生物技术制药概论
1、生物技术制药过程包括哪些内容（P5）
第一阶段：实验室研究阶段，也称为发现或探
索研究，属于应用基础研究阶段;
第二阶段：产品开发阶段，属于应用阶段，与
第一阶段统称为研发阶段，即临床前研究;
第三阶段：商业化阶段，是将产品推向市场的
过程。
2、详细说明下面专业英语的含义：
T arget identification and validation：靶基因的发现和证实
Assay development：建立检验方法
Proof of concept:理论验证
High throughput:高通量筛选
Lead generation:先导化合物的发现
Lead optimization: 先导化合物的优化
System biology：系统生物学
Therapeutics: 治疗学
Commercialization : 商业化
First human dose：人类第一剂量
基因工程制药
3、有哪些方法合成第二链cDNA?
第一：自我引导合成法，（Self priming）：RNaseH 消化mRNA摸板；cDNA 3’形成发夹结构（loop）；发夹作为引物合成第二链；需要酶：klenow 和S1。第二：大肠杆菌RNaseH酶降解取代法（Replacement synthesis）：RNaseH 在RNA摸板上形成缺口或空隙，从而形成RNA引物；在E.coli DNA polymerase 的驱动下合成非连续性第二链，需要T4 连接酶接合形成完整第二链。
4、有哪些引物用来合成cDNA第一链？
Oligo dT (T=12-18),；随机引物(n=6) ；基因特异性引物(n=18-25)
5、建立cDNA 文库有什么好处？（书）
cDNA文库代表生物某一特定器官或组织在某一特定的发育时期，细胞转录水平上的基因群体。因为基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同的环境条件、不同的分化时期，故基因表达的种类和强度也不尽相同，因此cDNA文库具有组织特异性。一旦获得含有某种组织器官cDNA信息文库，就可用于筛选目的基因、大规模次序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。
6、判定从cDNA文库质量的标准？
（1）cDNA的数量:1-2 million （2）cDNA 的平均长度: 1.5-2.0 kb
（3）全长cDNA的含量: about 50% （4）空载体, 源于ribosomal RNA的cDNA 的数<10%
（5）是否含有目的基因
7、什么是基因表达？
外源基因(exogenous gene)在生物体内的转录(transcription)，翻译(translation) 和加工过程(post translation modification)的过程。
8、选择表达宿主细胞的原则
生长快，成本低，表达产量高，表达产物的生物活性，容易分离和纯化，无毒。
9、大肠杆菌作为表达宿主的优缺点
优点：遗传性状清楚、操作简单、生长快、成本低、种类多、很多表达载体可供使用。成功生产了很多治疗性外源蛋白。
缺点：不能糖基化，产生内毒素，不能正确折叠形成核内包涵体（inclusion bodies)。
10、大肠杆菌遗传标记recA是什么意思？Homologous recombination abolished, desirable for sequences containing direct repeats （同源重组的废除，获得包括直接重复的序列）
11、表达载体应具备的特点, 克隆载体应具备的条件
表达载体应具有的特征：
①能够独立地复制（origin of replication）；
②应具有灵活的克隆位点（multiple cloning
site or polylinker）；
③具有方便的筛选标记（selectable marker），
有利于外源基因的克隆、鉴定和筛选；
④如果在大肠杆菌中表达，则应具有很强的启
动子（promoter），能为大肠杆菌的RNA聚
合酶所识别；
⑤应具有阻遏子（suppressor），使启动子受到
控制，只有当诱导时才能进行转录；
⑥应具有很强的终止子（terminator）；
⑦所产生的mRNA必须具有翻译的起始信
号，即起始密码AUG（start codon）和核糖
体结合位点。
克隆载体应具有的特征：
①能够独立地复制（origin of replication）；
②应具有灵活的克隆位点（multiple cloning
site or polylinker）；
③具有方便的筛选标记（selectable marker），
有利于外源基因的克隆、鉴定和筛选；
12.、pLac, LacI和IPTG的关系
pLac启动子受Lac I负调控，IPTG解除LacI的抑制作用
13、T7 启动子的工作原理。
工作原理：两个表达载体系统，一个表达T7RNA聚合酶，另一个含有T7启动子。T7聚合
酶为lacUV5 启动子所驱动。lacUV5
为IPTG所诱导。
14、影响大肠杆菌表达的因素。
1、外源基因的拷贝数，即载体的拷贝数，取决
于plasmid origin of replication
2、外源基因的表达效率
a 启动子的强弱,lac trp,tac,T7
b 核糖体结合位点的有效性
c SD序列和起始密码A TG的间距
d密码子codon preference, e.g., UCU,UCC,UCA,UGG 全都编码丝氨酸
3、表达产物的稳定性, 蛋白的半衰期，dimer
(二聚体）较单体稳定，
4、细胞的代谢负荷，控制外源蛋白的表达，
（tight control, without leaking). 改变宿主菌
5、工程菌的培养条件
15、基因体外表达好坏的重要参数
产量（yield)、生物活性(bioactivity)、理化性状、可溶性(solubility)等
16、基因体外移包涵体形式表达的优缺点
包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种由不可溶的蛋白质聚集折叠而形成的晶体结构物。优点：产量高、易纯化、抗蛋白酶、保护宿主
缺点：空间构型错误-无活性
17 、在哺乳动物细胞中表达常用的启动子
病毒源性和细胞源性强启动子，如mCMV、hCMV、hEF-1α、人的c-fos、鸡胞浆β肌动蛋白等启动子18 、有哪些转染哺乳动物细胞的方法？
一：病毒介导的转染方法；
二：非病毒介导的转染方法，包括：脂质体法、磷酸钙共沉淀法、鸡DEAE-葡聚糖法（常用）
钙转染法：原理是沉淀，廉价
DEAE-葡聚糖转染技术(diethyl-aminoethyl-dextran)，简称DEAE-葡聚糖，是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNA
电转染(electroporation) 是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，可以促使细胞吸收外界环境中的DNA分子
压缩DNA转染法：原理是将DNA压缩成微小颗粒；
利用细胞周期转染法：原理是利用G2/M周期细胞分裂时细胞膜的孔隙增大的原理；
提高转染率：（chloroquine) 原理是提高细胞内lysosome 的pH
显微注射法：直接将目的基因通过注射器倒入受体细胞中；DNA分布在细胞周围，让它通过穿刺形成的孔洞或跟随穿刺的针头进入细胞
19、用逆转录病毒介导DNA的过程。
逆转录病毒载体是单链RNA病毒，进入细胞后逆转录为双链DNA并整合在细胞染色体，以此为模板合成病毒基因及子代RNA，再装配成病毒颗粒。载体分为两部分: 增殖性载体和非增殖性载体。20、逆转录病毒载体的主要结构。
一：携带目的基因、标记基因的载体。
二：以反式提供逆转录病毒蛋白的包装细胞系，这种辅助细胞含顺式功能有缺陷的逆转录病毒，其RNA不能被包装配成病毒颗粒，但能表达所有病毒蛋白，反式补偿进入包装细胞的载体所缺失的基因，将重组逆转录病毒载体导入包装细胞后，可产生有感染力的复制缺陷型病毒，病毒转染细胞使外源基因稳定插入靶细胞染色体。（增殖性载体和非增殖性载体）
21. 什么是装配细胞？装配细胞的主要特点。（1）装配细胞：是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gap、pol、evw所编码的蛋白质，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不同产生任何形式的病毒颗粒。
（2）含顺式功能有缺陷的逆转录病毒，其RNA不能被包装配成病毒颗粒，但能表达所有病毒蛋白，反式补偿进入包装细胞的载体所缺失的基因，将重组逆转录病毒载体导入包装细胞后，可产生有感染力的复制缺陷型病毒，病毒转染细胞使外源基因稳定插入靶细胞染色体。
22、脂质体转染的原理。
