第33卷第5期暨南大学学报（自然科学版）
Vol．33No．52012年10月
Journal of Jinan University （Natural Science ）
Oct．2012
［收稿日期］2012－03－26
［基金项目］国家自然科学基金项目（81202449）；广东省科技计划项目（201213010300016）［作者简介］向军俭（1952－），男，教授，研究方向：抗体技术与应用
抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术
向军俭，童吉宇，王
宏
（广东省分子免疫与抗体工程重点实验室；暨南大学抗体工程研究中心，广东广州510632）
［摘
要］100年来，抗体的发现为人类疾病诊断、治疗和有害物质的分析检测发挥了巨大的作用．特别是1975年
发明了单克隆抗体技术以及1986年发明基因工程抗体技术，为研制特异性高、大量均一并大量生产抗体成为了现实，也使嵌合抗体、全人源抗体造福人类并产生巨大的经济效益．为了克服鼠源性单抗可诱发人抗鼠抗体（HA-MA ），通过嵌合抗体、改构抗体、小分子抗体等技术和改良抗体与抗原结合的特异性，已成为抗体技术研究的主要发展方向，本文主要就抗体人源化及抗体分子小型化，抗体功能复合化两个部分的进展进行综述．［关键词］抗体；
人源化抗体；
基因工程抗体；
抗体库技术；
小分子抗体
［中图分类号］R392．11
［文献标志码］A
［文章编号］1000－9965（2012）05－0524－07
Recent advances in antibody technique （1）：Humanized antibody technique
XIANG Jun-jian ，TONG Ji-yu ，WANG Hong
（Guangdong province Key laboratory of Molecule Immunology and Antibody Engineering ，Jinan University ，Guangzhou 510632，China ）
［Abstract ］In the past 100years ，antibody has played a significant role in human disease diagnosis
and treatment and the analysis of detrimental substances．Especially ，the inventions of both monoclonal antibody technique in 1975and genetic engineering technique in 1986，on one hand ，have made it possi-ble for producing abundant antibodies of high specificity and homogeneity ，on the other hand ，help chim-eric antibody and fully human antibody bring benefit to human beings．To overcome the problem that mu-rine monoclonal antibody may induce HAMA ，technologies such as chimeric antibody ，reshaping antibod-y ，small-molecule antibody and improvements of the specificity between antibody and antigen have be-come the main trend when developing antibody technique．This review gives an overview on antibody hu-manization ，small-molecule antibody and composite function of antibody．［Key words ］antibody ；humanization antibody ；genetic engineering antibody ；
antibody library
technique ；small-molecule antibody 19世纪末抗体首次被发现，其后很长一段时间内人们都以抗原免疫动物获得抗血清（多克隆抗
体）．1975年，
K hler 和Milstein 建立了B 淋巴细胞杂交瘤技术，为大量生产均一、特异性强的单克隆抗体提供了技术支持并使免疫学发生一场革命，有力
地促进诊断与治疗性抗体的发展．然而由于单克隆
抗体大部分为鼠源性抗体，在临床治疗中可在人体
内可诱发人抗鼠抗体（HAMA ）［1］
，限制了单克隆抗体在临床治疗中的应用．随着基因工程技术的发展和对各类抗体结构和氨基酸序列、及其变异种属和
功能之间关系的深入研究，基因工程技术将抗体的表达同抗体DNA重组技术有机的结合起来，基因工程抗体是继血清多克隆抗体、单克隆抗体之后的第三代抗体．
1鼠单抗人源化
为了降低鼠单抗的异源性，人们利用基因工程技术对鼠源单抗进行改造，即鼠单抗的人源化，其基本的方法是保留鼠源单抗与抗原特异结合的部分基因，其余部分用人源抗体基因代替．
1．1人－鼠嵌合抗体
通过对抗原抗体结合作用的分析，发现抗体的可变区是与抗原结的部位，而恒定区与抗原的结合无关，因此可以用人的恒定区基因取代鼠的恒定区基因，构建人－鼠嵌合的质粒载体，通过转染宿主细胞，表达人－鼠嵌合抗体［2］．与鼠单抗相比，嵌合抗体的异源性大大降低，而其结合抗原的特异性和亲和力得到了保留．目前已经有部分嵌合抗体批准应用于临床治疗，如Reopro、Rituxan分别于1994年和1997年批准上市，前者用于治疗心血管疾病，后者用于非何杰奇金斯淋巴癌和类风湿性关节炎的治疗．
1．2人改型抗体
虽然嵌合抗体的异源性相比鼠源单抗有很大程度的降低，但其仍然含有30%左右的鼠源序列，可引起不同程度的HAMA，所以有必要设法进一步降低其鼠源性．进一步研究表明，抗体分子与抗原直接接触的是可变区中的6个互补决定区（complement-determining regions，CDRs）形成的平面，骨（框）架区（framework regions，FRs）作为支架，立体构象保守．因此，将鼠单抗的互补决定区移植到人单抗的骨架区上，使抗体既获得鼠单抗的特异性，又大大的降低鼠单抗的异源性［3］．但是研究表明，起脚手架作用的骨架区不仅提供了CDR的空间构象环境，有时还参加抗体结合位点正确构象的形成，甚至参加与抗原的结合，简单的CDR移植往往导致抗体亲和力的降低或丧失．因此，如何在FR中、FR和CDR 之间进行操作至关重要，目前主要有以下4种策略．（1）模板替换使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR．这种同源替换主要考虑的是，使鼠CDR在替换后有类似的折叠环境，从而保持原来的构象．在选择人FR时通常有两条途径．第一种是对需要进行人源化的鼠单抗，用已有晶体结构数据的人源抗体FR作为替换的基本模板，借助序列比较与分子建模，从而确定在鼠FR中与CDR有密切作用的氨基酸残基，使其保留在替换的人源FR中．此方法中，确切的人源FR晶体结构为残基替换提供了明确的信息，减少了盲目性，但由于改变的氨基酸残基数较多，不易保存CDR的天然构象，成功率低．
第二种是通过对已有的抗体序列库进行筛选，得到与鼠单抗FR有最大同源的人源FR用以替换，此方法同样需要分子建模来提供与CDR移植相关的关键残基信息．此方法所需更改的氨基酸数目较少，能更好的保持CDR折叠所需空间环境．两种方法均有成功的实验报道．两种方法均需要通过分子模建来提供CDR移植后可能或缺的FR关键残基的信息．同源替换的优点在于减少需要更改的氨基酸数目，更好地保持CDR需要的空间环境；不足在于选择的人源FR可能并无结构数据，不能提供有效的关键残基信息．
（2）表面重塑抗体对鼠CDR及FR表面残基进行修饰或重塑，使之类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的型式．
1991年Padlan经过研究发现尽管鼠和人的可变区来自不同种属，但暴露于表面的氨基酸残基的位置和数目却非常保守，它们是可变区免疫原性的主要来源，于是Padlan提出了利用表面重塑的方法来改造非人源抗体［4，5］，此方法的原则是将鼠可变区中暴露在表面的骨架区残基替换为人源性残基．此方法可以不进行同源建模，在序列同源分析的基础上，选择与鼠表面残基暴露类型最匹配的人源型式进行，但是不够准确，且如果改变后的残基在侧链大小、电荷、疏水性方面变化较大或者形成氢键，从而影响到CDR的构象，则此残基不予改变，以减少CDR-FR之间的不相容性．由于鼠源单抗在人体引起的HAMA反应，究竟是完全由其表面暴露残基引起，还是由内外部残基共同作用，涉及抗体产生的最基本的免疫学机制，而这种机制仍在探讨之中．表面重塑抗体消除异源性的效果如何，至今尚无临床报道．
（3）补偿变换在人FR中，通过对与CDR有相互作用、与抗体亲和力密切相关或与FR空间折叠起关键作用的残基的改变，来补偿完全的CDR移植［6］．
通过对抗体立体结构数据和同源性分析，根据FR残基对抗原结合、CDR构象的稳定、FR的折叠中的重要程度，可将这些残基分为：低风险性残基，
525
第5期向军俭，等：抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术
