硕士学位论文
荧光原位杂交技术及其在环境领域内的应用
Fluorescence in situ hybridization technology and its application in
the field of environment
作者姓名： **
学科、专业：环境科学与工程
学号： ********
指导教师： ***
完成日期： 2014/3/26
大连理工大学
Dalian University of Technology
大连理工大学硕士学位论文
摘要
荧光原位杂交（FISH）是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。总结了一些实验关键步骤的操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面的应用做了综述。利用FISH 技术在环境样品上直接原位杂交，不仅可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，而且可原位分析它们的空间及数量分布。并且展望了FISH技术的未来。
关键词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测
- I -
大连理工大学硕士学位论文格式规范
Abstract
Fluorescence in situ hybridization （FISH）is a new technology which is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summarizes the experimental principle, process and technical issues of FISH .Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps, and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples, can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms, but also analyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the future of FISH.
Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology; Probe; Environmental microbes; monitoring
- II -
目录
摘要............................................................................................................................. I Abstract ............................................................................................................................. II 1 荧光原位杂交技术简介. (4)
1.1 FISH发展历史 (4)
1.2 FISH原理 (5)
1.3 FISH基本过程 (6)
1.3.1 探针制备 (6)
1.3.2 探针的标记 (7)
1.3.3杂交前处理 (7)
1.3.4 杂交 (8)
1.3.5荧光检测与结果分析 (9)
1.4 FISH技术特点 (9)
1.5 常见的技术问题及解决措施 (9)
1.5.1 FISH检测的假阳性 (9)
1.5.2 FISH检测的假阴性 (10)
2 FISH技术在环境领域的应用 (10)
2.1 对硝化细菌的监测 (10)
2.2 对除磷细菌的监测 (11)
2.3 FISH技术在丝状微生物研究中的应用 (11)
2.4 对厌氧颗粒污泥中微生物的监测 (12)
2.5 对自然环境中微生物多样性的监测 (12)
3 未来展望 (13)
参考文献 (14)
- III -
1 荧光原位杂交技术简介
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH技术是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点。同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术。
1.1 FISH发展历史
1986年人们用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行分析，从而建立了荧光原位杂交技术。1988年，Giovannoni等[1]首次将原位杂交技术引入细菌学研究中，使用放射性标记rRNA 寡核苷酸探针检测微生物。然而由于放射性物质对人体有害，加上实验周期长，操作比较繁杂，人们开始研究使用非放射性物质取代同位素来标记探针，如使用生物素和地高辛标记探针，由此建立了非放射性原位杂交技术。1989年，Delong[2]首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。从此，人们越来越多地使用荧光原位杂交技术来检测环境中的微生物样品。进入20世纪90年代以后,FISH技术在方法上逐步形成了从单色向多色- FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。多色荧光原位杂交（M- FISH）的最大特点是可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位在一次FISH实验中完成。Cremer等[3]用生物素和汞或氨基乙酰荧光素标记探针建立了双色FISH技术。最近，多种标记的探针和荧光染料可以同时测多个靶序列，最新的多色FISH可同时用7种颜色进行检测。荧光染料具有不同的激发和散射波可以同时检测一个或更多微生物。