脂质体使一种人造的脂质小泡，外周使脂双层，内部使水腔，形成双层质膜包埋DNA如FuGene (Roche) LipoFectaimine (Invitrogen)，把外源DNA 导入培养的哺乳动物细胞。
23、酵母表达载体的类型
根据载体的复制序列，载体可分为四类：
A、YEp类（yeast episomal plasmid （游离质粒）,酵母附加体质粒）含有酵母自然质粒2μ的复制中心REp3 的载体，可独立增殖；拷贝数：低拷贝每个细胞5-50个质粒，高拷贝数：100-200；转化率：103-105/ μg DNA；不稳定：每代质粒丢失率10-2。
B、YRp类（yeast replication plasmid, 酵母复制型质粒）
含有酵母自然增殖中心ARS，由于质粒丢失率非常高10%，所以很少应用。
C、YCp类(yeast centromeric plasmid,酵母着丝
型质粒）含有着丝点顺序和增殖中心ARS，可独立增殖，拷贝数特别低，每个细胞1-3拷贝。不稳定：每代质粒丢失率10-2ideal for cloning genomic DNA libraries
D、Yip 类(yeast integrative plasmid,孝母整合型质粒）无增殖中心，不能独立增殖，但可通过同源DNA顺序整合到酵母基因组
24、杆状病毒表达系统的特点
1、安全性，杆状病毒具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物；
2、容量大，杆状病毒基因组较大，具有多个天然启动子，可实现多基因表达；
3、表达效率高，表达量最高可达所感染细胞总蛋白量的50%;
4、表达产物具有活性，昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近，能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应；
5、具有完整的感染性，昆虫病毒载体的重组区是基因组的非必需区，即使缺失也不会影响病毒的复制和表达，保持了昆虫杆状病毒载体的完整感染性；
6、标记显著。在多角体蛋白基因区插入外源基因后，失去了多角体蛋白的空斑较易辨认；
7、细胞可连续传代，25-30℃培养无需二氧化碳。可悬浮培养，适于规模化；
8、可用于有细胞毒作用的重组蛋白表达，当宿主细胞死亡后它可以感染另外的昆虫细胞。
25、哺乳动物细胞病毒载体有哪些？
（1）腺病毒载体(A V)：双链无包膜病毒，基因组大小为36 kb，其中4、7型A V在美国已使用多年，证明对人无害，A V有较大的宿主范围，可感染非分裂细胞。由于A V感染细胞时其DNA不整合至宿主细胞染色体，因此无潜在致癌危险。
(2) 腺相关病毒载体(AA V)。它是目前动物病毒中最简单的一类单链线状病毒，基因组仅5kb，是缺损型病毒，需辅助病毒如腺病毒、痘苗病毒存在才能进行有效复制和产生溶细胞性感染。AA V的最大特点是可以定点整合。
(3) 逆转录病毒载体：单链RNA病毒，进入细胞后逆转录为双链DNA并整合在细胞染色体，以此为模板合成病毒基因及子代RNA，再装配成病毒颗粒。载体分为两部分: 增殖性载体和非增殖性载体。
(4) 痘苗病毒载体(VV)：线性双链DNA，长180-200kb，其载体特点是：容量大，可插入25-40kh 的外源基因；能同时插入多个外源基因；能在多种细胞中生长繁殖；
26、有哪些酵母用于重组蛋白的体外表达酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)
裂殖酵母（S．pombe）
甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）
多形汉逊酵母（Hansenula Plymorpha）糖基化位点：Asn-X-Thr 与哺乳动物糖基化位点相同
巴氏毕赤酵母（Pichia Pastoris）
27、酵母表达系统的优点（书）
酵母表达系统的主要优势在于：它既具有真核细胞的特性又具有类似原核细胞的生长特点。
（1）与原核细胞相比酵母是真核生物，可对表达的蛋白进行修饰，有利于保持生物产品的活性和稳定性；
（2）可将表达的蛋白分泌到胞外不仅有利于产品的纯化，还避免了表达产物的过度积累对宿主产生不利影响;
(3)与哺乳动物细胞表达系统相比酵母更易于培养，可进行大规模的发酵生产，故在表达外源蛋白，特别是大分子真核生物蛋白方面得到了广泛的应用。
28、哺乳动物细胞表达系统的优缺点
优点：(1)哺乳动物细胞能精确有效的识别真核蛋白合成、加工和分泌的信号并且能识别和剪
切外源基因中的内含子并加工为成熟的
mRNA；
(2)可以指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N
连接的糖基化和精确的O连接的糖基化等多
种翻译后加工功能；
(3)哺乳动物细胞可以作为基因表达宿主细胞的
有293、CHO、COS、BHK、SP2 /0、N IH3T3
等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白
质的糖基化有不同的影响；
(4)信号多肽（signal peptide) 工作正常，形成分
泌蛋白。可溶性蛋白，容易提纯；
缺点：培养液昂，贵产量低，容易污染。细部生长周期长，转化细胞产物令人担忧
29. 腺病毒能感染非分裂细胞吗？
能
30、整合质粒和附加质粒的定义
整合型质粒（integration plasmid)：整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在
附加型质粒(episome plasmid)：附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。
附加体型载体在细胞内的复制需要两种病毒成分：病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白
31、Kozak序列的作用
Kozak系统分析了mRNA的5’端的序列翻译效率的关系。结果表明：最有效的翻译起始的共有序列是:5’-CCA/GCCA TGG -3‘ (画线处为起始密码子)，而且最重要的是-3位的嘌呤，其次是+4位的G。32、描述载体的结构
（1）启动子：真核启动子都含有两个基本组成部分，TA TA框和上游的富含GC的序列。启动子往往具有组织特异性。（猴病毒40(SV40)启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子；腺病毒晚期启动子(MLP)）（2）转录终止信号和高效多聚腺苷酸(polyA)加尾信号：强转录终止信号和加尾信号可以提高重组蛋白的表达水平。多聚腺苷酸(polyA)加尾信号：AAUAAA位于polyA上游11-30个核苷酸处
（3）选择标记基因：如His，HA等
（4）核糖体结合位点
33、pCDNA3
PCNA基因启动子
34、瞬时表达
瞬时表达的特点：目的基因不整合到转化植物的基因组中，表达速度快。
35、在CHO (dhfr-) 细胞中筛选高效表达外源基因的原理
原理：CHO (dhfr-) 是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株，自身无法合成四氢叶酸，当携带dhfr基因的质粒与携带外源基因的表达质粒共转染CHO-dhfr-细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆。36、什么是转染？
把基因的自然状态和突变体导入各种细胞来分析它的功能特点，这种将DNA导入哺乳动物细胞核内的过程称之为转染
37、有哪些转染哺乳动物细胞的方法？
（1）非病毒性介导：钙转染法；脂质体转染法；DEAE-葡聚糖转染技术(diethyl-aminoethyl-dextran)；电转染(electroporation) ；压缩DNA转染法；利用细胞周期转染法；提高转染率；显微注射法。
（2）病毒介导：逆转录病毒载体；腺病毒载体(A V) 38、利用细胞周期转染法时在那个周期转染？
利用G2/M周期细胞分裂时细胞膜的孔隙增大的原理
39、列举两个报告基因并说明原理。
报告基因（Reporter Gene）：载体分子上的一种特殊基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来，这种基因就是报告基因。
（1）β-半乳糖苷酶基因（lacZ）：能够催化乳糖水解为单糖，产物可使X-gal底物变蓝色。（2）绿莹光蛋白基因（GFP Gene）：稳定可溶性的蛋白，能持续发出绿色荧光。
40、有哪些溶解包涵体的方法。
包含体溶解使用的变性剂通常为：表面活性剂SDS （1-2％）、盐酸胍（5-8mol/L）和尿素（6-8mol/L）。SDS主要破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用, 盐酸胍和尿素破坏离子间相互作用，解除维系蛋白质稳定性的非共价键，引起蛋白质的变性。
41、用什么化学物质溶解包涵体,包涵体复性有哪些方法，不同方法的优缺点
