Botanical Research 植物学研究, 2015, 4, 25-31
Published Online March 2015 in Hans. https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,/journal/br
https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,/10.12677/br.2015.42004
Establishment and Optimization of
Agrobacterium-Mediated Transient
Gene Expression System in Tabacco
Liwei Wen, Hongliang Zhu*
Department of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing
Email: 210824@https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,, *hlzhu@https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,
Received: Apr. 15th, 2015; accepted: May 1st, 2015; published: May 6th, 2015
Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
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Abstract
To establish and optimize a transient expression system in Nicotiana benthamiana, the method was developed with the β-glucuronidase (GUS) and Ripening Inhibitor (RIN) as marker genes. Us-ing the agrobacterium-mediated transformation method, GV3101 was used for the effects of dif-ferent bacteria concentration on the efficiency of protein transient expression in Nicotiana ben-thamiana. Observed by the results, a higher transient expression level of GUS & RIN gene could be obtained as OD600 value of A. tumefaciens for intiltration 1.0. The entire process only took 25 days from sowing seed to protein analysis. Therefore, this method is simple and rapid. It has a potential application in dissecting gene expression and function in Brassica napus.
Keywords
Tobacco, Leaf, Transient Expression System
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
文莉薇，朱鸿亮*
中国农业大学，食品科学与营养工程系，北京
Email: 210824@https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,, *hlzhu@https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,
*通讯作者。
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
收稿日期：2015年4月15日；录用日期：2015年5月1日；发布日期：2015年5月6日
摘要
本研究以GUS基因和RIN基因作为报告基因，利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101对烟草叶片注射侵染，探究了农杆菌侵染浓度对本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达效果的影响，建立并优化了烟草中的瞬时表达体系。结果表明，β-葡萄糖苷酶(GUSβ-glucuronidase)基因与RIN基因在OD600 = 1.0的侵染浓度时表达效果最佳。农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达方法简单高效，结果准确可靠，从种子播种到收获蛋白只需25天左右。该体系的建立与优化为基因表达和蛋白功能性研究等方面提供了一定支持。
关键词
烟草，叶片，瞬时表达
1. 引言
本氏烟草(N. benthamiana)是一种原产于澳大利亚北部地区的一种茄科烟草属的植物，于1837年首次被Benjamin Bynoe发现并采集。自发现以来，本氏烟草因其叶片的易感染性与免疫和防御信号功能，被作为植物病毒学中的典型物种[1]，同时它也是病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)实验的植物生物反应器。在Gene Bank中可获得16,000个本氏烟草的单个基因序列，通过序列对比分析发现烟草与其他物种在24个基因上具有直系同源性[2]。
目前植物瞬时表达技术已经被广泛利用，该体系具有操作简便，安全性更高的特点，是迄今为止分子生物学研究中应用最广泛的方法[3]，主要用于研究外源基因的表达、蛋白质间的互作、转录因子与顺式作用元件的互作、启动子功能分析、蛋白的亚细胞定位等方面[4]。但是仍有一些技术问题尚未解决，如目前大部分研究仅处在叶片组织层面,农杆菌本身对植物抗病性有一定影响[5]；在体外表达蛋白质过程中，并非所有的核糖体都能翻译表达全长蛋白，此过程可能影响抗体与蛋白的结合，甚至难以筛选到结合的抗体[6]。
β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是一种以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物的水解酶，其产物可通过组织化学法、分光光度法和荧光法等多种方法检测[7]。多数植物体内无内源的GUS，而通过外源导入GUS基因所表达出的GUS在植物体中可保持稳定和良好的活性。
MADS-box转录因子RIN是番茄果实成熟的主要调控因子。通过染色质免疫沉淀法，现已证明RIN 在番茄果实的成熟过程中与大量启动子结合调控基因的表达[8]，而且RIN基因控制单隐性遗传性状[9]。