高风险性残基和中度风险性残基．低风险性残基暴露于溶剂中，但对抗原结合和抗体结构影响很少，对此类残基进行同源替代既能降低免疫原性又不影响抗体的亲和力；高风险性残基直接参与抗原结合、CDR构象的稳定或FR折叠，此类残基应尽量避免替换．对中度风险性残基的替换应谨慎．通常将FR 中的高风险性残基与部分中度风险性残基通称为非CDR区补充调控残基．由于其可分布于线性序列的不同位置，为不同CDR回折提供合适的“平台”，从而其形状和侧链大小协同决定CDR的基本构象，影响抗原结合特异性．因而在CDR移植时，必须将FR 的这些关键位置也替换为鼠源非CDR区补充调控残基以补偿完全的CDR移植．此方法避免了人源化突变方案盲目性而可能导致失败的探索．并且在对中度风险性残基进行变化时，还有可能提高人源化抗体的亲和力．不足的是对残基的分类要以晶体数据和三维结构为基础，才能提供准确的标准．
（4）定位保留在人源化单抗中，通过保留鼠源单抗中参与抗原结合的CDR和FR中的一些关键残基［7］，其余残基进行人源化，从而保证人源化抗体的抗原结合能力和降低抗原性，但是所得到的人源化抗体序列与人抗体的保守序列在一些位置仍有差别，这些差别来源于在抗体亲和力成熟过程中产生的非典型残基．
通过以人FR保守序列为模板进行人源化是一个有效的途径．首先从现有的人源抗体保守序列中搜寻与鼠框架区最类似的序列；其次根据最简位置模板确定鼠可变区的关键位置残基；最后保留所有这些位置而将其余部分进行人源化．Couto等［8］利用此技术对抗乳腺表皮抗原BA46的抗体Mc3成功地进行了人源化．
1．3抗体库技术人源化抗体
（1）抗体库技术优化人改型抗体在进行抗体人源化过程中，除移植CDR外，还需移植部分在抗原结合过程中起重要作用的骨架区的残基．所以在通过CDR移植构建人改型抗体时，最关键的步骤是确定可影响抗原抗体结合活性的骨架区残基，尽管通过立体构象分析和分子模建有助于这些骨架区残基的确定，但其最终的确定往往需要构建多种抗体的突变体，反复测试．
由于抗体库技术对多样化抗体的强大筛选能力，其可以作为筛选关键骨架区残基的理想方法．通过分析抗体分子结构［9］，找出对抗原结合部位立体构象可能有影响的骨架区残基，将这些残基的鼠源副本和人源副本同时组合到一个抗体库中，进一步筛选过，从而确定需要保留鼠源性的骨架区残基位点［10］．Baca等［11］通过对抗VEGF鼠嵌合抗体的骨架结构的进一步分析，确定了骨架区中可能在抗原结合过程中起重要作的13个残基，将这13个残基进行随机化后构建噬菌体抗体库，通过8轮筛选获得了亲和力提高125倍的人源化抗体．
（2）抗原表位定向选择1994年由Jespers等首先提出，是在噬菌体抗体库技术基础上，对鼠单抗进行人源化的新策略．
此方法利用抗体库技术，通过抗原的诱导筛选，获得能够模拟鼠单抗的可变区，从而结合相同抗原表位的人源抗体［12］．其基本原理：首先选择鼠单抗的一个可变区基因（重链或者轻链）与人抗体的另一个可变区基因（轻链或者重链）配对，构建人－鼠杂合抗体库，通过相应的抗原，筛选出能结合抗原的克隆，从而可得到能与鼠可变区配对的人重或轻链可变区基因，再将所得到的人重或轻链可变区基因与另一条人轻或重链可变区基因文库组合构建成人抗体库，通过相同的抗原筛选，得到可以与抗原特异性结合的人抗体的重轻链基因，获得完全人源化的抗体．
此方法具有操作简便、可获得完全人源化抗体的优点，但是由于人抗体库多样性不一定能满足要求，可能会发生筛选失败，并且经此过程得到的抗体的亲和力得不到保证，甚至有些抗体的特异性会发生漂变．为了克服以上缺陷，可以事先在人可变区抗体库中植入鼠单抗的CDR3，此法一方面不影响抗体的人源性，另一方面可以大大增加抗体与抗原结合的能力．在抗原定向选择方法中，Rader等［13］以亲本鼠单抗的CDR3区基因替换所用的人抗体库中的CDR3，构建了含亲本鼠单抗CDR3基因的人源化噬菌体抗体库，再通过与鼠单抗亲本抗体配对，依次进行链替换，筛选到与亲本鼠单抗识别同一抗原表位的抗人整合素αβγ3人源抗体．
2抗体库技术
抗体库技术的出现，使抗体工程技术进入了一个新的时代．PCR技术的建立、功能性抗体分子片段在大肠杆菌中的成功表达和噬菌体展示技术的发展成为了抗体库技术得以建立的基础．
2．1噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术［14］的原理：将编码抗体分子可变区的全套基因克隆出来，与噬菌体外壳蛋白基
625暨南大学学报（自然科学版）第33卷
因进行融合，使抗体分子片段表达于噬菌体表面，由于可变区的多样性便导致了噬菌体抗体的多样性，再经过“吸附—洗脱—扩增”，可以有效的筛选出特异性的目的抗体可变区基因．
在建立噬菌体抗体库时，表达载体的选择尤为重要，目前常用于表达噬菌体抗体的主要有丝状噬菌体［15］和噬粒［16］（phagemid）．前者主要通过将抗体片段基因重组于噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ5'端前导序列下游，形成融合蛋白，将此噬菌体感染大肠杆菌后，可产生氨基端具有抗体分子片段的外壳蛋白颗粒．
噬粒为质粒载体，含有丝状噬菌体的基因间隔区（约500个碱基对）而不含任何噬菌体编码基因，其作用是介导噬菌体DNA的复制、包装和释放．辅助病毒（helper phage）含有编码所有噬菌体蛋白的基因，当辅助病毒感染了含有噬粒的大肠杆菌时，可将噬粒DNA以单链形式包裹在噬菌体蛋白内，组装成病毒颗粒而释放出大肠杆菌，由于间隔区没有编码基因，所以此病毒颗粒虽然能感染大肠杆菌但是却不能产生子代噬菌体［17］．当用基因工程方法将抗体分子片段基因与噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ融合后插入噬粒基因中，再通过辅助病毒感染大肠杆菌，可以得到外壳蛋白上表达抗体分子片段的噬菌体颗粒．在用丝状噬菌体基因作为载体时，为保证融合后噬菌体外壳蛋白的结构不发生很大变化，融合的抗体片段不应超过10个肽，并且由于表达的所有子代噬菌体外壳蛋白都带有抗体分子片段，所以在噬菌体表面抗体分子通常以多价的形式存在，从而不利于筛选高亲和力的噬菌体抗体．而利用噬粒作为载体时，子代噬菌体表面既含有辅助病毒基因编码的外壳蛋白，也含有噬粒基因编码的抗体分子片段—外壳蛋白，两者的数目取决于辅助病毒基因与噬粒基因的相对数量［18］，产生的抗体分子片段大多以单价的形式存在，可用于筛选高亲和力的噬菌体抗体．
目前已经建立了多种噬菌体展示系统［19］：M13噬菌体展示系统，主要展示在5个衣壳蛋白上，即P3、P6、P7、P8和P9蛋白；λ噬菌体展示系统，主要采用D蛋白和V蛋白介导展示；T4噬菌体展示系统，主要展示在HOC和SOC两种衣壳表面附属蛋白上；T7噬菌体展示系统，主要由10B蛋白介导展示．在噬菌体展示技术的应用过程中，根据不同目标选择不同的噬菌体和锚定蛋白，以及展示在锚定蛋白的N端还是C端成为噬菌体展示技术应用的首要考虑问题．随着噬菌体展示系统的开发、改良和新融合策略的应用，噬菌体展示技术在研究蛋白质相互作用、抗体工程和酶特异性等方面发挥着不可替代的作用．邓宁等［20］利用噬菌体展示技术从人外周血淋巴细胞获得抗HBsAg Fab抗体的轻、重链基因．将Fab的轻、重链基因分别整合到巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌株的染色体上，成功构建了高效分泌表达抗HBsAg Fab抗体的酵母工程菌．
2．2核糖体展示技术
同噬菌体展示技术类似，核糖体展示技术［21］建立在DNA文库的基础之上．其基本原理是：首先利用PCR技术构建抗体的DNA文库（此文库无3'末端的终止密码子），再将此文库进行体外表达．由于缺少3'端终止密码子，在翻译到mRNA末端时，mR-NA不会从核糖体上脱落下来，从而形成“抗体蛋白－核糖体－mRNA”三元复合物（protein-ribosome-mRNA complexes，PRM），使抗体展示于核糖体表面．通过抗原的亲和筛选得到可以与抗原有高亲和力的mRNA，通过RT-PCR扩增，PCR产物又可以进入下一轮循环，进行进一步筛选，从而最终获得高亲和力的抗体及其基因序列．
核糖体展示技术主要的优点有：库容大（可达1015），库的构建快（一般1 2d可完成）；筛选不依赖宿主细胞活性；可对毒素、半抗原等体内展示技术无法进行的物质进行筛选；可在每轮RT-PCR中引入突变，促进抗体亲和力成熟［22］．
此技术中，提高PRM复合物的稳定性［23］，保证mRNA的完整性是整个实验成败的关键，在低温、高浓度的Mg2+以及RNase活性抑制剂的条件下，PRM复合物稳定性大大提高．与此同时，对表达系统的选择目前仍没有定论，原核与真核表达系统各有优缺点，前者表达效率高但存在翻译暂停、不正确折叠等问题；后者则表达效率低．利用核糖体技术构建抗体库，通常是从动物或人的外周血淋巴细胞或脾脏中提取总RNA，然后利用设计好的引物，通过RT-PCR与重叠延伸等技术进行构建．由于完整抗体的分子量大，不利于展示，通常以构建scFv库多见．1997年，Hanes与Plückthun［24］利用E．coli S30裂解液系统构建了库容为1013的抗血凝素scFv 库，经5轮筛选后使高亲和力的抗血凝素scFv富集了108倍．
核糖体展示技术诞生的初期主要用于从肽库中筛选高亲和力的配体，随后应用于高亲和力单链抗
725
第5期向军俭，等：抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术
体（scFv）的筛选，也有学者将此技术应用于酶的活性分析和筛选高活性的蛋白酶［23］中，从而开拓了蛋白酶研究的新思路．
3基因工程小鼠制备全人抗体
3．1转基因小鼠