（1）包含体溶解使用的变性剂通常为：表面活性剂SDS（1-2％）、盐酸胍（5-8mol/L）和尿素（6-8mol/L）。
42、His标签的结构、用途与工作原理
聚组氨酸标签（polyhistidine-tag，His-tag）
结构：常用由6个组氨酸组成的标签
用途：固定化金属离子亲和层析来进行纯化和固定化，可与金属离子鳌合来分离和纯化，常用
镍离子纯化。
原理：组氨酸咪唑环上的电子供体可与固定化的过渡金属形成配位键，所以用咪唑竞争洗脱43、几丁质结构域标签的用途与工作原理
用途：包含51个氨基酸，表达的融合蛋白可以用几丁质亲和层析纯化。
原理：利用内涵肽的特异性原位剪切直接获得目标蛋白。（1）巯基诱导的N端剪切系统，将最
后一个氨基酸进行了N454A突变；（2）巯基
诱导的C 端剪切；（3）pH诱导剪切，在pH6-7
情况下剪切，在
切被停止；（4）可用于蛋白质环化的双内含
肽系统。
44、谷胱甘肽转移酶标签的用途与工作原理
用途：GST的分子量约为26kD，用固相谷胱甘肽亲和层析分离融合蛋白
工作原理：与目的蛋白融合来纯化蛋白，用10mM 谷胱甘肽在非变性的条件下洗脱，用3C
蛋白酶切除GST
45、小泛素相贯修饰物标签的用途与工作原理
用途：核质转运、细胞周期调控、新号转导、转录活性调控。
工作原理：SUMO含有95-103个氨基酸，分子量约为12kD ，结合于目的蛋白的氨基端，
常与His标签相连，用SUMO蛋白酶-1
切除SUMO标签，切除后不留任何残基46胰岛素的结构
胰岛素有51 AA，6kd，胰岛素由二个多肽链组成，即A链和B链（A链= 21 AA，B链=30 AA），二个多肽链由二个二硫键连接（二硫键：A7-B7和A20-B19）；第三个二硫键由A链之间的A6-A11组成。
47、胰岛素的主要功能
?促进合成代谢，调节血糖稳定，主要靶器官为肝脏、脂肪组织、骨骼肌。
?对糖代谢的调节：吸收血糖、合成糖原。
?对脂肪代谢的调节：加速葡萄糖转变成脂肪酸。
?对蛋白质代谢的调节：增加蛋白合成、抑制蛋白分解。
48、调节胰岛素分泌的主要物资
（1）血糖的作用：血糖浓度是调节胰岛素分泌的最重要因素。胰岛素分泌的三个阶段：
（2）氨基酸和脂肪酸的作用：氨基酸促进血糖刺激胰岛素分泌的作用，以精氨酸和赖氨酸的作用最强。
（3）脂肪酸和酮体大量增加时，也可促进胰岛素分泌。
（4）激素的作用：胃肠激素，如胃泌素、促胰液素、胆囊收缩素和抑胃肽，都有促胰岛素分泌的作用
49、锌离子在胰岛素制剂中的作用
胰岛素易形成多聚体，发生沉淀。锌离子可起到稳定所用。胰岛素制剂加约0.4% 锌使其成为稳定多六聚体，注射后解离，成为单体或二聚体被吸收。
50、加精氨酸延长胰岛素的药效的原理
胰岛素富含酸性氨基酸，可与碱性蛋白如精氨酸结合。形成大分子复合物这种复合物注射皮下或肌肉，吸收较慢，成为长效胰岛素。
51、甘精胰岛素（insulin glargine）的分子特征
分子特征：A链第21位上的氨基酸以甘氨酸（GIy）替代丙氨酸（Ala）并且在B链的C末
端加上两个精氨酸。
52、門冬胰岛素（insulin aspart）的分子特征
分子特征：在B28位上以天冬氨酸替代脯氨酸，降低了该分子形成六聚体的能力。分子量为5.8 kDa。
53、胰高血糖素的主要功能生理功能：与胰岛素的作用相反，胰高血糖素是一种促进分解代谢的激素。胰高血糖素具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化。
54、胰高血糖素样肽的生理效应
GLP-1能够促进胰岛素分泌，其与胰岛β细胞细胞膜上的受体结合，激活腺苷酸环化酶，通过磷脂酶C途径刺激胰岛素从细胞排出。刺激胰岛β细胞增生，抑制其凋亡。
55、干扰素的三个主要亚型
αβγ
56干扰素α-n1 （Wellferon）合成方法
用仙台病毒感染成淋巴细胞系而合成的α 干扰素57、干扰素的三大功能
抗病毒、抗肿瘤、免疫调节
58、合成红细胞生成素的主要器官
在人类胎儿和新生儿时期，肝脏是产生EPO的主要器官。成年期，EPO主要产生于肾脏。
59、红细胞生成素的主要生理功能
调节红系祖细胞、红细胞生成的主要激素
抗体工程
60、 ADCC解释
抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc片段直接杀伤被抗体包被的靶细胞
61、名词解释：
VL 轻链可变区
CL 轻链恒定区
VH 重链可变区
CH1 重链恒定区 1
CH2 重链恒定区 2
CH3 重链恒定区 3
CDR互补决定区
62、 CDR的数量和功能
轻链有三个CDR，重链有三个CDR。CDR的氨基酸顺序决定抗体的特异性
63、说说抗体的结构
由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链内二硫键连接而成的四肽链结构，重链和轻链靠近N端为可变区（包括高变区和骨架区），靠近C端为恒定区（不同Ig长度不一由CH1到CH4），CH1与CH2为铰链区
64、 Fab和F（ab)2 的区别
Fab 是由木瓜蛋白酶水解IgG铰链区二硫键连接的2条重链近N端得到的
F（ab)
2
是由胃蛋白酶水解IgG铰链区二硫键近C 端得到的
65、抗体糖基化的部位
CH2
66、什么叫HAMA反应？
人抗鼠抗体反应，鼠源的单抗对人体而言具有较强的免疫原性，因而人体产生抗抗体
67、有哪些办法解决HAMA反应？
减少单克隆抗体的鼠源部分，如嵌合抗体、单克隆抗体的人源化、改型抗体、CDR移植
68、为什么要人源化鼠抗体？
减少HAMA反应
69、重链和轻链基因片段的区别
轻链抗体基因片段：
V基因片段：85 J 基因片段：5 C基因片段：1 重链抗体基因片段：
V基因片段：300 D基因片段：12 J 基因片段：4 C基因片段：1
70、重组抗体与单克隆抗体的区别
单克隆抗体是B细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞融合后所产生的单克隆细胞系所分泌的抗体。
重组抗体就是按不同的目的和需要，对抗体基因进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达得到的抗体分子。
重组抗体涉及到对抗体基因的改造
71、制备单克隆抗体的原理
一个淋巴细胞只接受一个抗原决定簇刺激并经过扩增产生均一的同质抗体，将B细胞与缺乏HGPRT 的骨髓瘤细胞融合并在HA T培养基上进行筛选就可获得具有无限繁殖能力并可分泌均质抗体的杂交瘤细胞，
72、纯化抗体常用的方法
蛋白A（proteinA) 亲和层析提纯抗体：蛋白A特异性结合某些动物的抗体Fc 从而将抗体与其他杂蛋白分开
73、抗体可变区的结构
由N端到C端为FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
74、克隆抗体可变区的方法
采用RT-PCR的方法从mRNA分离可变区基因。利用抗体可变区框架区保守的特性引物，
75、克隆抗体可变区引物设计的原则
引物的设计允许有一定的简并性。5′末端引物可以设计在第一框架区，3′末端的引物可以设计在保守的恒定区或J链区。
76、简并引物（degenerated primer）
序列中含一定的有简并性、可与多个碱基配对的碱基的引物77、ScFv 抗体的结构
由完整的轻链和重链的VH+CH1组成
78、Fab 抗体的结构
由完整的轻链和重链的VH+CH1组成
79、Fv 抗体的结构
由VL 和VH组成，VL VH由非共价性结合
80、单域抗体的结构
由一条VH或VL构成
81、轻链的种类
κ型和λ型
82、有哪些鼠抗体人源化的方法
嵌合抗体、改形抗体、表位印迹选择
83、人-鼠嵌合抗体的结构
将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中表达。80﹪的成分是人源性的。
84、人-鼠嵌合抗体的优缺点
优点：效应功能部分可按照需要进行改造，如人的IgGl和IgG3激发的补体或细胞介导的裂解反应是最强烈。嵌合抗体人源的恒定区在治疗中能避免抗同种型抗体的产生，这也是它明显的优点。
缺点：与人单克隆抗体相比，它也会引发HAMA 反应；抗体分子质量较大，在体内存在的时间较长，可能引发不良反应；不容易渗透到实体瘤等目的组织；不容易大量表达，且生产成本高等。
85、什么是改型抗体
将人抗体可变区中互补决定簇序列改换成鼠源单抗CDR序列。主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体”
86、小分子抗体的种类和优点
种类：
1 Fab
2 Fv
3 ScFv
4 单域抗体 5
最小识别单位（MRU）
优点
1）减少非特异性，肿瘤显像清楚
2）增加渗透性，增加对肿瘤的治疗效果，
3）容易与杀伤性物资连接
87、有哪些筛选阳性抗体克隆的展示技术？
1）醋酸纤维膜杂交法
2）噬菌体展示法
3）核糖体展示法
4）酵母展示法
5）大肠杆菌展示法
6）质粒展示技术
