免疫组化
定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理一一抗原抗体反应，即抗原与抗体特
异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(im muno cytochemistry)。
临床常用免疫组化指标的意义临床病理工作中，我们常用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”，但是许多单位只写阳性结果，不写临床意义，其结果对临床帮助不大，因为许多医生不懂得这些结果的意义，因此建议大家在出此类报告时，把“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”的意义打印在报告中，以增加病理报告的使用价值。
1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记，全套4项：P-gP, GST n TOPO U, Ki-67。
2、乳癌免疫组化耐药预后标记，全套7项：P-gp, GSTt，TOPO U, Ki-67，ER PR, C-erbB-2
3、意义：标记物--作用--阳性部位--临床意义
多药耐药基因蛋白(P-Gp --药泵作用--胞膜/胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。
谷光甘肽S转移酶(GST n)--解毒作用--胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。
拓扑异构酶U( TOPO U)--靶点作用--胞核--阳性率越高，对下列药物越有效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其有效。
雌激素受体(ER --性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效, 预后越好。
孕激素受体(PR)-性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。
C-erbB-2-癌基因产物--胞浆--阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。ER PR阳性而
C-erbB-2也阳性者，用三苯氧胺治疗效果不好。
Ki-67--细胞增殖标志--胞核--阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度越高。
Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，GO期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA增埴细胞核抗
原）。
CEA多数腺癌表达CEA
Rb （reti no blastoma视网膜母细胞瘤）基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。
P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短
Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。目前已被广泛应用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、喉癌等多种恶性肿瘤的检测。几乎所有的研究都表明，nm23蛋白高表达患者淋巴结转移率相对较低，存活期相对较长。
E-Ca E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。
PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。
CK18低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常
阴性，主要用于腺癌诊断。
CK19,分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应
Hep par 1,肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。
CK20用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。
CK7卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。
Villin绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。
Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。
乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极不可能为乳腺来源。其他villin免疫组化染色通常为阴性表达的肿瘤还有：如卵巢浆液性
癌、尿道移行细胞癌和前列腺癌。间皮瘤也经常为villin阴性表达，因此在一些情况下Villin还可以作为鉴别间皮瘤和腺癌使用抗体的一种。
但是也有一些非胃肠道来源的肿瘤可表达villin，如子宫内膜样腺癌、卵巢粘液性癌、肾细胞癌和小部分肺癌。也有一些专家报道Villin在部分宫颈内膜腺癌病例中表达。
