实验报告
课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证
实验项目名称：
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
一、实验目的和要求
掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法
二、实验内容和原理
以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下：
1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙
酮提取。
2.皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
3.取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。
4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
透射光下呈绿色，反射光下呈红色。
5.光谱分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和
663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
三、主要仪器设备
1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机
2.研具、各种容（量）器、酒精灯等
四、操作方法与实验步骤
1.定性分析
a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆
取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。
b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。加KOH数片剧烈摇均，加石油醚
1ml和H
O 1ml分层后观察。
2
c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。观察颜色变化。
2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离
心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）
c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收
峰
3. 叶绿素定量分析：
鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。
五、实验数据记录和处理
1、定性分析：
观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。
皂化反应(3ml) ：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
图一在411nm 以及432nm
波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波
图表 4
图表 1
图表 3 图表 2
长范围内，根据类胡萝卜素吸收蓝紫光的特性，可以推测图二是类胡萝卜素的吸收光谱。
图二在424nm 左右及644nm 左右波长处吸收光谱出现峰值，两者分别位于蓝紫光和红光的波长范围内，根据叶绿素吸收蓝紫光和红光的特性，可以推测图一是叶绿素的吸收光谱。
3、叶绿素定量分析： 将数值代入式子，计算得：
Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645=12.7*0.206-2.69*0.087=2.38 mg/L Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663=22.9*0.085-4.68*0.206=0.982 mg/L CT (mg/L) = Ca+ Cb =3.36 mg/L
Chla 含量(mg/g.FW)= （Ca(mg/L)/1000）*2/ 0.1 *5/ 0.2=1.19 mg/g.FW Chlb 含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000）*2/ 0.1 *5/ 0.2=0.491 mg/g.FW Chl 总含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000）*2/ 0.1 *5/ 0.2=1.68 mg/g.FW
六、实验结果与分析
1、定性实验中，各组实验观测是颜色变化基本相同，区别只是颜色的深浅，与研磨时加入的叶片量、研磨的程度等因素有关。
2、从定量实验所得数据的计算结果来看，实验所用的叶片，叶绿素a 的含量大约是叶绿素b 的三倍左右。根据观察比较其他小组的数据，“三倍”大致相同。
3、邻组所得实验数据与我们的数据有一定差距，分析可能是因为研磨的充分程度不同和所取叶片位置不同，导致叶绿素含量有所区别。
波长/nm
645 652 663 OD 第一组 0.087 0.116 0.205 第二组 0.081 0.115 0.206 第三组 0.088 0.121 0.207 平均
0.085
0.117
0.206
七、讨论、心得
1、为什么叶绿素吸收红光和兰紫光？
叶绿素有基态（G），第一单线激发态（E1）和第二单线激发态（E2）及第三线态（E3），光子吸收必须遵守普朗克定律。被吸收光子能量必须等于激发态和基态的能量差。蓝紫光能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到E2，而红光能量小，只能使其跃迁到E1，故叶绿素只能吸收蓝紫光和红光。
2、为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱？
因为由于叶绿素皂化反应后的叶绿素盐并不影响叶绿素分子的骨架结构，叶绿素对光的吸收规律与叶绿素盐对光的吸收规律几乎是相同的，而且皂化反应可以从叶绿体色素中只筛选出叶绿素，排除了其他色素的干扰，所以可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱。
3、如要区分叶绿素a和b的吸收光谱，可用什么方法。
原理：
叶绿素a在645nm和663nm 处均有吸收，在645nm处吸光系数较小，，在663nm 处较大；叶绿素b 在645nm和663nm 处亦都有吸收，但在645nm 处吸光系数较大，在663nm 处较小 7