近几年，rin突变体逐渐发展为研究果实成熟机理的重要材料。rin突变体果实在室温下可贮藏两个多月，果实在转色期采下贮藏，品质与正常番茄相近，但是最终果实仍然呈现绿色，这就要求在今后的育种过程中要改善rin突变体果实颜色缺陷，提高其商品性[10]。
以农杆菌介导的烟草瞬时表达体系主要是利用农杆菌Ti质粒上的T-DNA(transfer DNA)的复制转移并整合到植物细胞的基因组中的特性，通过构建含有T-DNA片段中带有外源基因的载体，进而通过农杆菌介导，瞬时表达T-DNA中编码的基因，进行植物细胞的转化。通常2~3天后即可检测到外源基因的表达。目前常用载体有pMOG800、pBI121等，常用的农杆菌主要有GV3101、LBA4404、EHA105、AGL1等。目前，瞬时表达体系已在多个物种间逐渐建立[11]，并已成功应用于多种植物，如草莓[12]、拟南芥、
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
莴苣[13]、玉米[14]和黄瓜[15]等，更适用于基因–蛋白的相关细胞生物学研究。有实验表明，将LB培养基上活化后的农杆菌以10%接种量重新接种到新的培养基上有利于提高蛋白的表达量[16]。本研究以pCAMBIA-35S-35S-FMF-GUS和pCAMBIA-35S-35S-FMF-RIN为载体，采用农杆菌注射侵染的方法，以GUS基因和RIN基因作为报告基因，检测了不同农杆菌侵染浓度对瞬时表达效率的影响，优化了烟草叶片中的基因瞬时表达体系，高效表达了GUS基因及RIN基因。
2. 材料与方法
2.1. 烟草材料
本氏烟草(Nicotiana benthamiana)种子。
2.2. 菌株与载体
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，植物表达载体pCAMBIA-35S-35S-FMF-GUS (图1)、pCAMBIA-35S-35S-FMF-RIN (图2)。
2.3. 主要生化试剂
吗啉乙磺酸MES、乙酰丁香酮ASG、卡那霉素(Kanamycin) (50 mg/ml)、庆大霉素(Gentamicin) (50 mg/ml)、利福平(Rifampicin) (50 mg/ml)、一抗Anti-c-myc Rabbit、Anti-Plant-Actin Rabbit Polyclonal An-tibody、二抗Anti-Rabbit IgG HRP均购于Sigma公司，PVDF膜购于Millipore公司，ECL发光液购于普利莱公司。MgCl2为国产化学纯。
2.4. 仪器
Trans-Blot SD半干转印槽购于BIO-RAD公司，P4蛋白垂直电泳仪DYCZ-25E型购于北京市六一仪器厂，X-OMAT BT医用X-光片购于柯达公司，X射线摄影暗夹购于粤华公司，易杰膜购于EASYBIO 公司。
2.5. 方法
选取饱满烟草种子，4℃用水浸泡48 h，播种于土壤中，在(26 ± 1)℃、16 h/d光照的培养箱中培养。约25天后待其为五叶或六叶期时取其植株中较宽大平坦的叶片用于实验。
分别将含有pCAMBIA-35S-35S-FMF-GUS、pCAMBIA-35S-35S-FMF-RIN质粒的GV3101农杆菌进行活化。用已灭菌的1 ml枪头挑取农杆菌加入LB培养基(含50 mg/L卡那霉素，100 mg/L利福平，100 mg/L 庆大霉素)中，28℃下，200 rpm培养过夜。吸取60 μl菌液加入3 ml LB液体中，按比例加入2-(N-吗啡啉)-乙磺酸(MES，工作浓度10 mM)、乙酰丁香酮(ASG，工作浓度20 μM)、卡那霉素(工作浓度50 mg/L)，利福平(工作浓度100 mg/L)和庆大霉素(工作浓度100 mg/L) (表1)。于28℃，200 rpm培养过夜。第二天收集菌体，4℃下，5000 ×g离心5 min，去除上清液，留菌体。将不同量的菌体悬沉在侵染液(10 mM的MES，200 μM乙酰丁香酮，10 mM氯化镁)中，配制3种不同浓度梯度的农杆菌菌液(OD600 = 0.2，1.0，2.0)，室温下静置培养3 h后待用。
用已消毒的1 ml注射器，取其针头，在烟草植株叶片背面扎2~3个孔，用无针头的针管注射叶片，依靠压力将菌液注入叶片的叶脉之间。注射完毕后，置于22℃人工培养室中培养两天。
收集不同农杆菌浓度(OD600 = 0.2，1.0，2.0)下注射的烟草样本，各取300 mg烟草叶，低温(液氮)下研磨成粉末状，用等体积4 × Protein SDS extracting Buffer溶解，95℃加热10 min，6000×g离心3 min，
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
Figure 1. Construction of pCAMBIA-35S-35S-FMF-GUS
图1. pCAMBIA-35S-35S-FMF-GUS 构建示意图
Figure 2. Construction of pCAMBIA-35S-35S-FMF-RIN
图2.
pCAMBIA-35S-35S-FMF-RIN 构建示意图
Table 1. Concentration of reagents
表1. 各试剂浓度
浓度
MES ASG Kan Gen Rif MgCl 2 储液浓度
1 M 100 mM 50 mg/ml 50 mg/ml 50 mg/ml 1 M 工作浓度 10 mM 20 μM/200 μM 50 mg/L 100 mg/L 100 mg/L 10 mM
取上清液，置于?20℃保存。
按照分离胶12%，浓缩胶4%的浓度配制电泳胶，加入浓缩胶后插入梳齿，待胶凝固后放入电泳仪中，加入蛋白电泳缓冲液，拔出梳齿，以120 V 电泳90 min 。
电泳结束后，切去浓缩胶，量取剩余电泳凝胶胶部分的长宽，按照比电泳凝胶面积略大的尺寸剪裁PVDF 膜及滤纸，按照四层滤纸–PVDF 膜–胶–四层滤纸的顺序铺好，用半干式转移装置将蛋白质转移CaMV35S
FS (test)
hptll (hygromycin resistance) gene
RA kanamycin resistance pCAMBIA-35S-35S-FMF-GUS
nos terminator gusA
FMF rev
GATC 新增
FMF
FMF infusion for
35 S
CaMV 35S promot 12980 bp
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
到PVDF膜上，根据凝胶面积按0.7 mA/cm2电流转移70 min。将脱脂奶粉与washing buffer按照1:20 (m/V)配制封闭液(TBST)，将PVDF膜转移至装有封闭液的盒子中，置于室温下脱色摇床振荡封闭2 h，之后将封闭液倒掉。将一抗(anti-c-myc)用(washing buffer)稀释(1:5000 V/V)之后，加入装有PVDF膜中的盒子中，摇床常温振荡2 h。倒出一抗液，加入washing buffer，洗膜10分钟，重复洗膜三次。配制二抗(anti-Rabbit)稀释液(1:5000 V/V)并加入封闭盒中，重复上述振摇及洗涤步骤。