肝癌的诊断
Villin免疫组化染色可以显示出毛细胆管结构，因此它也可能在表达部分肝癌的管状结构上很有用。多克隆CEA是用于此目的的第一种试剂，而且CD10 (CALLA) 在表达肝癌的该结构上也非常有用。多克隆CEA villin和CD10 (CALLA在肝癌病例上的表达，相互之间并没有任何的冲突，因此如果怀疑肝癌的可能性，建议将这三种抗体共同使用以协助疑难病例的诊断。
Villin在神经内分泌肿瘤上的应用
Villin在神经内分泌肿瘤的研究上也很有帮助。众所周知，类癌和胰腺的胰岛细胞肿瘤具有相相似的形态学特征，仅在形态学上区分这两种肿瘤几乎是不可能的。Villin 在这种情况下特别有用，因为据文献报道在85%的胃肠道类癌病例中
有villin的表达，但在胰岛细胞肿瘤上未见阳性表达报道。Villin在类癌上的表达通常为胞膜阳性。另外，有一些证据表明villin在胃和下消化道的小细胞癌上的
表达率比在其他部位的小细胞癌上要高。如：肺、食道、膀胱或前列腺等。据文献报道，大约有40%的肺类癌病例villin阳性，在其他一些神经内分泌肿瘤上，如甲状腺髓样癌和少数的美克尔细胞瘤上也有villin的表达。
MRP1多药耐药相关蛋白1,影响化疗敏感性，和预后相关。
MDR多药耐药基因
TS胸苷合成酶，是5-FU重要作用靶点，如果其高表达，阳性反映++以上，提示肿瘤细胞对5FU耐药。
Syn突触素神经组织标志
S-100神经组织标志，存在于神经组织，垂体、颈动脉体，肾上腺髓质、唾液腺、少数间叶组织，常用于神经鞘瘤、恶黑、脂肪肉瘤、软骨肿瘤诊断。
NSE主要用于神经内分泌肿瘤诊断
Chr嗜铬素，肾上腺髓质含量很高，鉴别肾上腺髓质和皮质，用于神经内分泌肿瘤诊断。
CKH高分子角蛋白，主要标记鳞状细胞肿瘤
CKL低分之角蛋白，主要标记单层上皮、腺上皮
EMA上皮膜抗原，糖蛋白，广泛分布各种上皮及其肿瘤
Vim波形蛋白，间叶组织标志
P504甲酰基辅酶A消旋酶检测诊断前列腺癌的敏感性为97%,特异性为100%。AMACR的优点在于它是癌症特异性，只存在于癌症组织。Rubin称，AMACR亦
可用作其他癌症的诊断标志物。对各种癌症细胞进行检查后发现，结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤都过度表达AMACR以结肠
直肠癌和前列腺癌表达最高。
CD117胃肠间质瘤
CD10作为共同急性淋巴母细胞型白血病抗原，主要表达于未成熟淋巴细胞，在Burkitt 淋巴癌，慢性髓性白血病等造血系统疾病的诊断中具有应用价值。近几年
来发现该抗原在造血系统外的某些肿瘤中有表达，如子宫内膜间质肉瘤、恶性黑色素瘤等。抗体在对肾细胞癌进行诊断和鉴别时有一定的参考价值。
CD15是一种细胞粘附分子，因其对霍奇金淋巴瘤(HD)中的R-S细胞具有良好
的标记作用，被认为是HD的重要标志物。除HD的鉴别诊断外，对胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、乳腺癌等肿瘤CD15的表达研究发现，CD15表达随癌细胞分化程度下降、淋巴结转移和临床分期增高而明显增高。认为CD15的表达是判断
肿瘤的发展、预测淋巴结转移和预后的良好指标。免疫电镜观察显示，CD15抗
原主要分布于大肠癌细胞浆的界膜、内质网、高尔基体及近细胞核膜处，CD15 可能是通过对所结合的铺基构型改变影响和参与肿瘤的形成和转移过程。
SMA平滑肌肌动蛋白，标记平滑肌
CD56为神经细胞黏附分子，主要分布于大多数神经外胚层来源细胞，常用于星型细胞瘤、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤诊断，也是NK细胞瘤的重要标志，
也标记小细胞肺癌
Des结蛋白，广泛分布于平滑肌、心肌、骨骼肌细胞和肌上皮细胞，高分化高表达、低分化低表达。
MSA肌特异性肌动蛋白，广泛分布于几乎所有肌型细胞中
CD68存在于骨髓和各神经组织的巨噬细胞用于粒细胞白血病、各种单核细胞
来源肿瘤、包括恶性纤维组织细胞瘤诊断(首选)。
CD34表达于早期淋巴造血干细胞、祖细胞、内皮细胞、胚胎纤维母细胞和某些神经组织细胞，多用于标记血管内皮细胞，血管源性肿瘤的诊断，GIST 80-90%.CD31也标记血管内皮。
CD44是一种分布广泛的跨膜糖蛋白分子，分CD44S和CD44v两大类。CD44s主要作为透明质酸受体，结合透明质酸后影响肿瘤的生长和转移。而CD44v则主
要表达于转
移的肿瘤细胞。李道明等用免疫组化LSAB法检测了42例食管鳞癌CD44v4/5 的表达，结果发现，淋巴结转移组的阳性表达率为76. 19% (16/21)，而非转
移组的阳性率为42. 86%(9/12)，两组间有显著性差异。癌巢周边的癌细胞、肌间浸润的癌细胞、有核分裂的癌细胞和癌栓中的癌细胞及浸润脉管壁的癌细
胞均呈强阳性表达。张成武等检测了20例正常胃粘膜上皮、43例异型增生和85 例胃癌组织CD44v6的表达，结果正常胃粘膜无表达，而异型增生和胃癌组织阳性率分别为30. 2%和74. 1%，其表达强度与胃癌浸润深度、淋巴结转移、肿瘤生长方式、静脉和淋巴管侵袭及远处转移密切相关。以上结果均表明，
CD44v的高表达构成了肿瘤细胞的侵袭性与易转移性。
NESTIN G经干细胞中极为丰富Ost成骨素，为骨化细胞分泌。
AAT抗胰蛋白酶纤维组织细胞来源肿瘤ACT抗糜蛋白酶
GFAP胶质纤维酸性蛋白神经组织标志，多用于星形胶质瘤诊断
Tg甲状腺球蛋白，甲状腺癌TG阳性。
CT降钙素甲状腺髓样癌阳性。