FISH技术由于灵敏度高，具有较好的分辨力，实验周期短，操作安全，特别是可以同时分析一种以上的探针，它将成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具，同时FISH技术本身也得到快速发展。
1.2 FISH原理
荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针按照碱基互补的原则，与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，形成可被检测的杂交双链核酸，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA 区域或RNA 分子在染色体或其它细胞器中的定位，图1.1显示的是荧光原位杂交原理。
图1.1荧光原位杂交原理图
FISH技术的目标分子通常是16S rRNA，因为它在微生物体内具有较高的拷贝数，分布广泛、功能稳定，而且在系统发育上具有适当的保守性。根据待测微生物体内16S rRNA中某段特异性序列，设计相应的寡核苷酸探针，就可实现对目标微生物的原位检测，而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列，就可在不同水平（如属、种等）上进行检测。
目前，公共和商业数据库中已发布的16S rRNA序列逐渐增多，因此，基于16S rRNA 的FISH技术的应用也越来越广泛，对环境样品中微生物的原位研究也越来越方便和准确。除16S rRNA 外，还可以23S rRNA 或mRNA 等作为研究的目标分子。
1.3 FISH基本过程
荧光原位杂交技术基本过程如图所示，主要包括探针制备、探针标记、杂交、荧光检测与结果分析。图1.2所示的是荧光原位杂交方法标记细胞的基本流程：
图1.2荧光原位杂交方法标记细胞的基本流程
1.3.1 探针制备
进行荧光原位杂交试验首先需要有荧光探针。它是一段带有荧光色素的核酸序列。探针有很多种，包括：DNA探针，RNA探针，寡核苷酸探针等。每种探针的特点如表所示。
表1.1各种探针优缺点[4]
DNA探针制备简单，放射比活性好，信号
特异性强，杂交体稳定变性后才能使用，要基因克隆，穿透性差，易于退火
RNA探针信号特异性强，不需变性，信噪
比高，杂交体非常稳定易被降解，易吸附于器皿上，穿透性差，要做亚克隆
寡核苷酸探针易制备，使用方便，穿透力强，
不用克隆，不会退火需核酸合成仪，需明确mRNA序列，杂交体不稳定，信噪比低
寡核苷酸探针是一种人工合成的、根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度为15-50个核苷酸。由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域，但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子的数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。
1.3.2 探针的标记
对探针的标记是通过把荧光素标记的核苷酸引入探针序列来实现的，根据引入的过程不同，标记方法可分为缺口平移法、随机引物法、PCR法等；缺口平移法：基本方法是通过酶的作用在5’-3’核酸链上产生随机缺口，再通过酶将核苷酸添加到缺口的3’端，从而把带有荧光色素的核苷酸引入核酸链。随机引物法是以变性后的探针DNA链为模板，在随机引物的引导下，利用酶活性把标记核苷酸引入DNA链。PCR法是把荧光色素标记的核苷酸引入DNA链中。
FISH 技术的目标分子通常是16S rRNA，因为它在微生物体内具有较高的拷贝数，分布广泛、功能稳定，而且在系统发育上具有适当的保守性。根据待测微生物体内16S rRNA中某段特异性序列，设计相应的寡核苷酸探针，就可实现对目标微生物的原位检测，而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列，就可在不同水平（如属、种等）上进行检测。
1.3.3杂交前处理
（1）增强细胞通透性
荧光原位杂交实验的程序中，如何增强细胞通透性，保证核酸探针能与目标核苷酸结合是一个重要的问题。该步骤根据应用固定剂的种类，杂交样品的种类和核酸探针的长度来决定。某些固定剂能影响细胞的通透性，因此需要利用一些试剂如稀释后的酸、乙醇等进行处理。另外，使用表面活性剂对样品处理能够较好地增加细胞的通透性。
（2）降低背景
荧光原位杂交中背景的染色是由多种因素造成的，杂交后的洗涤能够降低背景染色。预杂交也是降低背景染色的一种有效手段，预杂交液与杂交液的不同是在于前者不含有探针。将玻片浸入到预杂交液中可达到封闭特异性杂交点的目的，从而降低背景染色。
（3）变性
单链的DNA/RNA探针不需要变性。双链DNA探针杂交前需要变性为单链，一种方式是样本与探针分别变性，其中双链DNA变性是在70℃-80℃条件下变性10分钟左
右，然后立刻转移到冰浴中。而样本是放置在70℃-80℃的变性液中5-10分钟，用70%，85%，100%的系列乙醇脱水，吹干。另一种方式是共同变性：样本经过70%，85%，100%系列乙醇脱水快速吹干后，将探针溶液加至玻片上，盖上盖玻片，封片液封固边缘，放置在70℃-78℃的加热板上10分钟左右，然后立即转入37℃的湿盒中。
1.3.4 杂交
杂交前的一切准备工作都是为了能让荧光探针在杂交这一步骤中能够进入到细胞内，与目标核苷酸结合。杂交能否实现决定了整个实验的成败，因此，杂交是荧光原位杂交中最重要也是最关键的一步。