将ECL发光液加到PVDF膜上，放入压片夹中，静置3 min。将压片夹移入暗室，把医学X胶片放在PVDF膜上，关上压片夹，曝光3 min。结束后，将胶片取出放入显影液中静泡15 s，之后放入定影液中静泡15 s，取出X胶片观察显色情况。用扫描仪扫描X胶片，并分析目标带是否出现。
3. 结果与分析
3.1. RIN基因瞬时表达结果
蛋白印记结果(图3)表明，注射3种菌液浓度的烟草叶片均能表达出RIN蛋白，但不同浓度的农杆菌诱导基因瞬时表达的水平不同；总体上，RIN蛋白表达量随农杆菌菌液浓度增大而呈增强趋势。在内参蛋白Actin基本表达一致的情况下，当OD值分别为1.0和2.0浓度时，RIN瞬时表达水平明显高于农杆菌浓度为0.2时的表达水平。但是，1.0与2.0浓度下，RIN蛋白表达量相差不大(图3)。
3.2. GUS基因瞬时表达结果
同样，对于GUS基因，图4表明菌液浓度为1.0和2.0的瞬时表达水平高于侵染浓度为0.2，而且，1.0时的表达效果比2.0的更佳，表明高浓度农杆菌可能会影响基因瞬时表达。
anti-c-myc抗体检测RIN基因，以Actin蛋白作为内参。
Figure 3. Effects of optical density of Agrobacterium
to RIN expression
图3. 烟草中不同农杆菌侵染浓度对RIN瞬时表达
的影响
anti-c-myc抗体检测RIN基因，以Actin蛋白作为内参。
Figure 4. Effects of optical density of Agrobacterium to GUS expression
图4. 烟草中不同农杆菌侵染浓度对GUS瞬时表达的影响
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
综上所述，本实验设置了3个农杆菌菌液浓度(OD600= 0.2、1.0、2.0)，分别表达了GUS、RIN两种基因，检测了不同菌液浓度下蛋白表达量的大小。研究结果表明，GUS以及RIN的最佳顺时表达水平的农杆菌菌液浓度为OD6001.0。
4. 讨论
本实验以农杆菌为介导，以GUS和RIN为报告基因，通过检测蛋白表达量，探索了烟草叶片中农杆菌菌液浓度对基因瞬时表达的影响及最佳诱导菌液浓度。如图3和图4，菌液浓度过低时，农杆菌数目偏少，会使瞬时表达率降低；而农杆菌密度过大时，叶片细胞中农杆菌的结合位点是有限的，农杆菌之间过于激烈的竞争不利于菌体与植物细胞的结合，同时过高的菌液浓度会对烟草造成较大的毒性伤害，影响基因瞬时表达率[17]。因此寻找适合的侵染条件是十分必要的。我们的实验结果表明，农杆菌菌株GV3101的侵染浓度为OD600= 1.0时，瞬时表达效果最好。目前其他研究也发现在多种植物中建立的瞬时表达体系与植物材料的遗传背景、生长状态和农杆菌的菌株和侵染浓度等都有关系[18]。本研究以在细胞质中表达的GUS基因以及在细胞核中表达的RIN基因为报告基因，研究在烟草叶片中统一进行的蛋白瞬时表达系统，探寻烟草叶片中蛋白瞬时表达时最佳农杆菌菌液浓度，为蛋白亚细胞定位、外源基因的表达、蛋白质间的互作、转录因子与顺式作用元件的互作、启动子功能分析、蛋白功能的研究提供了简便快捷的方法。
致谢
本论文由国家自然科学基金31471921、“中央高校基本科研业务费专项(2014RC006)资金”和中国农业大学本科生科研训练计划(URP)共同资助，感谢杨永芳、于童童、王恬、李冉、李蕊对本实验的技术支持。
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2019-2020年高考生物必背知识点基因的表达 摘要：小编为大家整理了高考生物知识点总结，内容基因在染色体上呈间断的直线排列，每个基因中可以含有成百上千个脱氧核苷酸，希望大家在查看这些高考知识点的时候注意多加练习。 名词： 1、基因：是控制生物性状的遗传物质的功能单位和结构单位，是有遗传效应的DNA片段。基因在染色体上呈间断的直线排列，每个基因中可以含有成百上千个脱氧核苷酸。 2、遗传信息：基因的脱氧核苷酸排列顺序就代表～。 3、转录：是在细胞核内进行的，它是指以DNA的一条链为模板，合成RNA的过程。 4、翻译：是在细胞质中进行的，它是指以信使RNA为模板，合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。 5、密码子(遗传密码)：信使RNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基，叫做～。 6、转运RNA(tRNA)：它的一端是携带氨基酸的部位，另一端有三个碱基，都只能专一地与mRNA上的特定的三个碱基配对。 7、起始密码子：两个密码子AUG和GUG除了分别决定甲硫氨酸
和撷氨酸外，还是翻译的起始信号。 8、终止密码子：三个密码子UAA、UAG、UGA，它们并不决定任何氨基酸，但在蛋自质合成过程中，却是肽链增长的终止信号。 9、中心法则：遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质的转录和翻译过程，以及遗传信息从DNA传递给DNA的复制过程。后发现，RNA同样可以反过来决定DNA，为逆转录。 语句： 1、基因是DNA的片段，但必须具有遗传效应，有的DNA片段属间隔区段，没有控制性状的作用，这样的DNA片段就不是基因。每个DNA分子有很多个基因。每个基因有成百上千个脱氧核苷酸。基因不同是由于脱氧核苷酸排列顺序不同。基因控制性状就是通过控制蛋白质合成来实现的。DNA的遗传信息又是通过 RNA来传递的。 2、基因控制蛋白质的合成：RNA与DNA的区别有两点：①碱基有一个不同：RNA是尿嘧啶，DNA则为胸腺嘧啶。②五碳糖不同：RNA 是核糖，DNA是脱氧核糖，这样一来组成RNA的基本单位就是核糖核苷酸;DNA则为脱氧核苷酸。 3、转录：(1)场所：细胞核中。(2)信息传递方向：DNA→信使RNA。(3)转录的过程：在细胞核中进行;以DNA特定的一条单链为模板转录;特定的配对方式：
生物技术通报 国外动态 BIOTECHNOLOG Y BU LLETIN 2004年第4期利用生物技术拯救珍稀濒危的药用植物轮冠木 Plant Cell Reports2003年21卷5期415~420页报道:轮冠木(Rotula aquatica)是紫草科芳香药用灌木。分布于印度和斯里兰卡等南亚国家、东南亚热带国家和拉丁美洲国家。 轮冠木是印度传统的药用植物。块根含收敛、苦味和利尿物质。可用于治疗咳嗽、心脏病、排尿困难(尿痛)、血液病、发热、中毒、溃疡和子宫疾患。根含固醇(rhabdiol)和尿囊素。根煎剂有利尿和轻泻作用,可用于治疗膀胱结石和性病。菲律宾常将其茎干煎剂用于利尿和发汗。此外,轮冠木的茎干纤维坚韧,可用于制绳。 轮冠木是一种濒临灭绝的植物。目前只有少数野生于多岩石的河岸。为保证药用的需要和保存物种,亟需为轮冠木建立大规模的快速繁殖系统。鉴于轮冠木种子的活力小,萌发率低,种子繁殖有困难,利用茎干切段进行繁殖又极麻烦,故寄希望于利用生物技术进行微型繁殖。 但迄今对此种有价值的药用植物尚无离体繁殖研究。为此,印度卡利卡特大学生物技术系的科学家K. P.Martin,利用轮冠木的腋芽进行了离体繁殖。表明最有效的腋芽繁殖培养基是加入1.0mg1-1N6-苄氨基嘌呤(BAP)和0.5mg1-1吲哚-3-丁酸(IBA)的M S培养基。