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抗体纯化大全

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抗体的纯化

第一节 硫酸铵沉淀法

基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

试剂及仪器

组织培养上清液、血清样品或腹水等

硫酸铵( )

饱和硫酸铵溶液( )

蒸馏水

含 叠氮钠 见附录一

透析袋

超速离心机

磁力搅拌器

实验步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 。

一、配制饱和硫酸铵溶液( )

将 ( ) 边搅拌边慢慢加到 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到 。

抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化的方法有哪些? 抗体制备出来之后,需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗,既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清,而通常经过免疫制备的 硫酸铵沉淀法: 基本原理:高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜,降低球蛋白的溶解性,是分离免疫球蛋白的常用方法,而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别,一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。 适用于:鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作: 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清; 2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%,静置沉淀蛋白; 3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解,用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐; 4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱,PBS或硼酸盐(含0.02%叠氮钠)缓冲液洗脱; 5.电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度; 6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜,-20℃保存不超过一个月,避免反复冻融。 亲和层析法 基本原理:基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段,将protein A和protein G结合到柱料上,通过亲和层析的方式,可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍:protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁,分子量42 kDa,由spa 基因编码,具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域,每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域

protein A的各个结构域 protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段(尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4,豚鼠,猕猴,鼠类IgG2a、兔)以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主,表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能,也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域,另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。 protein G分离自G Streptococcus的细胞壁,分子量65 kDa,由spg基因编码,可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域,其结合力较protein A更强。 protein G的B结构域 protein G的各个结构域 还有一种protein A/G蛋白,是基因工程改造产物,是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性,能结合人和鼠的IgG所有亚型,不结合鼠的IgA、IgM。 ①proteinA亲和层析 适用于:人(IgG3除外)、兔、豚鼠、猪的抗体; 基本操作: 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清; 2.调节pH到8.0:腹水以10倍体积pH8.0 PBS稀释、培养上清用pH8.0 PBS透析或强氧化钠调节; 3.过proteinA琼脂糖凝胶柱,pH8.0 PBS洗杂; 4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体(小鼠IgG1用pH6.5,IgG2a用pH4.5,IgG2b和IgG3用pH3.0),并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液; 5.用PBS透析;

抗体ProteinA纯化方法

抗体ProteinA纯化 一.P roteinA柱子的制备 1.配制溶液; 结合/洗涤缓冲液:NaCl,0.5M ;Na2HPO4,20mM ;PH8.0。 配制500ml的方法: 称取NaCl 4.383g,Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。 2. 制备空柱子 (1)先打开用过的PD-10上盖,拿掉上面的盖膜。盖上盖子,摇晃,倒去里面的填料,用PBS清洗3次。 (2)用胶带固定好PD-10空柱子,要求垂直放置。 (3)在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。 (4)ProteinA填料混匀,(10ml包装一小瓶)。 (5)加入5ml的ProteinA到柱子中。 (6) (7) (8) 二.纯化步骤 1.样品准备;将兔血清与结合缓冲液1:1混合,过滤(防止堵塞柱子)。 2.平衡柱子:用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。 3.上样:将准备好的血清样品上样,根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。 4.洗脱杂蛋白:用结合缓冲液冲洗柱子,直至结合液中不含蛋白。 5.收集抗体:用洗脱液过柱,同时收集漏出液(约3-4ml/管),直至漏出液中不含蛋白。 测定各收集管中的蛋白含量,合并蛋白管。(注意:收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液,防止抗体在过酸的环境下失活) 6.柱子再生:用5-10倍体积的再生液再生柱子。 7.PBS透析收集的抗体。 三.试剂的制备 1. 结合缓冲液1000ml 500ml 甘氨酸112.6g 56.3g 氯化钠175.2g 87.6g 氢氧化钠调PH至9.0 2. 洗脱缓冲液500ml

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体(antibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody),简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。 1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),简称单抗。 与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次**,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒(Georges Ko1er)和英国科学家米尔斯坦(Cesar Milstein)两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 (一)杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