在已经预处理好的样品上滴加杂交液，加盖盖玻片就可以完成杂交。在杂交区域，探针与目标核苷酸复性，形成DNA-RNA的合体。盖玻片的作用是防止在杂交过程中的高温情况致使杂交液和探针的挥发。同时，整个杂交环境应当保持黑暗、潮湿，可在暗盒内洒一定量的杂交液，同时暗盒也必须耐高温不会影响杂交的顺利进行。盖玻片必须清洁无杂质，同时也要光滑不会产生气泡，还必须不会影响样品细胞与杂交液的接触。在实验中还必须注意以下环节。
（1）探针的浓度及长度
探针的浓度必须给于该实验最大的信噪比，探针浓度过高会造成背景染色过高，探针浓度过低会导致荧光信号的不足。因此，最低的探针浓度应达到与靶核酸最大饱和结合度的程度。根据国内外多数专家学者的经验，认为保存浓度为5ng/μL为最佳浓度。另外，杂交过程中加杂交液的量也不能太多，杂交液过多易导致盖玻片滑动脱落，影响杂交的结果。探针的长度对杂交结果也有很大的关系。探针短则易进入细胞，杂交效率高，杂交时间短，但是信号不是很强烈。探针长则信号好，易观察，但是不易进入细胞，杂交时间厂，而且配错对的几率也会增加。
（2）杂交温度和时间
杂交温度是杂交能否成功的一个关键因素。DNA探针需要变性解链后才能进行杂交。双链DNA变性一半所需要的温度称为DNA的溶解温度（Tm），大多数的DNA
探针需要的Tm是90℃，这种高温对保存细胞完整和保持样品黏附在载玻片上是很困难的。而使用寡核苷酸探针不需要经过这一步骤，但是杂交也需要在60℃左右才能进行，这么高的温度对样品也是很不利的。因此在杂交过程中需加入一定量的甲酰胺反应液中每增加1%的甲酰胺，Tm值就可降低0.72℃。可以调节甲酰胺的含量来适当降低杂交的温度。杂交的温度随着探针的种类不同而不同，杂交的时间也对杂交有较大的影响。杂交时间过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性杂交。大部分的DNA探针杂交时间为2-4小时，但是为了稳妥起见，人们将反应时间定地较长，为16-20小时。而
使用寡核苷酸探针是不需要这么长的时间的。杂交反应的时间应当与探针的长度和细菌细胞通透性有关，在充分进行细胞通透性的处理之后，核酸长度很短的寡核苷酸探针只需要2-6小时便可完成杂交。杂交时间因探针的种类不同而不同。
1.3.5荧光检测与结果分析
荧光原位杂交的结果观察需要使用荧光显微镜或者激光扫描共聚焦显微镜。荧光显微镜的特点为：
（1）数值孔径大于普通显微镜，荧光较弱。
（2）光源由汞灯提供全波段的激发光，通过物镜投射于样品上。
（3）有两个特殊滤光片，分别滤除可见光和紫外线。
观察不同荧光标记的探针需要调节不同的滤光片以选定适合波长的激发光
1.4 FISH技术特点
原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点：
优点：1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；
3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；
4、FISH可定位长度在1kb 的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；
5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；
6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。1.5 常见的技术问题及解决措施
1.5.1 FISH检测的假阳性
在FISH检测中，寡核苷酸探针的特异性决定了检测结果的可靠性和精确性，所以通常希望设计得到的寡核苷酸最好与数据库中的寡核苷酸一样的精确。现存数据库的不断扩大和所报道序列的非精确性，探针序列的检测最好用最常规、最新版本的序列数据库进行校对。而对于一些培养条件苛刻的和暂时无法培养的微生物，应该用点杂交的方
法分析探针的特异性，来确定探针设计的合理性。此外，一些微生物本身具有荧光性，会对FISH检测产生干扰。虽然自身荧光性有利于复染，但经常降低信噪比，同时掩盖特异的荧光信号。所以在处理一些混合菌群时要防止自身背景荧光的处理。使用狭窄波段的滤镜和放大系统以及适当的预处理，可以降低背景荧光[5]。Lin等发现用H2O2预处理可以有效的减少假阳性[6]。Taguchi 等在使用FISH之前，用HCl 预处理可以减少来自荧光标记寡核苷酸探针非特异性吸收的背景荧光以及减少大量的杂质[7]。Hahn等发现用地高辛标记探针原位观察Frankia strains与用荧光标记探针相比，不产生自身荧光问题[8]。
1.5.2 FISH检测的假阴性
虽然大多数细菌含有高的rRNA丰度，但rRNA丰度变异不仅仅发生在种属间，亦发生在同一菌不同生长阶段，生长率慢的细菌含有低的rRNA丰度[9];有些微生物细胞壁渗透性差，使探针不能充分进入细胞内与rRNA分子杂交，这些都将导致假阴性结果。因此，优化渗透性、用高亮度的荧光染料Cy3或Cy5和多重探针标记，应用信号放大系统或多核苷酸探针和CARD-FISH均可以增加杂交信号。Watt。等用FISH技术分析生长小麦根系的土著细菌、假单胞菌、丝状菌的量以及分布情况时发现使用Cy5或Cy5。5荧光染料可以避免在观察时看到自身荧光[10]。一些研究发现用多核苷酸荧光杂交技术和CARD-FISH均可以发现在水体中丰富的古生菌，而寡核苷酸荧光杂交技术无法发现[11]，表明寡核苷酸荧光探针的杂交信号较弱，通过其方法的改进，可以消除实验结果的假阴性。
2 FISH技术在环境领域的应用
2.1 对硝化细菌的监测
硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自养菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定等步骤，耗时长（4～8w），而且因为所用的培养基有选择性，使得某些易于培养的菌株如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterwinogradskyi 等超过了其他硝化细菌，在培养基中处于竞争优势，因此得到的优势类群与样品中的真实情况有差异。此外，传统的方法对培养困难的硝化细菌无法进行研究。FISH技术的引入解决了上述困难。随着人工设计合成的硝化细菌及氨氧化菌探针的不断推出，FISH技术被广泛地应用于活性污泥系统、硝化流化床反应器和膜生物反应器等污水处理系统中。JuretschkoSL和SchrammA等[12]曾对硝化流化床、普通活性污泥等工艺的活性污泥中硝化细菌的多样性