生根的再生苗经过温室驯化后,成功地移植于大田,有80%的小植株存活。3个月内可从单一的结节外植体获得约750个小植株。 美启动烟草基因组测序计划 AgBiotech Reporter2003年20卷1期10页报道:据悉,美国Philip Morris公司已同意给北卡罗来纳州立大学拨款17.6百万美元,用于绘制烟草基因图谱。 北卡罗来纳州立大学的农业和生命科学学院在得到这笔款项后,将用4年半的时间来完成烟草基因组测序的创新计划。 北卡罗来纳州立大学的科学家说,有了烟草基因图谱,就可以利用基因工程对烟草的叶片进行改造,使其适合于其他用途。 已知烟草含有25000至50000个基因。烟草基因组测序计划的领导人、植物病理学和遗传学教授Charles Opperman宣称: 我们希望能检测出烟草90%以上的基因序列。将有可能确定某些基因,虽然不是全部基因的功能。 印度发现24种新的植物基因 AgBiotech Reporter2003年20卷2期15~16页报道:在 印度生物多样性图谱和数据库 建成之初,印度科学家已利用这一图谱和数据库,在27种印度本地植物中,鉴定出24种新的基因。出于保密的考虑,没有能够公布这些植物物种的名称。目前,科学家已为这些新基因申请了具有巨大经济效益的专利权。 据称,印度科学家已从喜马拉雅山脉的植物中鉴定出抗胁迫和抗冷基因。还已从沙漠地带的植物和沿海的红树中分离出耐胁迫基因。这些基因都具有重大的研究和应用价值。此外,还已分离出一系列的生物活性化合物和酶。目前,正在将其用于生产。 印度的空间部和生物技术部是利用遥感技术绘制出印度 生物群落图 的。这些图谱在宏观水平上显示了有关生境和生物多样性的信息,为印度科学家发现新的植物基因提供了必要的依据。汪开治
农杆菌介导的瞬时表达系统 一．溶液配制 乙酰丁香酮AS 0.1M，取0.101gAS溶于5mLDMSO中，在工作台上用灭过菌的0.45μM滤膜过滤,分装入无菌小管，-20℃冰冻保存； MES 1M 调pH=5.6，过滤除菌； MgCl2 1M 过滤后灭菌； Kan 终浓度100mg/ml，过滤除菌。 (AS ，MES均购自泰安齐旺试剂公司) YEB过夜培养液(30ml) MES AS Kan 10mM 20μM 50μg/ mL 300μl 6μl 15μl 悬浮培养液(50ml) MES 10mM 500μl AS 200μM 100μl MgCl2 10mM 500μl YEB培养基(pH 7.2) 酵母膏 牛肉膏 蛋白胨 蔗糖 MgSO4·7H2O 1g/L 5g/L 5g/L 5g/L 493mg/L 二．操作步骤 1. 挑起单个农杆菌菌落，接种3mL YEB培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜，储存时间比较长的菌液可多活化两次； 2. 接种2mL过夜培养的50mL的YEB液体培养基（含抗生素，10mM MES和20μM乙酰丁香酮），28℃摇床培养2-4h； 3. 将上述过夜培养菌液在4℃，8000g下离心6min，收集菌体； 4. 用渗透培养液重新悬浮沉淀的农杆菌细胞。调节浓度OD600至0.5-1.0（一般需要100-150mL渗透培养液），置室温培养至少3小时，无需振荡； 5. 对需要渗透处理的烟草植株无一定大小要求，一般4-5叶期，已经生长一个月左右的本生烟比较合适。一般渗透处理下部2-3个比较大的叶片。用针头在需要渗透处理的叶片背面非常细微地扎一细小的浅微孔，然后用3mL的无针头的注射器吸取2-3mL悬浮有农杆菌的渗透培养液，从针孔处将培养液轻微的注入叶片内。注意用一手指从叶片下面拖住叶片，将注射器平平地堵住针孔，不让液体从叶片边缘挤压出来。注射区域接近叶片边缘即可或根据自己的实验目的决定； 6. 将处理过的烟草放回温室，照常管理。一般沉默发生在2-5天内； 7. 在暗室里，利用长波紫外灯（MODEL SB-100P/F,365nm）观察渗透处理过的叶片，并拍照记录叶片侵染区绿色荧光表达的变化过程。
基因表达练习题 班级姓名 一、选择题 1．下图所示的过程，正常情况下在动植物细胞中都不可能发生的是 ( ) A．①② B．③④⑥ C．⑤⑥ D. ④⑤⑥ 2．关于蛋白质生物合成的叙述，正确的是( ) A．一种tRNA可以携带多种氨基酸 B．DNA聚合酶是在细胞核内合成的 C．反密码子是位于mRNA上相邻的3个碱基 D．线粒体中的DNA能控制某些蛋白质的合成 3．基因、遗传信息和密码子分别是指( ) ①信使RNA上核苷酸的排列顺序 ②基因中脱氧核苷酸的排列顺序 ③DNA上决定氨基酸的三个相邻碱基 ④信使RNA上决定氨基酸的三个相邻碱基 ⑤转运RNA上一端的三个相邻碱基 ⑥有遗传效应的DNA片段 A．⑤①③ B．⑥②④ C．⑤①② D．⑥②③ 4．下列图示的生理过程(图中④代表核糖体，⑤代表多肽链)的叙述中，不正确的是( ) A.图中所示的生理过程主要有转录和翻译 B.图中所示的全过程可发生在人的线粒体中 C.遗传信息由③传递到⑤需要tRNA作中介 D.图中①在该过程中起模板作用 5．翻译时出现肽链终止，是因为( ) A．一个与mRNA链终止密码相应的tRNA不能带氨基酸 B．不具有与mRNA链终止密码相应的反密码子 C．mRNA在mRNA链终止密码处停止合成 D．tRNA上出现终止密码 6．下列有关如右图所示的生理过程（图中④代表核糖体，⑤代表多肽链）的叙述，不正确的是( )
A．图中所示的生理过程包括转录和翻译 B．图中所示的过程发生在原核细胞中 C．遗传信息由②传递到⑤需要mRNA作中介 D．图中①在该过程中不起作用，由此可确定①在遗传上不具功能 7．艾滋病病毒(HIV)为逆转录病毒。但无法独立繁殖，其繁殖过程需要在活细胞内进行。其原因不包括( ) A．需要活细胞提供核糖体和tRNA B．需要活细胞提供各种酶和ATP C．需要活细胞提供DNA D．需要活细胞提供各种原料 8．关于基因表达的叙述中，正确的是( ) A．基因表达的最终场所都是核糖体 B．DNA聚合酶催化DNA转录为RNA C．遗传信息只能从DNA传递到RNA D．tRNA上的反密码子是由mRNA转录而来 9．下列关于“中心法则”含义的叙述中，错误的是( ) A．基因通过控制蛋白质的合成来控制生物性状 B．②③过程可在RNA病毒体内发生 C．⑤③④过程所需的原料分别是脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸 D．②过程中碱基互补配对时，遵循A－U、U－A、C－G、G－C的原则 10．在信使RNA分子结构中，相邻的碱基G与C之间是通过什么结构连接而成( ) A．3个氢键 B．－脱氧核糖－磷酸基－脱氧核糖－ C．－核糖－磷酸基－核糖－ D．－磷酸基－核糖－磷酸基－ 11．遗传学家发现一种某基因的突变对该基因编码的多肽没有影响。这种突变最可能( ) A.缺失了一个核苷酸对 B.改变了起始密码子 C.插入了一个核苷酸对 D.替换了一个核苷酸对 12．组成生物体蛋白质的20种氨基酸所对应的密码子共有( ) A．4个 B．20个 C．61个 D．64个 13．下图示DNA转录过程中的一段，其中核苷酸的种类是( ) A．4种 B．5种 C．6种 D．8种 14．关于转录和翻译的叙述，错误的是( ) A.转录时以核糖核苷酸为原料 B.转录时RNA聚合酶能识别DNA中特定碱基序列
