机会。 实例二：flk—GFP斑马鱼模型[2]，它是研究抗血管生成药物的理想动物模型。方法如下：成年flk一GFP转基因斑马鱼交配，产卵，待分裂至16—256细胞期时，将鱼卵随机置于96孔培养板(U底)中。实验组，每孔载入3个胚胎及鱼水(速溶海盐40 g加蒸镏水1000 mL)200μl，于4 hpf(hourpost fenilized,受精后小时数)时，自化合物库中加样，使加药后终浓度为10μmol·L-1；28℃培养箱中,培养至24 hpf；于倒置荧光显微镜下，观察flk—GFP转基因斑马鱼的血管生成情况。于同一培养板中，留出一列孔，不予加药，作为对照组。近年来随着肿瘤发病机制研究的不断深入，分子靶向药物的研究成为肿瘤治疗学研究的热点之一。血管生成抑制剂就是其中一类。斑马鱼通过血管芽的发育形成血管，与哺乳动物的血管形成途径需要相同的生物活性物质。flk—GFP转基因斑马鱼是一种在血管内皮细胞表面表达GFP的转基因动物，研究者可以在多孔板中观察斑马鱼胚胎的血管生成发育过程，从而能直接快速地筛选出影响血管形成过程和形状的化合物。因而，flk—GFP斑马鱼已成为研究血管生成独特的模式生物。 斑马鱼不仅在分子生物学和医学中得到广泛应用，在发育生物学、遗传学、毒性评价、胚胎毒性技术中都有应用[3]。如由于斑马鱼胚胎发育迅速、具有透光性，各器官正处于发育形成阶段，对水质污染和受压状态非常敏感，可用来监测水质的细微变化；能耐受的氧含量范围宽，所需溶液少，尤其适用于代谢物的检测；胚胎的急性毒性实验与成鱼具有很好的相关性，完全可以替代成鱼用于急性毒性检测；OECD也将斑马鱼胚胎检测技术列为测定和评价化学品毒性，尤其是致畸性的标准方法，并制定了详细的操作指南(OECDTG212)。此外，斑马鱼已经作为人类疾病研究模型，而且也被认为是人类基因组计划中功能染色体组研究的理想模型。以上综述可见，斑马鱼的发展前景是十分诱人的，它将在更宽广的领域得到更深入
斑马鱼研究报告（Zebrafish,Danio rerio）
目录 一﹑斑马鱼 二﹑斑马鱼基因与人类极为相似 三﹑利用斑马鱼作为模式动物 四﹑斑马鱼的心生 五﹑突变斑马鱼及转基因斑马鱼表現类似人类疾病 六﹑斑马鱼胚胎研究 七﹑研究者在活的斑马鱼身上直接观看器官的发育与病变 八﹑解开人与体內活菌共生秘密 九﹑斑马鱼胚胎基因有助研究癌症、阿滋海默和帕金森症 十﹑视网膜有自我修复潜能 十一﹑培育变种斑马鱼可望用于人脸整型 十二﹑基因決定人类肤色 十三﹑斑马鱼的运动情形肌肉的发育及肌肉与运动神经的调控机制 十四﹑细胞如何储存脂肪有助減肥新疗法 十五﹑类固醇荷尔蒙的功能与调控 十六﹑中神经细胞形成之分子调控机制 十七﹑斑马鱼基因调控网路 十八﹑干扰斑马鱼基因的技术 十九﹑培育环保转基因斑马鱼 二十﹑改造斑马鱼基因來试水质 二十一﹑利用斑马鱼作为人类疾病模型及药物节选 二十二﹑药物节选 二十三﹑抗癌药物节选
斑马鱼 原产于东印度恒河流域，亦分布于巴基斯坦、尼泊尔、缅甸。斑马鱼成鱼体长约4～5公分，体呈纺锤形，稍侧扁。体侧从头至尾布满多条蓝色条纹，酷似斑马，故得名斑马鱼。 1.斑马鱼是研究发育生物学的新兴模式动物。 2.斑马鱼由于具有饲育容易、胚胎透明、体外受精、突变种多、遗传学工具成熟等诸多优点，近年来已成为研究脊椎动物发育与人类遗传疾病的新兴模式动物。 3.与其他脊椎动物相较下，斑马鱼最大的优点就是具有多达6000多种的遗传突变种，这些突变种的建立大致上是利用X射线、ENU或反转录病毒的感染造成基因组的突变，之后再经由多次的子代筛选所得。 4.突变种的表征包含如胚层分化，器官发育，生理调适与行为表现等多方面，所以可提供研究人员极佳的正向遗传学材料来进行发育机制上的研究。 5.在斑马鱼系统中也开发出阻断基因功能的工具-Morpholino，可快速以逆向遗传学手法来验证基因的功能。所以正向遗传学与逆向遗传学的巧妙利用，可以正确推导出斑马鱼遗传发育途径，也是目前斑马鱼成为研究人类疾病新兴模式动物的主要原因。 斑马鱼基因与人类极为相似 在实验室里，动物在生物研究领域中对人类有巨大的贡献。除了人们所熟悉的鼠、兔等动物外，斑马鱼凭借繁殖能力强、胚胎透明、生长速度快以及其基因与人类基因相似性高的优势，已成为生物学家在实验室进行科研的新选择。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。因为斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响。 雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。正