转基因动物是指将外源基因导入早期胚胎细胞，使之整合于细胞基因组而建立的动物品系．转基因小鼠制备的基本原理［25］是将人的Ig基因导入小鼠的ES细胞（embryonic stem cell，胚胎干细胞）中，然后将此ES细胞再次植入假性受孕雌鼠子宫中，使其发育成带有外源基因的转基因小鼠．转基因小鼠的Ig基因被人相应的基因所取代，从而产生全人的抗体．此技术保留了完整的Ig类别转换和亲和力成熟的自然机理，避免了抗体库中模仿抗体分子重构和亲和力成熟过程的基因水平的复杂性．此技术关键在于构建处于胚系构型（germline configuration）的人Ig基因，主要有3种方法：Ig基因小位点法（miniloci）、P1噬菌体（温和噬菌体）载体法及酵母人工染色体（YACs）法．小位点法是指将Ig基因片段人工地缀合在一起，一般构建的片段较小；P1噬菌体法是应用PI噬菌体为载体，可承载稍大的DNA 片段，并可有效防止其断裂，但构建的基因较人Ig 基因仍偏小；而YACs技术可弥补上述不足，承载更大的DNA片段，从而其抗体谱（antibody repertoire）也更完全，具较大的应用优势．
1997年Mendez等应用YACs等一系列技术分别将1020kb人重链（IgH）链基因组和800kb的人κ轻链（Igκ）基因组导入Ig基因组失活小鼠，获得了名为Xenomouse的小鼠模型．随后经过3种抗原（IL－8、TNF－α、EGFR）免疫后制备的Ig G2κ单抗，都显示了高亲和力，证实转入的人Ig基因组已成功在小鼠B细胞内发生了高频突变和类别转换，标志着基因工程人抗体研制已进入基因组时代．转人Ig基因组小鼠的构建较为复杂，需多次应用转基因技术和胚胎操作技术，基因打靶是转基因技术的核心．以Xenomouse的构建为例：①先行基因打靶分别敲除小鼠重链（IgH）、κ轻链（Igκ）基因，制备IgH、κ失活小鼠（double inaetivited，Dl），然后将其子代多次交配，筛选出IgH、Igκ双失活但保留所有调控Ig基因重排和表达的反式作用序列的小鼠；
②YACs的构建；③构建完成的酵母人工染色体，通过原生质体融合的方法导入小鼠ES细胞．经筛选后可得到分别含有重链和轻链酵母人工染色体的ES细胞；④转人Ig基因组小鼠的获得．将上述筛选的ES细胞显微注射于小鼠囊胚，经体外培养后植入假孕母鼠子宫．随后对受精卵发育成的子代分析鉴定，筛选出分别携带有人IgH和Igκ的小鼠，再与Ig基因失活的小鼠交配，得到遗传背景分别为yH2，DI与yκ2，DI的子代小鼠．由该两系小鼠经互交后产生的遗传背景为yH2，yκ2，DI的小鼠即为人Ig基因组小鼠．
据资料显示，Xenomouse模型小鼠的免疫器官都有大量的hμ+B细胞，研究证明这类hμ+B细胞无论在数量、κ与λ链的比例和成熟标志表达，以及细胞活性功能等方面指标均与野生型小鼠相近，这表明这系小鼠在应用中几乎可以完全取代野生型小鼠．
3．2SCID鼠模型
SCID鼠［26］，全称为联合免疫缺陷鼠（severe combined immunodeficiency mice）．其位于16号染色体发生隐性基因突变，使小鼠的T、B淋巴细胞不能成功分化为功能性淋巴细胞，从而形成联合免疫缺陷．由于缺乏体液和细胞免疫，该突变系小鼠对异源性移植排斥作用很小，可接受人器官和组织的移植，形成人鼠嵌合体，即hu-SCID小鼠．
自1983年SCID小鼠问世以来，已陆续在移植有人外周血淋巴细胞的SCID小鼠中（hu-PBL-SCID）产生了抗破伤风类毒素（T-T）、抗乙肝核心抗原（HBcAg）、抗血吸虫、抗呼吸道合胞病毒等抗体，显示了SCID小鼠在制备人单抗中的一定潜力．从已获得的实验资料看，多数作者报道只有继发免疫才能在hu-PBL-SCID小鼠中获得特异性免疫反应．其原因可能是在hu-PBL-SCID继发性抗体反应比原发性抗体反应易于获得，此现象反映了人记忆性B细胞和原始B细胞的不同的移植和反应特性．可以通过选择合适的供者，或者利用体外致敏等技术使人的淋巴细胞在移入SCID小鼠体内之前进行抗原免疫，在移入小鼠体内之后用同样的抗原再次刺激，获得特异性的抗体．
由于人淋巴细胞在小鼠体内的存活和增殖受到其微环境的调节，故可以从经抗原免疫的hu-PBL-SCID小鼠分离出抗原特异性的人B细胞，进一步融合或者制备抗体库，从而获得针对特异性抗原的全人单抗．目前也有学者将分离的B细胞进行EBV转化［27］，筛选出能分泌特异性抗体的细胞群，进行建系，产生了高特异性的单抗．利用SCID小鼠，结合体外致敏、融合或基因工程技术，可以有效的解决免疫受限，特异性B细胞富集等问题，为获得亲和力高的抗体库提供了新的思路．
825暨南大学学报（自然科学版）第33卷
4单个B细胞抗体技术
相比于噬菌体展示技术和核糖体展示技术，利用SCID小鼠制备单抗的最大优势在于其获得的单抗是保留有完整天然的人抗体的VH和VL链．但由于EBV不可能转化所有的B细胞，被转化的仅仅是其中的一小部分，而融合技术的效率又比较低［28］，所以此方法不适合做大规模的抗体库筛选．为了维持抗体在人B细胞中的天然结构，人们建立了一种基于单个B细胞抗体VH和VL基因扩增和表达的技术．
4．1鉴定和分离单个抗原特异的B细胞
从外周血中收集淋巴细胞，进行B细胞筛选．根据不同的研究目的，单个B细胞的分离可以分别通过“随机分选”或者“抗原特异性分选”两种途径进行［29］．“随机选择”的主要方法有：基于显微操作的细胞分选［30］、激光捕获显微切割技术以及流式细胞分选技术．“抗原特异性分选”的主要方法有：抗原包被的磁珠分离、荧光包被的抗原多参数流式细胞分选［31］、溶血空斑实验和荧光灶实验等．为了满足高效、高通量筛选分泌单抗细胞的需求，人们又建立了细胞微阵列芯片系统，主要包括显微雕刻技术［32，33］和免疫斑点阵列芯片技术［34］．
显微雕刻技术利用凹雕和软板印刷技术来构建含有单个细胞分泌物的微阵列．芯片的制作选用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，大小与“1?3”的盖玻片相匹配，其阵列的微孔直径和深度均为50或100μm，微孔间隔与微孔直径相同．通过将细胞稀释，静置培养，使B细胞粘附在微孔上，用细胞分裂素刺激B细胞分化为能产生抗体的浆细胞，产生的抗体在相应的盖玻片上印制出对应的蛋白质阵列，然后用荧光标记的抗原对抗体微阵列进行扫描筛选，其结果与相应的细胞阵列成对应关系，通过显微操作技术挑出目标孔中的细胞，进行后续的克隆扩增或者单细胞的RT-PCR［33］．这样在每次可对近十万个多克隆B细胞进行筛选．
4．2单个B细胞的免疫球蛋白基因的转录扩增，测序和克隆
从单个B细胞获得cDNA为同步研究IgH和IgL基因的表达提供了很好的方法，通常不同类型的B细胞的特异性Ig基因转录量上有明显的不同，例如，相对于记忆B细胞来说，浆细胞的Ig基因表达量要大很多，所以浆细胞有利于特异性的Ig基因的扩增．通常，基因的扩增通过巢式RT-PCT［35］（nested RT-PCR）或半巢式RT-PCR（semi-nested RT-PCR）进行．巢式PCR是在完成普通PCR的基础上继续扩增比普通PCR更小的片段，需要使用两对引物：第一对引物与普通PCR类似，一般上游引物与相应IgH和IgL基因的前导序列互补，下游引物与恒定区的序列互补，也可以选择针对重链恒定区的不同区域的混合下游引物来扩增不同类型的IgH．第二对引物称为巢式引物，其结合在第一次PCR产物的内部，使第二次PCR扩增的片段短于第一次扩增．巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低．因此，巢式PCR的扩增非常特异．半巢式PCR只将普通PCR中的一个引物换成巢式引物，其扩增的片段长度介于普通PCR和巢式PCR之间．为了将重、轻链基因连接，在RT-PCR的过程中加入了重叠延伸的步骤（overlap-PCR）［36］．然后将连接的DNA片段导入相应表达载体中用于单抗的生产．
在过去的十年时间里，单个B细胞抗体技术受到越来越多的关注，通过接种、自然免疫捐赠者或者自身免疫病病人外周血淋巴细胞分离的方法获得了一些非常有价值的抗体，在疾病的诊断、药理学分析和临床研究中都起着重要作用．
［参考文献］
［1］WEINER L M．Fully human therapeutic monoclonal anti-bodies［J］．J Immunother，2006，29（1）：1－9．
［2］BOULIANNE G L，Hozumi N，Shulman M J．Production of functional chimaeric mouse/human antibody［J］．Na-
ture，1984，312（5995）：643－646．
［3］NAKANO K，ISHIGURO T，KONISHI H，et al．Genera-tion of a humanized anti-glypican3antibody by CDR
grafting and stability optimization［J］．Anticancer Drugs，
2010，21（10）：907－916．
［4］MICHAEL A，ROGUSKA PEDERSEN J T，KEDDY C A，et al．Humanization of murine monoclonal antibodies
through variable［J］．Prec Nail Acad Sci USA，1994：969
－973．
［5］MICHAEL A，ROGUSKA J T P，ANDREW H HENRY，et al．A comparison of two murine monoclonal antibodies