2．材料与方法 2.1实验材料 植物材料：K326烟草种子 药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等； MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0 预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml 分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml. 生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10g MS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基 2.3实验方法 2.3.1浸染菌液制备 将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。 挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。 活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。 取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。加入100ml的MS0培养基，混匀。 2.3.2烟草转化 按叶圆盘法转化烟草。将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养
高中生物必修二基因的表达知识点总结 一、基因指导蛋白质的合成 1.RNA的结构和种类 1结构：与DNA相比，RNA在组成上的差异表现在：五碳糖是核糖，碱基组成中没有T，而替换为U尿嘧啶。 2种类：mRNA、tRNA和rRNA三种。 2.遗传信息的转录 1概念：在细胞核中，以DNA的一条链为模板，合成RNA的过程。 2原料：4种游离的核糖核苷酸。3碱基配对：A-U、C-G、G-C、T-A。 3.遗传信息的翻译 1翻译①概念：游离在细胞质中的各种氨基酸，以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。②场所：细胞质中的核糖体。③运载工具：tRNA。④碱基配对：A-U、U-A、C-G、G-C。 2密码子①概念：遗传学上把mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻碱基叫一个密码子。②种类：共64种，其中决定氨基酸的密码子共有61种。 3转运RNA①结构：形状像三叶草的叶，一端是携带氨基酸的部分，另一端有三个碱 基可与密码子互补配对，称为反密码子。②种类：61种。密码子与氨基酸有怎样的对应关系? 一种密码子只能决定一种氨基酸终止密码子除外，一种氨基酸可由一种或多种密码 子决定。 二、基因、蛋白质与性状的关系 1.基因对性状的控制 1直接控制：通过控制蛋白质分子结构来直接控制生物性状。 2间接控制：通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物性状。 2.基因与性状的关系 1基因与性状的关系并不都是简单的线性关系。如人的身高可能是由多个基因决定的，同时，后天的营养和体育锻炼等对身高也有重要作用。
2基因与基因、基因与基因产物、基因与环境之间存在着复杂的相互作用，精细地调 控着生物体的性状。基因与性状的关系，体现了基因型、表现型、环境三者之间的什么关系? 表现型=基因型+环境 回归课本最重要 经过对一部分的同学做试卷分析，发现很多的人觉得生物的题出得很难，但实际上他 们错的题更多的是最基础的内容，长时间没有回顾学过的内容，很多人已经忘了一些很基 础的知识，有谁还能准确地说出性状、相对性状、显性性状、隐性性状、性状分离等概念?还有谁能记得有氧呼吸的三个步骤?或者伴性遗传病与常染色体遗传病的区别?如果不能的话，孩子们，回归课本吧!先将基础知识梳理清楚再说! 多想几个为什么 生物的考察的另一个重点就是通过现象看本质。那么这就要求我们在复习的过程中除 了要理解透彻基础知识外，还要多想想为什么是这样。比如说为什么影响光合作用的因素 是二氧化碳、水分、温度等，它们是怎么影响光合作用的。 错题整理，归类解决 自己分析或找有经验的老师帮助分析为什么会错，如果是基础知识的不扎实，那么拿 起课本再好好看一遍，强化一下，下次争取不要犯同类错误，如果是知识点间的联系不明了，那么就好好想想知识的内在联系。一个人只有不断的消灭自己的薄弱之处，才会更快 的进步。 调整好心态 世界上所谓的天才实际上是勤奋的人走了一条正确的路而已，永远不要怀疑自己的能力，如果你认为自己不能达到100分，那么你已经输在了起跑线上，如果你真的认为自己 能通过努力达到这个目标，那么你很有可能达到90分甚至更高的分数。如果曾经跌倒了，跌得很痛，没关系，我们可以利用跌倒的机会反思一下自己的路走得是否正确，能否换个 更有效的方法，然后整理好行囊，用更快的步伐去追赶前行者的脚步。 感谢您的阅读，祝您生活愉快。
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/9016680986.html, 农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用 作者：宋建刘仲齐 来源：《天津农业科学》2008年第01期 摘要：主要介绍了农杆菌介导的基因瞬时表达方法的原理、技术、影响因素及其在外源基因表达分析、启动子分析、基因沉默及防卫反应等方面的应用。 关键词：农杆菌；植物；基因瞬时表达 中图分类号：Q789文献标识码：A文章编号：1006—6500(2008)01—0020—03 把外源基因导入受体植物内，是研究基因功能和获得遗传修饰有机体的主要手段。农杆菌介导法是目前最常用的遗传转化方法，当农杆菌感染植物受伤组织后，质粒上的目标基因可以进入植物细胞内并整合到植物染色体中，这种转化细胞经过诱导分化，再生成为转基因植株。通常大多数植物的遗传转化和再生效率低下，费时且费用昂贵。即使对于转化程序大大简化的植物，例如拟南芥，仍然需要花费数月的时间来产生适合分析的转基因植株。农杆菌介导的瞬时表达提供了一种快速分析基因型功能的方法，该方法是Rossi等在1993年创建的。他们将带有重组质粒的农杆菌，经诱导后通过抽真空渗透入植物叶片进而渗透入植物细胞，通过目的基因瞬时表达来检测植物中农杆菌介导的T-DNA转移的效率。随后人们又采用针管注射活体植株叶片，来进行农杆菌介导的基因瞬时表达检测。近几年该项技术不断完善、发展，已被广泛用于外源基因表达分析、无毒基因与抗性基因的相互作用、基因沉默、启动子分析等许多植物分子生物学领域。 1主要原理 农杆菌介导的瞬时表达是将目的基因插入共整合载体或双元载体，转化根癌农杆菌，后者经酚类化合物诱导处理后，通过真空渗透或针管注射入植物叶片组织中，农杆菌在叶片内与植物细胞紧密接触。诱导处理在转录水平激活Vir区基因，真空渗透或注射使得农杆菌与植株叶片细胞接触，从而实现了T-DNA转移进入植物细胞核。大部分T-DNA并未整合入植物基因组而是暂时存在于核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达T-DNA基因，通常在数小时后即可检测到外源基因的表达，并在1～2d内达到最高值。而少量整合进植物染色体的 T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。