鱼病种类很多。按照发生原因的不同，大体分为两类：一类是非感染性疾病，一类是感染性疾病。两类疾病对斑马鱼的健康均可形成严重的危害。其中以感染性疾病造成的危害较为严重，常常可形成大规模的爆发或感染，严重影响斑马鱼的质量和实验结果的准确性。斑马鱼属于鲤科鱼类。感染鲤科鱼类动物的病原均有可能感染斑马鱼。本章将对斑马鱼中常见疾病及可能的应对方法做一个简单的介绍。 第一节细菌性疾病 1、分支杆菌病 病原：海分支杆菌（M. marinum）、脓肿分支杆菌（M. abscessus）、龟分支杆菌(M. Chelonae)、偶发分支杆菌 (M. Fortuitum)、草分支杆菌(M. Peregrinum) 和嗜血分支杆菌(M. Haemophilum)等。分支杆菌属是一类细长或略带弯曲的需氧杆菌，该属细菌一般不易着色，需要进行抗酸性染色，此外染色时需要加温或者延长染色时间。该病能引起鱼结核病。 临床症状和病变：溃疡、出血、头部周围充血、鱼鳞凸起，鱼鳍磨损，皮肤或者鳃苍白等。内脏器官会有白色结节出现（图）。 图分支杆菌感染病理图。 左侧，宝刀鱼头肾组织感染分支杆菌产生的白色肉芽肿；中间，分支杆菌感染产生的肉芽肿切片（其切片内含有空腔的巨噬细胞）；右侧，分支杆菌感染雨肠道切片的抗酸染色（抗酸菌染色呈红色，非抗酸菌染色呈蓝色） 显微观察与诊断：诊断时根据上诉症状，再取内脏中的小结节做涂片，进行抗酸染色后如发现长杆形的抗酸菌，基本就可以确诊。也可根据分支杆菌16S rDNA基因保守序列设计引物，PCR扩增一段924bp的特异性片段，对其测序就可快速得出鉴定结果。 防治：一般来说分支杆菌感染很难用抗生素进行根治，有文献报道50 ppm卡拉霉素对其有一定的控制作用。此外，优化饲养条件对其预防也有一定作用。 2、细菌性败血症 病原：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria），河弧菌生物变种（Vibrio fluvialis），产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，豚鼠气单胞菌（）等气单胞菌属。气单胞菌属均为革兰氏阴性菌，其中是嗜水气单胞菌能产生外毒素，具有溶血性、肠毒性及细胞毒性。 临床症状和病变：体表及内脏充血, 出血, 突眼, 腹部膨大,有淡黄色或红色腹水, 肝、脾、肾肿大, 花肝, 脾紫黑色, 严重贫血等。 显微观察与诊断：显微镜下可见红细胞肿胀，有时发生溶血，在脾、肝、胰、肾中均有较多的血源性色素沉着。在病鱼腹水或者内脏检出嗜水气单胞菌PCR确诊。 3、滑动细菌（细菌性鳃病、环境性鳃病） 病原：黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、屈桡杆菌属(Flexibacter spp.)；淡水养殖中常被检测出来的菌尾柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)和嗜鳃黄杆菌(F. branchiophilum)。其中，柱状黄杆菌不能用
斑马鱼常见鱼病 鱼病种类很多。按照发生原因的不同，大体分为两类：一类是非感染性疾病，一类是感染性疾病。两类疾病对斑马鱼的健康均可形成严重的危害。其中以感染性疾病造成的危害较为严重，常常可形成大规模的爆发或感染，严重影响斑马鱼的质量和实验结果的准确性。斑马鱼属于鲤科鱼类。感染鲤科鱼类动物的病原均有可能感染斑马鱼。本章将对斑马鱼中常见疾病及可能的应对方法做一个简单的介绍。 第一节细菌性疾病 1、分支杆菌病 病原：海分支杆菌（M. marinum）、脓肿分支杆菌（M. abscessus）、龟分支杆菌(M. Chelonae)、偶发分支杆菌(M. Fortuitum)、草分支杆菌(M. Peregrinum) 和嗜血分支杆菌(M. Haemophilum)等。