humanized by CDR-grafting and variable domain resurfa-
cing［J］．Protein Eng，1996：895－904．
［6］TICCHIONI M，BERNARD A，LEFRANC M P．Inhibi-tion of T cell activation with a humanized anti-beta1inte-
grin chain mAb［J］．Molecular Immunology，1995，32
（2）：101－116．
925
第5期向军俭，等：抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术
［7］SEHLIN D，HEDLUND M，LORD A，et al．Heavy-chain complementarity-determining regions determine conforma-
tion selectivity of anti-abeta antibodies［J］．Neurodegener
Dis，2011，8（3）：117－123．
［8］COUTO J R，BLANK E W，PETERSON J A，et al．Anti-BA46monoclonal antibody Mc3：humanization using a
novel positional consensus and in vivo and in vitro charac-
terization［J］．Cancer Research，1995，55（8）：1717－
1722．
［9］ZHANG W，FENG J，LI Y，et al．Humanization of an anti-human TNF-alpha antibody by variable region resur-
facing with the aid of molecular modeling［J］．Molecular
Immunology，2005，42（12）：1445－1451．
［10］ROSOK M J，YELTON D E，HARRIS L J，et al．A com-binatorial library strategy for the rapid humanization of an-
ticarcinoma BR96Fab［J］．Journal of Biological Chemis-
try，1996，271（37）：22611－22618．
［11］BACA M，PRESTA L G，O'CONNOR S J，et al．Anti-body humanization using monovalent phage display［J］．
Journal of Biological Chemistry，1997，272（16）：10678
－10684．
［12］JESPERS LS，ROBERTS A，MAHLER S M，et al．Guid-ing the selection of human antibodies from phage display
repertoires to a single epitope of an antigen［J］．Biotech-
nology（N Y），1994，12（9）：899－903．
［13］王卓智，王琰，李竟，等．用抗原表位定向选择方法人源化抗TNF_抗体Fab段［J］．中华微生物学和
免疫学杂志，1998，18（6）：490－494．
［14］SMITH G P．Filamentous fusion phage：novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface
［J］．Science，1985，228（4705）：1315－1317．
［15］马巍娜，贾雷立，刘雪林，等．噬菌体抗体库技术在农兽药快速检测技术中的进展［J］．现代检验医学杂志，
2008，23（2）：83－84．
［16］乔媛媛，王琰．构建大容量噬菌体抗体库及获得人源抗体的策略［J］．中国生物制品学杂志，2007．20
（1）：65－68．
［17］SOLTES G，HUST M，NG K K，et al．On the influence of vector design on antibody phage display［J］．Journal of
Biotechnology，2007，127（4）：626－637．
［18］CHASTEEN L，AYRISS J，PAVLIK P，et al．Eliminating helper phage from phage display［J］．Nucleic Acids Res，
2006，34（21）：e145．
［19］MENG F M，ZHANG C H，AI Y C．Advances of devel-opment of phage display systems［J］．Hereditas（Bei-
jing），2011，33（10）：1113－1120．
［20］邓宁，向军俭，陈文吟，等．重组人源性抗HBsAgFab 抗体的特性分析［J］．暨南大学学报（自然科学版），
2004．25（5）：656－660．［21］MATTHEAKIS LC，B R，DOWER W J．An in vitro pol-ysome display system for identifying ligands from very
large peptide libraries［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，
1994．
［22］LEVIN A M，WEISS G A．Optimizing the affinity and specificity of proteins with molecular display［J］．Mol Bi-
osyst，2006，2（1）：49－57．
［23］郑磊，李前伟．核糖体展示技术的研究与应用现状［J］．现代生物医学进展，2009：3753－3756．
［24］HANES J，PLUCKTHUN A．In vitro selection and evolu-tion of functional proteins by using ribosome display［J］．
Proc Natl Acad Sci U S A，1997，94（10）：4937－4942．［25］郭长占．转基因小鼠研究进展［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2000，20（3）：278－282．
［26］BOSMA G C，CUSTER R P，BOSMA M J．A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse［J］．
Nature，1983，301（5900）：527－530．
［27］刘庆丰，崔莲仙，何维，等．免疫重建SCID小鼠B淋巴母细胞瘤模型的建立［J］．中国医学科学院学报，
2003，25（3）：294－296．
［28］王军．SCID小鼠在制备人单克隆抗体中的应用［J］．国外医学免疫学分册，1993（4）：200－204．［29］TILLER T．Single B cell antibody technologies［J］．N Biotechnol，2011，28（5）：453－457．
［30］江培洲，沈新明，黄华，等．显微操作仪快速分离癌细胞并提取微量RNA的方法［J］．第一军医大学学
报，2002，22（6）：551－553．
［31］朱锋，陈钰．多参数流式细胞术诊断弥漫大B淋巴瘤相关噬血细胞综合征5例并文献复习［J］．中国
医药导报，2011，8（7）：116－121．
［32］LOVE J C，RONAN J L，GROTENBREG G M，et al．A microengraving method for rapid selection of single cells
producing antigen-specific antibodies［J］．Nat Biotechn-
ol，2006，24（6）：703－707．
［33］OGUNNIYI A O，STORY C M，PAPA E，et al．Screen-ing individual hybridomas by microengraving to discover
monoclonal antibodies［J］．Nat Protoc，2009，4（5）：
767－782．
［34］JIN A，OZAWA T，TAJIRI K，et al．A rapid and effi-cient single-cell manipulation method for screening anti-
gen-specific antibody-secreting cells from human periph-
eral blood［J］．Nat Med，2009，15（9）：1088－1092．［35］徐萌，绳波，刘志英，等．巢式RT_PCR法检测HIV_ 1阳性者中庚型肝炎病毒感染的研究［J］．北京医学，
2011，33（6）：467－469．
［36］符勇耀，李正国，李泮志，等．优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变［J］．生物技术通报，2009
（7）：150－155．
［责任编辑:黄建军］