本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法： 一、农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、实验步骤： 1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。 B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.710mM MgCl210mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 1M MgCl2过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。 C、关于表达时间： 烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。 D、关于侵染液浓度： 推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
植物基因工程的新进展自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以霸占杨树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性进展。但是，以往的工作重点多在容易做的模式植物上，从而使烟草、马铃薯、番茄、矮牵牛、拟南芥菜等植物的分子生物学和转基因技术发展很快。近年内以实用为目标的研究数目大大增加，在国外，主要的种子公司和一些小公司竞相开发重组 D NA技术，用于重要作物的商业应用，将研究机构和大学首创的原理和科技用于开发，导致植物基因工程向重要粮食和豆科作物遗传改良的实用化目标迈进。在1988年以前，重要谷类作物和豆科作物的转化十分困难，只是在一种生物技术的新工具——“基因枪”研制成功以后，才使得这些作物的转基因不但成为可能，而且常常可以做到不依赖于品种或基因型。基因枪是用火药爆炸、电容放电或高压气体作为加速的动力，发射直径仅1微米左右的金属颗粒。微粒表面用优选的基因包覆，高速射入植物细胞，并在细胞内表达产生有活性的基因产物，从而达到改良品种的目的。最初大豆基因工程的重点放在原生质体和胚性悬浮细胞的再生上，但进展很慢，获得转基因大豆是一个很大的难题。基因枪的出现，使大豆转基因成为现实，实际上目前大豆已成为许多难转化作物的模式作物。在1988至1990年仅两年时，建立了可实用的大豆转化体系，这是目前唯一的不依赖于基因型的大豆转化方法。抗除草剂 B astar和Roundup的基因也已转入大豆，并在过去三年中连续进行了田间试验，预期不久将可商业化，这将是豆科作物基因工程商业化应用的一个里程碑。大豆基因工程今后的目标可包括蛋白质和油脂成分的修饰、抗虫、抗病毒及其他病害抗性等。水稻为世界第二大谷类作物，但在我国则为最大的粮食作物，年产18992万吨（中国农业年鉴1993）。我国和印度的水稻产量占世界总产量的60％，全球几乎一半人口以稻米为主要热量的来源。水稻和爪洼稻、籼稻占栽培水稻的80％，供世界20多亿人食用。水稻得到转基因植始于1988年，最初均以原生质体为受体，采用 D NA直接转移法，再生出了可育的转基因植株。但是，原生质体再生体系的限制很大，粳稻上只有少数品种如台北309等，可由原生质体再生植株，大多数优良的粳稻品种和绝大多数籼稻品种都难以由原生质体再生。可由原生质体再生植株的籼稻品种迄今尚未获得转基因植株。由于水稻未成熟胚的盾片再生植株的能力很强，几乎所有水稻栽培品种均能由未成熟幼胚再生。因此，一些科学家认为，原生质体转化在水稻上应用前景有限，最好是用基因枪转化水稻幼胚。最近
、名词解释： 1.基因：基因是位于染色体上的遗传基本单位，是负载特定遗传信息的DNA片段，编码具 有生物功能的产物包括RNA和多肽链。 2.基因表达：即基因负载遗传信息转变生成具有生物学功能产物的过程，包括基因的激活、转录、翻译以及相关的加工修饰等多个步骤或过程。 3.管家基因：在一个生物个体的几乎所有组织细胞中和所有时间段都持续表达的基因，其 表达水平变化很小且较少受环境变化的影响。如GAPD、B -肌动蛋白基因。 4.启动子：是指位于基因转录起始位点上游、能够与RNA聚合酶和其他转录因子结合并进 而调节其下游目的基因转录起始和转录效率的一段DNA片段。 5.操纵子：是原核生物基因表达的协调控制单位，包括有结构基因、启动序列、操纵序列等。如：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等。 6.反式作用因子：指由其他基因表达产生的、能与顺式作用元件直接或间接作用而参与调节靶基因转录的蛋白因子（转录因子）。 7?顺式作用元件：即位于基因附近或内部的能够调节基因自身表达的特定DNA序列。是转 录因子的结合位点，通过与转录因子的结合而实现对真核基因转录的精确调控。 8. Ct值：即循环阈值（cycle threshold , Ct）,是指在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数。（它与PCF T增的起始模板量存在线性对数关系，由此可以对扩增样品中的目的基因的模板量进行准确的绝对和（或）相对定量。） 9.核酸分子杂交：是指核酸分子在变性后再复性的过程中，来源不同但互不配对的核酸单链(包括DNA和DNA DNA和RNA RNA和RNA相互结合形成杂合双链的特性或现象，依据此特性建立的一种对目的
生物信息前沿研究进展讲座结课论文 ——基因表达调控网络研究文献综述 物理学院张玉萍 10304830 摘要 近些年来，基因序列测序的完成、大规模测定基因表达水平的基因芯片（Microarray）技术的出现和高性能计算机的使用使得用模拟计算的方法大规模的研究基因表达调控成为可能，一些研究者已经开始绘制控制整个活细胞基因表达的调控网络。例如λ噬菌体的溶原/裂解活性的调控网络的数学模型已经构建出来。用数学模型的方法预测网络结构是目前研究的热点。本文对表达转录调控网络的研究现状进行综述。 基因表达调控网络 Wyrick(2002)[1] 中给出了一个基因表达调控网络的定义：一组调控因子如何调控一套基因表达的过程称为基因表达调控网络。基因表达调控网络是基因调控网络的一个重要部分。参与基因表达调控网络的元素主要包括cDNA、mRNA、蛋白、小分子等。从元素间相互联系的角度来看，基因表达调控网络是一个由节点（调控元素）、边（调控作用）组成的一个有向图结构。如图1 图1：简单基因网络结构示意图 图中每一个圆圈代表一个节点，也就是调控网络的元素，如基因。有向箭头表示表达增强作用，末端断线表示表达抑制作用。在基因网络中，存在基因对自身表达的自调控的现象。 总的来说表达调控网络有如下特点：