由此可知：叶绿素a的吸收峰值出现在663nm 处，该吸收曲线延伸到645nm处，在此波长处的吸收系数不如在663 nm 处大。
所以观察叶绿素a和b的吸收光谱，在645nm左右出现峰值的为叶绿素b，在663nm左右出现峰值的为叶绿素a。
附图：
实验九叶绿体色素的提取分离与理化性质鉴定 一、实验目的 1、学会叶绿体色素提取和分离的方法。 2、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。 二、实验原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。 提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。 叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 三、实验器材 新鲜的植物叶片。 研钵；漏斗；100ml三角瓶；玻璃棒；剪刀；滴管；培养皿；定性滤纸条（5cm×1.5cm）。 毛细管；试管；试管架；石棉网；烧杯（100ml）；酒精灯；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支。 四、实验试剂 1、95%乙醇；石英砂；碳酸钙粉 2、推动剂：按石油醚：丙酮：苯（10：2：1）比例配制（体积比） 3、醋酸铜粉末；5%的稀盐酸 4、甲醇、KOH 五、实验步骤 1、叶绿体色素的提取 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%
叶绿体色素实验报告 ●实验名称 叶绿体色素的提取分离和理化性质测定 ●实验原理 叶绿体是光合作用的细胞器。叶绿体中叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素可以溶解于乙醇等有机溶剂提取。 薄纸层析色谱法是将吸附剂均匀涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把带分离的样品溶液点在薄层板下端，然后用一定量溶剂作流动相，将薄层板下端浸入展开剂中。由于吸附剂对不同物质的吸附能力不同，吸附力强的物质相对移得慢些，吸附力弱的物质相对移得快些，从而使各组分有不同的移动速度而分开。 叶绿素是一种由叶绿酸和叶绿酯形成的复杂酯，故可以与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿酯及叶绿酸盐，盐可溶于水，继而可以分离叶绿素和类胡萝卜素。叶绿素吸收光子转变为激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当变回基态时可发出红光量子，产生荧光。叶绿体不稳定，容易受强光破坏，特别是当叶绿体与蛋白质分离后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中Mg2+可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，之后遇铜生成铜代叶绿素。 ●实验材料和工具 1.新鲜的菠菜叶 2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7：5：1，体积比） 3.天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸 4.刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管 5.苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸—醋酸铜溶液，氢氧化钾—甲醇溶液 ●实验步骤
（一）色素提取液的制备 1.取新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中 2.研钵中加入少量CaCO3，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml 体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液，避免阳光直射 （二）叶绿色素的分离 1.取硅胶板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行与硅胶板短边，据下边缘1cm处划线，风干后再划3~4次 2.干净的层析缸中加适量展开剂，高度约0.5cm，将硅胶板有色素一端放入，使其下端浸入展开剂。迅速盖好 当各种色素得到较好分离时，展开剂前沿接近硅胶板上边缘时，取出并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带位置 （三）理化性质的测定 ①光对叶绿色素的破坏 取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用体积分数95%的乙醇稀释1倍。其中1支放在直射阳光下，另外1支放到暗处或用锡箔纸包严，40分钟后对比观察颜色变化 ②皂化作用 1.取1支10ml刻度试管加入3ml浓的叶绿素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾—甲醇溶液，充分摇匀 2.片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水，轻轻混匀，然后置于试管架上静置分层。 ③H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg+的取代作用 1.取两支试管，第一支加叶绿色素提取液5ml作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液5ml后，再加质量分数为5%的HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60℃水浴加热。 2.取新鲜植物叶两片，放入试管中，加醋酸—醋酸铜溶液，使之没过叶片，60℃水浴，观察颜色 ④荧光现象的观察 取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光照射下，比较溶液透射光和反射光颜色有何不同 实验结果 提取与分离 计算方法Rf=斑点中心到原点的距离 溶液前沿至原点的距离R f（叶绿素a）=60.5/84.5=0.716 R f（叶绿素b）=56.0/84.5=0.663 R f（叶黄素）=53.5/84.5=0.633