88、展示技术的共同特点是什么？
高通量
高容量
高敏感度
容易回收抗体基因
89、噬菌体展示技术的特点。
将外源蛋白质或多肽的基因与噬菌体衣壳蛋白(PIII，PⅧ等)的基因进行融合，制造出有扩增能力且在噬菌体表面表达某一外源性蛋白质或短肽的融合噬菌体，并且其遗传密码信息稳定整合到个体噬菌体的基因组中
90、在噬菌体展示技术中可与外源因融合的噬菌体基因是哪些？
将抗体基因与pIII或pVIII 基因相融合。
91酵母展示技术的原理。
a 凝集素-目的蛋白表面展示系统：将目的蛋白作为C 端与a 凝集素Aga2p 亚基的N 端融合的表面展示系统。a 凝集素有两个糖蛋白亚单位。含有725 个氨基酸残基的Aga1p亚单位通过β葡聚糖的共价连接而锚定在细胞壁上, 含有69个氨基酸残基的Aga2p亚单位通过两对二硫键与Aga1p 亚单位相连接。
92、核糖体展示技术的原理。
核糖体展示法是一种筛选蛋白或多肽的无细胞系统，
原理是利用蛋白合成后仍与mRNA相联系，形成稳定的
蛋白-核糖体- mRNA复合物（PRM）的现象，可用配体亲
和力的方法筛选功能蛋白并同时分离编码该蛋白的mRNA。
进而用RT-PCR的方法获得目的基因
93、在核糖体展示技术中稳定蛋白-核糖体-mRNA 复合物的方法
1）加入抗菌素，如在原核系统中加入利福
平（rifampicin）或氯霉素（chloramphenicol ）；
在真核系统中加入cytoheximide 蛋白合成抑
制剂,目的是终止翻译。
2 ）删除终止密码（Stap Codon），正常情况下
终止密码会使新合成的多肽解离mRNA，使核
糖体在mRNA的末端终止
94、细菌展示技术的原理。
细菌展示技术又称以细胞内膜为基础的细胞间质表达技术（anchored periplasma expression technology, APEx)（图3-39和图3-40）。技术特点是以特定的埋藏在细胞内膜的信号肽诱导ScFv定位于细胞间质，外膜被酶消化后，ScFv 可与培养液中标记的抗原相结合。阳性克隆可用流式细胞分离仪分离，用FCR技术分离阳性ScFv 基因
95、质粒展示技术的原理。
质粒展示技术是以“蛋白质-DNA复合物”形成为基础，将随机多肽与DNA结合蛋白以融合蛋白的形式表达。由于在细胞内表达的融合蛋白及其相应的编码质粒结合在一起，通过筛选可以得到目的蛋白及其编码的基因序列。质粒展示技术的应用是建立在LacI和Lac操纵子 (LacO)可控结合的基础之上，用于蛋白质展示的质粒既包括LacI的可读框，也包含LacO的基因序列。
96、在噬菌体展示中哪些蛋白可与展示多肽融合，并说明道理。
外壳蛋白III和VIII，III在一端，VIII为主体而且数量多
97、谈谈工程抗体的应用。
1 中和抗体
2 抗器官移植反映抗体
3 肿瘤显像
4 肿瘤治疗-放射性免疫疗法（生物导弹）
5 抗炎症反应和自身免疫病抗体
6 根据配体/受体复合物可进入细胞内
（Internalization）从而降解细胞受体的原理，
介导细胞表面受体进入细胞。可利用这一现象
达到如下目的：
1）通过促进受体细胞内部化减少引起细胞过
度生长的生长受体，如EGF受体，FGF受体
等，从而减弱配体促进细胞生长的速度。
2 ）借助抗体/受体复合物细胞内部化的机会，携带毒素，RNA酶，同位素等。
98、用于肿瘤显像的抗肿瘤抗原的抗体是怎么结合同位素锝的？
1）在抗体分子的C端加一个半胱氨酸（Cysteine）与锝形成二硫键。
2）抗体分子与金属结合蛋白融合，如金属硫因蛋白
metallothionein ，从而连接锝。
3）在抗体分子C端加上六个组氨酸（histidine),通过鏊合作用于锝结合。
99、 Rituximab的治疗机理。
Rituximab能够特异性地结合抗原CD20，CD20在90％以上的非霍奇金淋巴瘤的B细胞上都有表达，但在造血干细胞、原B细胞、正常的浆细胞或其他组织并未被发现。Rituximab的Fab结构域结合到B淋巴细胞的CD20抗原上，Fc结构域介导溶解B细胞的免疫效应功能。细胞溶解的可能机制包括补体介导和抗体介导的细胞毒作用。
100、Infliximab 的治疗机理。
Infliximab通过与可溶性的穿膜炎症细胞因子的高亲和力结合，中和TNF-α的生物学活性，并且抑制TNF-α与其受体的结合（TNF-α可诱导前炎症细胞因子，增强白细胞的迁移，活化嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞的活性，诱导急性期反应）。
101、 Etanercept的设计和治疗机理。
与Infliximab类似，均是抗TNF-α的抗体，中和TNF-α的生物学活性，以降低滑膜和关节损伤。102、 Bevacizumab的治疗机理
一般认为癌細胞血管新生的目的在于向宿主吸收养份，并可透过新生的血管转移至其他部位。因此若能有效抑制癌细胞的血管新生，应可压制癌细胞的生长，并减少转移。目前已经知道癌细胞的血管新生牵涉到多种细胞激素的分泌，其中血管內皮细胞生长因子（VEGF)为最主要的调控因子。研究发现VEGF在多种肿瘤，如脑瘤、肺癌、乳癌、消化道肿瘤及泌尿道肿瘤等均有过度表达的现象。這种情形也见于血液恶性疾病，如淋巴瘤、多发性骨髓瘤及白血病。VEGF抗体可以减少肿瘤引起的血管新生。因此VEGF是一個理想的肿瘤“標靶”。
A vastin可有效抑制多种癌症细胞株的生长，而且和化学治疗合用有加乘效果。
103、拮抗药（agonist）策略
答：1 显性阴性作用（dominant negative)，如IL-1ra
2 可溶性受体（soluble receptors) ，如VEGF 受体Flit
3 中和作用因子抗体
4 中和受体抗体
基因工程药物设计
104、复制蛋白药物的困难
大多数蛋白药品是人的同源蛋白，注射后患者表现正常的免疫耐受性。对这类药物，污染物（如宿主蛋白、宿主细胞DNA等）或分子多聚体是破坏免疫耐受性主要原因
105、改进现有蛋白药物的方法
1 根据理论有目的突变
2 增加二硫键，改变分子稳定性
3 随机突变，高通量筛选
4 增加或减少糖基化位点和种类
5 与IgGFc融合增加蛋白药物的可溶性
6 与聚乙烯二醇化增加小分子量蛋白药物的半衰期
7 改变codon preference (密码偏爱性）增加表达量
8 剂型改变，给药途径改变方便病人
106、蛋白药物聚乙烯而醇化（pegylation）的作用
延长蛋白药物在血浆中半衰期，增加药物的可溶性，减少酶降解，掩盖药物的抗原性。减少药物的毒性
107、N-linked 糖基化位点的氨基酸结构N-糖肽键连接的Asn，经常处于多肽链的
Asn-X-Thr/Ser序列中，其中X为除脯胺酸外的任一氨基酸残基。
108、O-linked糖基化位点的氨基酸结构
O-糖肽键大多连接在脯胺酸附近的Ser 或Thr 上。
生物技术制药期末复习 提纲 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
生物技术制药复习提纲 生物技术所含的主要技术范畴包含有哪几个工程 基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 基因工程菌在传代过程中的质粒不稳定的现象主要是指哪两种不稳定质粒不稳定分为分裂不稳定性和结构不稳定性 基因工程菌的培养方式有哪几种 分批培养；补料分批培养；连续培养；透析培养和固定化培养； 从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可以分为哪几种 悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。 动物细胞培养基分为哪三类 天然培养基合成培养基无血清培养基 植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有哪几类。 无机盐碳源植物生长调节剂有机氮源维生素 在V区中，决定抗体分子与抗原分子发生特异性结合的关键部位称为互补决定区（CDR），而 c 区则决定了Ig分子的异种抗原性。 酶固定法中的包埋法可分为哪两种 网格型微囊型
发酵工业的生产水平取决于哪三个要素 生产菌种、发酵工艺和发酵设备 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为哪三类 治疗药物、预防药物、诊断药物 基因工程药物制造的主要步骤如何 目的基因的获得；构建DNA重组体；构建工程菌；目的基因的表达；产物的分离纯化；产品的检验 酶和细胞的固定化载体主要有哪三类 吸附载体包埋载体交联载体 单克隆抗体制备时对动物的免疫方法分为哪两种 体内免疫法和体外免疫法 生产用动物细胞为原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系以及工程细胞系。 目前工业常用的酶一般是以什么为主要来源 微生物 发酵工程产品开发的关键是筛选到高效菌株，一般优良菌种的选育方法主要有哪几种 自然选育、诱变育种和原生质体融合 .
