1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。静置培养7天。第8天根据生长情况，进行换液、传代。
2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。
3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。1200rpm，离心6min，弃上清。合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
脂肪细胞的基础知识 脂肪细胞的生长全过程及其形态变化脂肪母细胞，是指能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化成为单能干细胞。它可保持着干细胞增殖活跃的特性，脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，即通常人们所说的脂肪细胞前体。前脂肪细胞再经历细胞融合、接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。全过程可以表示为：多能干细胞——脂肪母细胞——前脂肪细胞——不成熟脂肪细胞——成熟脂肪细胞。生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积，以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“O”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。此时的细胞无分裂增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。 张高娜,梁正翠.动物脂肪细胞的研究进展[J].饲料工业,2009,30(2):42-44. 脂肪细胞由起源于中胚层的间充质干细胞逐步分化形成,按间充质干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→不成熟脂肪细胞→成熟脂肪细胞的过程发展。前脂肪细胞在多种转录因子调控下,激活脂肪组织相关基因,并在这些基因的顺序性调控下,经一系列复杂的步骤分化为成熟脂肪细胞。 张艳.脂肪细胞分化过程中的分子事件[J].儿科药学杂志,2008,14(1):56-57.
间充质干细胞 概念： 不同文献中，分别命名为抽脂处理细胞（processed lipoaspirate cells, PLA），脂肪基质微管碎片细胞（stromal vascularfraction cells, SVF），脂肪组织源基质细胞（adipose-tissue derived stromal cells, ATSCs），脂肪源中胚层干细胞（adipose-derived mesodermal stem cells, ADMSCs）等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。 李惠侠,屈长青. 脂肪组织源性干细胞研究进展[J]. 生理科学进展,2007,38(2) 脂肪细胞是由起源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)逐步分化、发育而来，MSC主要分布于脂肪组织和骨髓中。脂肪细胞不同发育阶段的两类细胞系为多能干细胞系和前体脂肪细胞系，前者为不定向的细胞系，能转变为稳定的脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞，后者为定向的细胞系，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。 庞卫军,李影. 脂肪细胞分化过程中的分子事件[J]. 细胞生物学杂志,2005,27: 497-500. 脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ADMSCs) 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新及多向分化潜能,是一种 具有潜力的组织工程种子细胞。目前研究得比较多的是骨髓来源的MSCs,但骨髓中的间 充质干细胞数量很少(约占细胞总数的1/105),且存在取材困难等问题。MSCs广泛分布于 其他组织中,包括肌肉、血管、肝脏、胰腺和脂肪等。 ADMSCs表面有CD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH-2、SH-3、STRO-1等多 种抗原标志。 李冬艳,宇丽. 脂肪来源的间充质干细胞分离方法的改进[J]. 暨南大学学报(医学版),2007,28(6). 脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） Zuk等从脂肪组织中分离出了一种成纤维细胞样细胞，它与骨髓间充质干细胞(MSCs)形态相似，称之为脂肪干细胞（ADSCs)，平均每300 ml脂肪组织可获得2×108～ 6×108个这样的细胞。ADSCs和MSCs具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、 CD70、CD105/SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34和CD45为阴性反应。此外， 它们还具有各自特征性的表达分化抗原：ADSCs具有特征性表达分化抗原CD49d，而MSCs具有特征性表达分化抗原CD106。 张高娜, 梁正翠. 动物脂肪细胞的研究进展[J]. 饲料工业,2009,30(2) 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具备干细胞特点的细胞系，具有自我更新能力、长期的活性和多系分化潜能。 脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs），以其取材方便、来源丰富等多种优势逐渐取代骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。 