035暨南大学学报（自然科学版）第33卷
人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体通过基因克隆及DNA重组技术等进行改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，同时又降低了其异源性，有利应用于人体。然而，即使通过嵌合抗体技术把C区替换，人源化抗体V区的互补决定区（CDR）和框架区（FR）也仍有可能诱导相当强的抗体反应。因此，研究者开始着手将部分CDR和FR区也改造为人抗体序列，以便能进一步提高抗体的人源化程度，降低药物抗体反应发生的可能。经过数年的研究和改进，人们已经创建并完善了以重构抗体、表面重塑抗体、去免疫化抗体和链替换抗体等为代表的多种人源化抗体技术。 人源化抗体技术 重构抗体 重构抗体是由异源抗体中和抗原结合相关的残基与人抗体重新剪接构建的抗体，包括互补决定区移植、部分互补决定区移植和特定决定区转移。构建重构抗体的流程：①克隆分析亲本鼠单抗的V区基因，确定CDR和FR区；②通过数据库检索比对及辅助计算机分子模拟等，找出有最大同源性的人FR 区模板；③确定需要保留和改变的关键残基，经基因合成、真核表达、检测实际结合效果后，对需要保留和改变的关键残基进行相应的修正；④最终获得高亲和力的、具有与亲本鼠单抗相同抗原结合表位的人源化抗体。 表面重塑抗体 表面重塑抗体是通过对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造而获得的人源化抗体。表面重塑抗体的库构建流程：①首先在结构数据库中寻找鼠源的最大同源性蛋白，利用相应的软件并采用分子三维结构分析的方式确定表面残基的位置；②在公用数据库中寻找最大同源性的人抗体序列，在相应的表面残基位置上尝试替换为相应的人抗体残基（替换中要兼顾考虑被替换残基的侧链匹配情况和与CDR是否在空间上紧邻）；③确定替换后的残基种类，即可采用定点突变或基因合成等方法获得
第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。
第33卷第5期暨南大学学报（自然科学版） Vol．33No．52012年10月 Journal of Jinan University （Natural Science ） Oct．2012 ［收稿日期］2012－03－26 ［基金项目］国家自然科学基金项目（81202449）；广东省科技计划项目（201213010300016）［作者简介］向军俭（1952－），男，教授，研究方向：抗体技术与应用 抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术 向军俭，童吉宇，王 宏 （广东省分子免疫与抗体工程重点实验室；暨南大学抗体工程研究中心，广东广州510632） ［摘 要］100年来，抗体的发现为人类疾病诊断、治疗和有害物质的分析检测发挥了巨大的作用．特别是1975年 发明了单克隆抗体技术以及1986年发明基因工程抗体技术，为研制特异性高、大量均一并大量生产抗体成为了现实，也使嵌合抗体、全人源抗体造福人类并产生巨大的经济效益．为了克服鼠源性单抗可诱发人抗鼠抗体（HA-MA ），通过嵌合抗体、改构抗体、小分子抗体等技术和改良抗体与抗原结合的特异性，已成为抗体技术研究的主要发展方向，本文主要就抗体人源化及抗体分子小型化，抗体功能复合化两个部分的进展进行综述．［关键词］抗体； 人源化抗体； 基因工程抗体； 抗体库技术； 小分子抗体 ［中图分类号］R392．11 ［文献标志码］A ［文章编号］1000－9965（2012）05－0524－07 Recent advances in antibody technique （1）：Humanized antibody technique XIANG Jun-jian ，TONG Ji-yu ，WANG Hong （Guangdong province Key laboratory of Molecule Immunology and Antibody Engineering ，Jinan University ，Guangzhou 510632，China ） ［Abstract ］In the past 100years ，antibody has played a significant role in human disease diagnosis and treatment and the analysis of detrimental substances．Especially ，the inventions of both monoclonal antibody technique in 1975and genetic engineering technique in 1986，on one hand ，have made it possi-ble for producing abundant antibodies of high specificity and homogeneity ，on the other hand ，help chim-eric antibody and fully human antibody bring benefit to human beings．To overcome the problem that mu-rine monoclonal antibody may induce HAMA ，technologies such as chimeric antibody ，reshaping antibod-y ，small-molecule antibody and improvements of the specificity between antibody and antigen have be-come the main trend when developing antibody technique．This review gives an overview on antibody hu-manization ，small-molecule antibody and composite function of antibody．［Key words ］antibody ；humanization antibody ；genetic engineering antibody ； antibody library technique ；small-molecule antibody 19世纪末抗体首次被发现，其后很长一段时间内人们都以抗原免疫动物获得抗血清（多克隆抗 体）．1975年， K hler 和Milstein 建立了B 淋巴细胞杂交瘤技术，为大量生产均一、特异性强的单克隆抗体提供了技术支持并使免疫学发生一场革命，有力 地促进诊断与治疗性抗体的发展．然而由于单克隆 抗体大部分为鼠源性抗体，在临床治疗中可在人体 内可诱发人抗鼠抗体（HAMA ）［1］ ，限制了单克隆抗体在临床治疗中的应用．随着基因工程技术的发展和对各类抗体结构和氨基酸序列、及其变异种属和
抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～ 1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
人源化单克隆抗体的构建技术 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。 关键词：人源化，单克隆抗体，构建 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。 1 嵌合抗体的构建 抗体分子与抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆
基因工程抗体及其进展 【摘要】着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能,进而开发了新的抗体应用领域,使单克隆抗体技术又向前发展了一步。基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。 【关键字词】基因工程抗体人源化抗体小分子抗体广阔的前景 基因工程抗体以其独特的优点(免疫原性低、可按人的意愿加以改造等) 正逐渐取代动物源性单抗。随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用, 适应不同需要的基因工程抗体的种类日趋多样化, 构建日趋合理化, 在体内的生物学效应也日臻完善, 使之较天然单抗的治疗效果更好, 范围更广, 并在初步临床试用中展示了光辉的前景。分子生物学技术的发展，推动了免疫球蛋白遗传学的研究。抗体的研究从原来的血清学方法、氨基酸水平分析发展到大免疫球蛋白基因结构、表达及调控DNA水平的研究，揭示了抗体多样性、等位基因排斥现象、抗体的分泌型和膜结合型形式、H链类别转换以及亲和力成熟机制等多种生物学现象。自1975年Milstein和k?hler等人研制出单克隆抗体以来，抗体技术得到了广泛的应用和发展，但在生物研究和临床疾病的治疗中却遇到了一定的困难。异源性鼠抗体在人体内诱生免疫应答，产生抗小鼠抗体；人单克隆杂交瘤制备困难，生产量少，稳定性差；获得特异性类别抗体比较困难。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。 1、基因工程抗体概述及分类 基因工程抗体又称重组抗体, 是指利用重组DNA 及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配, 经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。目前报道的基因工程抗体很多, 分类方法不一, 大体可以分为三类。 1．1 完整的抗体分子该类抗体类似于天然抗体分子, 但经改造后更接近于人的免疫球蛋白, 可在一定程度上降低HAMA。 1．1．1. 嵌合抗体(ch imeric an t ibody) 由在基因水平上连接的小鼠抗体V 区及人抗 体C 区组成。这种抗体含75%～ 80% 人抗体, 20% 鼠抗体, 保留了原来鼠源单抗的特异性, 但对人体仍具一定的免疫原性。 1．1．2. 人源化抗体(human ized an t ibody)又称重构型抗体、改型抗体( reshaped an t ibody)或CDR 移植抗体(CDR graf t ing an t ibody) : 通过置换三个发夹状环的鼠抗体超变区(又称互补决定区, CDR) , 使构成抗原结合部位的轻重链各3 个CDR 区是鼠源的, 其余