PH甲状旁腺素甲状旁腺肿瘤阳性
N-myc表达增强的小细胞肺癌和神经母细胞瘤对化疗缺乏反应并进展快速；
bcl-2:耐药机理为抗凋亡作用，高表达者对多数抗癌药物/放射治疗耐受。
肿瘤相关抗原72 （TGA72）多种恶性上皮性肿瘤表达TGA72尤其是乳腺癌、卵巢癌和结肠癌。正常上皮细胞、肉瘤、淋巴造血系统肿瘤通常TGA72阴性。TGA72 抗体用于乳腺癌的研究较多，其高表达通常与肿瘤体积大、淋巴结转移瘤细胞分化差及高增殖活
性有关。
肿瘤相关抗原（GA733）编码上皮糖蛋白40,是一种上皮细胞黏附分子（EP-CAM）对上皮细胞的生长与分化起着重要作用。多种肿瘤可有GA733表达，尤其是乳
腺癌、结肠癌及肺癌等。Kubuschok等采用GA733对非小细胞肺癌手术切除淋巴结中隐匿性微转移灶进行检测，发现隐匿灶的检出是判断总生存率的独立预后因子。结肠癌GA733表达形式与肿瘤预后有关，细胞膜及细胞浆的表达预后较基膜侧的表达为差。TTF-1甲状腺转录因子-1, TTF-1表达于甲状腺腺上皮和肺的上皮细胞中。在肺肿
瘤研究中发现，大多数肺的小细胞癌、原发性和转移性肺腺癌、少部分大细胞未分化肺癌、大多数非典型神经内分泌肿瘤免疫组化结果显示TTF-1阳性，而肺鳞
癌及绝大多数典型类癌TTF-1阴性。在甲状腺乳头状腺癌中TTF-1亦阳性，而TTF 在其它组织表达阴性。据此认为TTF-1可用来鉴别肺腺癌与鳞癌，并有助于与肺转移性腺癌的鉴别。
TTF-1在甲状腺及其肿瘤中的表达
TTF-1主要表达在甲状腺滤泡细胞中和甲状旁腺的主细胞中，
TTF-1为甲状腺分化和甲状腺球蛋白分泌调节的基础物质，可促进甲状腺过氧化物酶、碘/钠的转运，？TTF-1与血清TSH的活性有关，活性的TSH-R可增强TTF-1 的表达。
TTF-1在良恶性甲状腺组织中表达不同，正常甲状腺和良性腺瘤表达多，甲状腺乳头状癌与滤泡癌中表达少，未分化癌中不表达，TTF-1在恶性甲状腺病变中的
表达强度随年龄增加而增强，而且病变存瘤期长，复发机率高。
TTF-1在肺癌中的表达
75%的肺非小细胞癌（NSCLCS）性表达，腺癌（ACs明显高于鳞癌（SCC） 90%以上的原发性小细胞肺癌（SCLC表达阳性，TTF-1在非小细胞肺癌（NSCLC阳性表达强度与病人的预后成呈负相关，可作为一项独立的预后指标，
肺的典型性类癌（TCS均为阴性，表明小细胞肺癌和非小细胞肺癌可能有一个不同于TCS的共同起源的理论。
临床常见的免疫组化指标在乳腺癌诊治中的应用
近年来，由于免疫组化实验方法在各医院病理科的迅速普及，许多患者的术后标本可以进行免疫组化检查。这对于患者的诊断、分型以及术后的综合治疗有着重要的意义。本文就临床上常见的一些指标及其意义进行综诉。
一、激素受体（ER和孕激素受体（PR
人类最先发现乳腺癌细胞和激素的关系始于1896年。Bentson观察到乳腺癌患者
切除卵巢后可使乳腺癌细胞的生长受到抑制。1967年Jen sen发现人类乳腺癌中
含有ER从此开始了真正意义上的乳腺癌内分泌治疗的研究。女性正常乳腺的细胞上存在ER和PR雌激素和孕激素通过ER和PR对细胞功能进行调节。当细胞恶变时，肿瘤细胞可以部分地或全部保留正常的受体系统，其功能与正常细
胞相似。这种肿瘤细胞的生长仍然依赖原来的激素环境调节，称为激素依赖性肿瘤，临床上称为ER阳性乳腺癌。有些细胞在癌变过程中，其受体系统保留很少或完全丧失，不能再作为激素的靶细胞，其生长不再受激素的控制与调节，临床上表现为ER阴性乳腺癌。Jensen发现ER后，很快又发现PR,并证明PR的合成与雌激素和ER复合物在核内发生的变化过程有关，PR的形成直接受ER的控制和调节，故PR阳性的乳腺癌，ER大多为阳性。
常用免疫组化标记物公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
常用免疫组化指标的意义 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 多数腺癌表达CEA Rb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。 E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应 Hep par 1,肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1．石蜡切片脱蜡至水： （石蜡切片染色前应置60℃1小时）。 ①二甲苯I、II，各30分钟。 ②梯度酒精：100%I、II，各10分钟;95%，5分钟;80%，5分钟;70%5分钟。 ③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。 2抗原修复： 根据待检测的抗原，选择适当的方法。 附： 抗原修复液（10mMpH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制： ①储备液的配制： A液： 枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+蒸馏水1000ml；B液： 枸橼酸21g +蒸馏水1000ml；②工作液的配制： A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml 抗原修复的方法： 高压锅处理技术： 枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH
6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。晾至室温抗原修复的注意事项： ①组织不能干。②选择抗原修复方法要因抗体而异。③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。 3．PBS：5分钟，2次（置于摇床） 4．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温20分钟（避光）。 5．PBS水洗：5分钟，2次。 6．正常血清封闭： 从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片 正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。 附： 正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)： 按1:10比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。 7．滴加第一抗体： 用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体50μ，（也可置于4℃冰箱过夜）。 第二天片子晾至室温 8．PBS：5分钟，2次。 9.滴加聚合物增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟， 0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
临床免疫组化意义 1恶性肿瘤免疫组化耐药预后标志全套4项：P-gP, GSTt, TOPOI, Ki-67。 2、乳腺癌免疫组化耐药预后标志全套7项：P-gp, GSTr, TOPO, Ki-67 , ER PR C-erbB- 2。 3、意义：标志物作用阳性部位临床意义 (1) 、多药耐药基因蛋白(P-Gp)药泵作用胞膜/胞浆，阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。 (2) 、谷光甘肽S转移酶(GSTr)解毒作用胞浆，阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。 ⑶、拓扑异构酶n(TOPO )靶点作用胞核，阳性率越高，对下列药物越无效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26阳性率高者对VP16尤其无效。 ⑷、雌激素受体(ER性激素作用胞核，阳性率越高，肿瘤对内分泌医治越无效，预后越好。 (5) 、孕激素受体(PR) 性激素作用胞核,阳性率越高,肿瘤对内分泌医治越无效,预后越好。 ⑹、C-erbB-2癌基因产物，胞浆阳性率越高，肿瘤恶性水平越高。ER PR阳性而C-erbB-2 也阳性者,用三苯氧胺医治效果不好。 (7) 、Ki-67 细胞增殖标志, 胞核阳性率越高肿瘤增殖越快,恶性水平越高。 Ki-67为细胞增值的一种标志，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多 肿瘤分化水平、浸润、转移、预后亲密相关。PCNA增埴细胞核抗原)。 (8) 、CEA 少数腺癌表达CEA (9) 、Rb (retinoblastoma 视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因,调理细胞周期。 (10) 、P53在免疫组化中均为渐变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 (11) 、Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。目前已被普遍使用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、喉癌等多种恶性肿瘤的检测。简直一切的研讨都标明，nm23蛋白高表达患者淋巴结转移率绝对较低，存活期绝对较长。 (12) 、E-Ca, E钙粘附蛋白，介导细胞间粘轮作用的跨膜糖蛋白，其功用丧失惹起细胞之间衔接的毁坏,次要用于肿瘤侵袭和转移方面的研讨。 (13) 、PS2(雌激素调理蛋白)，其表达和ER表达有关，可作为内分泌医治和预后判别的目标 之一。 (14) 、CK18 低分子量角蛋白,主要标志各种单层上皮包括腺上皮,而复层鳞状上皮常阴性, 主要用于腺癌诊断。 (15) 、CK19 散布于单层上皮和间皮,常用于腺癌诊断,肝细胞不表达,而胆管为阳性反应。 (16) 、Hep par 1, 肝细胞抗原,正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性,低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 (17) 、CK20用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、 肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 (18) 、CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 (19) 、Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin 通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上 皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾本质的上皮细胞中(特别是近曲小管)。