免疫表型：研究发现ADSCs主要表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表达CD34、CD3、CD19、CD45、CD14、CD117、CD31、CD62L、CD95L和HLA-DR。这个结果和其他的MSCs几乎一致。但ADSCs与BMSCs也有差别：大部分BMSCs表达CD10，而表达CD10的ADSCs仅占5%～20%；几乎所有的ADSCs表达CD49f和CD54，而BMSCs极少表达。 周苏娜,张明鑫. 脂肪来源的间充质干细胞的生物学特征及临床应用[J]. 中国现代普通外科进展,2009,12(1). 不同细胞的表面标志是不同的，脂肪干细胞的表面标记为：CD9、CD10、CD13、CD29、CD10、CD44、CD49e、CD49d、CD54、CD55、CD59、CD90、CD105、CD107、CD146、
脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略 脐带间充质干细胞（UCMSC ）具备药品的“工厂化、规模化、标准化”生产特点，是目前“成药”性最高的成体干细胞（ASC ）之一。UCMSC 还有广泛的生物效应，对各种损伤、退变和炎症性疾病的疗效明确，且具有免疫原性低、异体治疗无免疫排斥反应、临床应用的安全性高、无伦理限制等临床应用优势。UCMSC 的研究与应用受到了国内外研究者的广泛关注，已对其高效制备技术、体内生物学行为、临床疗效与机制及安全性进行了深入研究，解决了临床前关键技术和理论问题，进入了迈向临床验证的最后一公里，即将成为临床疾病治疗的新型“药物”和技术。但如何科学、合理、规范、循序渐进地推进UCMSC 向临床转化，是管理部门和研究者共同面临的问题。笔者在对UCMSC 进行系统性临床前研究的基础上，对UCMSC 治疗系统性损伤和自身免疫性疾病的临床技术及规范进行了探讨。 1 . UCMSC 治疗的临床适应证 UCMSC 制剂可在临床上用于涉及组织细胞损害（变性、坏死、缺失）、自身免疫和炎症反应引起的疾病的治疗，但在同种疾病的不同阶段、不同个体之间，疗效可能不尽相同，其原因在于UCMSC 来源、质量及临床实施方法的差异。根据UCMSC 的生物学特性及疾病治疗机制研究进展，UCMSC 的临床适应证主要有： （1）机械性创伤：包括武器、交通与意外伤害、自然灾害等导致的各种类型的组织器官损伤； （2）退变性疾病：如衰老、器官纤维化、骨质疏松、器官萎缩、动脉硬化等； （3）缺血性疾病：心脑血管意外、血管栓塞等； （4）中毒性疾病：如酒精、食物、药物、毒剂、环境等导致的肝、肾、神经中毒等； （5）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮，再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肝病等； （6）炎症性疾病：慢性炎症、急性系统性炎症综合征等； （7）代谢性疾病：糖尿病、甲状腺功能异常、高血酯症、高血压等； （8）组织残缺性疾病：主要用于组织缺损的局部再生及人工组织构建与移植治疗。 总之，UCMSC 的适应范围很广，可通过多种机制发挥治疗作用，对并发多种疾病的患者有“一药治多病”的效应。
脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图
2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明
脐带间充质干细胞的研究进展 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC S ）是来源于发育早期中胚层 的一类多能干细胞[1-5]，MSC S 由于它的自我更新和多项分化潜能，而具有巨大的 治疗价值 ,日益受到关注。MSC S 有以下特点：(1)多向分化潜能，在适当的诱导条件下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3、4]、脂肪细胞、神经细胞[9]、肝细胞[6]、心肌细胞[10]和表皮细胞[11, 12]；(2)通过分泌可溶性因子和转分化促进创面愈合；(3) 免疫调控功能，骨髓源（bone marrow ）MSC S 表达MHC-I类分子，不表达MHC-II 类分子，不表达CD80、CD86、CD40等协同刺激分子，体外抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受[11, 15]，在预防和治疗移植物抗宿主病、诱导器官移植免疫耐受等领域有较好的应用前景；(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗。1974年Friedenstein [16] 首先证明了骨髓中存在MSC S ，以后的研究证明MSC S 不仅存在于骨髓中，也存在 于其他一些组织与器官的间质中：如外周血[17]，脐血[5]，松质骨[1, 18]，脂肪组织[1]，滑膜[18]和脐带。在所有这些来源中，脐血(umbilical cord blood)和脐带(umbilical cord)是MSC S 最理想的来源，因为它们可以通过非侵入性手段容易获 得，并且病毒污染的风险低，还可冷冻保存后行自体移植。然而，脐血MSC的培养成功率不高[19, 23-24]，Shetty 的研究认为只有6%，而脐带MSC的培养成功率可 达100%[25]。另外从脐血中分离MSC S ，就浪费了其中的造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells,HSCs/HPCs) [26, 27]，因此，脐带MSC S (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC S )就成 为重要来源。 一．概述 人脐带约40 g, 它的长度约60–65 cm, 足月脐带的平均直径约1.5 cm[28, 29]。脐带被覆着鳞状上皮，叫脐带上皮，是单层或复层结构，这层上皮由羊膜延续过来[30, 31]。