实验报告 课程名称： 植物生理学实验 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验类型： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、 实验目的和要求： 1． 掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定。 2． 掌握定量分析的原理和方法。 二、 实验内容和原理： 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下： 1．叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 2．皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 3．取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+装 订
取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 4．叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5．定量分析。叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 三、实验材料与试剂 材料：青菜叶 试剂：KOH固体、醋酸铜粉末、醋酸 四、主要仪器设备： 1．天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机 2．研具、PE管、酒精灯等 五、操作方法和实验步骤（必填） 1．定性分析： 荧光现象：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成匀浆，过滤入三角瓶，观察荧光现象 O 1ml，分层后观察皂化反应：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H 2 取代反应：加醋酸约1ml，观察颜色，取1/2加醋酸铜粉，加热变亮绿色2．叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD ），在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素的吸收峰 反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)，（稀释663nm OD ），分别测定叶绿素的吸收峰
实验报告 课程名称： 植物生理学实验（乙） 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验类型： 一、 实验目的和要求 了解改良半叶法、氧电极法测定光合作用和呼吸作用的基本原理，掌握红外线CO2分析 仪法测定光合作用和呼吸作用，蒸腾速率和气孔导度测定的基本原理; 掌握用LI-6400测定光合作用、呼吸作用、蒸腾速率和气孔导度的方法，测定光-光合响应曲线的方法. 二、 实验基本原理 （一）改良半叶法测定光合作用 （二）熟悉仪器基本结构，及按装调试。 以榕树和蚕豆等植物为材料，用LI-6400portable photosynthesis system 测定它们的光合作用、呼吸作用、蒸腾速率和气孔导度及光-光合响应曲线，通过比较分析其属于什么光合类型植物。 Principles for measuring photosynthesis and respiration 6CO 2+6H 2O 6(CH 2O)+6O 2 一）测干重——改良半叶法：同面积光暗叶片重量差。使用三氯乙酸（TCA ）涂抹在叶片叶柄处，阻断叶片在进行光合作用的时候向外输出营养物质。测定的为总光合作用量。 二）测放O2 ——氧电极法。气相和液相。氧电极的原理：氧电极是由嵌在有机玻璃上的铂和银所构成，以0.5mol/L KCl 为电解质，电极头外覆盖一层聚乙烯或聚四氟乙烯薄膜，其厚度在15～25μm 之间，用“〇”形套膜环固定，使电极与被测溶液隔离，而溶解在溶液中的氧仍能透过薄膜，进入电极内。较薄的膜易透过氧，因而对氧浓度变化的响应时间短. 三）红外线CO2分析仪法：CO2吸收4260nm 红外线,有封闭式：单位时间内CO2下降量和开放式：参比室和叶室CO2差值 本实验将采用开放式测得。 三、实验材料与试剂 1. 实验试剂：三氯乙酸（TCA ） 2. 实验材料：树叶、菜豆 装 订 线
实验报告 课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证 实验项目名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 一、实验目的和要求 掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下： 1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙 酮提取。 2.皂化反应。 叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 3.取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。 4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 透射光下呈绿色，反射光下呈红色。 5.光谱分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和 663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 三、主要仪器设备 1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机 2.研具、各种容（量）器、酒精灯等 四、操作方法与实验步骤 1.定性分析 a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆 取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。 b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。加KOH数片剧烈摇均，加石油醚 1ml和H O 1ml分层后观察。 2 c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。观察颜色变化。
