第七章 血清学试验
微生物以及其他一些抗原性物质进入机体后，能在机体的血清中产生特异性抗体，。这种抗体与相应的抗原在体外相遇，可以表现出凝聚、沉淀、溶解、补体结合等多种反应，这些反应的试验都是采用免疫血清来进行的，所以称为血清学试验。现将其原理及其应用作简要介绍。
一、 抗原与抗体
（一）抗 原
凡能刺激机体产生特异性抗体，并能与所产生的抗体进行结合发生反应的物质，称为抗原。
1. 抗原的性质
（ 1）抗原一般为大分子胶体，相应分子质量在 10万以上。相对分子质量越大，抗原性越高。由于大分子胶体物质在机体内停留时间较长，因此能刺激机体产生抗体。
（ 2）大多数天然抗原都为蛋白质，如细菌、病毒、细菌外毒素、动物血清等，这些蛋白质物质就是具有抗原性的物质。并非物品有蛋白质物质都具有抗原性，如明胶虽是蛋白质，但不具抗原性。
（ 3）抗原均具有特异性。所谓特异性，即一种抗原所产生的抗体，只能与这种抗原结合发生反应。例如立即杆菌刺激机体所产生的抗体只能与痢疾杆菌发生反应，而不一其他细菌起反应。这种特异性与抗原的化学结构有关。
（ 4）异种物质才具有抗原性，即机体对它本身的物质，一般不产生抗体。异种动物间，种族的亲缘关系越远则抗原性就越强。
2. 抗原的种类
（ 1）完全抗原 即具有抗原性的物质，能刺激机体产生抗体，又能在机体外或机体内与相应的抗体结合发生反应。例如：病毒、细菌、细菌外毒素、蛋白质多糖复合物、动物血清等均为完全抗原。
（ 2）不完全抗原 不能单独刺激机体产生抗体，若与蛋白质结合后，即成为完全抗原。例如多糖体与类脂体即为不完全抗原或称半抗原。不完全抗原可与完全抗原所产生的抗体发生特异性结合。
（二） 抗 体
抗体是由于抗原刺激后，在机体内所产生的免疫球蛋白、这种球蛋白在机体的血清或其他体液中出现，它能与相应的抗原结合，发生各种反应。血清内因受抗原刺激后而产生抗体，这种含有抗体的血清，就叫做免疫血清。
1. 抗体的性质
抗体是球蛋白，它与正常球蛋白的理化性质基本相同，但它能与相应抗原发生特异性反应，这是与正常球蛋白惟一的区别。抗体的分子质量一般较抗原为大，约在 15× 10 ～ 10× 10 之间。同一种抗原刺激不同的动物所产生的抗体，由于不同动物的球蛋白的分子质量不同，因此所产生抗体的分子质量也不相同。
2. 抗体的种类
根据抗体和抗原结合后，是否出现可
见反应，可以分为完全抗体和不完全抗体。
（1） 完全抗体 能够和相应的抗原结合，结合后的反应是可的。
（2） 不完全抗体 能够和相应的抗原结合，结合后的反应是不可
见的。若将不完全抗体先与抗原结合后，这抗原就不能再与其相应的完全抗体结合。
二、抗原抗体反应及其应用
微生物的实验室中，常用已知的病原微生物，以检查病原微生物感染者的血清中有无相应的抗体，或用含有已知抗体的特异免疫血清来鉴定未知的微生物。抗原抗体反应的试验方法很多，现将常用的分述如下。
（一） 凝 聚反 应
将微生物细胞或动物红血球的悬浊液与含有相应特异抗体的血清混合，可以在电解质（ 0.85%NaCL）溶液中发生反应，并出现肉眼可见的凝聚块，这种现象，就叫凝聚反应。参与反应的微生物细胞或血球等，称为凝集原，免疫血清中的特异抗体，称为凝集素。
1. 试验方法
（ 1）玻片法 吸取一滴经生理盐水（ 0.85%NaCL）稀释的免疫血清置于玻片上，另加一小滴细菌悬液（用生理盐水制成的菌液）。使之充分混合，在几分钟内，即可出现凝集现象。同时以生理盐水代替免疫血清作对照。
（ 2）试管法 在一系列的小试管中，加入等量的、不同稀释度的被检血清，最后一管以生理盐水代替血清，作为对照。在各试管中，再滴加等量细菌悬液，使均匀混合，置于水浴（ 52～ 55℃）保温约 4h后，观察结果，而后再置于 4℃冰箱中过夜，再观察结果。以最高稀释度血清管发生凝集者，为免疫血清的凝集效价。凝集效价越高，则说明抗体含量越多。
2. 试验种类
（ 1）直接凝集反应 利用抗原与抗体两者直接结合，使它们产生凝集反应。例如细菌、红血球等与其相应的抗体血清结合后嗣素出现的反应即凝集反应。
（ 2）间接凝集反应 并不是抗原与抗体两者直接发生反应，而是先将抗原物质吸附于一种颗粒状物体表面，然后再与相应的抗体发生凝集反应。例如可溶性抗原和病毒等一些极为微小的抗原物质，先使之吸附于一种颗粒状物体的表面，这些颗粒物体有：人的 O型红血球，绵羊、家兔等顶物的红血球，或某些惰性颗粒如聚苯乙烯乳胶（ 0.6～ 0.7nm）、矽酸铝、活性碳颗粒等。如果血球吸附抗原物质后，这种血球即称为致敏血球与相应的抗体结合后密集棵出现凝集现象。也可以用抗体先使血球致敏，而后再与相应的抗原发生凝集反应。用抗原致敏血球以测定待检样品中的抗体，这种试验可称为正向间接血凝试验；如果以抗体致敏血球来测定相应的抗原，这种试