Villin 在胃肠 道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有分明腺样构造的肿瘤上没有 villin 表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的能够性极低。乳腺癌也常常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别扫除的一种疾病。由于在转移癌组织上察看到分明的villin 免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极不能够为乳腺来源。其他villin 免疫组化染色通 常为阴性表达的肿瘤还有：如卵巢浆液性癌、尿道移行细胞癌和前列腺癌。间皮瘤也常常为villin 阴性表达，因而在一些状况下Villin 还可以作为鉴别间皮瘤和腺癌运用抗体的一种。 但是也有一些非胃肠道来源的肿瘤可表达villin ，如子宫内膜样腺癌、卵巢粘液性癌、肾细胞癌和小局部肺癌。也有一些专家报道Villin 在局部宫颈内膜腺癌病例中表达。 肝癌的诊断
免疫组化 定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理—-抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 临床常用免疫组化指标的意义 临床病理工作中,我们常用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”,但是许多单位只写阳性结果，不写临床意义，其结果对临床帮助不大，因为许多医生不懂得这些结果的意义，因此建议大家在出此类报告时，把“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记"的意义打印在报告中，以增加病理报告的使用价值。 1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记,全套4项:P—gP，GSTπ，TOPOⅡ，Ki—67。 2、乳癌免疫组化耐药预后标记，全套7项：P—gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki—67，ER，PR，C-erbB—2。 3、意义：标记物—-作用-—阳性部位——临床意义 多药耐药基因蛋白(P-Gp）-—药泵作用—-胞膜/胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。 谷光甘肽S转移酶（GST π)--解毒作用-—胞浆—-阳性率越高,对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。 拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ）—-靶点作用—-胞核-—阳性率越高，对下列药物越有效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其有效. 雌激素受体(ER)—-性激素作用——胞核-—阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好. 孕激素受体（PR) -—性激素作用—-胞核-—阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。 C—erbB-2——癌基因产物-—胞浆—-阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。ER、PR 阳性而C-erbB—2也阳性者,用三苯氧胺治疗效果不好。 Ki-67-—细胞增殖标志—-胞核——阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度越高. Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达,G0期缺如，
免疫组化常用标记物 免疫组化常用标记物 一、常用标志物 1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。 2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～1 20 kDa，分布广泛。含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。 4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。 5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。因此，可用于鳞癌和腺癌、间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。支气管上皮基底细胞、间皮；鳞癌、大细胞癌、移行细胞癌、间皮瘤阳性。大多数腺癌为阴性。 6. 细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）---（阳性部位：细胞浆）。