抗体纯化

一、抗体纯化部分 1、腹水/血清的亚型测定完成后,IgG亚型的腹水/血清使用Protein G 抗体纯化柱纯化;IgM 亚型的腹水/血清则使用饱和硫酸铵沉淀法沉淀。 1.1 Protein G 抗体纯化步骤: (1)新柱子先用DDW 5ml过柱; (2)10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱; (3)抗体过柱,过程中要求缓慢过柱,以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上; (4)继续10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱; (5)5倍柱体积甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体,并加入Tris-HCI(pH 9.0)中和甘氨酸,使pH保持为适合抗体保存的中性; (6)10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱; (7)5倍柱体积20%乙醇溶液过柱,于4℃条件下保存纯化小柱; (8)将洗脱的抗体用聚乙二醇浓缩并透析,以彻底去除不相干离子。 其中所用试剂配方: DDW:超纯水 Binding Buffer(100ml):A液,0.2M磷酸氢二钠61ml B液,0.2M磷酸二氢钠39ml 磷酸氢二钠4.37g 磷酸二氢钠1.22g 甘氨酸-盐酸缓冲液:0.1M甘氨酸溶液加浓盐酸调pH 2.7 Tris-HCL缓冲液:1M Tris溶液加浓盐酸调pH 9.0 1.2 饱和硫酸铵沉淀法步骤: (1)配制饱和硫酸铵溶液,再用氨水调节pH至8.5 (2)沉淀:a、腹水/血清离心去除细胞碎片,保留上清液并测定体积; b、边搅拌边逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液,搅拌均匀使蛋白充分沉淀; c、上述蛋白质溶液经过离心弃上清取沉淀,并用PBS溶液(pH 7.0)溶解; d、继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液,搅拌均匀使蛋 白充分沉淀; e、继续离心沉淀弃上清去沉淀,用PBS溶液(pH 7.0)溶解; (3)透析:每隔3-6小时换一次透析液,以彻底去除硫酸铵。 其中所用试剂配方: PBS缓冲液(1L pH 7.0):氯化钾0.2g 磷酸二氢钾0.2g 磷酸氢二钠3.35g 氯化钠8g

抗体分离纯化技术的研究进展

生物技术通报 BIOTECHNOLOGYBULLETIN ·技术与方法· 2008年第3期 收稿日期:2007-11-19 基金项目:内蒙古自治区自然科学基金重大项目(编号200408020402)作者简介:侯越(1982-),男,硕士研究生,研究方向:动物学生物技术通讯作者:吴应积,教授 引言 抗体是一种特殊的蛋白质分子,被作为体外诊断的试剂、治疗疾病的药物、免疫亲和层析的配基等,在生命科学研究、生物技术及医学领域中有着广泛的应用。尤其是抗体作为各种免疫分析的核心试剂,对免疫分析结果的灵敏度、 特异性起着至关重要的作用。在对一些与生命体功能关系密切的新基因产物的研究中,是否拥有相应的抗体以检测与鉴定新基因的产物蛋白质,是整个研究工作能否深入开展的关键。 抗体技术是免疫学领域中的一个重要方面,广泛应用于生命科学和医学各学科。从第一代抗体———血清多克隆抗体开始,它就在疾病治疗和体外诊断中发挥了很大的作用。由于免疫动物制备血 清抗体的免疫原性和非均质性,给抗体研究和应用造成了困难[1],激发了人们对抗体进行深入研究的热情。1975年Kohler和Milstein通过杂交瘤技术制备出针对一种抗原决定簇的抗体即第二代抗体—— —单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb),是均质的异源抗体[2]。单克隆抗体具有高度均质性、高度特异性,促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性,是目前应用最广泛的抗体。单克隆抗体的出现,引起了生物学理论的革命,生物学技术的广泛应用提供了重要的工具[3]。20世纪80年代采用基因工程的手段研制抗体,并对抗体的基因进行改造和重组等,制备出第三代抗体——— 基因工程抗体(geneticengineeringantibodyGEAb)。基因工程抗体主要对现有的鼠源性单克隆抗体进行人工改造,并 抗体分离纯化技术的研究进展 侯越 罗奋华吴应积 (内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特010021) 摘 要: 制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败。抗体 的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化。重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法。对当前的纯化方法进行了一个简要的综述。 关键词: 抗体 分离 纯化 ProgressinTechnologyofAntibodyPurificationandSeparation HouYueLuoFenhuaWuYingji (KeyLaboratoryofEducationMinistryofChinaforMammalianReproductiveBiologyandBiotechnology, UniversityofInnerMongolia,Hohhot010021) Abstract: Preparationofantibodiespossessedhighspecificityandaffinityisthebaseofimmunology.Thesuccess ofexperimentdependsonthequalityofantibodies.Preparingantibodieshastwoways:oneiscommonlycurrentmethod,tobeusedtoobtainpolyclonalantibodiesviaimmunizinganimalswithpurifiedantigen;theotherispreparationofmonoclonalantibodybyusinghybridomatechnique.Whatevertechnologyused,thepreparedantibodiesneedstobepurified.Itisessentialtochoosetheproperprocedureforisolationandpurificationofanantibody,accordingtopropertiesandsourceoftheantibody.Thisreviewisfocusedonthecurrentpurificationmethods. Keywords: AntibodiesIsolation Purification

