Western Blot Marker说明书
货号：PR1800
规格：10T(50μL)/20T(100μL)
保存：-20℃可保存2年。避免反复冻融，建议分装保存。
产品简介:
传统的Western Blot试验需要使用预染蛋白Marker来跟踪检测阳性抗原信号和转膜效率，但预染蛋白Marker无法在胶片上曝光，曝光信号需要根据膜上的预染蛋白Marker来判断。Western Blot Marker是专门为Western Blot试验设计的分子量标准，由9种发光蛋白和9种预染蛋白组成；9种发光蛋白分别为23、30、36、44、50、62、90、120和160KDa，这些蛋白均可与抗体结合，因此能与抗原在同一张膜上曝出信号，阳性信号可以直接通过Western Marker的位置来判断；9种预染蛋白分别为15、25、35、40、55、70、100、130和180KDa，其中70KDa为红色，其他为蓝色，转膜完毕后在膜上肉眼可见。
主要特征：
1.可与抗原同时检测信号，使Western blot结果判断更加简便
2.发光Marker没有偶联和标记其他分子，分子量更加准确
3.综合发光Marker和预染Marker的优势，既能监测转膜又能与抗原同时检测
使用说明:
1.取出后于室温放置融化；
2.温和地充分混匀，取5-10μL该Western Blot Marker至上样孔中，进行SDS-PAGE电泳。
3.电泳完毕后转至PVDF膜或NC膜，与一抗二抗孵育。
4.孵育完毕，将Western Blot Marker与抗原一起通过ECL曝光至胶片或荧光显色。
图示：
1、HRP标记的Goat anti mouse IgG二抗（一抗：mouse anti p38）ECL化学发光检测
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2、多重荧光检测
注意事项:
1.本产品可直接使用，不需要加热。
2.可根据抗体的效价或曝光时间的长短调整Western Blot Marke的上样量。
3.使用新配制的凝胶，及时更换电泳缓冲液和转膜液，以免影响实验结果。
4.该产品与抗血清或高浓度多克隆抗体一起孵育时可能会出现非特异性条带，此时可降低该预染发光
Western Blot Marker 的上样量至1~2μl。
彩虹130广谱蛋白marker说明书 货号：PR1950 规格：20T(100μL)/50T(250μL)/100T(250μL×2)/500T(250μL×10) 保存：-20℃保存，有效期至少2年。 产品特点： ●三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。 ●用量少，节约成本，仅5ul即可完美呈现（1.5mm，10孔梳）。 ●广谱多带，一支即可满足多种实验需求。 产品简介： 本产品包含9种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为15kD-130kD，每种蛋白含量约为 0.2-0.4mg/ml。预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC膜上可得到清晰的9条彩色蛋白条带，其中70kD条带为红色，25kD条带为绿色，其余条带为蓝色。 使用说明： 1.本产品是即用型液体，可直接上样电泳。上样前无需加热，稀释或添加还原剂。 2.上样5ul，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。 3.建议分离胶浓度为15%。 电泳示意图说明： 第1页，共2页
第2页，共2 页注意事项： 1.本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。若冰箱温度不稳，导致结冰，可 适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。 2.Marker分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD以下条带不易分离，但不影响绿色 （25KD）及以上条带。如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。 3.转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜 成功，属于正常现象。
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续
平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：
考马斯亮蓝染色套装使用说明 货号：P1305 保存：室温保存，至少一年有效。 规格：100ml+500ml 产品简介： 本考马斯亮蓝染色套装(Commassie Blue Staining Kit)采用了最经典的 考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝G-250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western 转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。 产品内容： 考马斯亮蓝染色液100ml 考马斯亮蓝脱色液500ml 说明书1份 使用方法： 1、电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中(至少5倍胶体积)，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 2、将凝胶置于摇床上缓慢摇动，室温染色至少2小时，低丰度蛋白染 色需4小时以上。 3、染色结束后移除染色液，染色液通常可重复利用2-3次，但染色效
果会略有影响。 4、将凝胶浸泡于和染色液等量体积的脱色液中，摇床上脱色4-8小时，期间更换3-5次脱色液。 注意事项： 1.染色时间4小时以上效果最佳。 2.脱色可根据目的蛋白丰度和脱色效果随时终止，或延长脱色时间。 3.脱色越彻底，检测的蛋白量越低，脱色24小时一般可以检测出0.1ug蛋白量。 4.脱色后，将凝胶保存在水中，拍照或扫描保存图像。或制成干胶保存。 相关试剂： P1300-500考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液 PC0020BCA蛋白浓度测定试剂盒 PR1400低分子量蛋白MARKER PR1700预染次高分子量蛋白MARKER I1020IPTG溶液(50mg/ml) A101030%丙烯酰胺(29:1) T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 P1300SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h
（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