分支杆菌属是一类细长或略带弯曲的需氧杆菌，该属细菌一般不易着色，需要进行抗酸性染色，此外染色时需要加温或者延长染色时间。该病能引起鱼结核病。 临床症状和病变：溃疡、出血、头部周围充血、鱼鳞凸起，鱼鳍磨损，皮肤或者鳃苍白等。内脏器官会有白色结节出现（图3.1）。 图3.1分支杆菌感染病理图。 左侧，宝刀鱼头肾组织感染分支杆菌产生的白色肉芽肿；中间，分支杆菌感染产生的肉芽肿切片（其切片内含有空腔的巨噬细胞）；右侧，分支杆菌感染雨肠道切片的抗酸染色（抗酸菌染色呈红色，非抗酸菌染色呈蓝色） 显微观察与诊断：诊断时根据上诉症状，再取内脏中的小结节做涂片，进行抗酸染色后如发现长杆形的抗酸菌，基本就可以确诊。也可根据分支杆菌16S rDNA基因保守序列设计引物，PCR扩增一段924bp的特异性片段，对其测序就可快速得出鉴定结果。 防治：一般来说分支杆菌感染很难用抗生素进行根治，有文献报道50 ppm卡拉霉素对其有一定的控制作用。此外，优化饲养条件对其预防也有一定作用。 2、细菌性败血症 病原：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonassobria），河弧菌生物变种（Vibrio fluvialis），产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，豚鼠气单胞菌（A.caviae）等气单胞菌属。气单胞菌属均为革兰氏阴性菌，其中是嗜水气单胞菌能产生外毒素，具有溶血性、肠毒性及细胞毒性。 临床症状和病变：体表及内脏充血, 出血, 突眼, 腹部膨大,有淡黄色或红色腹水, 肝、脾、肾肿大, 花肝, 脾紫黑色, 严重贫血等。
Wholemount Immunohistochemistry of 0- to 40-h Zebrafish Embryos 1Fixation：Fix the embryos in 4% paraformaldehyde for 3 h at room temperature or overnight at 4°C. 20 embryos in each 1.5 mL volume microcentrifuge tube. After fixation, replace the solution with an equivalent volume of PBS (此步骤后胚胎可存放数周，但下次用时要wash 5 × 5 min with PBS). 2Blocking: Dilute the goat serum to 10% (v/v) in PBT and incubate 20–30 embryos in 0.5 mL of this solution for 1 h at room temperature on a rocking table. 3Primary antibody incubation: Remove the blocking solution with a pipet. Dilute the primary antibody in PBT plus 1% goat serum to the appropriate concentration, as recommended by the supplier. Apply the primary antibody in a minimum volume of 100 μL. overnight at 4°C on a rocking table with gentle agitation. 4Washing: remove as much of the primary antibody as possible and replace with a large volume of washing solution (PBT). Change the wash three to five times, with at least 15 min for each wash with gentle rocking at room temperature (洗的时间长，背景会降低). 