脐带的内部是两根动脉和一根静脉，血管之间是粘液样的结缔组织，叫做沃顿胶质，充当血管外膜的功能。脐带中无毛细血管和淋巴系统。沃顿胶质的网状系统是糖蛋白微纤维和胶原纤维。沃顿胶质中最多的葡萄糖胺聚糖是透明质酸，它是包绕在成纤维样细胞和胶原纤维周围的并维持脐带形状的水合凝胶，使脐带免受挤压。沃顿胶质的基质细胞是成纤维样细胞[32]，这种中间丝蛋白表达于间充质来源的细胞如成纤维细胞的，而不表达于平滑肌细胞。共表达波形蛋白和索蛋白提示这些细胞本质上肌纤维母细胞。 脐带基质细胞也是一种具有多能干细胞特点的细胞，具有多项分化潜能，其 形态和生物学特点与骨髓源性MSC S 相似[5, 20, 21, 38, 46]，但脐带MSC S 更原始，是介 于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一种干细胞，表达Oct-4, Sox-2和Nanog等多
人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法 间充质干细胞属于成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织，下面是小编搜集整理的一篇探究干细胞体外分离培养方法的，供大家阅读查看。 大面积皮肤缺损、重度烧伤的传统修复方法-自体或异体皮肤移植，因存在免疫排斥和供区不足等缺陷而限制了广泛临床应用。近年来，干细胞相关机制及应用的研究为皮肤创伤的治疗带来了新突破。研究显示，间充质干细胞能维持皮肤稳态和促进皮肤创面修复，其机制包括促进细胞分化、免疫调节和分泌生长因子来促进创面再上皮化和血管形成[1-2].人脂肪间充质干细胞(humanadipose-derivedmesenchymalstemcells,hAD-SCs)是由Zuk等[3]首次从抽脂术脂肪中分离出的一类具有多向分化能力的细胞群，因其具有来源丰富、容易获取和扩增快等优点，是组织工程的理想种子细胞。本实验旨在提供一种有效的hADSCs体外分离培养方法，为以后临床细胞移植提供实验基础。 1材料与方法 1.1材料成人腹部大网膜脂肪组织7例取自江苏大学附属医院产科剖宫产手术患者，年龄17~33岁，平均为26岁，健康状况良好，无系统性疾病。低/高糖DMEM、Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相应同型对照(eBio-sciences公司),地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(Sigma公司). 1.2方法 1.2.1hADSCs细胞分离培养产科无菌条件下取出腹部大网膜脂肪组织约 10ml,PBS清洗，剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化45min,10%胎牛血清终止消化，离心，沉淀重悬，200目细胞筛过滤，再离心。加入完全培养液(含10%胎牛血清、1×双抗的低糖DMEM)重悬，以5×104/ml接种于6孔板，置于37℃,5%CO2培养箱中培养，48h后首次换液，之后每周换液2次，待细胞生长至80%融合时，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代。实验时用第3~9代细胞。 1.2.2细胞免疫表型检测取消化消化贴壁的第3代hADSCs,1000r/min离心5min,用PBS重悬分装于1.5ml的EP管中，每管100μl,细胞密度为105/ml,加入鼠抗人CD29、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166E、HLA-DR等单克隆抗体及其同型对照。4℃避光孵育30min,PBS洗2次，加PBS300μl重悬后流式细胞仪检测细胞表面抗原。 1.2.3细胞生长曲线和倍增时间取处于对数生长期的第3、6和9代细胞，消化贴壁细胞，将细胞按5×103/孔接种于24孔板，分7组，每组3孔，置培养箱培养。每24h用台盼蓝计数一次，每次计3孔，取其平均数;连续计数7d,
人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;
间充质干细胞治疗小脑萎缩（山东干细胞网） 遗传性小脑共济失调，即遗传性小脑萎缩，是一组以共济运动障碍为突出表现的慢性进行性小脑变性疾病，发病年龄多在33—34岁，病情进行性加重。发病机理目前并不清楚，病变主要累及小脑，但脊髓、颅神经、基底节、脑干、大脑皮质等也可受累。遗传方式为常染色体显性遗传，因此，如果有本病家族史的人尽量不要生育。 患者：宋某，男性，40岁，患有遗传性小脑共济失调，即遗传性小脑萎缩。其具有明显的家族遗传性，其外公、姨、母亲、两个哥哥均患有该病。 入院时，患者口齿不清，行走经常跌倒 ，双手动作笨拙，症状逐渐加重，并出现双下肢无力，下蹲后不能自行站起。后经间充质干细胞移植成功治疗，基本恢复正常的生活。 目前采用的治疗方法是给予体外培养扩增的间充质干细注射，每周1次，共4次为一个疗程，同时给予系统功能锻炼。 干细胞治疗后在这位患者出院的时候，已经能行走稳健，未再出现跌倒情况，口齿清楚。后来，这位患者的两位哥哥也来做间充质干细胞治疗，恢复的效果也不错。 干细胞治疗重度颅脑外伤后遗症期 患者，男性，35岁。诊断：重度颅脑外伤后遗症期 重度颅脑外伤术后言语及肢体活动障碍8个月，拟行神经外科行颅骨修补和干细胞移植治疗。 干细胞移植治疗前： 四肢肌张力均高，以左侧为著，右上肢、右下肢活动较灵活，左侧肢体处于肌紧张状态，疼痛刺激后有屈曲。 影像学检查：双侧大脑见多发片状低密度区，CT值10-15Hu，边尚清。左侧侧脑室后部与左脑内低密度区贯通，脑内见引流管影。脑室系统略扩张，右侧脑室后角增大明显。右侧颅骨见巨大缺损区，左侧颅骨呈术后状态。[印象]双侧大脑多发软化灶、脑积水分流术后。 干细胞移植治疗后效果： 颅骨修补并干细胞脑内移植治疗后4天，患者左侧上肢肌张力明显降低，第二次干细胞移植后，次日患者左上肢肌张力进一步降低，左下肢肌力增强，达三级，屈伸自如(之前在强刺激下能才在水平面屈曲)。该患者再经过一阶段锻炼，有望下地行走。
脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验 作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应
中国组织工程研究 第18卷 第10期 2014–03–05出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 5, 2014 Vol.18, No.10 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1609www.CRTER .org 李艳琪，女，1988年生，山东省淄博市人，汉族，天津大学在读硕士，主要从事脐带间充质干细胞分离培养等方面的研究。 通讯作者：靳继德，博士，副研究员，军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 并列通讯作者：吴祖泽，研究员，中国科学院院士，天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市300072；军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.10.021 [https://www.doczj.com/doc/9e3654760.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)10-01609-06 稿件接受：2014-01-18 Li Yan-qi, Studying for master’s degree, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China Corresponding author: Jin Ji-de, M.D., Associate investigator, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Corresponding author: Wu Chu-tse, Academician, Investigator, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Accepted: 2014-01-18 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进 李艳琪1，王洪一2，姚 尧2，刘晶晶3，徐 潇2，张 宇2，刘 洋3，吴祖泽1， 4，靳继德4(1天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市 300072；2解放军沈阳军区总医院，辽宁省沈阳市 110016；3北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京市 100022；4军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039) 文章亮点： 在脐带干细胞的培养过程中，实验特色性的对传统的组织块贴壁法进行了改进，将传统组织贴壁法中本应丢 弃的组织转移到新的培养瓶中，进行二次贴壁培养，在较短时间内获得更多数量的间充质干细胞。通过二次 贴壁法得到的细胞经流式细胞仪检测符合间充质干细胞的特性，且增殖能力旺盛，具有体外多向分化潜能， 可成为临床研究和应用的细胞来源。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；脐带；间充质干细胞；分离培养；二次贴壁 主题词： 干细胞；脐带；间质干细胞；细胞培养技术 摘要 背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能，以及取材方便等优点而日益受到 关注。 目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法，并对其生物学特性进行分析。 方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带，利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，即将 传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养，取第3代脐带间充质干细胞进行 生物学特性分析。 结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出，第10天左右可形成明显的细胞克隆。 将组织块转移到新培养瓶中继续培养，2 d 后即可见有细胞爬出，细胞生长速度较快，5 d 即可形成细胞克隆。 传代后的细胞形态均一，呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105，不表达CD34、 CD45、HLA-DR 。细胞增殖能力旺盛，平均倍增时间为50 h 左右，41.24%的细胞处于G 2/S 期。体外可诱导 分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性， 而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。 李艳琪，王洪一，姚尧，刘晶晶，徐潇，张宇，刘洋，吴祖泽，靳继德. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法 的改进[J].