第二章生物药物概论 一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。 主要原则:有效成分含量高,原料新鲜;来源丰富,易得;原料产地较近;杂质含量少;原料成本低;易提取。 特性:(1)药理学特性:治疗的针对性强;药理学活性高;毒副作用小,营养价值高;生理副作用常有发生。 (2)生产、制备中的特殊性:原料中的有效物质含量低;稳定性差;易腐败;注射用药有特殊要求。 (3)检验上的特殊性:要有理化检验指标,与生物活性检验指标。 分类: 按药物化学本质与化学特性分类:(1)氨基酸及基衍生物类(2)多肽与蛋白质类(3)酶与辅酶类(4)核酸及其降解物与衍生物类(5)糖类(6)脂类(7)细胞生长因子类(8)生物制品类(9)小动物制剂(10)动物器官或组织制剂。 按原料来源分类:(1)人体组织(2)动物组织(3)植物组织(4)微生物(5)海洋生物来源的药物。按生理功能与用途分类:(1)治疗药物(2)预防药物(3)诊断药物(4)其她。 二、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。在对生物药物进行提取操作时,选择提取试剂需注意的问题。 工艺流程:1、生物药物原料的选择、预处理与保存(保存方法: 冷冻法,-40℃;②有机溶剂脱水法;③防腐剂保鲜,多用于液体)。 2、生物药物的提取:(1)生物组织与细胞破碎:磨切法,压力法,反复冻融法,超声波震荡破碎法,自溶法,酶溶法(2)选择合适的溶剂进行提取(考虑提取剂的用量、提取时间、提取次数,注意温度、变性剂等因素)。 3、生物药物的分离纯化:(1)蛋白质类药物的分离纯化:沉淀法,亲与层析法,疏水层析法(2)核酸类药物的分离纯化:提取法,发酵法(3)糖类:沉淀法,离子交换层析法(4)脂类:沉淀法,吸附层析法,离子交换层析法(5)氨基酸类:沉淀法,吸附法,离子交换法。 试剂的选择:1、对所需要提取的活性成分溶出度较高,对杂质较低。2、不破坏活性成分。3、利于后续预处理。4、对环境影响较小,有利于回收与处理。5、对设备要求不高。6、成本较低。7、最好对人体无害。 第三章基因工程制药 一、基因工程制药的主要工艺过程。 获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌(或细胞)→培养工程菌→产物的分离纯化→质量控制→产品检验包装 二、什么就是目的基因？有几种获取方法？用于构建基因工程菌的目的基因应该达到什么要求？ 目的基因既就是人们所需要的特定基因,一般也就是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。 获取方法:(1)直接从生物体中提取总DNA,构建基因文库,从中调用目的基因;(2)以mRNA为模板,反转录合成互补的DNA片段;(3)利用聚合酶链式反应(PCR)特异性地扩增所需要的目的基因片段(4)化学合成法;⑸逆转录(RT)-PCR法合成cDNA。 基本要求:不含多余干扰成分,纯度高;片段大小适合重组操作;结构、序列正确,达到一定数量。 三、基因工程克隆细胞与表达细胞、克隆载体与表达载体其各自特点。 克隆载体:1、具备复制原点,在宿主细胞内必须能够自主复制。2、有一个或多个用于筛选的
第一章绪论 填空题 1. 生物技术制药的特征 _高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。 2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是_治疗药物、预防药物、诊断药物。 3. 现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白 质类治疗剂；二是基因药物_______________ ；三是来自动物植物和微生物的天然生物药 物；四是合成与部分合成的生物药物； 4. 生物技术的发展按其技术特征来看，可分为 三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。 5. 生物技术所含的主要技术范畴有基因工程; 细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 选择题 1?生物技术的核心和关键是（A ） A细胞工程B蛋白质工程C酶工程D 基因工程 2. 第三代生物技术（A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围 A基因工程技术B蛋白质工程技术C海 洋生物技术D细胞工程技术 3. 下列哪个产品不是用生物技术生产的（D）A青霉素B淀粉酶C乙醇D氯化钠 4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制 药的特征 A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B 高技术、高投入、低风险、高收益、长周期 C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期 D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期 5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作 A10% B5% C 1% D 7% 名词解释 （2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物 发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初 级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶 反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技 术发展速度快。代表产品有青霉素，链霉素，红 霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。 （3）现代生物技术阶段的技术特征是DNA 重 组技术。所得的产品结构复杂，治疗针对性强， 疗效高，不足之处是稳定性差，分离 纯化工艺更复杂。代表产品有胰岛素，干扰素和 疫苗等。 3. 生物技术在制药中有那些应用？ 生物技术应用于制药工业可大量生产廉价的防治 人类重大疾病及疑难症的新型药物，具体体现在 以下几个方面： （1）基因工程制药，利用基因工程技术可生 产岀具有生理活性的肽类和蛋白质类药物，基因 工程疫苗和抗体，还可建立更有效的药物筛选模 型，改良现有发酵菌种，改进生产工艺，提供更 准确的诊断技术和更有效的治疗技术等。随着基 因技术的发展，应用前景会更广阔。 （2）细胞工程和酶工程制药 该技术的发展为现代制药技术提供了更强大的技 术手段，使人类可控制或干预生物体初次生代谢 产物和生物转化等过程，使动植物能更有效的满 足人类健康方面的需求。 （3）发酵工程制药 发酵工程制药的发展主要体现在对传统工艺的改 进，新药的研制和高效菌株的筛选和改造等。 第二章基因工程制药 填空题 1. 基因工 程药物制造的主要步骤是：目的 基因的获得；构建DNA重组体;构建工程菌；目 的基因的表达；产物的分离纯化; 产品的检 验。 1. 生物技术制药 采用现代生物技术可以人为的创 造一些条件，借助某些微生物、 植物或动物来生产所需的医学药 品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物 一般说来，采用DNA重组技术 或其它生物新技术研制的蛋白 质或核酸来药物称为生物技术药 物。 3. 生物药物 生物技术药物是重组产品概念在 医药领域的扩大应用，并与天然 药物、微生物药物、海洋药物和 生物制品一起归类为生物生物药 物。 简答题 1.生物技术药物的特性是什 么？ 生物技术药物的特征是： （1）分子结构复杂 （2）具有种属差异特异性 （3）治疗针对性强、疗效高 （4）稳定性差 （5）免疫原性 （6）基因稳定性 （7）体内半衰期短 （8）受体效应 （9）多效应和网络效应 （10）检验特殊性 2.简述生物技术发展的不同阶段 的技术特征和代表产品？ （1）传统生物技术的技术特征 是酿造技术，所得产品的结构较 为简单，属于微生物的初级代谢 产物。代表产品如酒、醋、乙 醇，乳酸，柠檬酸等。
生物技术制药考试题复 习 内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
一：选择题 1、酶的主要来源是（C） A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/植物细胞与组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指 (A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：（E） A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用? B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定? C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒? B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：（D） A、Poly?A B、PolyC C、PolyG D、PolyT E、发夹结构
7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达? C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达? D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产物的功能 B、表达产物的产量C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易? 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和（安全性鉴定）。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A.糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇（PEG）诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相对分子量大，促进融合率高 B、PEG的浓度高，促进融合率高 C、PEG的相对分子量小，促进融合率高 D、PEG的最佳相对分子量为4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物为糖基化蛋白质 B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D、表达产物为天然产物? 13、人类第一个基因工程药物是：(A)