2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离 心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1） c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收 峰 3. 叶绿素定量分析： 鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。 五、实验数据记录和处理 1、定性分析： 观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。 皂化反应(3ml) ：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。 2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 图一在411nm 以及432nm 波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波 图表 4 图表 1 图表 3 图表 2
一、实验原理 叶绿素是植物光合作用色素，主要有chla chlb ，不溶于水,可溶于酒精.丙酮和石油醚。叶绿素是叶绿酸的酯，叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶醇酯化，能发生皂化反应。叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇( 植醇，phytol) 的“尾巴”。卟啉环中的镁原子可被H＋、Cu2 ＋、Zn2 ＋所置换。用酸处理叶片，H＋易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。 叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色，这种现象称为叶绿素荧光现象。原因是当叶绿素分子吸收光量子后，就由最稳定的、能量的最低状态－基态（ground state）上升到不稳定的高能状态－激发态（excited state）。叶绿素荧光指被激发的叶绿素分子从第一单线态回到基态所发射的光。寿命很短。处于第一三线态的叶绿素返回到基态所发射的光称为叶绿素磷光。 二、实验目的 1．学会提取和分离叶绿体中色素的方法。2．观察叶绿体中的各种色素。3．掌握叶绿素的物理和化学性质 三、实验用品 1．材料与试剂：菠菜、脱脂棉等、固体碳酸钠或碳酸钙、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和NaCL水溶液、醋酸铜结晶、KOH-甲醇溶液等。2．仪器设备：载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、解剖刀、玻璃漏斗、分液漏斗中、研钵、试管、具塞锥形瓶等等。 四、方法和步骤 1、叶绿体色素的提取 ? 将新鲜菠菜叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许固体碳酸钠或碳酸钙和10 mL丙酮，迅速研磨成匀浆，再加15 mL丙酮充分研磨提取叶绿素。 ? 在玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤到已装有15 mL石油醚的分液漏斗中，再用少量丙酮冲洗叶片残渣和研钵，合并滤液。 ? 沿分液漏斗的壁小心加入30mL蒸馏水，轻轻转动加入4 -8mL饱和NaCl水溶液，静止几分钟待分层清楚后，弃去下面的丙酮一水层。再加入30mL蒸馏水，轻轻晃动分液漏斗，以洗去石油醚中残留的丙酮，弃去水层。共洗两次。将色素的石油醚提取液放入具塞锥形瓶中，置暗处或用黑纸包好备用。 2、叶绿体色素的观察 取一张色层分析纸或定性滤纸代用，剪成圆形，直径应略大于培养皿的直径；将圆形滤纸平放在培养皿上，用滴管吸取叶绿素提取液，滴在滤纸的中心位置，稍干后，再重复操作几次；然后取另一滴管吸取石油醚，慢慢地推动叶绿素提取液，不久即可看到分离的各种色素的同心圆环,由内到外依次为：叶绿素a为蓝绿色、叶绿素b 为黄绿色、叶黄素呈鲜黄色、胡萝卜素为橙黄色。 3、叶绿素含量的测定 取1 ml叶绿素提取原液移入至10 ml容量瓶，石油醚定容(稀释液)，以石油醚作为空白对照，测OD652 ?叶绿素浓度: C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml ) ?叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重 4、叶绿素理化性质的观察 ? 光对叶绿素的破坏作用，在2支具塞试管中各放入2mL上述色素石油醚提取液，盖好塞子。一支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经2—3h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变化，或在分光光度计上测定663nm 处吸光度值后进行比较。 ? 叶绿素的荧光，取2mL上述色素的石油醚提取液放入一支小试管中，可在窗口与入射光相垂直的方向观察叶绿素暗红色的荧光。 ? 叶绿素的皂化反应，取 1 -2mL上述色素的石油醚提取液一试管中，逐步加入2 -5mL新配制的30% 3KOH-甲醇溶液，用力振动试管后静止分层，观察上下层溶液的变化。65℃水浴5 min；取出冷却后，先加3 ml苯，后加3 ml 水（沿壁慢慢加入），轻轻摇匀，静置观察其分层现象。 ? 去镁叶绿素的形成，取 1 -2mL上述石油醚提取液放入试管中，小心加入3mL 6mol/L HCL，摇动后静止分层观察溶液颜色变化。 ? 铜的取代作用，取 1 -2mL色素的丙酮提取液于试管中，加入3mL6mol/L HCL，摇动试管，再逐步加入醋酸铜结晶（把试管放进65℃水浴中微微加热），可观察到溶液的颜色由褐色变成鲜亮绿色，说明铜取代了氢占据在镁在叶绿素中的位置。