CK7是分子量为54 kDa的一种碱性细胞角蛋白，存在于大多数正常组织的腺上皮和移行上皮细胞中，一般非上皮来源的细胞无表达。在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈阳性反应，而胃肠道的腺癌阴性。 7. 细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）---（阳性部位：细胞浆）。CK20（46kDa）存在于正常的胃肠道上皮、移行上皮、Merkel细胞及其来源的肿瘤，而乳腺癌、肺癌和神经内分泌肿瘤不表达。CK7positive CK7 negative CK20 positive uninformative colorectum CK20 negative lunguninformative 8. 细胞角蛋白（高分子量）（cytokeratin，HMW）---（阳性部位：细胞浆）。高分子量细胞角蛋白抗体（34βE12）可以识别68kDa、58kDa、56.5kDa和50kD a的细胞角蛋白。 9.上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）(MUC1)---（阳性部位：细胞浆）。上皮膜抗原是一种高分子量（400 kDa）跨膜糖蛋白，广泛分布于各
免疫组化染色操作步骤 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和 2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
常用免疫组化指标的意义 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 多数腺癌表达CEA P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。 E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应 CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极不可能为乳腺来源。其他villin 免疫组化染色通常为阴性表达的肿瘤还有：如卵巢浆液性癌、尿道移行细胞癌和前列腺癌。间皮瘤也经常为villin阴性表达，因此在一些情况下Villin还可以作为鉴别间皮瘤和腺癌使用抗体的一种。
免疫组化 定义: 免疫组化,就是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 临床常用免疫组化指标的意义 临床病理工作中,我们常用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”,但就是许多单位只写阳性结果,不写临床意义,其结果对临床帮助不大,因为许多医生不懂得这些结果的意义,因此建议大家在出此类报告时,把“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”的意义打印在报告中,以增加病理报告的使用价值。 1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记,全套4项:P-gP,GSTπ,TOPOⅡ,Ki-67。 2、乳癌免疫组化耐药预后标记,全套7项:P-gp,GSTπ,TOPO Ⅱ,Ki-67,ER,PR,C-erbB-2。 3、意义:标记物--作用--阳性部位--临床意义 多药耐药基因蛋白(P-Gp)--药泵作用--胞膜/胞浆--阳性率越高,对下列药物耐药性越强:阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。 谷光甘肽S转移酶(GST π)--解毒作用--胞浆--阳性率越高,对下列药物耐药性越强:阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。 拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)--靶点作用--胞核--阳性率越高,对下列药物越有效:蒽环类抗生素与鬼臼毒素类,如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其有效。 雌激素受体(ER)--性激素作用--胞核--阳性率越高,肿瘤对内分泌治疗越有效,预后越好。 孕激素受体(PR) --性激素作用--胞核--阳性率越高,肿瘤对内分泌治疗越有效,预后越好。 C-erbB-2--癌基因产物--胞浆--阳性率越高,肿瘤恶性程度越高。ER、PR阳性而C-erbB-2也阳性者,用三苯氧胺治疗效果不好。 Ki-67--细胞增殖标志--胞核--阳性率越高,肿瘤增殖越快,恶性程度越高。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总 结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等