第一章绪论 1、生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是（）、（）、（) 2、生物技术制药发展历程经历了飞速发展的四个十年，分别是（）、（）、（）、（）。 3、生物技术所含的主要技术范畴有（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）和（）。 4、下列哪个产品不是用生物技术生产的（） A 青霉素 B 淀粉酶 C 乙醇 D 氯化钠 5、我国科学家承担了人类基因组计划（）的测序工作 A 10% B 5% C 1% D 7% 6、生物技术 7、生物技术药物 8、生物技术制药 第二章基因工程制药 1、基因工程药物制造的主要步骤是：（）、（）、（）、（）、（）、（）。 2、目的基因获得的主要方法是（）、（）、（）、（）。 3、基因表达的微生物宿主细胞分为2大类。第一类为（），目前常用的主要有（）；第二类 为（），常用的主要有（）。 4、基因工程药物的分离纯化一般不应超过5个步骤，包括（）、（）、（）、（）和（）。 5、在基因工程药物分离纯化过程中，基因重组蛋白的分离比较困难，可用（）、（）、（）、 （）的方法，达到初步分离的目的。 6、人工化学合成DNA新形成的核苷酸链的合成方向是（），合成的DNA 5’末端是（），3’ 末端是（）。 7、凝胶过滤法是依赖（）来分离蛋白组分 A、分子大小 B、带电状态 C、分子质量 D、解离状态 8、可用于医药目的的蛋白质和多肽药物都是由相应的（）合成的 A RNA B 基因 C 氨基酸 D 激素 9、用反转录法获得目的基因，首先必须获得（） P13cDNA文库法 A tRNA B cDNA C rRNA D mRNA 10、那一类细菌不属于原核细胞（） A 大肠杆菌 B 枯草芽孢杆菌 C 酵母 D 链霉菌 11、基因工程菌的生长代谢与（）无关 A 碳源 B RNA聚合酶 C 核糖体 D产物的分子量 12、基因工程菌的高密度发酵过程中，目前普遍采用（）作为发酵培养基的碳源 A 葡萄糖 B 蔗糖 C 甘油 D甘露醇 13、下列那种色谱方法是依据分子筛作用来纯化基因工程药物（） A 离子交换色谱 B 亲和色谱 C 凝胶色谱 D气相色谱 简答: 1、基因工程制药的概念？ 2、什么是载体？载体主要有哪几种？ 3、质粒载体的三种构型是什么？质粒载体的性质？用于克隆表达质粒载体的三个要素是 什么？ 4、目的基因常用的制备方法有哪四种？这四种方法的基本步骤是什么？
生物技术制药要点概括 1.现代生物技术发展大事记： 年代主要发现和进展 1953 Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构 1958 分离得到DNA聚合酶I，并在试管内制得人工DNA 1960 发现mRNA，并阐明了mRNA在蛋白质合成中的作用 1966 破译遗传密码 1967 分离得到DNA连接酶 1970 分离出第一个限制性内切酶 1971 第一次用限制性内切酶和连接酶获得重组DNA 1972 合成了完整了tRNA基因 1974 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术 1975 Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术 1976 DNA测序技术诞生 1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1981 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用 1981 第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生 1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准 1983 基因工程Ti质粒用于植物转化 1988 PCR（聚合酶链式反应）技术诞生 1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案 1997 英国培育出世界上第一只克隆羊多莉 1998 美国批准艾滋病疫苗进行人体实验 2001 人类基因组草图完成 2003 世界上第一个正式批准的基因治疗药物重组腺病毒-p53注射液在中国上市 2008 人类将表皮细胞激活为干细胞 2.生物技术药物（biopharmaceutics）:广义是是指所有以生物质为原料只去的各种生物活性物质及其人工合成类似物、以及通过现代生物技术制的的药物，狭义指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学。生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核算类药物。 3.生物技术药物的四大类型：基因重组药物、基因药物、天然药物、合成的半合成的生物技术药物。 4.生物技术药物的主要特点：剂量小，活性高；分子结构复杂，分子量一般较大；稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短；具有种属特异性；具有免疫原性；分析检验的特殊性。 5.生物技术药物与化学药物的区别：
生物制药练习题A 一、名词解释： 1.生物技术： 2.疏水层析： 3.生物技术制药： 4.疏水层析： 5.生物反应器： 6.贴壁培养： 二、判断题： 1．细胞工程操作主要对象是细胞。（） 2．细胞工程理论基础是细胞的全能性。（） 3．细胞核移植是指将一种细胞的细胞核转移到另一种去掉了细胞核的细胞质内，然后将不同来源的细胞核和细胞质融合组成新的细胞。（） 三、填空题： 1．生物技术制药的特征包括：（1）；（2）；（3）； （4）；（5）。 2．基因工程药物主要包括: （1）；（2）；（3）；（4）。 3．细胞物理破碎包括：（1）；（2）； （3）；（4）。 4．酶在医药领域的应用：（1）； （2）；（3）
；（4）。 四、简答题： 1. 现代生物药物包括哪几类？ 2．次级代谢产物的特征。 3．B淋巴细胞杂交瘤技术中常用哪种选择性培养基和细胞融合剂？4．提高质粒稳定性的方法。 5．基因工程产品纯化前的性质。 五、问答题： 1．成纤维细胞型细胞的特点及来源。 2．正常细胞体外培养在原代培养期的特点并举例。 3. 免疫毒素可用于治疗哪些疾病？优点是什么？ 4. 发酵过程的溶氧变化。 5．固定化酶的优点。
生物制药练习题A答案 一、名词解释： 1. 生物技术： 生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（或品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。 2．疏水层析： 是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。 3.生物技术制药： 采用现代生物技术可以人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，称为生物技术制药。 4.疏水层析： 是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。 5．生物反应器： 在体外模拟生物体的功能，设计出来用于生产或检测各种化学品的反应装置。或者说，生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。 6．贴壁培养：
第一章、绪论 1. 生物技术制药：采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，称为生物技术药物。 3. 生物药物：指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 4. 现代生物药物四大类型：⑴应用重组DNA技术制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂； ⑵基因药物 ⑶来自动物、植物和微生物的天然药物； ⑷合成与部分合成的生物药物。 5. 生物药物功能用途分类：⑴治疗药物，⑵预防药物⑶诊断药物。 6. 生物技术制药的特征：⑴高技术⑵高投入⑶长周期⑷高风险⑸高收益 7. 生物技术在制药中的应用：⑴基因工程制药：①基因工程药物品种的开发、②基因工程疫苗、③基因工程抗体、④基因诊断与基因治疗、⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型、⑥应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物、⑦基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用、⑧利用转基因动、⑨植物生产蛋白质类药物 ⑵细胞工程制药：①单克隆抗体技术、②动物细胞培养 ⑶酶工程制药 ⑷发酵工程制药 8. 我国生物技术制药现状和发展前景（自己阐述观点）
第二章基因工程制药 1．基因工程生产哪些药：⑴免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体。⑵细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子及凝血因子。⑶激素，如胰岛素、生长激素、心钠素⑷酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物歧化酶等。 2. 利用基因工程技术生产药品的优点在于： ⑴利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用建立有效的保障。 ⑵可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。 ⑶利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。 ⑷内源生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程读起进行改造。 ⑸利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 3. 上游阶段：是研究开发比不可少的基础，主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）。上游阶段的工作主要咋实验室内完成。 4. 下游阶段：是从工程菌（细胞）的大规模培养直到产品的分离纯化、质量控制等。下游阶段是将实验室成果产业化、商品化。 5. 制备基因工程药物的基本过程：获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装 6. 宿主菌应该满足以下要求：⑴具有高浓度、高产量、高产率；⑵能利用易得廉价原料； ⑶不致病、不产生内毒素；⑷发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；⑸容易进行代谢调控；⑹容易进行重组DNA技术；⑺产物容易提取纯化 7. 宿主细胞分为两大类：⑴原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；⑵真核细胞：酵母、丝状真菌 8. 表达载体必须具备以下条件（特点）： ⑴载体能够独立地复制 ⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且克隆位点应位于启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达。 ⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。 ⑷应具有阻遏子，使启动子收到控制，只有当诱导时候才能进行转录。 ⑸应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有反义的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。 ⒐密码子的偏爱性：在基因组中把使用频率高的同义密码子称为主密码子或偏爱密码子。此现象被称为密码子偏爱性 ⒑融合蛋白：由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的，称为融合蛋白。 ⒒酵母的复制序列的几种不同载体：⑴YEp类（酵母附加体质粒） ⑵YRp类（酵母复制型质粒） ⑶YCp类(酵母着丝粒质粒) ⑷Yip类（酵母整合型质粒） ⒓基因工程菌的不稳定性：基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。