彩虹245广谱蛋白marker使用说明 货号：PR1920 规格：20T(100μ1)/50T(250μ1)/100T(250μ1×2)/500T(250μ1×10) 保存：-20℃保存，有效期至少2年。 产品特点： ●三色预染，颜色鲜亮，条带整齐，便于观察。 ●稳定性能突出，经检测4℃放置两年无明显降解。 ●用量少，节约成本，仅5ul即可完美呈现（1.5mm，10孔梳）。 ●广谱多带，一支即可满足多种实验需求。 产品简介： 彩虹245广谱蛋白marker包含12种彩色预染的已知分子量标准蛋白，分子量范围为 11kD-245kD，每种蛋白含量约为0.2-0.4mg/ml。预染marker可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。经SDS-PAGE凝胶电泳或转移到PVDF或NC膜上可得到清晰的12条彩色蛋白条带，其中25kD为绿色条带，75kD为红色条带，其余10条是蓝色条带。 使用说明： 1.彩虹245广谱蛋白marker是即用型液体，可直接上样电泳。上样前无需加热，稀释或添加还原剂。 2.上样5ul，SDS-PAGE电泳过程及转膜后可看见清晰的彩虹条带。 3.建议分离胶浓度为15%。 电泳示意图说明：
彩虹245广谱蛋白marker经15%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜上。 注意事项： 1，本产品含有较高浓度甘油，常规-20℃保存为液体状态，可直接使用。若冰箱温度不稳，导致结冰，可适当分装后置于4℃保存，至少稳定6个月。 2，Marker分离效果与PAGE胶浓度相关，若分离胶浓度低于15%，25kD以下条带不易分离，但不影响绿色（25KD）及以上条带。如果目的条带小于25KD，建议分离胶浓度大于或等于15%。3，转膜效果与转膜时间有关，需根据客户目的条带大小而定，如果转膜后较大分子量条带有部分未转膜成功，属于正常现象。 相关试剂： P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT） P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 D106010×电泳转移缓冲液 PR1910彩虹180广谱蛋白marker
4×蛋白上样缓冲液（含DTT）使用说明 货号：P1015 规格：10ml 保存：-20℃保存，建议分装冻存，避免反复冻融，自发货之日起至少12个月有效。 产品简介： 4×蛋白上样缓冲液（含DTT）适用于SDS-PAGE(SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)时作蛋白质上样用。其主要成份为SDS，DTT，溴酚蓝，缓冲盐溶液等。SDS可与蛋白质结合使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，这时蛋白质本身的电荷完全被SDS掩盖，消除了各种蛋白质本身电荷的差异；SDS还可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。DTT可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质结构，消除了蛋白结构之间的差异。最终无电荷及结构上差异的蛋白（亚单位），电泳速度只是与其分子量大小有关。溴酚蓝用作电泳时的指示剂，可大概指示电泳结束的时间。 使用说明： 1、请按每30微升蛋白样品加入10微升上样缓冲液的比例(4倍稀释)来使用。如果蛋白样品浓度过高，可用双蒸水稀释。 2、混匀后，100℃水浴加热5-10分钟，使蛋白变性。 3、冷却至室温后，10000-14000rpm离心2-5分钟，取上清直接上样电泳即可。 注意事项： 4、聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%时溴酚蓝指示条带的位置大概在30kd左右，胶浓度为12%时，约在20kd左右，胶浓度为15%时，大概在10kd。请根据自己目的条带来判断电泳时间。 5、本试剂因含DTT，有一定的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6、蛋白上样缓冲液含有溴酚蓝指示剂，PH值受保存温度影响，在低温冻存状态下，溶液可能会呈现深棕色，不影响产品使用。 相关试剂： P10182×蛋白上样缓冲液（含DTT） P10174×非变性蛋白上样缓冲液 P001210×丽春红染色液 P1300-500考马斯亮蓝快速染色液 P1300SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 PR1700预染次高分子量蛋白MARKER
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳
PH0302|超低分子量蛋白Marker II(3.4-100kD) Ultra Low Molecular Weight Protein Marker 货号：PH0302规格：?10T（50ul）保存：Store@-20℃ ◆产品简介 本产品包含5种多肽和3种低分子量蛋白质组成，分子量范围为3.4kD-100kD。可以用来判断SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。 ◆使用说明 第一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用；本产品为即用型，融化后既能使用，不能95℃加热处理。 一.制胶： I配制分离胶 1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（19:1）、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合。 2．加入10%APS和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。 3．在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的水层，使凝胶表面保持平整。4．静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。 表一（一块0.75mm mini胶用量） 分离胶浓缩胶 18％T,5%C/6.0ml5％T,3.3%C/2ml 40%PAA（19:1） 2.7ml/ 40%PAA(29:1)/0.25ml 4×凝胶缓冲液 1.5ml0.5ml 乙二醇（电泳级） 1.8ml/ ddH2O/ 1.25ml 10％APS50-65μl20μl TEMED6μl2μl 注：如非必须，不要使用1.0mm和1.5mm的凝胶，尽量使用厚度0.75mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。 II配制浓缩胶 去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去。 1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（29:1）和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合。
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