5Dilute the secondary antibody：Dilute the secondary antibody in PBT plus 1% goat serum to the appropriate concentration, as recommended by the supplier. overnight at 4°C on a rocking table with gentle agitation. keep the embryos in the dark from this step on to prevent bleaching. 6Remove the secondary antibody and wash the embryos in PBT. Change the wash three to five times, with at least 15 min for each wash with gentle rocking at room temperature. Finally transfer the embryos to PBS alone prior to the detection steps. At this point, if fluorescence is used, clear the embryos in graded glycerols and mount in 70% glycerol containing an antibleaching agent such as Citifluor(抗荧光衰退剂) (Agar Scientific Ltd). 7Examine use confocal microscope. 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）: 配制方法：称取10g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入125～200ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于250ml，充分混匀。 PBS: 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in 1 L dH2O, pH 7.4, PBT: PBS plus 0.8% Triton X-100 (Sigma). goat serum (sigma) graded glycerols: 30%, 50%, and 70% glycerol in PBS Citifluor(抗荧光衰退剂) (Agar Scientific Ltd)
基于铱配合物磷光探针的活细胞及斑马鱼成像研究磷光铱配合物具有发射寿命长、光稳定性好、发射波长易调节和量子效率高等优异的光物理性质,被广泛应用于化学传感和生物成像等领域。共聚焦激光扫描显微镜和时间分辨光学显微镜是生命科学领域先进的光学成像设备。 共聚焦显微镜具有优越的光学切片和三维重建能力,可在体内和体外获得高度清晰的图像。基于磷光铱配合物长的发射寿命,可通过时间分辨光学技术,结合发光寿命成像和时间门成像,有效地消除生物体内短寿命自发荧光的干扰,提高检测信噪比。 共聚焦激光扫描显微镜和时间分辨光学显微镜在活细胞成像领域已得到很好的发展,但在活体成像领域报道较少。本论文中,我们首先探究了细胞及线粒体内极性变化,其次我们将基于铱配合物的磷光探针注射进斑马鱼体内,实现斑马鱼活体层次的时间分辨光学成像。 主要工作有:1、以对极性敏感的线粒体靶向磷光探针为研究对象,通过共聚焦和发光寿命成像显微镜发现,相比于HL-7702正常细胞,磷光探针在HepG2癌细胞中发射光谱蓝移并且发射寿命变长,表明癌细胞极性比正常细胞小,通过发射寿命不同成功区分了正常细胞与癌细胞,这在癌症诊断方面具有良好的应用前景;接着通过发光寿命成像显微镜监测在细胞凋亡过程中线粒体极性的变化,结果表明在细胞凋亡过程中探针在线粒体中发射寿命逐渐变长,说明线粒体极性变小,并且不同细胞状态下发射寿命不同,从而通过发光寿命成像实现了对活细胞、凋亡细胞和死细胞的区分。2、探究水溶性磷光探针的斑马鱼成像实验,通过考察显微注射时斑马鱼麻醉剂的浓度、注射针头粗细、注射位置、成像时斑马鱼摆放位置以及磷光探针注射体积,一系列不同因素对显微注射及成像结果的影响,得到