生物技术制药复习提纲 生物技术所含的主要技术范畴包含有哪几个工程？ 基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 基因工程菌在传代过程中的质粒不稳定的现象主要是指哪两种不稳定？ 质粒不稳定分为分裂不稳定性和结构不稳定性 基因工程菌的培养方式有哪几种？ 分批培养；补料分批培养；连续培养；透析培养和固定化培养； 从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可以分为哪几种？ 悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。 动物细胞培养基分为哪三类？ 天然培养基合成培养基无血清培养基 植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有哪几类？。 无机盐碳源植物生长调节剂有机氮源维生素 在V区中，决定抗体分子与抗原分子发生特异性结合的关键部位称为互补决定区（CDR），而c 区则决定了Ig分子的异种抗原性。 酶固定法中的包埋法可分为哪两种？ 网格型微囊型 发酵工业的生产水平取决于哪三个要素？ 生产菌种、发酵工艺和发酵设备 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为哪三类？
治疗药物、预防药物、诊断药物 基因工程药物制造的主要步骤如何？ 目的基因的获得；构建DNA重组体；构建工程菌；目的基因的表达；产物的分离纯化；产品的检验 酶和细胞的固定化载体主要有哪三类？ 吸附载体包埋载体交联载体 单克隆抗体制备时对动物的免疫方法分为哪两种？ 体内免疫法和体外免疫法 生产用动物细胞为原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系以及工程细胞系。 目前工业常用的酶一般是以什么为主要来源？ 微生物 发酵工程产品开发的关键是筛选到高效菌株，一般优良菌种的选育方法主要有哪几种？ 自然选育、诱变育种和原生质体融合 . 在制备大量微生物菌体或其代谢产物时，可采用不同的发酵方式。微生物的发酵方式有哪几种？ 分批发酵、补料分批发酵、连续发酵 目的基因的获得方法有哪几种？用反转录法获得目的基因，首先必须获得什么？cDNA法获得目的基因的优点是什么？将构建好载体导入动物细胞最常用的方法是什么？ 反转录法、反转录-聚合酶链反应法和化学合成法 目的基因的mRNA 获得的目的基因编码序列无内含子，目的基因的筛选较容易 磷酸钙沉淀法电穿孔法
生物技术制药 第一章绪论 药学一级学科分类：药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及微生物与生化药学二级学科 ★生物技术与生物技术药物的概念 生物技术药物的分类 ?按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片) ?按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物 ?按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物 ★生物技术药物的特性 ?理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差 ?药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性 ?生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染 ?质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等) 第二章基因工程制药 蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性 临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学 真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响 基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH 基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性 基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节 ?上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞 ?下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装 基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞 ?酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端 ?1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量?影响限制性内切酶反应的因素： ?DNA样品的纯度： ?DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。 ?酶切反应的温度 ?DNA的分子结构 ?反应缓冲液组成 ?反应时间、反应体积等
第三章动物细胞工程制药 一?生产用动物细胞目前用于生物制药的动物细胞有4类,即原代细胞?二倍体细胞系,融合的或重组的工程细胞系和转化细胞系? 1原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液?动物细胞生产生物药品的早期,一般用原代培养的细胞来生产疫苗,如鸡胚细胞?原代兔肾细胞?鼠肾细胞,淋巴细胞等,Ender最先用原代培养的猴肾组织细胞来生产脊髓灰质炎灭活疫苗?原代细胞增殖能力有限,需要大量动物才能增加产量,费钱费力,限制了它的应用? 2传代细胞系 原代细胞经过传代筛选克隆,从多种细胞成分中挑选并纯化出某种具有一定征的细胞株称为CCL?许多CCL建立于50年代,用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量,并且因为所用的细胞性质均一,通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量,避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题?但C CL在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处,有时是从肿瘤细胞衍生而来,由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性,因而数十年间未允许C CL用于生产?7 O 年代以后,大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性,wI一38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系?二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取,有明显的贴壁和接触抑制特性,有正常细胞的核型,一般可传代培养5 0代?且无致瘤性,现在C C L已被广泛用于人用治疗性药物的生产,但仍不是理想的生产细胞系? 3工程细胞系 工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组,获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系?用于构建工程细胞的动物细胞有BHK一2l,CHO—dhfr?Namalwa?Vero?SP2/O,Sf一9等细胞系?sP2/0一Ag l4工程细胞系是通过融合的方法,从抗羊红细胞活性的BALB/c的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞P3x63A98融合杂交瘤sP2/NL—Ag 亚克隆中分离获得,可用于生产单克隆抗体幢l?目前用重组DNA技术改造的C H O细胞生产干扰素,白介素,E P O?单克隆抗体?诊断试剂以及其它各种蛋白质类药品已成为国际医药市场上的热销产品,但这些产品的生产规模普遍较小(大多为5~50升的小型培养罐)? 4转化细胞系 通过某个转化过程形成的,常由于染色体断裂变成异倍体,失去正常细胞特点,而获得无限增殖能力?转化细胞系具有长期培养,倍增时间短,对培养条件和生长因子等要求较低的特点,适于大规模工业化生产?在生物制药中,可通过改造宿主细胞特性,如延长细胞周期.提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量?李红艳等研究空间环境对CH0(dhfr)细胞生长特性的影响,结果表明空间诱变致生长减慢的细胞株有利于提高目的蛋白的产量,为筛选优化的生物工程制药细胞提供可能?目前cHo(dhfr)作为重要的基因表达受体细咆,已成功应用于表达促红细胞生成素(EPO)?重组乙型肝炎疫苗等生物制药领域? 二、动物细胞工程制药技术 1细胞融合
《生物技术制药》复习资料（Biotech nological Pharmaceutics ） 第一章绪论 一、概述 1.概念：生物药物（生物制药）是泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。|采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，叫做生物技术制药。 2.技术范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白质工程、抗体工程、糖链工程和海洋生物技术等。 3.相关学科：有生物学（含微生物学、分子生物学、遗传学等）、化学、工程学（化学工程、电子工程等）、医学、药学、农学等。但从基础学科来讲，生物学、化学和工程学是其主要的学科。 4.应用范围：（1）医药；（2）农业；（3）食品；（4）工业；（5）环境净化；（6）能源。 二、生物技术的发展简史 1.传统生物技术阶段 主要产品：乳酸、酒精、丙酮、丁酸、柠檬酸、淀粉酶。 生产的特点：过程简单，大多属兼气发酵或表面培养，生产设备要求不高，产品化学结构简单，属初级代谢产物。 2.近代生物技术阶段 主要产品：抗生素、维生素、甾体、氨基酸；食品工业的工业酶制剂、食用氨基酸、酵母、啤酒；化工业的酒精、丙酮、丁醇、沼气；农林业的农药；环境保护业的生物治理污染。生物技术的特点：（1）产品类型多，初级（氨基酸、酶、有机酸）、次级（抗生素）、生物转化（甾体）；（2）生物技术要求高， 纯种、无菌、通气，产品质量要求也高；（3）生产设备规模大；（4）技术发展速度快。 3.现代生物技术 主要产品：胰岛素、干扰素、生长激素等。 生物技术的内容包括：（1）重组DNA技术及其它转基因技术（基因工程）；（2）细胞和原生质体融合技术（细胞工程）；（3）酶或细胞的固定化技术（酶工程）；（4）植物脱毒和快速繁殖技术；（5）动物细胞大量培养技术；（6）动物胚胎工程技术；（7）现代发酵技术；（8）现代生物反应工程和分离工程技术；（9）蛋白质工程技术；（10）海洋生物技术。 三、医药生物技术的新进展 1.基础研究不断深入