抗体的制备方法与原理

抗体的制备方法与原理-单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交瘤细胞既可产生抗体,又可无性繁殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体,由于每种抗原都有几个抗原决定簇,用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体,即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的,所以它的免疫球蛋白属同一类型,质地纯一,而且它是针对某一抗原决定簇的,因此特异性强,亲合性也一致。单克隆抗体(McAb)的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体(McAb)和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体的制备方法如下。 (一)动物的选择与免疫 1.动物的选择纯种BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2.免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~ 1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。 (2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例,免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。

单克隆抗体制备的技术原理

单克隆抗体制备的技术原理 单克隆抗体是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的抗体,具有单一、特异与纯化的特性。该抗体在医学临床诊断及治疗上具有极其重要的作用。因此它的问世在现代免疫学上具有划时代的意义。 大家知道,当外源性物质在人体或动物血液中出现时,机体中有一些淋巴细胞便会做出反应,产生一些特殊的免疫球蛋白,叫做抗体。而那些外源性物质则称为抗原。抗体与抗原能发生特异结合,从而清除异物,达到保护肌体的作用。抗原不同,它所诱发的抗体也不一样。如细菌或病毒表面存在着几种抗原,因此它们就会对应地诱发出几种不同的抗体。过去人们为了获得抗体,就根据上述原理,反复注射某种抗原到动物(如兔、羊、马等)体内,然后从其血清中分离出所需的抗体。长期以来,用这种经典方法得到的抗体,往往存在着两个严重的缺点:第一,这些抗体不是均质的,而是一种抗体的混合物,特异性差,效价低;第二,抗体的产生是有限量的,因为分泌抗体的成熟淋巴细胞寿命很短,一般只能存活几天,无法大量生产。 为了克服上述缺点,许多免疫学家曾进行了长期的研究与探索,这一难题终于在1975年被国外两名免疫学家考勒和米尔斯坦解决了。他们利用自己创立的杂交瘤技术,使产生抗体的淋巴细胞能在体外长期存活,并源源不断地分泌抗体。这就是有高特异性和非常均质的单克隆抗体。 单克隆抗体的技术原理并不十分复杂。它是把能产生单一抗体的淋巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合,形成杂交瘤细胞,又称杂交瘤。由于这些杂种细胞继承了双亲细胞的遗传物质,因此它们不仅能表现出淋巴细胞分泌单一抗体的能力,而且还能表现出骨髓瘤细胞在体外大量繁殖的本领。就这样,取长补短,使杂交瘤变成了一座制造单克隆抗体的理想“工厂”。 目前制备单克隆抗体的具体方法,主要有以下三步(图2-9)。 第一步:将抗原注射到小鼠体内进行免疫,取出受免脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合。 第二步:用选择培养基,选出杂交瘤细胞,逐一克隆或扩增,从中挑出能产生抗体的杂交瘤细胞。 第三步:将杂交瘤细胞接种在培养瓶中扩大培养或注射到动物的体液中作为腹水癌生长,然后再分离纯化单克隆抗体。

抗体纯化大全资料

抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵(NH4)SO4 ·饱和硫酸铵溶液(SAS) ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液(SAS) 将767g(NH4)2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1 mol/L, 25°C); 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1;