一、研究现状 1．抗体研究发展历程 抗体作为药物用于人类疾病的治疗拥有很长历史。但整个抗体药物的发展却并非一帆风顺，而是在曲折中前进。第一代抗体药物源于动物多价抗血清，主要用于一些细菌感染性疾病的早期被动免疫治疗。虽然具有一定的疗效，但异源性蛋白引起的较强的人体免疫反应限制了这类药物的应用，因而逐渐被抗生素类药物所代替。第二代抗体药物是利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物。单克隆抗体由于具有良好的均一性和高度的特异性，因而在实验研究和疾病诊断中得到了广泛应用。 单抗最早被用于疾病治疗是在1982年，美国斯坦福医学中心Levy等人利用制备的抗独特型单抗治疗B细胞淋巴瘤，治疗后患者病情缓解，瘤体消失，这使人们对抗体药物产生了极大的期望。1986年，美国FDA批准了世界上第一个单抗治疗性药物——抗CD3单抗OKT3进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应。此时抗体药物的研制和应用达到了顶点。随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，鼠单抗用于人体的毒副作用也越来越明显。同时一些抗肿瘤单抗未显示出理想效果。人们的热情开始下降。到20世纪90年代初，抗内毒素单抗用于治疗脓毒败血症失败使得抗体药物的研究进入低谷。由于大多数单抗均为鼠源性，在人体内反复应用会引起人抗鼠抗体（HAMA）反应，从而降低疗效，甚至可引起过敏反应。因此，一方面在给药途径上改进，如使用片段抗体、交联同位素、局部用药等使鼠源性抗体用量减少，也增强了疗效；另一方面，积极发展基因工程抗体和人源抗体。 近年来，随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA 重组技术开始用于抗体的改造，人们可以根据需要对以往的鼠抗体进行相应的改造以消除抗体应用不利性状或增加新的生物学功能，还可用新的技术重新制备各种形式的重组抗体。抗体药物的研发进入了第三代，即基因工程抗体时代。与第二代单抗相比，基因工程抗体具有如下优点：①通过基因工程技术的改造，可以
人源化抗体 中文名称：人源化抗体 英文名称：humanized antibody 其他名称：互补决定区移植抗体 定义：将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植到人抗体可变区框架中而制成的抗体。此抗体可明显降低由鼠源单克隆抗体所致的人抗鼠抗体反应。 概述 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。 人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。 嵌合抗体 嵌合抗体是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。 改型抗体 改型抗体也称CDR植入抗体(CDRgraftingantibody)，抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。然而，抗原虽然主要和抗体的CDR接触，但FR区也常参作用，影响CDR的空间构型。因此换成人源FR区后，这种鼠源CDR和人源FR相嵌的V区，可能改变了单抗原有的CDR构型，结合抗原的能力会下降甚至明显下降。虽然目前已能对抗体进行分子设计，在人源FR区引入鼠源FR区的某些关键残基，如配置得当，其亲和力可与原有小鼠抗体的亲和力相当，但人化抗体常达不到原有鼠源单抗的亲和力。 表面重塑抗体 表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。 全人源化抗体 全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。
论人源化单克隆抗体的研究进展 *** （生物工程一班生命科学学院 ***大学哈尔滨 150080） 摘要：自从单克隆抗体问世至今已广泛应用与临床治疗，然而鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会产生人抗鼠抗体反应，从而使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。随着基因工程技术和抗体工程技术的迅速发展，人源性单克隆抗体开始快速发展而逐渐代替鼠源性单克隆抗体。本文将就人源化单克隆抗体的构建以及其在临床治疗方面的应用进行综述。 关键词：单克隆抗体人源化临床治疗 Theory humanized monoclonal antibody research progress *** (The 1st class of Bioengineering , College of Life Science, *** University, Harbin, 150080) Abstract: Since the advent of monoclonal antibody has been widely applied in clinical treatment, but the mouse source sex monoclonal antibodies in clinical treatment will produce people resistance to mouse antibody response, so that the rat source sex monoclonal antibody application are highly limited. Along with the genetic engineering technology and the rapid development of antibody engineering technology, humanized sex monoclonal antibody began to rapid development and gradually replaces the rat source sex monoclonal antibody. This paper will review humanized monoclonal antibody construction and the application of clinical treatment in this article. Keywords: monoclonal antibody humanized clinical treatment 1975年。Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术[1]，此后单抗药物开始迅速发展并广泛应用于临床。1982年，Philip Karr 将第一株抗独特型单抗(anti- ld) 应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功[2]，使得治疗性抗体的研究很快成为生物医药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。然而，鼠源性单克隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，能诱发人抗鼠抗体( Human ant-i mouse antibody, HAMA) 反应，引起强烈的免疫排斥反应[3]，而且鼠源性单克隆抗体不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用。这使研究学者意识到研制鼠源性单克隆抗体人源化或完全的人源性抗体才有可能减少或避免HAMA反应并提高疗效。然而反复实验证明, 杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。直到80年代末期，随着分子生物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一