A：网络结构复杂 网络中节点和边的数目庞大。在人体中总共有3万到4万左右的基因，而且真核生物中大多数的基因会同时被两个和两个以上的基因调控，这就使网络形成了一个非常高维的结构。 B：网络结构变化 生物学的实验表明，相同的基因在人和动物的细胞周期中可以参加不同的生理过程，实现不同的生理功能。还有一些基因只在某些时刻和特定的外界条件下是有相互作用的，在其他条件下不会发生作用。简单的说就是两个基因间的那条边是否存在、作用的方向在不同时期是可能不一样的。 C：相互作用类型多变 在生物体中，基因间相互作用可以有很多类型（如图1），包括了很多作用的特征：两个基因间谁影响谁、影响的方式、增强的作用还是抑制的作用、影响产生的条件、影响的强弱量级、被调控基因的表达量和调控基因的表达量直接的关系等。目前的研究表明，基因间的相互作用可能是一种非线形的作用关系。在多因子调控模式中还要考虑不同的调控因子对同一个目标调控基因产生作用时的某种逻辑关系，这种逻辑关系是由调控模式中各调控因子的相互关系决定。 D：节点类型多样 网络节点的元素可以是DNA、mRNA、蛋白、分子、大分子、外界环境等等。 E：节点状态变化 在细胞周期过程中，每一个基因的表达量不是固定的，会随着条件的变化而变化、蛋白质在不断的合成，同时也在不断的被降解。在不同的调控模式下，蛋白合成和降解的比率会发生变化，从而会使蛋白处在不同的水平上。基因的表达量的变化会影响到相互作用的变化，会引起网络结构的变化。 F：有向循环结构 在生物体中各种生理上的周期现象，我们很容易理解生物体中的相互作用存在周期性。至少在网络的局部上是循环的。在已经研究的比较多的低等生物E.coli的表达调控网络[2]中已经发现了循环的结构。 表达转录调控网络的研究现状 目前关于基因调控的绝大部分问题还没有解决。除了生物学家努力通过新的实验技术和生物理论来研究问题外，近几年，利用数学、统计学、神经网络、人工智能等方法在计算机上分析模拟表达调控机理，是计算分子生物学方面一个飞速发展的方向。由于分析模型的不同和采用的数据类型的差异，目前研究主要分为两个方面：基于基因芯片数据的关系推断模型和基于基因序列信息的调控因子结合位点推断模型。 下面分别就这两个方面的一些方法做一个简要介绍。 （一）基于基因芯片数据的关系推断方法 基因芯片的数据形式为：
烟草转基因操作细则 烟草无菌苗准备: 将烟草种子灭菌放入1/2 MS培养瓶中发芽；然后按2-3株每瓶移植到新的1/2MS培养瓶中一般组培光温条件下生长。 转基因步骤： 1 10 mL YEB (YEP) 摇菌过夜（农杆菌菌株GV3101; EHA105 ）； 2 离心收集菌液； 3 用25 mL激活培养基(液)悬浮； 4 在28o C摇3- 5 h； 5 转入到培养皿； 6烟草叶片放到上面培养皿（含菌液的激活培养基）； 7 用解剖刀将烟草无菌苗叶片切至0.2-0.5 cm见方； 8 在激活培养基中浸泡10 min 左右； 9 将叶片取出，置于灭菌纸上吸干菌液； 10 将叶片放入共培养基上暗培养3天；然后将叶片用50 mL灭菌水（含一滴吐温和40 μL 头孢）洗4-6次，最后一次用纯灭菌水（不加吐温和头孢）； 11 将叶片转到筛选培养基（平板/或培养瓶）上，常规光温条件培养； 12 一般2周后有芽（小植株）出现；当小植株长出后，切下小植株转移到生根培养基（培养瓶）上培养。 培养基配方 激活培养基：MS (Suc 3%) + 200 μM As，pH5.2 (pH5.8)； 共培养基：MS (Suc 3%) + 2 (1)* mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.5 (5.8); 筛选培养基: MS (Suc 3%)+ 2 (1) mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.8，头孢0.5g/L； 潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）**； 生根培养基：1/2 MS (Suc 3%) [（+ 2 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，可以不加），pH5.8，头孢0.5 g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）。 注：* [2 (1) mg/L 6-BA] 按(1)这些后面数据激素比例出愈（苗）率高，但是假阳性比例可能也较高。**一般来看潮霉素假阳性少，卡那霉素假阳性较多。
基因工程细胞工程知识点汇总 一、基因工程 （一）基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 技术扩增目的基因
82 中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 2010-08，31（4） 烟草基因组知识篇：4. 结构基因组学 龚达平 （中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101） 基因组学的研究可分为两方面：以基因组测序为目标的结构基因组学和以功能鉴定为目标的功能基因组。结构基因组学是在基因组学研究的早期阶段，着重进行基因作图、序列分析以研究基因组成、定位的科学。染色体不能直接用来测序，必须将基因组分解成容易操作的较小的结构，即进行基因组作图，获得基因组图谱。根据作图使用的标志和手段，基因组图谱可分为遗传图谱（genetic map）、物理图谱（physical map）、转录图谱（transcription map）及序列图谱（sequence map）[1]。 1 遗传图谱 遗传图谱又称连锁图谱（linkage map），它是以连锁的遗传标记间的重组频率确定遗传学距离（一般用厘摩cM表示，即减数分裂事件中1%的重组率）的基因组图。早期使用的多态性标志有RFLP（限制性酶切片段长度多态性）、RAPD（随机引物扩增多态性DNA）、AFLP（扩增片段长度多态性）；20世纪80年代后期，开始应用MS（微卫星）标记绘制图谱。MS的出现不但提高了遗传图的精度，同时也成为物理图谱上的标记，从而促进了遗传图谱与物理图谱的整合；近年来，第三代的多态性标记SNP（单核苷酸多态性）标记得到大量使用。Dib等在5264个AC/TG型微卫星的基础上绘制了人类的完整遗传图谱[2]，平均密度是每0.6 Mb一个标记。遗传图谱的建立为基因识别和疾病相关基因的定位创造了条件。 2 物理图谱 遗传图谱的分辨率和精确度都非常有限，对于大多数真核生物来说，在进行大规模DNA测序前，需要用其它作图方法来补充遗传图谱。物理图谱是DNA序列上可以识别的标记位置和相互之间的距离（以碱基对的数目为衡量单位）的信息。这些标记包括限制性内切核酸酶的酶切位点、基因等。物理作图方法很多，主要为以下三类：限制性酶作图，荧光原位杂交（FISH）和序列标记位点（STS）。限制性图谱是指DNA链的限制性酶切片段的排列顺序，即酶切片段在DNA链上的定位，用于对如kb数量级的小区域做精细结构制图。最早的物理图谱是细胞遗传学图谱，通过原位杂交将基因定位在染色体各区带上。细胞遗传学图用于较大片段的区域制图；荧光原位杂交图谱使用荧光标记的DNA探针，来探测DNA序列在染色体上位置的物理图谱。但限制酶作图和FISH均不能满足快速简单绘制大基因组物理图谱的要求。最有效的物理作图技术是STS作图，其优点在于适合大规模测序并容易在染色体上定位。STS是具有位点专一性、染色体定位明确、而且可用PCR扩增的单拷贝序列。HGP在1998年完成了包含52 000个STS位标、覆盖人类基因组大部分区域的YAC或BAC 为载体构建的连续克隆系[3]。 3 转录图谱 转录图谱即基因图谱，是识别基因组所包含的蛋白质编码序列在基因组中的位置以及基因表达模式等信息的图谱。转录图谱是以表达序列标签（EST）为标志绘制的分子遗传图谱。通过从cDNA