次高分子量蛋白质Marker(43kD-200kD)使用说明 货号：PR1500 规格：10T 保存：-20℃可保存至少六个月。避免反复冻融，建议分装保存。 产品简介： 次高分子量蛋白质Marker包含5种蛋白质混合物，分子量范围为43kD-200kD，每种蛋白的含量约为20ug。经SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染色后可以得到分布均匀密度相近的5条带。可以用来判断SDS-PAGE电泳后蛋白质的分子量。 本产品配有一支蛋白上样缓冲液（150ul）。 使用说明： 将两支试剂开启，取110ul蛋白上样缓冲液加入蛋白Marker干粉中，混匀，取出液体，置于 1.5ml离心管中，100℃沸水浴加热5分钟，冷却后根据需要分装成小管，建议每管分装10μl，-20℃贮存，每次取一管使用。 注：如长期贮存后使用，使用前最好取分装后的小管99℃预热3分钟后再上样电泳。 用考马斯亮蓝G-250染色后可见5条蛋白带（见下示意图）。
注意事项： 1.建议分离胶浓度7%，浓缩胶浓度4%，制胶时先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。电泳时，80v电压大约跑1小时后，待指示剂沿到达分离胶上沿时，将电压调至120v，直到电泳结束。整个电泳过程大约需3-4个小时。 2.电泳之后可将胶进行染色观察，如果使用配方进行染色时效果不好或考虑其毒性，可以选择考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液，具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的替代品。 相关试剂： P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT） T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 P1300-500考马斯亮蓝快速染色液
BCA微量蛋白浓度测定试剂盒 货号：PC0050 规格：500微孔(500T)/1000微孔(1000T)/2000微孔（2000T） 保质期：本试剂盒自订购之日起一年内有效。 产品内容： 包装500微孔1000微孔2000微孔保存 BCA试剂100ml2×100ml4×100ml室温 Cu试剂3ml6ml12ml室温 PBS稀释液30ml60ml120ml室温 BSA蛋白标准 0.3ml0.5ml1ml-20℃ (5mg/ml BSA) 产品简介： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。 操作说明： 一.微孔酶标仪法 1.配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工
作液室温24小时内稳定。 2.稀释标准品：先用PBS将BSA标准品稀释至终浓度为0.8mg/ml备用。再依次稀释至80、40、20、10、5、2.5ug/ml.。 3.高浓度蛋白可将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。 4.各孔加入200微升BCA工作液和40ul稀释后的蛋白或标准品溶液，对照孔加入PBS稀释液。37℃放置4小时。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。 二.分光光度计法 如没有酶标仪，在离心管中混匀样品后加入比色皿，用分光光度计比色。 采用分光光度计测定蛋白浓度方法与酶标仪法相似，只需要按照分光光度计比色皿容量要求按照比例配置相应的BCA工作液和标准品溶液。 常规比色皿用量为200ul有样本加入1mlBCA工作液或400ul样本加入2mlBCA工作液。微量比色皿用量为20样本加入100ul BCA工作液。或根据仪器情况自行调整。 附：样本及标准品稀释示意图 样本管号A B C D E PBS稀释液用量180100100100…… 标准品用量20（原液） 100 （从A管吸出） 100 （从B管吸出） 100 （从C管吸出） …… 终浓度（ug/ml）80402010…… 注意事项：
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
蛋白Marker可分为：一、未预染的Marker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Marker即单色预染和多色预染。 在western blot 过程中，分子量Marker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。这个Western Blot 参照家族的一员的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是western blot实验成功的必要条件之一。 总体来说，蛋白分子量标准可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准二个级别。以下是关于蛋白分子量标准的小叙： 一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量标准 未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条!数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker 使用上不如预染Marker(pre-stained)好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才―开蛊‖，无法对实验起预示参照作用。完全属于―后知后觉‖型的，当然还是比―不知不觉‖不做对照的要好。 ①宽分子量蛋白标准
蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。
Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
低分子量蛋白质Marker（14.4kD-97.4kD)使用说明 货号：PR1400 规格：20T 保存：-20℃可保存至少一年。避免反复冻融，建议分装保存。 产品简介： 低分子量蛋白质Marker包含6种蛋白质混合物的冻干粉，分子量范围为14.4kD-97.4kD，每种蛋白的含量约为20-30μg。经过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳后，用考马斯亮蓝染色可以得到分布均匀密度相近的6条带。可以用来判断SDS-PAGE电泳后蛋白质的分子量。 使用说明： 1.开封后，溶于400μL体积的1×蛋白上样缓冲液（含巯基还原剂），于沸水浴中加热5分钟，冷却后可根据需要进行小量分装，每管20μL，-20℃贮存，每次取一管使用。 2.如长期贮存后使用，使用前最好取分装后的小管沸水浴预热3-5分钟后再上样电泳，用考马斯亮蓝G-250染色后可见6条蛋白带(见下示意图)。 注意事项： 1.建议分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，制胶时先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。电泳时，80v电压大约跑1小时后，待指示剂沿到达分离胶上沿时，将电压调至120v，直到电泳结