实验七叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定 一、目的 1、学习应用提取分离叶绿体色素的实验方法。 2、验证叶绿素的理化性质。 3、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。 二、原理 1、叶绿体色素：植物叶绿体色素主要有三类：1）叶绿素2）类胡萝卜素3）藻胆素。高等植物叶绿体中含有前两类，藻胆素仅存在于藻类植物中。 高等植物体内叶绿素（chlorophyll两种）主要有两种：叶绿素a、b（简写为chla、chlb，其结构式见图7-3），chla通常呈蓝绿色，而chlb呈黄绿色，chlb是chla局部氧化的衍生物。chla是chlb的三倍，二十世纪30年代，知道了叶绿素的分子结构，50年代末期，人工合成了叶绿素a，其它色素也几乎在同时发现。 叶绿体中的类胡萝卜素主要包括胡萝卜素（carotene）和叶黄素（lutein）两种，前者呈橙黄色，后者呈黄色。叶黄素是胡萝卜素的二倍。一般植物叶绿素是类胡萝卜素的三到四倍；胡萝卜素：C40H56 （有α、β、γ三种同分异构体） 叶黄素：C40H54（OH）2 (同分异构体很多)。 2、理化性质：这二大类四种色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。通常用80%的丙酮或丙酮：乙醇：水为4.5：4.5：1的混合液来提取叶绿素。 按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，在碱的作用下，可使其酯键发生皂化作用，生成叶绿酸的盐，能溶于水，但由于它保留有Mg核的结构，仍保持原来的绿色。而类胡萝卜素中，胡萝卜素是不饱和的碳氢化合物，β—胡萝卜素水解可生成2分子维生素A，叶黄素是由胡萝卜素衍生的二元醇，不能与碱发生皂化反应，根据这一点，可以将叶绿素和类胡萝卜素分开。此外，叶绿素还可以在酸的作用下，其中的Mg被H所代替形成褐色的去Mg叶绿素：去Mg叶绿素能与其他金属盐中的铜、锌、铁盐等代H，又重新呈现绿色，比原来的绿色更稳定。根据这一原理可用醋酸铜处理来保存绿色标本。 3、功能： 1．叶绿体色素的功能 叶绿素和类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，与蛋白质结合在一起，组成色素蛋白复合体，根据功能来区分，叶绿体色素可分为二类： （1）作用中心色素：叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾部”，呈蝌蚪型，大卟啉环由四个小吡咯环以四个含有双键的甲烯基（-CH=）连接而成。镁原子居于卟啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而其“头部”具有极性，是亲水的，可以与膜上的蛋白质结合；而其“尾部”是叶绿酸的双羧基被甲醇和叶醇所酯化后形成的脂肪链，具疏水亲脂性，可以与膜上的双卵磷脂层结合，因此，这决定了叶绿素分子在类囊体膜上是有规则的定向排列。极少数具特殊状态的chla分子，其卟啉环上的共轭双键易被光激发而使电子与电荷分离，引起光能转化为电能的重要反应，因此这些chla分子是光合作用的重要色素，称“作用中心色素”； （2）天线色素（聚光色素）：没有光化学活性，只有收集光能的作用，包括大部分chla 和全部chlb、胡萝卜素、叶黄素。这些色素排列在一起，象漏斗一样，把光传递集中到作用中心色素，引起光化学反应。类胡萝卜素还是一种保护性色素，在光过强时，可耗散过剩激发能，消除活性氧自由基，防止光合器官被氧化损伤。 3、形成条件： 叶绿素的形成
装订 线 实验报告 课程名称：植物生理学实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质的鉴定 一、实验目的和要求 掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。 二、实验内容和原理： 以菠菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下： 1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 2 、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 3、取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ 。 4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析 三、主要仪器设备： 1、天平（万分之一）、可扫描分光光度计（）、离心机 2、研具、各种容（量）器、酒精灯等 四、操作法与实验步骤：
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 3．叶绿素定量分析： 鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份0.2ml 加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上 清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663=0.702mg/L CT (mg/L) = Ca+ Cb =2.661mg/L 或=OD652*1000/34.5=2.667mg/L 两者基本相等
实验四、叶绿素的提取、分离及化学性质鉴定一．实验目的： 掌握植物中叶绿体色素的成分分离和定性、定量分析的原理和方法。 二．实验原理： 1、溶解性。 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取 2、吸附性。滤纸对Chlb、Chla、叶黄素、胡萝卜素的吸附能力不同(？)，当用石油醚作 推动剂时，其在滤纸上的移动速度不同，可相互分离。 当用适当溶剂推动时，混合物中各成分在两相（固定相和流动相）间具有不同分配系数，所以移动速度不同，一定时间后可将各种色素分离 三．实验材料: 新鲜植物叶片 器具： 研钵一个，漏斗一个，刻度试管两支，剪刀一把，长滴管一个，培养皿(直径9cm)一个，圆形滤纸（11cm和7cm)各一张，滤纸条一张 试剂：95%乙醇，石油醚 四．实验步骤: 1.色素提取（乙醇粗提液） a.取新鲜叶片洗净擦干，去中脉称1g左右剪碎于研钵 b.研钵中加3-5ml 95%乙醇研磨成匀浆过滤于刻度试管残渣用少许乙醇冲洗一并 过滤定容至10ml 注：研磨用石英砂或SiO2以利于充分研磨，加入CaCO3以保护叶绿素。 2.荧光观察 将乙醇提取液试管放于太阳光下观察反射光和透射光下的颜色 现象：透射光下呈绿色，反射光下呈红色为叶绿素荧光 3.色素萃取（石油醚提取液） 取乙醇提取液5ml与另一支试管加2ml石油醚摇荡静止片刻上层深绿色为石油醚提取液 注：用丙酮提取会更好些，各色素在石油醚中溶解度不同 4.色素分离 a.将（11cm)圆滤纸中间剪一小圆孔取滤纸条捻成紧实芯一端插入圆滤纸中心（孔缘 与纸芯紧贴且露出少许，最好相平）用长滴管吸少许石油醚提取液滴于纸芯上端待风干后再滴加几次。 b.将盛有石油醚的内盖（不要过满）放于培养皿中央将插上纸芯的滤纸放在培养 皿上纸芯下端浸入石油醚迅速盖好培养皿。 c.推动剂前缘接近滤纸边缘时取出滤纸，风干可见分离色带，用铅笔标出各种色素位置 和名称