第十四章特异性抗体的制备技术 Chapter 14 Preparation of Specific Antibody 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：特异性抗体的类型、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理；熟悉：常用颗粒性和蛋白质抗原制备的方法、多克隆抗体制备的的影响因素，常用佐剂种类；了解：抗血清的鉴定，基因工程抗体的类型。 二、教学内容 1．常见免疫原的种类和制备及佐剂。 2．免疫血清的制备，抗血清的鉴定与保存。 3．单克隆抗体制备技术。 4．基因工程抗体技术。 第二部分测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A型题） 1.配制绵羊红细胞免疫原一般细胞浓度为 A.102 /ml B.104 /ml C.105 /ml D.106 /ml E.108/ml 2．细菌鞭毛免疫原常规的制备方法 A．0.5%甲醛处理B．100℃加温2h处理C．1%氯化钙处理 D. 75%乙醇处理 E.2%氯肪处理 3. 细菌的菌体免疫原常规的制备方法 A. 75%乙醇处理 B. 100℃加温2h处理 C. 0.5%甲醛处理 D.1%氯化钙处理 E.2%氯肪处理 4.要从组织和细胞匀浆中粗提某种蛋白抗原，最常用又简便的分离方法 A. 盐析法 B. 凝胶过滤法 C. 离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E. 免疫电泳法 5.制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体 A. 免疫球蛋白 B. 人甲状腺球蛋白 C .人血清白蛋白 D. 牛血清白蛋白 E. 葡萄球菌A蛋白 6.蛋白质抗原首次免疫接种后，最好间隔多长时间再进行第二次免疫 A . 7~10天 B. 10~20天 C. 20~30天 D. 30~60天 E. 三个月 7.鉴定抗体的效价，最好采用下列哪一种方法 A.间接凝集试验 B.单向免疫扩散法 C.双向免疫扩散法 D.免疫亲和层析法 E.聚丙烯酰胺凝胶电泳法 8.纯化特异性抗体时，可采用下列哪种方法除去杂抗体 A.盐析法 B.凝胶过滤法 C. 离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 9.根据抗原分子所带电荷不同进行分离纯化的方法称为 A.盐析法 B.凝胶过滤法 C.离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 10。单克隆抗体目前效果较好的纯化方法 A。亲和层析法B。凝胶过滤法C。离子交换层析法D。超速离心法E。盐析法 11.完全佐剂的组成 A.液体石蜡+羊毛脂 B.羊毛脂+氢氧化铝 C. 液体石蜡+卡介苗+氢氧化铝 D.卡介苗+氢氧化铝+羊毛脂 E. 卡介苗+液体石蜡+羊毛脂 12.要使半抗原与载体结合具有免疫原性、半抗原分子的数目数至少要达到 A.10个以上 B.15个以上 C.20个以上 D.50个以上 E.100个以上 13．颗粒性抗原免疫接种方法一般采用 A．淋巴结注射B．静脉注射C．皮内注射D．皮下注射E．肌肉内注射14。免疫小鼠采血通常采用 A．心脏采血或断尾法 B．颈动脉放血或断尾法 C．颈静脉或摘除眼球采血 D．摘除眼球或断尾法 E．耳静脉采血或摘除眼球 15．较长时间(4~5年)保存抗体，通常采用 A．4℃保存 B．-10℃保存 C．-20℃保存 D．-30℃保存 E．真空干燥保存16．在HA T选择培养基中可长期存活者是 A．细胞多聚体B．融合的脾细胞与瘤细胞
抗体人源化技术进阶之路 在过去的十几年中，FDA已经批准了近100种抗体用于人类的疾病治疗。抗体药物经历了最初的多克隆抗体到单抗，并最终到基因工程的三个阶段。20世纪80年代初，随着鼠单抗在临床的大量应用，人们发现异源的鼠单抗所具有的免疫原性会引起强烈的抗抗体反应（HAMA），从而使患者发生严重的过敏反应和毒副作用，使其药物失去其应有的疗效。这使得之后的研究者致力于进行人源化改造，从而避免其在人体中免疫反应。经过多年的努力，目前人们已经可以使用嵌合抗体技术、人源化抗体技术、全人抗体技术来大大降低抗体药物的HAMA反应，以满足临床的要求（图1）。 虽然嵌合抗体成功地保留了亲本小鼠抗体的特异性，降低了其免疫原性，但是V区的FR区和CDR区仍有可能诱导强烈的HAMA反应。因此V区的人源化甚至全人源势在必行。在过去的几十年中，人源化方法已经多样化，目前人们已经创建了以重构抗体、表面重塑抗体、链替换抗体为代表的多种人源化抗体技术。 图1. 抗体人源化 重构抗体技术是英国剑桥大学Winter研究小组在1986年首先发明的，经过进一步完善，目前成熟的重构抗体技术路线是分析亲本鼠单抗的V区，确定CDR区和FR区，进而通过数据库检索比对和计算机同源建模，寻找出具有最大同源性的人的FR区模板，综合考虑确定FR区需要进行回复突变的关键残基，最终获得高亲和的人源化抗
体（图2）。目前在GeneBank 和IMGT等公用数据库中收录了大量的抗体的可变区基因共寻找最佳匹配的亲本鼠单抗的人FR序列。确定需要保留和改变的关键残基目前仍然是重构抗体人源化抗体最关键也是最困难的一步，它要求我们对于抗体抗原复合物的空间结构要具有足够的知识积累。当然目前人们已经总结出了一些需要保留的重要残基的规律，包括CDR两侧保守序列，有可能直接参与抗原结合位点以及对空间结构有重要影响的残基。目前已被批准的上市的人源抗体中，基本全采用的重构抗体技术。 图2. 重构抗体技术 CDR移植产生的人源化抗体对人类的免疫原性通常比小鼠或嵌合抗体低；但是，由于CDR不是人类的，它们仍然具有免疫原性。为了克服这一问题，一些研究人员提出用特异性决定残基(SDR)移植代替CDR移植来人源化抗体。人们发现在绝大多数抗体中通常只有约30%的CDR残基直接构成抗原抗体的结合位点。与CDR移植相比，仅移植数量更少且更关键的SDR将可能取得更佳的效果，比CDR移植相比具有更低的免疫原性。 CDR移植和SDR移植均是寻找最大同源性人抗体的V区序列作为改造的模板。与此不同，Hwang和他的同事设计了一种基于CDR区域同源性的抗体人源化的新方法。与通常的CDR移植方法不同，该方法不是寻找最大同源的人抗体作为模板，而是寻找与被改造的抗体的CDR结构同源的人胚系V区基因作为模板，然后简单、快速的将鼠单
人源化抗体的研究进展 摘要：单克隆抗体的问世使得人们对于一种新的治疗疾病的药物充满期待，然而鼠源性抗体往往会受到人体免疫系统的排斥，因而抗体的人源化已成为治疗性抗体的发展趋势。用人抗体取代鼠抗体，是克服鼠单抗临床应用障碍的关键。随着分子生物学研究的深入和一些技术的突破，抗体人源化技术日益成熟。大量人源化抗体已经被广泛应用于临床试验和应用。本文主要介绍了目前人源化抗体构建的三种方法：嵌合、重构和表面重塑，并对人源化抗体的未来发展趋势进行了展望。 关键字：基因工程抗体人源化 1 基因工程抗体简介 基因工程抗体(genetically engineered antibod2ies ，GEAb)是按人工设计所重新组装的新型抗体分子，它既保留或增加了天然抗体的特异性和生物学活性，又去除或减少了无关结构，降低或基本消除抗体的免疫原性，使抗体人源化，并改善抗体的药物动力学，具有生产简单，价格低廉，容易获得稀有抗体的优点，具有广阔的临床应用前景。其主要技术原理是：首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的宿主细胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分子，筛选出高表达细胞株，再用亲和层折等手段纯化抗体片段[1]。 1984年，Morrison等首次报道人鼠嵌合抗体在骨髓瘤成功表达，标志着基因工程抗体的诞生。1986年，Jones等人源化抗体构建和表达成功。1988年，Skerra 等第一次证明抗体的F ab和F v片段可以在大肠杆菌(E。coli)中正确地装配成保持原抗体特异性的小分子抗体。1989年，Huse等用外分泌型载体构建成功小鼠抗体库，利用抗体库技术获得了全人源化的抗体。1994年，德国基因工程抗体研究小组成功地将基因工程抗体在培养细胞中表达，抗体释放到组织培养液中，获得了较高的抗体产量[2]。 抗体药物的最大特征在于它识别抗原的高度专一性。本文主要介绍人源化抗体的发展历程与研究进展。近几年来随着鼠单抗人源化技术越来越成熟大量的人源性单抗被用于临床治疗肿瘤研究，并取得一定进展，由于其具有高效、低毒、病人不易产生抗药性等优点，同时又克服鼠单抗半衰期短、反复应用会引进病人的等缺点，人源性单抗已成为继手术切除、放疗及化疗后又一治疗肿瘤的药物[3]。 2 人源化抗体的发展 早在一个世纪前，Paul Ehrlich就把抗体形容为“魔弹”，1975年杂交瘤技术建立以后，大量制备含有相同抗原决定簇的单克隆抗体成为可能，从而使“魔弹”进入了临床试验阶段[4]。1982年，当Philip Karr将第一株抗独特型单抗(anti-1d)应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功之后[5]，治疗性抗体的研究很快成为