采用FISH法进行了跟踪分析，发现Nitrosospira、Nitrospira为优势菌种，而并未探测到Ni2trosomonas和Nitrobacter。Kazuaki H等[13]EUB338、NSO190、NIT3和NSR1156等探针研究了同时硝化反硝化好氧膜生物反应器中生物膜上的菌群结构，结果表明氨氧化菌是生物膜中的优势菌群，而亚硝酸盐氧化菌则未被检出。HanWoongLeeL等[14]用EUB338作为一级探针，ALF1b、BET42a、GAM42a和CF319a作为二级探针对两个不同脱氮反应器活性污泥中的分子生物学特征进行了定量研究，结果表明变形菌纲β亚纲是反应器中的优势菌群，变形菌纲γ亚纲是反应器中的第二大优势菌群。OlavSliekers
等[15]采用FISH技术对CAN-ON工艺调试过程中的优势菌种变化进行研究，结果表明：在厌氧运试阶段，以亚硝酸菌或硝酸菌的核酸探针检测，没有在污泥中检出亚硝酸细菌和硝酸细菌（检测限1%），以厌氧氨氧化细菌的核酸探针检测，大部分细胞呈阳性反应，污泥中的厌氧氨氧化菌占80%左右；在限氧运行7周后，同等测试结果显示活性污泥中的亚硝酸菌与厌氧氨氧化菌所占的百分率分别为45%和40%，而硝酸菌则未被检出。由此推断：在限氧条件下，硝酸细菌不能与亚硝酸细菌竞争氧，也不能与厌氧氨氧化菌竞争亚硝酸盐。
2.2 对除磷细菌的监测
近年来，国内外许多学者利用原位杂交技术对不同除磷工艺中聚磷菌的生态变化进行了大量研究。FISH技术的应用克服了以往除磷菌难于用常规方法培养造成的研究上的困难，并对不同条件下生物除磷工艺的改进起到了指导性的作用。Mamoru对除磷工艺的FISH研究中，使用ALF1b、HGC和Bet42a探针检测出的细菌量所占比例较大，分别在10%～64%；MP2和CF探针探测到的细菌含量并不高，在4%以下。在强化除磷（EBPR）工艺中，无论好氧或厌氧区的活性污泥中都存在着大量丰富的除磷微生物，其中常见类群为Bet Proteobacteria亚类的Actinobacteria菌、GPBHGC、Epbr15和Epbr16等。近期报道[16]的Rholocyclus也是生物除磷的优势种群，并且利用常规培养方法不能培养的γ- 亚纲变型细菌也在EBPR工艺中探测到。
2.3 FISH技术在丝状微生物研究中的应用
在污水生物处理工艺系统内，丝状微生物的大量滋生是引起污泥膨胀的主要成因。由于其对培养基的选择性很强，不易进行实验室分离培养，所以用传统的方法对丝状菌进行监测困难较大。利用FISH技术使该问题得到了较好的解决，许多科学工作者对活
性污泥中丝状微生物作了大量的FISH鉴定工作，从探针的设计及应用等方面作了详尽的阐述。FISH技术的应用对深入认识丝状微生物膨胀机理提供了大量有用的信息。2.4 对厌氧颗粒污泥中微生物的监测
厌氧颗粒污泥是由多种具有互营共生关系的厌氧微生物形成的复杂聚集体，是UASB、EGSB和IC等厌氧反应器高效稳定运行的关键，众多研究者对其形成机理、微观结构、微生态等进行了大量研究，但基于纯培养的传统微生物学研究方法自身存在的缺陷、颗粒污泥中微生物组成及其相互关系的复杂性以及某些厌氧细菌（如产氢产乙酸细菌和产甲烷细菌）的生长特异性等，使得对厌氧颗粒污泥的认识至今仍未取得共识。FISH技术的出现可以在很大程度上弥补传统方法的不足。利用FISH技术对颗粒污泥所进行的研究，主要集中在以下几个方面[17]：（1）组成颗粒污泥的各种微生物的种属关系及其空间分布；（2）工艺或环境条件对颗粒污泥内部微生物空间分布的影响；（3）两种或多种特定微生物之间的生态关系等。HermieJ ，MHarmsen[18]等人利用EUB338、ARC915、MX825和MG1200等探针的不同组合，研究发现以蔗糖为基质的颗粒污泥分为三层：外层为真细菌，中间层为产氢产乙酸细菌与产甲烷丝菌的共生体，内层存在着较大空洞，有少量产甲烷细菌和无机物；而以混合挥发酸为基质的颗粒污泥只分为较明显的两层：外层是真细菌内层则以产甲烷丝菌为主。Sekiguchi YY等人[19]利用EUB338和ARC915探针确定了真细菌和古细菌在中温和高温厌氧颗粒污泥中的分布情况，然后利用MX825、MG1200、MB1174、MS1414和D660等探针的不同组合对不同种类产甲烷细菌与真细菌的空间分布进行研究。结果表明：中温和高温颗粒污泥具有相似的微生物分布结构，外层主要是真细菌，内层主要是古细菌；颗粒中心均不能被染色，可能是无机物或死亡细菌；古细菌中以索氏产甲烷丝菌为主，在高温颗粒污泥中还存在少量的产甲烷八叠球菌；真细菌则种类较多，主要有脱硫叶菌、互营杆菌、和绿色非硫细菌等。
2.5 对自然环境中微生物多样性的监测
由于显微镜下可见的微生物99%以上通过常规方法不能被培养，由于培养条件与自然条件的差异，实际上培养所得到的只是自然环境中的少部分微生物，而且往往加入了浓度远高于自然状况的营养物质，其结果是在新的选择压力下群落结构通常会发生变化，适应丰富营养条件的菌种成为优势种，取代了自然条件下的优势种。[20]由于核酸序列可以提供遗传距离、分子杂交探针等信息，可进一步用于鉴定、监测自然生态系统中的微生物。基于核酸抽提和PCR扩增等技术存在一定程度的偏差，而FISH技术可以将整体微生物清晰地呈现出来而不需要额外的抽提和扩增等易引起偏差的步骤，精确性更