植物生理学实验 叶绿体色素的提取分离及其理化性质
摘要：本实验以新鲜的提取菠菜叶片为实验材料，对叶片中叶绿体中的色素进行了提取、分离和理化性质的鉴定。实验采用纸层析法进行分离，并从叶绿体色素的荧光现象、皂化作用、Mg2+的取代以及色素光谱对其理化性质进行了鉴定。纸层析法分离色素的实验在滤纸上分离出了5条色素带；荧光实验中在透射光下叶绿素提取液为蓝绿色，反射光下为紫红色；造化反应中出现了明显的分层现象；Mg2+的取代实验中颜色由蓝绿变为棕褐色，再变为墨绿色，由上述实验可以鉴定叶绿体色素的理化性质。 一、实验原理及实验目的 实验原理： 1、提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 2、分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。 3、理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。 分子吸收光能后，从基态转变到激发态。叶绿素分子有两种单线激发态，对应两个主要的光吸收区。 分子在激发态停留的时间不超过数纳秒（10-9秒） 由激发态回到基态的过程称为衰变（Decay)。 叶绿素a：C55H72O5N4Mg，MW=893.4891 叶绿素b：C55H70O6N4Mg，MW=907.4727 胡萝卜素：C40H56，MW= 536.8726 叶黄素：C40H56O2，MW=568.8714 实验目的： 以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质. 二、实验材料和方法 1、实验材料：菠菜 2、实验用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试 管等 3、实验试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3)，20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、 醋酸铜 三、实验步骤 1、叶绿体色素的提取 （1）取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵; （2）加入少许石英砂和CaCO3,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙酮15ml;
叶绿体色素的提取分离、理化性质实验报告 第一部分提取与分离 一实验目的 学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法 二实验原理 叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿体a(C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H72O6N4Mg)、胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离与鉴别。 薄层色谱分析法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层做固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上的逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱附、再吸附、再脱附……的过程。由于吸附剂的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。 三实验材料与试剂 1 新鲜的菠菜叶片 2 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂(石油醚:丙酮:苯=7:5:1，体积比) 3 天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸 四实验步骤 (一)色素提取液的制备 1 取新鲜叶片4至5片(2g左右)，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中。 2 研钵中加入少量碳酸钙粉末，加2至3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加10至15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存。 (二)叶绿体色素的分离 1 取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘约1cm处用毛细管划线，风干后再划第二次，重复操作3至4次。 2 在干洁的层析缸中加入适量的展开剂，高度约0.5cm，将硅胶预制板带有色素的一端放下，使其浸入展开剂中(但不要使待测样品浸入展开剂中)。迅速盖好层析缸盖。此时，展开剂借毛细管作用沿硅胶预制板向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可以看到各种色素的色带。 3 当各种色素的得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端近边缘处时，取出硅胶预制板，并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。
光合和呼吸代谢 【模块实验目的】 光合作用与呼吸作用是植物代谢的两大核心内容。前者是物质合成与能量储存的过程，属于同化作用，为包括人类在内的几乎所有生物的生存提供了物质来源和能量来源，对人类和整个生物界都具有非常重要的意义；后者是物质分解与能量释放过程，属于异化作用，为生命活动提供能量。光呼吸是在光下绿色细胞发生吸氧与放出二氧化碳的过程，虽然在气体交换方面它与光合作用正好处于相反方向，但无论从发生部位、对光的依赖及在生化上的联系来看，都同光合作用具有很密切的关系。本模块实验通过测定玉米种子萌发至两周内的呼吸速率。线粒体H+-ATP酶活性、光合速率、叶片中叶绿素含量及乙醇酸氧化酶活性，了解研究植物的光合和呼吸代谢的基本方法。 【流程图】 4-1叶绿体色素的提取和分离 ［实验目的］ 了解和掌握叶绿体色素提取、分离的原理和方法。