病理科免疫组化在临床上的应用及其意义 免疫组化技术是以免疫学的抗原抗体反应为其理论基础发展起来的一门方法学，在生物学领域尤其是在医学的基础和临床研究中发挥重要的作用，对疾病尤其是肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强有力的手段。免疫组化技术是20世纪70年代初Sterb Berger在酶标法的基础上发明的，80年代在外国开始应用于临床研究和诊断，90年代初在我国逐渐开始应用于疑难病例的诊断和鉴别诊断。随着新技术的不断发展，抗体种类从研发开始的十几种发展到目前数百种抗体应用于临床科研的各个领域，我国在临床病理诊断上可用抗体293种。由于抗体较昂贵，所以各院根据活检量和病种不同选择不同的抗体，这些抗体对大部分疑难病例的诊断起到重要的辅助作用。对病人的预后及指导治疗具有重要的意义。 一、目前常用的抗体分四大类 1．上皮性标记物：CK high（AE3），CK low ，CK-pan，CK19，CK7，CK20，EMA，CEA，-CA15-3，SCLC , E－Caldeherin, CA125, Tg(甲状腺球蛋白) ,TTF-1 AFP。这些抗体阳性，表明肿瘤组织起源于上皮组织，如果是恶性肿瘤，就是癌 2．间叶组织标记物：SMA ，Desmin，Vimentin，Lysozyme，AACT , CD68 MyoD1，CD117，这些抗体阳性，表明肿瘤组织起源于间叶组织，如果是恶性肿瘤，就是肉瘤。 3．神经及神经内分泌标记物：CgA ，Synaptophysin，NSE，S-100：NF （神经纤维丝蛋白），GFAP，CD99，CD56。 4淋巴细胞标志物： T cell标记物：CD3, CD45RO , CD43, CD5, CD8,CD4,ALK,GranmB , CD56 。 B cell标记物：CD-20 ，CD79a ，CD23，CD10 ，Kappa ，Lambda CD21 CD38 ，CyclinD1 ，Bcl-2。 其它：LCA，CD15，CD30，MPO ，CD34，TdT，这些抗体用于淋巴瘤33个亚型的诊断和鉴别诊断。 二、目前开展的系列检查和意义 1.乳腺癌五项（ER、PR、C-erbB-2(Her-2)、Ki-67、P53） ER、PR阳性，90％的病人对三苯氧胺类药物疗效好。C-erbB-2阳性（2+－3+）可服用抗Her-2基因药物。如果ER和PR均阴性，C－erbB－2强阳性预示预后不好。 Ki-67是细胞生长指数，代表细胞周期中除G0期以外的细胞生长速度。Ki-67值越高表明肿瘤细胞生长越快，预后越不好。P53是广谱致癌基因，在许多肿瘤中都有表达，表达值越高预后越不好。据报道，国际上目前有抗P53基因阳性的药物用于治疗肿瘤。 2.垂体腺瘤功能六项检查 LH（促黄体生成素），FSH（卵泡刺激素），ACTH（促肾上腺皮质激素），TSH（促甲状腺素），PRL（泌乳素）GH（生长激素）。根据某一种抗体阳性表达进行术后药物治疗。 3.恶性肿瘤的Ki-67和P53常规检查 目前的研究表明，大部肿瘤的复发、转移取决于Ki-67值和P53值，而与肿瘤的组织的分型关系不是十分密切，如中分化腺癌，如果Ki-67和P53值超过50％，预后不佳，相反，如肿瘤的组织分型为低分化腺癌，而Ki-67和P53值较低，预后也会较中分化或高分化癌的预后稍好。 4.GIST（胃肠道间质瘤）和EGIST（胃肠道外间质瘤）的诊断 GIST是90年代新发现的肿瘤，过去均诊断为平滑肌瘤或平滑肌肉瘤，现在经过一组免疫组化可将其诊断，GIST的生物学形为一般无良性，因为小于2cm的GIST偶而也有转移。其良恶性程度取决于肿瘤的大小和核分裂像，国际确定GIST侵袭行为危险性的推荐方案如下： 危险程度大小核分裂数
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
免疫组化常用标记物 一、常用标志物 1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。 2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～120 kDa，分布广泛。含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。 4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱 CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。 5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。因此，可用于鳞癌和腺癌、间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。支气管上皮基底细胞、间皮；鳞癌、大细胞癌、移行细胞癌、间皮瘤阳性。大多数腺癌为阴性。 6. 细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）---（阳性部位：细胞浆）。CK7是分子量为54 kDa的一种碱性细胞角蛋白，存在于大多数正常组织的腺上皮和移行上皮细胞中，一般非上皮来源的细胞无表达。在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈阳性反应，而胃肠道的腺癌阴性。 7. 细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）---（阳性部位：细胞浆）。CK20（46kDa）存在于正常的胃肠道上皮、移行上皮、Merkel细胞及其来源的肿瘤，而乳腺癌、肺癌和神经内分泌肿瘤不表达。 CK7 positive CK7 negative CK20 positive uninformative colorectum CK20 negative lung uninformative 8. 