好。所以，FISH技术被广泛应用于环境微生物多样性的研究。近几年，应用FISH技术研究自然环境微生物多样性的报道较多，如河水和高山湖水的浮游菌体、海水沉积物的群落以及土壤和根系表面的寄居群落。SimonNathalie等[21]在2002年利用FISH技术研究海水中细菌和有害藻类种群之间的相互作用；应用FISH技术不仅能研究微生物群落结构的特征，还可以跟踪微生物种群的动态变化。Liu J等[22]2002年利用FISH技术监测了河流中微生物群落的动态变化，并利用此技术得到了一些在人工条件下很难培养的菌种以及一些新的微生物信息。FISH技术也被用于监测环境中的微生物群落动态，如季节变化对高山湖水微生物群落的影响、原生动物的摄食对浮游生物组成的影响等。此外，我们不仅可以更准确地了解不同环境下微生物群落中各种功能菌群的组成比例，而且对不同功能菌群的相互作用有了更直观的认识。
3 未来展望
FISH技术在国内外环境微生物监测中已得到较为广泛的应用，技术水平日趋成熟。然而，FISH技术在环境微生物研究中的应用尚处在起步阶段，还存在着不足：首先，FISH检测的精确性和可靠性依赖于寡核苷酸探针的特异性，因此探针的设计和评价十分重要，目前一些探针的灵敏度还有待提高；其次，微生物的自身荧光也会干扰FISH 检测而出现假阳性使检测结果出现正偏差，一些细菌如假单孢菌属、军团菌属、世纪红蓝菌、蓝细菌属和古细菌如产甲烷菌中存在这样的荧光特性，环境样品中自发荧光的生物或存在于微生物周围的化学残留物使应用FISH分析环境微生物变得复杂；此外，试验过程中杂交液渗透不充分、杂交后荧光标记见光褪色等则会导致假阴性而使检测结果出现负偏差；另外，一些生长缓慢的细胞由于rRNA含量低而很难被探测到。因此，FISH 技术作为一项新兴的研究手段和工具，还需要在高灵敏度探针的研究与开发、荧光信号的完善与加强、杂交过程的优化等几个方面进行加强和改进。相信随着分子生物学技术和精密仪器设备研制技术的不断发展和新探针的开发，FISH技术将具有更强的可操作性和实用性，从而使FISH技术在环境微生物的监测和生态学解析中具有更广阔的应用前景。
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免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
荧光原位杂交技术FISH 1 目的 通过FISH实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价。 2材料与仪器 2.1材料 件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸45 s；循环30次； 72℃再延伸8 min。 2) 将所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产 物，并用微量分光光度计测定其浓度。 3) 进行体外转录反应合成Brd2 cRNA探针，20 μL体外转录反应体系如下：RNase
inhibitor 1μL，10×NTP dig labeling mixture 2μL，10×transcription buffer 2μL，Template DNA 13μL，RNA polymerase 2μL。 4) 37℃水浴孵育2 h，取0.5μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测。 5) 加入2μL无RNase污染的Dnase I 37℃水浴孵育15 min来消化模板DNA。 6) 加入EDTA 0.8μL，加入5.6μL NH4Oac终止反应，再加入56μL无水乙醇并混匀，于 -80℃放置20 min。 7) 15000 r/min,4℃离心15 min，弃上清，加入700μL 80%的无水乙醇混匀，15000 r/min,4℃ 离心10 min沉淀RNA。 8) 干燥后用DEPC处理的水50μL溶解RNA。合成的两条探针经1%琼脂糖凝胶电泳鉴 定并用微量分光光度计测定探针浓度，于-80℃保存备用。 3.2荧光原位杂交实验检测探针的效果 1) 正常C57BL/6小鼠用1%戊巴比妥钠深麻后，依次以30 mL 0.01 mol/L DEPC-PBS和 100 mL含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）行左心室灌注，小心剥离脑组织，于4℃环境下用上述相同固定液进行后固定过夜，后将组织转移浸没于含30%蔗糖的PB溶液中脱水至沉底。 2) 最后取出组织用OTC包埋，冰冻切片机连续切片至需要的层面，切片厚度30 μm。 3) 选取上述脑组织切片于室温条件下经含有2%H2O2的0.1 mol/L DEPC-PB处理10 min 以阻断内源性过氧化物酶，再用0.1mol/L DEPC-PB室温漂洗10 min，接着用含 0.3%Triton X-100的0.1 mol/L DEPC-PB处理20 min，在用乙酰化液处理10 min，后 于0.1mol/L DEPC-PB中清洗2次，每次10 min，后加入预杂交液，60℃预杂交1 h 以封闭非特异结合位点。 4) 分别于两组切片中加入探针并使探针终浓度为1 μg/mL。于60℃杂交炉中恒温孵育 16-20 h，同时设立省略探针的空白对照，以上操作严格在无RNA酶环境下进行。 5) 杂交后组织切片置于wash buffer中60℃浸洗2次，每次20 min，接着切片在RNase buffer中室温孵育5 min，后加入终浓度为20 μg/mL的RNase，37℃作用30 min以消化未结合的cRNA探针。 6) 接下来恒温37℃条件下依次用2×SSC，0. 2×SSC溶液各浸洗切片2次，每次20 min， 再在TS7.5溶液中室温孵育5 min，后置于TBS溶液中室温封闭1 h，加入地高辛抗体（POD-anti-DIG,1:100）室温孵育过夜。