中国组织工程研究，2014，18(10):1609-1614. An improved method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells Li Yan-qi 1, Wang Hong-yi 2, Yao Yao 2, Liu Jing-jing 3, Xu Xiao 2, Zhang Yu 2, Liu Yang 3, Wu Chu-tse 1, 4, Jin Ji-de 4 (1Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2the General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3College of Life Sciences and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 4Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China) Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells with capabilities for self-renewal and multi-differentiation have attracted widespread attention. OBJECTIVE: To develop an efficient method for isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to analyze the cell biological features. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by improved tissue cultivation. Immunophenotype and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Growth curve was determined by MTT assay, and differentiation ability was evaluated by in vitro osteogenic and adipogenic induction as well. RESULTS AND CONCLUSION: Some fusiform cells crawled out from human umbilical cord tissues after cultivation for 5 days and formed colonies about 10 days later. When the removed tissues were further cultured, more cells appeared again within 2 days and formed colonies after 5 days. The isolated cells exhibited similar morphology of fibroblast-like shape after passage. Furthermore, the cells expressed CD90, CD105, but were negative for the markers of CD34, CD45, HLA-DR. Population doubling time of the cells calculated from the result of MTT was about 50 hours and cell cycle analysis showed that 41.24% cells were in the G 2/S phrase. Therefore, the isolated cells had a high prolification ability. In addition, the isolated cells could be induced into osteoblasts
脐带间充质干细胞26问 1. 什么是干细胞? 干细胞是指那些具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变分化成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。 2. 什么是成体干细胞？ 成体干细胞是指存在于成体不同组织中的干细胞，当机体需要时可以被激活分化成具有特定功能的细胞，如造血干细胞可分化形成各种血细胞等。 3. 什么是胚胎干细胞？ 胚胎干细胞是指来源于早期胚胎的干细胞，它们可以产生构成机体所有组织器官的细胞。 4. 干细胞如何分类? 有几种分类方法。根据发育阶段不同，分为胚胎干细胞、胎体和成体干细胞。根据来源不同，可分为骨髓、骨膜、脂肪、滑膜、骨骼肌、肝、乳牙、脐带、脐带血干细胞等，根据功能不同，可分为造血、神经、心肌、血管、皮肤干细胞等。 5. 什么是多向分化？ 在特定的生理或体外诱导条件下，可以分化成具有不同功能的成熟细胞，如心肌细胞，神经细胞，血细胞等。 6. 什么是自我复制？ 通过细胞分裂的方式复制自身，完成数量上的飞跃。 7. 间充质干细胞只存在于脐带吗? 不是，间充质干细胞广泛分布于胎儿、成体骨髓、骨膜、松质骨、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中。 8. 什么是间充质干细胞（MSC）？ 间充质干细胞是干细胞的一种，因能在体内外特定环境下，分化成为骨、软骨、肌肉、脂肪等间叶组织而得名。 间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞具有干细胞的共性，即具有自我更新和多向分化潜能的生物学特性；此外，间充质干细胞还具有体外扩增的特性。 9. 什么是脐带间充质干细胞？ 我们所说的脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带中的间充质干细胞。
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.doczj.com/doc/9e3654760.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.doczj.com/doc/9e3654760.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化