基因工程抗体类药物的发展 XXX （师范学院生科学院 08级2班） 摘要：基因工程抗体药物的发展经历了鼠源单克隆抗体(McAb) 、人2鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体等阶段。目前临床治疗中人抗鼠抗体反应的出现使鼠源性单克隆抗体的应用受到了极大的限制。为降低其免疫原性, 人们利用基因工程技术对鼠源抗体进行改造, 以减少其鼠源成分。简要概述了目前研究比较多的几种基因工程抗体及其临床应用。 关键词：基因工程抗体，嵌合抗体，抗体人源化。 Abstract: genetic engineering antibody drugs development has experienced rat source monoclonal antibodies (McAb), 2 chimeric antibody, RenYuan of rat antibody and all-round antibody stage. Currently clinical treatment middleman resistance rat antibody response appearance of rat source sex of monoclonal antibodies applications received great restrictions. To reduce its immunogenicity, people use genetic engineering technology to rat antibody modification, in order to reduce its rat source composition. Briefly summarizes the current research more several genetic engineering antibody and its clinical application. Keywords: genetic engineering antibody, chimeric antibody, antibody RenYuan glycosylated. 单克隆抗体技术自1975年问世至今，已被广泛地应用于疾病的诊断及治疗中，但是，目前应用的单克隆抗体绝大数是鼠源性的，临床重复给药时机体会产生免疫反应。应用于临床的理想抗体应该是人源性的，而人-人杂交瘤技术目前进展缓慢，即使研制成功，仍存在杂交瘤细胞体外传代不稳定，产量不高及抗体亲合力低等缺陷。迄今为止，解决这一问题最理想的途径就是研制基因工程抗体。基因工程抗体的研究兴起于20世纪80年代早期，这一技术是将对免疫球蛋白（immunogloblin，简称Ig）基因结构与功能的认识与DNA重组技术有机结合，在基因水平上对Ig分子进行重组后导入受体细胞表达出来的，继多克隆血清和单克隆抗体之后，基因工程抗体也被称为第三代抗体。 1．基因工程抗体概述： 基因工程抗体, 即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中, 在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是[1], 首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA, 逆转录成cDNA, 再经PCR 分别扩增出抗体的重链及轻链基因, 按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中, 并在适当的细胞( 如大肠杆菌、CHO 细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等) 中表达并折叠成有功能的抗体分子, 筛选出高表达的细胞株, 再用亲和层析等手段纯化抗体片段。基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分, 保留原有抗体的亲和力和特异性。借助于基因工程技术, 既可以对完整抗体, 又可以对抗体片段进行改造。 抗体是“Y”字型的四肽链结构[2], 由2 条相同的重链(H 链)和2 条相同的轻链( L 链) 借助二硫键连接而成。分析不同的免疫球蛋白的重链和轻链氨基酸序列时发现, 在多肽链N 端, 占轻链的约1 /2( 含107～130 个氨基酸残基) 或重链的约1 /4( 含107～130 个氨基酸
人源化抗体发展及应用概略 【摘要】伴随着一系列重大生物技术（如PCR技术、抗体库技术、转基因动物技术等）的发展，抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。人源化抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植等方面已经显示出独特的优势和良好的应用前景。本文介绍了人源化抗体的构建及其表达系统，并对其临床应用进行了展望。 【关键词】嵌合抗体；人源化抗体；噬菌体展示技术；转基因技术 【Abstract】With the development of a series of substantial biotechnologies, such as PCR, phage display and transgenic animal, antibody techniques have developed from chimeric antibody and reshaped antibody to humanized antibody. As therapeutic antibodies, the humanized antibodies have been showed specific advantage and application prospect for cancer therapy,autoimmudisease,transplant rejection.The humanized antibody construction and expressing system, also foresaw tendency of humanized antibodies in clinical application have summarized in this paper. 【key word】chimeric antibodies; humanized antibodies; phage display; trangenic technology 引文： 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody,HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点。 正文： 1.人源化抗体的建构策略 鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导HAMA反应。对鼠源抗体进行人源化改造时要遵守两个原则，首先要保持抗体的亲和力和特异性，其次要降低或消除抗体的免疫原性。 1.1 嵌合抗体(Chimeric antibody) 20世纪80年代中期开始研制的第一代人源化抗体，即简单的嵌合抗体，是用人源基因代替鼠源单抗的恒定区。这样构建的嵌合抗体不仅保留了抗原抗体结合的特异性，又大大降低了鼠源单抗的免疫原性。美罗华(Rituximab)作为第一个用于肿瘤治疗的基因工程抗体，就是由鼠可变区和人恒定区组成的嵌合抗体。但由于嵌合抗体可变区(V)约占整个抗体的30％，鼠源性抗体V区中的框架区(FR)仍残留一定的免疫原性，可诱发HAMA反应。灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于短尾猿猴抗体的可变区几乎与人可变区无差异，这类嵌合抗体不需要作任何改变，而不致发生抗体反应。 Fab和F(ab’)，嵌合抗体的制备原理是将功能性抗体轻、重链可变区基因分别与人抗体的K链和重链CHl恒定区基因进行重组，克隆到表达载体中，构建成鼠一人嵌合的Fab基因表达载体，再转入宿主细胞表达。天然抗体分子重链CHl和CH2之间的一段铰链区结构，其中的2个Cys残基可以生成二硫键，将2条重链紧密地共价结合在一起。在Fab的C-端额外连接一
鼠源抗体的人源化设计 前言 (1) 方法 (2) 结果与讨论 (3) 鼠源抗体筛选人源框架 (3) 人源化抗体CDR的改造 (4) 结论 (6) 附录 (6) 参考文献 (7) 前言 第一个人用抗体药物来自鼠源抗体，直到现在鼠源抗体仍然是抗体药物的一大来源[Pogson et al.,2016]。由于鼠源抗体的免疫原性，一般会对其作人源化处理。目前最通用的方法是将鼠抗的CDR序列移植到人源框架上[Hwang et al., 2005]。通常CDR移植后的人源化抗体与抗原的亲和力会减弱，如何保持人源化抗体的亲和力是目前最大的技术瓶颈。通过高通量的筛选方法可以得到适合CDR
移植的人源框架，但是这种实验方法周期长，价格昂贵[Townsend et al.,2015]。为了快速筛选出适合的人源框架，研究者利用序列比对和结构模拟的方法筛选出适合的人源框架，然后通过实验验证抗体与抗原的亲和力，减少了实验工作量，节约了成本和时间，未来会成为具有潜力的抗体人源化设计方法[Kurella et al., 2014;Choi et al.,2015;Choi et al.,2016]。本文采用自主开发的抗体人源化设计程序，对已知的鼠源抗体进行人源化设计，结果表明计算的方法可以筛选出序列同源性靠后但是亲和力更高的人源化框架。 方法 抗体阻断蛋白-蛋白相互作用的受体和配体结构已知（图1）。配体与抗体结合的区域重叠在受体和配体结合的区域（图2），所以鼠源的抗体可以有效阻断受体和配体的相互作用[Apgar et al.,2016]。通过鼠源抗体的人源化设计可以最大限度减少抗体的免疫原性。首先使用鼠源抗体（PDBID为5F3B）的序列在人源框架库中搜索排名靠前的序列作为候选序列，然后将人源序列同源建模到鼠源抗体的骨架上，保留鼠源CDR的序列，然后计算同源模型的能量，判断人源化抗体的稳定性。人源化CDR突变体采用相同的策略，不同之处在于替换鼠源CDR 序列为突变体序列，并且保留抗原的结构。