直接免疫荧光法测抗原 基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 试剂与仪器 l 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 l 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 l 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制 l 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） l 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） l 荧光显微镜 l 玻片架 l 滤纸 l 37℃温箱等。 实验步骤 1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。 3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++
--++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。 注意事项 1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 （1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。 （2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 （3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
荧光原位杂交（FISH）综述 摘要 本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。 关键词：荧光原位杂交; 1.发展 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。 2.原理 通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。 原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。只有这样染色体DNA才能与探针杂交。变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展 早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。如果使用低辐射能的放射性标记物，如 3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。20世纪80年代后期，非放射性DNA荧光标记技术的发展解决了上述问题，这些标记将高灵敏度与高分辨率结合起来，适用于原位杂交。 现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，因此有可能将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每种杂交信号，从而测定出各探针序列的相对位置。为了得到最高的灵敏度，探针的标记需要尽可能大一些。在过去这就意味着探针必须是相当长的DNA分子，通常是至少40kb的克隆片段。现在已发展出将较短的DNA分子进行标记的技术，对长度的要求已不那么重要。 构建物理学图谱时，克隆的DNA片段可被简单地看作另一种类型的标记物，但在实际应用，由于克隆的DNA片段确定了DNA序列，将其作为标记应用则具有另一层含义。因此，克隆间位置关系的确定提供了基因组图谱与其DNA序列间的直接联系。如果探针是长的DNA片段，至少对于高等真核生物，就可能产生这样一个问题：探针中可能含有一些重复的DNA序列，因此探针可能与染色体上多个位点杂交，探针在使用前要与来自被研究组织的未标记DNA混合。这种DNA可以是总的核DNA（即代表了全基因组），但如果使用富集重复序列的片段更好。加入未标记DNA的目的在于与探针中的重复序列结合并将其封闭，使随后的原位杂交完全由单一序列驱动（Lichter et al.，1990）。这样非特异性杂交即可被减少或完全消除[1]。 4.荧光染料 常用的荧光染料的DAPI(在UV 光激发下发出蓝色荧光)、FITC和荧光素(蓝光 下发出绿色荧光)以及罗丹明和德克萨斯红(绿光激发下产生红色荧光)。由于FISH 的信号空间分辨率高。不同的DNA 探针可以用不同的半抗原标。再用不
荧光原位杂交技术及其应用 摘要：荧光原位杂交技术是一种非常有用的分子细胞遗传学工具，特别是对一些染色体数目异常和复杂染色体异常的诊断，架起了染色体显带技术和分子遗传学之间的桥梁。本文主要就荧光原位杂交技术的发展历程、探针制备和临床应用做一简单的综述。 关键词：FISH；荧光原位杂交；临床应用；产前诊断；肿瘤 Fluorescence in situ hybridization and applications SUN Jingjing,YAN Shouqing (College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China) Abstract:FISH is a powerful molecular cytogenetic technique which allows rapid detection of numerical and complex chromosome aberrations on interphase cells and metaphase spreads, bridging the gap between conventional chromosome banding analysis and molecular genetic DNA studies. This review gives a brief overview of the historical developments of FISH techniques and applications in clinic genetic diagnostics. Key words:FISH; Fluorescence in situ hybridization; Clinical applications; Prenatal diagnosis; Tumor DNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法[1]。