束。整个电泳过程大约需3-4个小时。 2.电泳之后可将胶进行染色观察，如果使用配方进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液，该试剂具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，是常规染色液的替代品。 相关试剂： P10154×蛋白上样缓冲液（含DTT） P10164×蛋白上样缓冲液（含巯基还原剂） T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 P1300-1SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 P1300-500考马斯亮蓝快速染色液
Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明 货号：PC0010 规格：2500T 保存：开封使用后请密封保存，本试剂盒自订购之日起九个月内有效。 产品内容： 组成包装（2500微孔)保存 5×G250染色液100ml2-8℃ PBS稀释液30ml2-8℃ 蛋白标准(5mg/ml BSA)1ml-20℃产品简介： 考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由465nm变为595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM，但受略高浓度的去垢剂影响，需确保SDS的浓度低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween20,60,80低于0.06%。 操作说明： 一．微孔酶标仪法 1.完全溶解蛋白标准品，取10ul，稀释至250ul，使终浓度为0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
2.5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取1ml5×G250染色液，加入4ml双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。 3.将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20微升。 4.将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。 5.各孔加入200微升稀释后的1×G250染色液，室温放置3-5分钟。 6.用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。 7.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。 二．分光光度计法 如无酶标仪，染色反应可在离心管中进行，反应液混匀后加入比色皿中，使用分光光度计测定吸光值。 步骤如下： 1.取八支（或者更多）干净的10ml离心管，标记上号。 2.取100ulBSA加入PBS2.4ml稀释至终浓度为0.2mg/ml。 3.5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取10ml5×G250染色液，加入40ml 双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。 4.按下表加入试剂(以每孔5ml计，多余的用来清洗比色皿)
WesternBlot操作步骤及注意事项 【原理】 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【试剂及配制】 1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。 2、电泳缓冲液 Tris（分子量121.14） 3.03g 甘氨酸（分子量75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。 3、转膜缓冲液 湿转法 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L甘氨酸11.25g 0.0375%SDS 0.375g 加少部分蒸馏水溶解 20%甲醇200ml 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。 4、TBS缓冲液 1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml NaCl 8.8g 蒸馏水定容至1000ml 配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。 5、TBST缓冲液（洗膜液） 20%Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。
中分子量蛋白Marker I 使 用 说 明 书 包 装 量： 浓 度：每种蛋白约0.1－0.2mg/ml 在1×loading Buffer 储运温度：收到产品后分装冻存，避免反复冻融降解蛋白，-20℃ (长期保存请置于-70℃ )(用于小胶5μl/次 可用20次 用于大胶10μl /次 可用10次) 制品说明：本产品是由6种蛋白质分别纯化后混合而成的蛋白质溶液，分子量范围为14KD －94KD ，经SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用考马斯亮蓝R －250（Coomassie Blue R-250）染色后可得清晰的7条蛋白带。建议使用分离浓度为12%～15%。 适用胶浓度：最优适用于12% (37.5:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶。 该Marker 也可用于8-15%的胶。胶浓度为8-10% 时蛋白Marker 中低分子量的蛋白易于同染料前沿跑在一条线上不易区分，在12-15%的胶上及梯度电泳中，所有的条带都能锐利清晰分开。 推荐上样量： 上样量 胶厚度大小 5μl 0.75mm thick mini 10μl 1.5mm thick mini 0.75mm thick large 20μl 1.5mm thick large 操作步骤： 1. 室温融解Marker 或37- 40°C 温浴几分钟使之融解，混匀均一，不要高温加热。 2. 为避免污染最好分装保存以备使用，取所需体积的Marker 置于一干净离心管中并封好口。 3. 上样并进行 SDS-PAGE 电泳。
4.该Marker适用于考马斯亮蓝, 银染或其他蛋白染色方法。 注意：银染比考马斯亮蓝染色敏感度高10～100 倍，相应的银染需要减少用量。 5.变性蛋白Marker储存于-20°C。 6.在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中不要使用该Marker，因为在该Marker的储存缓冲液中存在SDS。 质量检测： 5μl 的该Marker 用于12% 的凝胶进行SDS-PAGE电泳(mini gel)并用考马斯亮蓝R-250染色,能得到6条亮度相同的锐利条带。 NOT FOR HUMAN OR DRUG USE