一：选择题 1、酶的主要来源是( C) A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/ 植物细胞与 组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指(A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素( EPO)基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：( E) A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用 B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定 C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒 B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：( D) A、Poly A B、Poly C C、Poly G D、Poly T E、发夹结构 7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达 C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达 D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产 物的功能B、表达产物的产量 C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和(安全性鉴定)。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A. 糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇( PEG)诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相 对分子量大，促进融合率高B、PEG的浓度高，促进融合率高C、PEG 的相对分子量小，促进融合率高D、PEG的最佳相对分子量为 4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物 为糖基化蛋白质B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D 、表达产物为天然产物 13、人类第一个基因工程药物是：(A) A、人胰岛素 B、重组链激酶 C、促红细胞生成素 D、乙型肝炎疫苗 14、下列不属于加工改造后的抗体是：(C) A、人-鼠嵌合抗体 B、单链抗体C 、鼠源性单克隆抗体D、单域抗体 15、动物细胞培养的条件中，不正确的是：(D)
生物技术制药知识点纲要 生物技术制药:采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产药品。 生物技术药物一般来说，采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。 生物药物：生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物.微生物药物.海洋药物和生物制品一起归类为生物药物。 生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程、抗体工程等。 基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术； 细胞工程是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件； 发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。 生物技术：从广义角度来看，是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。 第三代生物技术是海洋生物技术 我国科学家承担了人类基因组计划1%的测序工作 现代生物技术包括: ⑴重组DNA技术 ⑵细胞和原生质体融合技术 ⑶酶和细胞的固定化技术 ⑷植物脱毒和快速繁殖技术 ⑸动物和植物细胞的大量培养技术 ⑹动物胚胎工程技术 ⑺现代微生物发酵技术 ⑻现代生物反应工程和分离工程技术 ⑼蛋白质工程技术⑽海洋生物技术 现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面： ①基因操作技术日新月异，不断完善。 ②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。 ③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。 ④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。 ⑤转基因植物和动物取得重大突破 ⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。 ⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向， ⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。
生物技术制药期末复习提 纲 Jenny was compiled in January 2021
生物技术制药复习提纲 生物技术所含的主要技术范畴包含有哪几个工程？ 基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 基因工程菌在传代过程中的质粒不稳定的现象主要是指哪两种不稳定？ 质粒不稳定分为分裂不稳定性和结构不稳定性 基因工程菌的培养方式有哪几种？ 分批培养；补料分批培养；连续培养；透析培养和固定化培养； 从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可以分为哪几种？ 悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。 动物细胞培养基分为哪三类？ 天然培养基合成培养基无血清培养基 植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有哪几类。 无机盐碳源植物生长调节剂有机氮源维生素 在V区中，决定抗体分子与抗原分子发生特异性结合的关键部位称为互补决定区（CDR），而 c 区则决定了Ig分子的异种抗原性。 酶固定法中的包埋法可分为哪两种？ 网格型微囊型 发酵工业的生产水平取决于哪三个要素？ 生产菌种、发酵工艺和发酵设备 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为哪三类？ 治疗药物、预防药物、诊断药物
基因工程药物制造的主要步骤如何？ 目的基因的获得；构建DNA重组体；构建工程菌；目的基因的表达；产物的分离纯化；产品的检验 酶和细胞的固定化载体主要有哪三类 吸附载体包埋载体交联载体 单克隆抗体制备时对动物的免疫方法分为哪两种？ 体内免疫法和体外免疫法 生产用动物细胞为原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系以及工程细胞系。 目前工业常用的酶一般是以什么为主要来源？ 微生物 发酵工程产品开发的关键是筛选到高效菌株，一般优良菌种的选育方法主要有哪几种？ 自然选育、诱变育种和原生质体融合 . 在制备大量微生物菌体或其代谢产物时，可采用不同的发酵方式。微生物的发酵方式有哪几种？ 分批发酵、补料分批发酵、连续发酵 目的基因的获得方法有哪几种用反转录法获得目的基因，首先必须获得什么cDNA法获得目的基因的优点是什么将构建好载体导入动物细胞最常用的方法是什么 反转录法、反转录-聚合酶链反应法和化学合成法 目的基因的mRNA 获得的目的基因编码序列无内含子，目的基因的筛选较容易
生物技术制药（Biotechnological Pharmaceutics）是不断引进现代生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学和制剂学及现代基因工程等多学科先进技术而形成与发展起来的实用制药技术。 基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：①上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。、 ②下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 基因工程药物制药的主要程序：⒈目的基因的克隆⒉构建DNA重组体⒊DNA重组体转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等 反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：RT-PCR是将以RNA为模板的cDNA合成同PCR 结合在一起，该法是mRNA经反转录合成cDNA第一链，在以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始协助下，PCR扩增，特异性的合成目的cDNA链（目的基因）。 化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA 双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程 进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。 表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。并且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。
2016-2017学年第二学期期末考试《生物制药学》 大作业 一、问答题:(每题10分,共100分) 1.成纤维细胞型细胞的特点及来源: 特点:细胞生长时胞体呈棱形或不规则的三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2~3个突起。细胞群常借该突起连接成网,生长时呈放射状、漩涡状或火焰状走 行。 来源:中胚层组织来源的细胞,如成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成骨 细胞等。 2.正常细胞体外培养在原代培养期的特点并举例: 特点:①原代培养细胞呈活跃的移动,细胞分裂不旺盛,并多呈二倍体核型;② 原代培养细胞与体内细胞在形态结构和功能活动上相似性大;③细胞群是异质的,即各细胞的遗传性状互不相同,细胞相互依存性强。 例如:鸡胚细胞、原代免或鼠肾细胞、以及血液的淋巴细胞。 3. 免疫毒素可用于治疗哪些疾病?优点是什么? 可用于治疗肿瘤、自身免疫病,并能克服组织移植排斥反应,可单独给药也可 以包裹在脂质体及其他微粒中给药。由于重组免疫毒素是在胞浆物质代谢中发挥作用,相对分子质量又小,渗透力强,故效果好。 4. 发酵过程的溶氧变化: 在发酵过程中,在已有设备和正常发酵条件下,每种产物发酵的溶氧浓度变化 有自己的规律。发酵时生产菌大量繁殖,需氧量不断增加,此时的需氧量超过供氧量,
使溶氧浓度明显下降。从发酵液中的溶解氧浓度的变化,就可以了解微生物生长代谢是否正常,工艺控制是否合理,设备供氧能力是否充足等问题,帮助查找发酵不正常的原因和控制好发酵生产。 5.固定化酶的优点。 (1)酶的稳定性提高。 (2)反应后,酶与底物和产物易于分开,产物中无残留酶,易于纯化,产品质量高。 (3)反应条件易于控制,可实现转化反应的连续和自动控制。 (4)酶的利用效率高,单位酶催化的底物量增加,用酶量减少。 (5)比水溶性酶更适合于多酶反应。 6.生物技术的主要技术范畴。 生物技术(biotechnology),是指人们以现代生命科学为基础,结合其他基础科学的科学原 理,采用先进的科学技术手段,按照预先的设计改造生物体或加工生物原料,为人类生产出所需产品或达到某种目的。 生物技术是人们利用微生物、动植物体对物质原料进行加工,以提供产品来为社会服务的技术。它主要包括发酵技术和现代生物技术。因此,生物技术是一门新兴的,综合性的学科。现代生物技术综合基因工程、分子生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、胚胎学、免疫学、有机化学、无机化学、物理化学、物理学、信息学及计算机科学等多学科技术,可用于研究生命活动的规律和提供产品为社会服务等。