高中生物基因的表达知识点归纳 名词： 1、基因：是控制生物性状的遗传物质的功能单位和结构单位，是有遗传效应的DNA片段。基因在染色体上呈间断的直线排列，每个基因中可以含有成百上千个脱氧核苷酸。 2、遗传信息：基因的脱氧核苷酸排列顺序就代表～。 3、转录：是在细胞核内进行的，它是指以DNA的一条链为模板，合成RNA的过程。 4、翻译：是在细胞质中进行的，它是指以信使RNA为模板，合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。 5、密码子（遗传密码）：信使RNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基，叫做～。 6、转运RNA（tRNA）：它的一端是携带氨基酸的部位，另一端有三个碱基，都只能专一地与mRNA上的特定的三个碱基配对。 7、起始密码子：两个密码子AUG和GUG除了分别决定甲硫氨酸和撷氨酸外，还是翻译的起始信号。 8、终止密码子：三个密码子UAA、UAG、UGA，它们并不决定任何氨基酸，但在蛋自质合成过程中，却是肽链增长的终止信号。 9、中心法则：遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质的转录和翻译过程，以及遗传信息从DNA传递给DNA的复制过程。后发现，RNA同样可以反过来决定DNA，为逆转录。 语句： 1、基因是DNA的片段，但必须具有遗传效应，有的DNA片段属间隔区段，没有控制性状的作用，这样的DNA片段就不是基因。每个DNA分子有很多个基因。每个基因有成百上千个脱氧核苷酸。基因不同是由于脱氧核苷酸排列顺序不同。基因控制性状就是通过控制蛋白质合成来实现的。DNA的遗传信息又是通过RNA来传递的。 2、基因控制蛋白质的合成：RNA与DNA的区别有两点：①碱基有一个不同：RNA是尿嘧啶，DNA则为胸腺嘧啶。②五碳糖不同：RNA是核糖，DNA是脱氧核糖，这样一来组成RNA的基本单位就是核糖核苷酸；DNA则为脱氧核苷酸。 3、转录：（1）场所：细胞核中。（2）信息传递方向：DNA→信使RNA。（3）转录的过程：在细胞核中进行；以DNA特定的一条单链为模板转录；特定的配对方式： 4、翻译：（1）场所：细胞质中的核糖体，信使RNA由细胞核进入细胞质中与核糖体结合。（2）信息传递方向：信使RNA→ 一定结构的蛋白质。 5、信使RNA的遗传信息即碱基排列顺序是由DNA决定的；转运RNA携带的氨基酸（如甲硫氨酸、谷氨酸）能在蛋白质的氨基酸顺序的哪一个位置上是由信使RNA决定的，归根结底是由DNA的特定片段（基因）决定的。 6、信使RNA是由DNA的一条链为模板合成的；蛋白质是由信使RNA为模板，每三个核
Botanical Research 植物学研究, 2015, 4, 25-31 Published Online March 2015 in Hans. https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,/journal/br https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,/10.12677/br.2015.42004 Establishment and Optimization of Agrobacterium-Mediated Transient Gene Expression System in Tabacco Liwei Wen, Hongliang Zhu* Department of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing Email: 210824@https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,, *hlzhu@https://www.doczj.com/doc/9016680986.html, Received: Apr. 15th, 2015; accepted: May 1st, 2015; published: May 6th, 2015 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,/licenses/by/4.0/ Abstract To establish and optimize a transient expression system in Nicotiana benthamiana, the method was developed with the β-glucuronidase (GUS) and Ripening Inhibitor (RIN) as marker genes. Us-ing the agrobacterium-mediated transformation method, GV3101 was used for the effects of dif-ferent bacteria concentration on the efficiency of protein transient expression in Nicotiana ben-thamiana. Observed by the results, a higher transient expression level of GUS & RIN gene could be obtained as OD600 value of A. tumefaciens for intiltration 1.0. The entire process only took 25 days from sowing seed to protein analysis. Therefore, this method is simple and rapid. It has a potential application in dissecting gene expression and function in Brassica napus. Keywords Tobacco, Leaf, Transient Expression System 烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究 文莉薇，朱鸿亮* 中国农业大学，食品科学与营养工程系，北京 Email: 210824@https://www.doczj.com/doc/9016680986.html,, *hlzhu@https://www.doczj.com/doc/9016680986.html, *通讯作者。