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增,产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。 1 FISH技术的产生 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后，Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板，利用体外合成的含3H 的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交，从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术[2]，但是没有得到广泛应用。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP)成功地进行了染色体原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术(Nonisotopic in situ hybridization)，至此，以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985年这项技术被引进到植物。1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分 钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper 成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应用。 1．原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。2．实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 3．特点 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 4．应用 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 荧光原位杂交FISH操作规程 一、主要试剂 1变性液20SSC 4mlddH2O 8ml甲酰胺28ml 2PBD液1000ml 20SSC中加入1.25gTween20 二、操作流程 1 硅化玻片切片烤片60过夜 2 脱蜡入水斜置切片空干 3 2SSC洗涤三次每次5min下简写为35 4 0.2M HCl处理室温10接步骤3 5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3 6 切片入20梯度酒精脱水各2空干 7 切片入85变性液8 8 迅速入20梯度酒精脱水各2空干 9 杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片37过夜 10 反应体系中加入等体积的甲酰胺4510
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
荧光原位杂交（FISH） 1.样品处理与固定(约4h，可提前准备) （1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液； （2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液； （4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液； （5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。 2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备） （1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用； （2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟； （3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次； （4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。 3.透化与脱水（约1h） 现配proteinase k buffer：50mL 1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL 5M NaCl1mL10%SDS 2.5mL dd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL （1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟； （2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。 （3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。 4.杂交（约2h） （1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖； （2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度