[ 实验原理] 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。他们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可分开各种色素。 [ 器材与试剂] 1. 实验仪器与用具 研钵、漏斗、剪刀、滴管、圆形滤纸（直径11cm）、层析缸 2. 实验试剂丙酮、甲醇、石英砂、碳酸钙、无水硫酸钠、四氯化碳、 乙醚 3. 实验材料 玉米幼苗叶片 [ 实验步骤] 1. 叶绿体色素的提取：取新鲜叶片4g,洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中，研钵中加2~3ml 95%乙醇，研磨至匀浆，再加10~15ml 95%乙醇，提取3~5min，过滤，残渣用5ml 95%乙醇冲洗，合并滤液，定容至25ml。 2. 将展层用的圆形滤纸剪成2cm x20cm的纸条，其中一端剪去两侧，中间留一窄条，长约1.5cm,宽约0.54cm。 3. 用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液，点于窄条上方，一次点的溶液不可过多，风干后，重复操作。 4. 在层析缸中加入四氯化碳3~5ml以及少许无水硫酸钠，将滤纸条插入层析缸内，使其浸入溶剂中，注意色素点样点要稍高于液面，待展层液达滤纸上沿1.5~2cm时，停止展层，用铅笔标出溶液前沿，风干。 [ 实验作业] 用铅笔标出滤纸上分离的各种色素位置，写出名称，分析原因。 4-2 叶绿体色素理化性质的鉴定 [ 实验目的] 了解和掌握叶绿体色素提取、分离的原理和方法。 [ 实验原理] 叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应形成绿色的可溶性叶绿素盐，可与有
叶绿体色素的提取、分离及含量测定 实验目的 叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。 实验原理 从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。 分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。纸层析是其中最简单的一种。当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。 强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。而离体的叶绿素提取液中不含有还原酶，光产生的强氧化物质会破坏叶绿素。 叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。 A663=82.04Ca+9.27Cb（1） A645=16.75Ca+45.60Cb（2）
生物学导论实验报告 叶绿体色素的提取分离和理化性质 一、提取与分离 1、实验目的 学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。 2、实验原理 提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。 分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。 3、实验材料与试剂 （1）新鲜的菠菜叶； （2）体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末、展开剂 （3）钵体、漏斗、三角瓶、剪刀、点样本、毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸。 4、实验步骤 （1）色素提取液的制备 取叶4~5片新鲜叶片，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入钵体中。 加入少量碳酸钙，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加入 10ml乙醇，上清液过滤，残渣再用10ml乙醇冲洗过滤。 （2）叶绿体色素的分离 取硅胶预制板一个，用点样毛细管取上述提取液，平行于硅胶板的短边， 距下边缘1cm处用毛细管划线，风干，重复操作3~4次； 在干燥的层析缸中加入适量展开剂，高度0.5cm，将硅胶预制板带有色素一 端放入，使其下端浸入展开剂中； 当色素较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板的上端边缘时，取出，画线。 Rf=斑点中心到原点距离/溶剂前沿到原点距离 5、实验结果与分析
叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定 生命科学学院09生科基朱文杰实验目的：掌握提取和分离叶绿体色素的方法；掌握测定叶绿体色素含量的方法；熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性；了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性。 实验原理：叶绿体色素是吸收光能的重要物质，包括叶绿素和类胡萝卜。利用不同色素的极性不同可以用色谱分离法将其分离。不同的色素对光的吸收范围不同，因此我们也可以测量不同色素在不同波长光下的吸光值，即可用公式计算出其中各色素的含量。光对叶绿体色素有破坏作用，将叶绿体色素暴露于强光下，可以发现叶绿素被破坏，溶液颜色变化。。叶绿体色素分子吸收光后变为激发态，如能量不被光合作用利用，激发态变回到基态，放出波长较长的红光。叶绿素分子中卟啉环上的Mg处于不稳定的状态，可被H、Cu、Zn离子取代。叶绿素不溶于水，能溶于有机溶剂，且各色素的脂溶性不同，故可利用乙醇或丙酮提取，用不同的有机溶剂萃取或用色谱法进行分离。 实验步骤：分别选取2g左右新鲜菠菜和0.2g左右玉米幼株的叶片剪碎放入研钵中。在研钵中加入5ml丙酮以及少量的石英砂和氯化钙，充分研磨至无纤维装组织。过滤并转移动至量筒中，再用3ml丙酮冲洗研钵，最后加入丙酮定容至10ml 作为备用提取液。 实验一：吸光值测定：取0.1 ml色素提取液，用80％丙酮稀释到3 ml ，测定663、645 nm 处的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b的含量。Chla（μg /ml）=12.7 OD663－2.69OD645，Chlb（μg /ml）=22.9 OD645－4.68 OD663。 实验二：光破坏：取少量色素提取液并稀释3到5倍，分为2份，一份至于暗处，一份正对观察透射光，反身观察反射光，最后放在培养箱中的强光下放置2H。实验三：铜带反应：取少量色素提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢用水浴加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。 