二、沉淀 1、样品(如腹水)20 000′g 离心30 min,除去细胞碎片; 2、保留上清液并测量体积; 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,终浓度为1:1(v/v); 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°C),使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min(4°C)。弃上清保留沉淀; 2、将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时(4°C),每隔3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨; 3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v); 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜(4°C); 3、3000′g 离心30 min(4°C),保留上清液; 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨; 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效的; 二、为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表1); 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献 1、Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma

抗体的制备方法与原理

抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原,还必须选择适当的免疫途径,才能产生质量好(特异性强和效价高)的抗体。 (一)用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类,主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等,实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量,如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清,多用家兔和山羊,因动物反应良好,而且能够提供足够数量的血清,用于免疫的动物应适龄,健壮,无感染性疾患,最好为///雄性,此外还需十分注意动物的饲养,以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔,最好用纯种新西兰兔,一组三只,兔的体重以2~3kg为宜。 (二)免疫途径 免疫途径有多种多样,如静脉、腹腔、肌肉、皮、皮下、淋巴结注射等,一般常用皮下或背部多点皮注射,每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性,如激素、酶、毒素等生物学活性抗原,一般不宜采用静脉注射。 (三)佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同,而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱,因此常常在注射抗原的同时,加入能增强抗原的抗原性物质,以刺激机体产生较强的免疫反应,这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体的存留时间,增加抗原刺激作用外,更主要的是,它能刺激网状皮系统,使参与免疫反应的免疫活性细胞增多,促进T细胞与B细胞的相互作用,从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。 常用的佐剂是福氏佐剂(Freund adjuvant),其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份,羊毛脂与石腊油的比例,视需要可调整为1:2~9(V/V),这是不完全福氏佐剂,在每毫升不完全佐剂加入1~20mg 卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法:按比例将羊毛脂与石蜡油置容器,用超声波使之混匀,高压灭菌,置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合,用振荡器混匀成乳状,也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨,均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液(其中加卡介苗3~4mg/ml或不加),加完后再继续研磨成乳剂,滴于冰水上5~10min完全不扩散为止。为避免损失抗原,亦可用一注射器装抗原液,另

抗体纯化常见问题回答

用 户园地Q & A 30 鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相 互作用,使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析 即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体 纯化提供很好的解决方案。然而要得到高质量高纯度的抗 体,需要我们从样品处理,纯化介质的选择以及纯化方法 上悉心考虑,这里我们就这些大家常见的问题来讨论。 1,对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品, 有哪些样品处理的方法? 在纯化前,合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高 纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱,延长使用寿 命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂 蛋白,酚红,小分子污染物等等。 腹水中经常含有高浓度的脂蛋白,这些脂蛋白和脂 类物质会堵塞层析柱,最好能在纯化之前去除。方法一是 在二价离子存在的情况下,硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋 白,沉淀可以通过离心除去;方法二PVP能产生一个pH值 依赖的沉淀效应,PVP在pH=7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球 蛋白。很多时候,可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释 腹水,不仅保证样品的结合pH,还有利于降低黏度。 酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然 并不直接的影响纯化,但是酚红可能结合到某些纯化介质 上,应该尽可能早的被除去,可以使用脱盐柱除去酚红。 对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除,如 硫酸铵沉淀,羊脂酸沉淀的方法。 最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐,把样品换到 合适的缓冲液中(PH和盐浓度),并除去没有用处的小分 子。更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。 2,实验室需要纯化小鼠的IgG1,我是选择ProteinG 还是ProteinA? 首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强 度”表(图1)来获取选择哪种配基的指导,针对小鼠的 IgG1, ProteinA结合相对弱,可以选择ProteinG配基的介 质。但由于Protein G结合力较强,因此有时需要pH低于2.0 才能有效洗脱,容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。 此时可以考虑结合力相对较弱的protein A填料,结合缓冲 液中需要加入0.5~3M 的氯化钠以增加结合能力,目标抗体 在pH4.5左右就可以被温和的洗脱。 若实验室有AKTA系统,那么Hitrap ProteinG HP是高分 辨率方便快捷的首选。 若没有AKTA系统,MabTrap抗体纯化试剂盒可以给你 带来最大的快捷和便利,试剂盒含有一个Hitrap ProteinG HP1ml的预装柱,结合,洗脱和中和的缓冲液,一个具有 接头的注射器、以及经过优化的纯化操作规程。 Ab Spin Trap是预装了100ulProteinGHP填料的离心 柱,和标准的小离心机一起使用,仅用20分钟就可以完成 一次小规模的抗体纯化。 ProteinG HP MultiTrap96孔板适用于高通量的筛选。 3,面对ProteinA如此多的配基形式,它们有何区别 和应用? 蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株 系,它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结 构域,可以特异性的和样品中的抗体分子结合,而使其他 杂蛋白流穿,具有极高的选择性,通常一步亲和层析就可 达到超过95%的纯度。 ProteinA sepharoseCL-4B,是将从金黄色葡萄球菌表 达纯化出蛋白A通过CNBr的方法偶联在sepharose CL-4B的 介质上,可以纯化体液或细胞培养液中的免疫球蛋白。 nproteinA sepharose4FF,nprteinA即为天然 (Native Protein A),表示其在生产过程中没有引入任何动物来源的组分。 rproteinA sepharose4FF,重组的蛋白A (rProtein A), 经基因工程改造后含有一个C末端半胱氨酸,可以单一位 点定向偶联于琼脂糖骨架上,有效降低空间位阻,增加了 与IgG 的结合能力。同时配基在发酵和纯化过程中没有引 用人源的IgG,避免了人源IgG的污染风险。 rmpProteinA,多位点附着的技术,保证更低的配体 的脱落。一步高度纯化单抗和多抗。 2005年我们推出了新一代的MabSelect ,是第一个使 用高流速琼脂糖凝胶 ( High ?ow Agarose) 作为骨架的新型 蛋白A层析介质,专为大规模抗体纯化而设计。相比传统 抗体纯化常见问题回答