细胞遗传学课程论文 题目：荧光原位杂交技术的发展 及在植物中的应用 姓名：秦冉 学号：11316040 荧光原位杂交技术的发展及在植物中的应用 摘要: 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术。该技术因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。本文简要介绍了荧光原位杂交在染色体制片技术、探针类型及探针标记方法方面的发展，概述了荧光原位杂交技术在基因定位，远缘杂种的鉴定及外源染色质的检测等方面的应用。 关键词：荧光原位杂交技术；染色体制片技术；探针标记方法；基因定位 The development of fluorescence in situ hybridization and its application in plant Abstract: Fluorescence in situ hybridization(FISH) is a non radioactive in situ hybridization technique developed in the late 1980s. Because of its characteristics:high sensitivity, strong specificity, accurate positioning, fast, safe and effective, it can be used in many fields.This paper briefly introduces the development of FISH in plant including the chromosomal technique, probe type and labeling method, then summarizes the application of FISH in gene mapping, identification of the distant hybrid and detection of the alien chromatin, etc. Keywords: fluorescence in situ hybridization; chromosomal technique; probe method; gene mapping 前言 荧光原位杂交技术是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术[1]。其基本原理为：根据核普酸碱基互补配对原则, 使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交, 然后用合适的检测方法将荧光信号检出, 达到基因定位的目的。因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。自从Rayburn等[2]于1985年首次将原位杂交技术应用于植物染色体研究后，该技术便在植物学研究中得到了广泛的应用。主要是由于以下几方面的原因：①FISH 的灵敏度接近同位素标记探针杂交[3-4]，在安全性，空间分辨率，速度和探针的稳定性等比放射性同位素标记探针杂交更具优越性；②运用不同荧光色素标记的探针可同时检测一个细胞核中2种或更多的核甘酸序列；③DNA 序列能被定位在目标范围从载玻片上分散的中期细胞染色体到悬浮固定保存细胞三维结构的间期核中[5]；④探针标记和荧光试剂从商业上可得，而且使FISH过程直接可靠；⑤荧光显微镜和数字成像系统在过去20 多年中不断改进；⑥特殊种属的全基因组，完整染色体，染色体亚区域或单拷贝序列能在多种探针混合运用情况下出现特异信号；⑦未标记的基因组DNA 通过探针预杂交抑制重复序列，对定位象柯斯质粒这样一类含大插入探针的特定序列是至关重要的。来。FISH技术的程序较复杂，主要流程包括染色体标本的制备，探针的制备、纯化与检测，染色体与探针的变性，原位杂交，杂交后洗脱，杂交信号的检测和放大，荧光显微镜观察、照相。 随着FISH 技术的不断发展，衍生了染色体原位抑制（CISS）技术、间期核FISH、引物原位标记或DNA 合成（PRINS）技术等，并且发展出M-FISH、3D-FISH、Rx-FISH 技术、CGH 以
胞免疫荧光步骤： 1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。 爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子 具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量） 取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。 爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。 将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。 2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)； 3.PBS漂洗5min； 4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)； 5.PBS漂洗2次，每次5min； 6.1%BSA封闭30min； 7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h； 8.PBS漂洗2次，每次5min； 9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h； 10.PBS漂洗2次，每次5min； 11.5ug/ml DAPI染色2min； 12.抗淬灭封片剂封片。