实验四：皂化反应 取叶绿体色素提取液2 mL于大试管中，加入4mL乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3mL蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻。待溶液分为两层后用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30％KOH－甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约3-5 mL，摇匀静置。 实验五：叶绿体色素分离： 圆盘分离：取圆形定性滤纸一张，用毛细管吸取叶绿体色素提取滴在圆形滤纸中心点样20次左右，在圆形滤纸中心戳一圆形小孔，将纸捻成灯芯状，一端插入圆形滤纸的小孔中，再往培养皿中加入适量的四氯化碳，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。 条带分离：取条形滤纸一张，在离一端1cm左右处用铅笔轻轻划线。再用毛细管吸取色素提取在细线处划线。将纸条的另一端用大头钉钉在玻璃管橡皮塞上。长度为盖上橡皮塞滤纸下部刚好触底为宜。最后向管中加入四氯化碳盖上塞子，注意不要使液面高于铅笔划线处。 实验五：不同色素吸光值测定：将条形滤纸上的条带剪下来放入不同小试管中，均用80%丙酮洗脱后，最为分光光度计观测的预备液。 实验结果：
植物叶片中色素的提取、分离和含量测定 班级姓名学号 实验一：植物叶片中色素的提取、分离 实验原理 （1）提取色素的原理：叶绿体中的色素属于色素，不溶于水，易溶于溶剂，故可用等有机溶剂来提取。绝大多数色素见光易分解，需要避光保存。 （2）法分离色素的原理：不同色素在层析液中的不同。溶解度大的色素，在滤纸上随层析液的扩散速度快；溶解度小的色素，在滤纸上随层析液的扩散速度慢。 实验步骤 1、称量植物材料：用天平秤取2.5g植物材料（两人一组,每组一种植物材料）。剪刀剪碎， 放入研钵中。 2、提取色素：用药匙加入少许二氧化硅和碳酸钙，用移液枪吸取5ml无水乙醇，快速研磨。 加入如下试剂的作用: SiO2：___________;CaCO3_____________________________ 酒精（或丙酮）：____________________________________ 3、画细线：在滤纸条的一端剪去两角。在距离这一端1cm处，折一条横线。用尺子沾取少 量滤液，在滤纸条上沿折横线，压出一条细而直的滤液细线。待滤液干后，再在背面划线。 每种材料，制备两个滤纸条。 4、分离叶绿体中的色素 将滤纸条（有滤液细线的一端朝下），分别轻轻插入到水层析液和石油醚+丙酮的层析液中，盖上盖子。注意：不能让滤液细线触及层析液，防止色素溶解在层析液中，影响扩散结果。 同心圆装置：用纸捻快速吸取滤液,放入同心圆装置中。层析液为石油醚+丙酮的层析液。 5、分析层析结果
（石油醚+丙酮层析液） （蒸馏水层析液） 你的植物材料是 。 请标出滤纸条上不同位置色素的名称、颜色。 实验二：色素的含量测定 实验原理：用混合提取液（丙酮：乙醇：蒸馏水=4.5：4.5：1）浸提法测定。 实验步骤 1、浸提色素。分别称取0.1g 菠菜叶、油菜叶、月季红色叶、月季绿色叶、银杏黄色叶、爬山虎红色叶，加入10ml 提取液，放入37度恒温箱中浸提24小时。 2、读值。分光光度计分别在波长440nm 、645nm 和663nm 处测定并记录光密度值，通过 3.计算。 根据以下公式计算叶绿素浓度：叶绿素a （Ca ，mg·L -1）=12.7×A663–2.69×A645。 叶绿素b （Cb ，mg·L -1）=22.9×A645–4.68×A663 叶绿素a +b （CT ，mg·L -1）=Ca+Cb=8.02×A663+20.21×A645 胡萝卜素（Car ，mg·L -1）=4.7×A440–0.27×Chl （a+b ） 式中：A663、A645、A440分别为663、645、440 nm 波长下的消光值。 根据以下公式计算叶绿素含量： 叶绿素含量（mg·g -1 Fw ）=叶绿素浓度（mg·L -1）×提取液体积（L ）/样品鲜重（g ）。
实验报告 课程名称： 植物生理学实验（乙） 指引教师： 成绩：__________________ 实验名称： 叶绿体色素旳提取、分离、理化性质和叶绿素含量旳测定 实验类型： 一、 实验目旳和规定 理解改良半叶法、氧电极法测定光合伙用和呼吸作用旳基本原理，掌握红外线CO2分析 仪法测定光合伙用和呼吸作用，蒸腾速率和气孔导度测定旳基本原理; 掌握用LI-6400测定光合伙用、呼吸作用、蒸腾速率和气孔导度旳措施，测定光-光合响应曲线旳措施. 二、 实验基本原理 （一）改良半叶法测定光合伙用 （二）熟悉仪器基本构造，及按装调试。 以榕树和蚕豆等植物为材料，用LI-6400portable photosynthesis system 测定它们旳光合伙用、呼吸作用、蒸腾速率和气孔导度及光-光合响应曲线，通过比较分析其属于什么光合类型植物。 Principles for measuring photosynthesis and respiration 6CO 2+6H 2 O 6(CH 2O)+6O 2 一）测干重——改良半叶法：同面积光暗叶片重量差。使用三氯乙酸（TCA ）涂抹在叶片叶柄处，阻断叶片在进行光合伙用旳时候向外输出营养物质。测定旳为总光合伙用量。 二）测放O2 ——氧电极法。气相和液相。氧电极旳原理：氧电极是由嵌在有机玻璃上旳铂和银所构成，以0.5mol/L KCl 为电解质，电极头外覆盖一层聚乙烯或聚四氟乙烯薄膜，其厚度在15～25μm 之间，用“〇”形套膜环固定，使电极与被测溶液隔离，而溶解在溶
液中旳氧仍能透过薄膜，进入电极内。较薄旳膜易透过氧，因而对氧浓度变化旳响应时间短. 三）红外线CO2分析仪法：CO2吸取4260nm红外线,有封闭式：单位时间内CO2下降量和开放式：参比室和叶室CO2差值本实验将采用开放式测得。 三、实验材料与试剂 1.实验试剂：三氯乙酸（TCA） 2.实验材料：树叶、菜豆 四、实验器材与仪器 天平、湿毛巾、烘箱、打孔器、游标卡尺、剪刀、LI-6400 portable photosynthesis system 五、实验操作措施和环节 （一）改良半叶法：光照不少于1.5h，注意测定打孔器内径（计算面积）。放入铝盒中，开盖放进烘箱后，下周实验时测定重量（如回潮，需再烘干）。 (二)CO2红外分析法（LI-6400便携式光合伙用测定系统）测定瞬时光合速率、光响应曲线等。 1.打开叶室夹好叶片，关紧叶室，按１，F5（Match) →F5(IAGR Match)，F1(exit) →开灯，按2,F5（Lamp off）选Quantum flux