抗体纯化大全教学资料

抗体纯化大全

抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵(NH4)SO4 ·饱和硫酸铵溶液(SAS) ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液(SAS) 将767g(NH4)2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1 mol/L, 25°C); 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1;

二、沉淀 1、样品(如腹水)20 000′g 离心30 min,除去细胞碎片; 2、保留上清液并测量体积; 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,终浓度为1:1(v/v); 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°C),使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min(4°C)。弃上清保留沉淀; 2、将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时(4°C),每隔3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨; 3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v); 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜(4°C); 3、3000′g 离心30 min(4°C),保留上清液; 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨; 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效的; 二、为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表1); 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献

抗体的纯化:盐析法

抗体的纯化:盐析法 发布时间:2009-02-18 新闻来源: 精制抗体的方法很多。一般采用综合技术,避免蛋白变性。如分离IgG时,多结合使用盐析法与离子交换法,以求纯化。提取IgM的方法也很多,如应用凝胶过滤与制备电泳法,或离子交换与凝胶过滤等。 一、原理 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度,以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液,中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质,于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时,中性盐加入蛋白质溶液后,由于离子强度发生改变,蛋白质表面电荷大量被中和,更加导致蛋白溶解度降低,使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 1、试剂 (1)正常人混合血清;灭菌生理盐水。 (2)饱和硫酸铵溶液的配制 称(NH4)2SO4(AR)400~425克,以50~80℃之蒸馏水500ml溶解,搅拌20分钟,趁热过滤。冷却后以浓氨水(15N NH4OH)调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵,瓶底应有结晶析出。 (3)萘氏试剂配制 称HgI 11.5克,KI8克,加蒸馏水至50ml,搅拌溶解后,再加入20%NaOH 50ml。 (4)0.02M,PH7.4磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制: 贮存液 A液:0.2M Na2HPO4:Na2HPO4·12H2O 71.64克,加蒸馏水至1000ml; B液:0.2M NaH2P4:NaH2P4·2H2O 3.12克,加蒸馏水至1000ml; 应用液:取A液81ml加B液19ml混合,再以生理盐水作10倍稀释即成。 (5)0.1M,PH7.4磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer P配制 将上述A液取81ml与B液19ml混合,再以蒸馏水对倍稀释即成。 (6)20%磺基水杨酸。

抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化的方法有哪些? 抗体制备出来之后,需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗,既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料就是腹水与细胞培养上清,而通常经过免疫制备 : 抗体非还原型PAGE/kDa 还原型PAGE/kDa IgG 150 50,25 IgM 900 65,25 IgM单体180 65,25 硫酸铵沉淀法: 基本原理:高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜,降低球蛋白的溶解性,就是分离免疫球蛋白的常用方法,而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别,一般用来分离抗体的硫酸铵饱与度在33~50%。 适用于:鼠抗所有亚类、其她种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作: 1、过滤、离心腹水或者培养上清得上清; 2、加入饱与硫酸铵至终浓度45%,静置沉淀蛋白; 3、沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解,用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐; 4、过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱,PBS或硼酸盐(含0、02%叠氮钠)缓冲液洗脱; 5、电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度; 6、抗体保存浓度在0、1-30 mg/mL适宜,-20 ℃保存不超过一个月,避免反复冻融。 亲与层析法 基本原理:基因工程改造的protein A与protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段,将protein A与protein G结合到柱料上,通过亲与层析的方式,可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍:protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁,分子量42 kDa,由spa基因编码,具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域,每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中,总共有两次筛选,第一次筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法:细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”),它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。因此,在HAT培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT)细胞,因此自身没有“S途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HA T培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法:在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞),再由这些单细胞克隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此,单克隆抗体制备过程中,两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理: B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程: 1)免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法。 2)骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性(恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活)。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3)细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。 4)阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便,RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5)克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多,而最常用的是有限稀释法。 (1)显微操作法:在显微镜下取单细胞,然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂,效率低,故不常用。 (2)有限稀释法:将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后,按每孔1个细胞接种在培养皿中,细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化,所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2~3次的再克隆才成。应该注意的是,每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

硫酸铵纯化抗体

1.兔抗人IgG抗体的初步纯化 ( 硫酸铵沉淀法) 一、基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯 化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。 盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 二、试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫 酸铵(NH4)2SO4 3. 饱和硫酸铵溶液4. 蒸馏水 5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 ) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器 三,操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。 (一)配制饱和硫酸铵溶液 1.将 767g (NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到 1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液(SAS)(4.1 mol/L, 25 ° C ). (二)沉淀 1.样品(如腹水)20 000 ′ g 离心 30 min ,除去细胞碎片; 2.保留上清液并测量体积; 3.边搅拌边慢慢加入等体积的

SAS 到上清液中,终浓度为 1 : 1 。4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜(4 ° C ),使蛋白质充分沉淀。 (三)透析 1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心 30 min (4 ° C )。弃上清保留沉淀; 2.将沉淀溶于少量( 10-20ml ) PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 四,应用提示 (一)先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1. 边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v) ; 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或过夜 ( 4 ° C );3.3000 ′ g 离心 30 min ( 4 ° C ),保 留上清液;上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ,再次离心得到 沉淀。将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨; 4.上清 液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ,再次离心得到沉淀。将沉淀 溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨; 5.杂蛋白与欲纯化蛋 白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是 非常有效 (二)为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析;硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。 纯化产物的鉴定: (1)效价测定 : 采用间接ELISA法 (3 mg / L抗原包被 , 1∶ 1

抗体纯化大全

抗体的纯化? 第一节硫酸铵沉淀法? 基本原理? 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。? 试剂及仪器 · 组织培养上清液、血清样品或腹水等 · 硫酸铵(NH4)SO4? · 饱和硫酸铵溶液(SAS) · 蒸馏水 · PBS(含L叠氮钠) (见附录一) · 透析袋 · 超速离心机 · pH计 · 磁力搅拌器? 实验步骤? 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。? 一、配制饱和硫酸铵溶液(SAS) 将767g(NH4)2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(mol/L, 25°C); 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1;?

二、沉淀 1、样品(如腹水)20 000′g 离心30 min,除去细胞碎片; 2、保留上清液并测量体积; 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,终浓度为1:1(v/v); 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°C),使蛋白质充分沉淀。? 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min(4°C)。弃上清保留沉淀; 2、将沉淀溶于少量(10-20ml)L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对L 叠氮钠透析24-48小时(4°C),每隔3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨; 3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。? 应用提示? 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为:1 (v/v); 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜(4°C); 3、3000′g 离心30 min(4°C),保留上清液; 4、上清液再加SAS到:1 (v/v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨; 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效的; 二、为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表1); 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。? 参考文献? 1、 Burd, ., Raymond, ., Ratz, C. A and Dunn, (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma 12,

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