细胞角蛋白（高分子量）（cytokeratin，HMW）---（阳性部位：细胞浆）。高分子量细胞角蛋白抗体（34βE12）可以识别68kDa、58kDa、56.5kDa和50kDa的细胞角蛋白。 9.上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）(MUC1)---（阳性部位：细胞浆）。上皮膜抗原是一种高分子量（400 kDa）跨膜糖蛋白，广泛分布于各种上皮细胞及其来源的肿瘤。癌细胞过表达MUC1与肿瘤侵袭有关，有意义的免疫反应性为膜阳性，如为纯粹的胞浆着色则为假阳性。此抗体可以用于标记上皮及上皮源性肿瘤，EMA阳性表达的肿瘤包括大多数的癌、间皮瘤、滑膜肉瘤和上皮样肉瘤等，淋巴瘤、黑色素瘤和软组织肿瘤阴性表达。 10.HBME1---（阳性部位：细胞膜）。该抗体与间皮细胞表面的抗原反应，染色方式呈现一种特殊的“厚膜”方式，在鉴别间皮瘤与腺癌时有一定的参考价值：间皮瘤为厚膜型，腺癌为薄膜型或胞浆着色。 11.突触素（synaptophysin，Syn）---（阳性部位：细胞浆）。突触素是分子量为38kDa的糖蛋白，主要存在于神经元突触前囊泡膜，是神经性和上皮性神经内分泌肿瘤的特异性标志之一，用于标记神经内分泌肿瘤。 12.甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）---（阳性部位：细胞核）。TTF-1表达于甲状腺腺上皮和肺的上皮细胞中。大多数肺的小细胞癌、腺癌、少部分大细胞癌、大多数非典型神经内分泌肿瘤免疫组化结果显示TTF-1阳性，而肺鳞癌及绝大多数典型类癌TTF-1阴性。
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
临床免疫组化实用大 全
免疫组化 定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 临床常用免疫组化指标的意义 临床病理工作中，我们常用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”，但是许多单位只写阳性结果，不写临床意义，其结果对临床帮助不大，因为许多医生不懂得这些结果的意义，因此建议大家在出此类报告时，把“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”的意义打印在报告中，以增加病理报告的使用价值。 1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记，全套4项：P-gP，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67。 2、乳癌免疫组化耐药预后标记，全套7项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，ER，PR，C-erbB-2。 3、意义：标记物--作用--阳性部位--临床意义
多药耐药基因蛋白（P-Gp）--药泵作用--胞膜/胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。 谷光甘肽S转移酶（GST π）--解毒作用--胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。 拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）--靶点作用--胞核--阳性率越高，对下列药物越有效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其有效。 雌激素受体（ER）--性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。 孕激素受体(PR) --性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。 C-erbB-2--癌基因产物--胞浆--阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。ER、PR阳性而C-erbB-2也阳性者，用三苯氧胺治疗效果不好。 Ki-67--细胞增殖标志--胞核--阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度越高。 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 CEA 多数腺癌表达CEA
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结 1 、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2 、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3 、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4 、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC 法、SP 三步法、即用型二步法检测系统等。
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序