验称为反向间接血凝试验。
如果先将游离的抗原与相应的抗体结合，隔一定时间后，再加入致敏的红血球，则不出现凝集现象，这就称为间接血凝抑制试验。本试验可用以检出和滴定样品中的未知抗原，亦可用来检查间接血凝试验是否为特异性的，如为特异性反应，则可因加入相应的抗原而被抑制。
（二） 沉 淀反 应
抗原物质为可溶性时，例如细菌外毒素、菌体裂解液、病毒、动物组织浸出液、动物血清等，与相应的免疫血清混合，在电解质的参与下，即产生可见的沉淀物，这种反应叫做沉淀反应。参与沉淀反应中的抗原，称为沉淀原，而相应的抗体称为沉淀素。
1. 试验方法
（ 1）沉淀试验 将相同稀释度的血清（免疫特异抗体）置于一系列的小试管中，各管中再加入等量不同稀释度的抗原，经混合后，置于 37℃或 42～ 45℃水浴中保温一定时间后，即可出现絮状沉淀现象。
（ 2）环状试验 在直径狭小的沉淀试管中，先加入少量免疫沉淀血清，热闹后沿试管壁滴入一定稀释度的抗原，防止摇动，在室温或在 37℃的保温箱中静置片刻后，在抗原与抗体的接触面即有一白色沉淀环出现。
（ 3）琼脂扩散试验 先用生理盐水配置的半固体琼脂倒入培养皿中或玻片上，待凝固后，即在凝固琼脂中央及四周挖孔，在中央孔内滴入沉淀素，四周孔内滴入沉淀原，间隔一定时间后，抗原与抗体在琼脂内扩散相遇即出现沉淀线。琼脂扩散试验也可在试管内进行。
（ 4）免疫电泳试验 因较大的胶体颗粒和蛋白质分子都带有电菏，在电场里会向一极移动，这种现象称为电泳。不同的蛋白质，因其颗粒的大小不同以及所带的电荷不同，在同一电场下，它们向一极移动的速度不同，据此，在电泳中就可以把不同的蛋白质分离出来。例如各种动物血清通过电泳方法分析，就可区分出蛋白质、α球蛋白、 β球蛋白、γ球蛋白四种不同的成分。用电泳方法与免疫学方法结合起来应用，称为免疫电泳。例如：先将血清或其他蛋白质抗原在琼脂内经过电泳后，再与其抗血清进行扩散沉淀反应。试验结果可发现在每一电泳
区带可能出现一个以上的沉淀线条。免疫电泳试验可分析出不同的抗原成分，从而借此来鉴定微生物和应用于某些疾病的诊断方面。
（ 5）对流免疫电泳试验 蛋白质在琼脂中电泳时， IgG（是机体血清中的主要球蛋白，一般的病毒抗体和球菌体和球菌抗体属于这一类）带有微弱的电荷，不能抵消电渗作用，故在电泳时向负极移动。而一般抗原通常带较强的负电荷，因此在抵消电渗作用后，仍向正极移动。如
将抗体置于正极方面，抗原置于负极方面，则电泳时两种成分就会相遇并产生沉淀带。由于抗原抗体在电场中定向移动，这样就限制了抗原抗体自由扩散的倾向，因而提高了灵敏度并加快了沉淀带出现的时间。采用本试验方法可比琼脂扩散法的灵敏度提高 10～ 16倍。
有关免疫电泳的应用，由于具体操作上的不同，还有其他多种方法，例如“火
箭”免疫电泳、交叉免疫电泳等等。
2. 沉淀反应与凝聚反应的区分
沉淀反应与凝集反应相似，因为两者都是抗原微粒在电解质的环境中与抗体结合而产生的反应，区别在于：
（ 1）两者抗原特性的不同，凝集反应的抗原微粒是显微镜下可见的细胞；沉淀反应的抗原则呈胶体状态，并且其微粒的大小在普通显微的可见范围以外。
（ 2）凝集反应中的抗原的颗粒大，与抗体结合的总面积小，为了不宜太多的抗体参与，因此必须稀释血清中的抗体。沉淀反应中的抗原颗粒小，结合抗体的总面积大，为防止太多的抗原，因此必须稀释抗原。
（三）溶 解 作 用
红菌或红血球与其相应的抗体结合，在电解质的环境中，就可产生凝集现象。如果抗原和抗体结合后，再加入正常动物的新鲜血清，就出现细菌或红血球被溶解，这种反应就是溶解反应。在正常动物的血清中起着参与溶解反应的非特异性物质，称为补体。补体能与任何一对抗原抗体复合物结合，因此，补体是非特异性的物质，它不能单独地与抗体或抗原结合。
（四）补体结合反应
有些抗原虽然能与其相应的抗体结合成复合物，并进而同补体结合，但并不出现任何可见现象。为了判断补体是否与抗原抗体复合物结合，就用红血球（抗原）与其夏管应的溶血素（抗体）作为指示剂以供鉴别。因此，补体结合反应的试验就有五个成分参与，即抗原、抗体、补体、红血球、溶血素。
试验过程进行中，在试管中先后加入抗原和抗体，随后再加入补体 ，最后加入溶血素和红血球的混合液（即溶血系统）。如果出现不溶血现象，即说明补体已与前两种抗原抗体复合物结合，溶血系统就得不到补体，也就不发生溶血作用。如果出现溶血现象，即说明补体不能与单独的抗体或抗原结合，而只能与溶血系统结合，因而发生溶血，见图 5-6。补体结合反应具有高度的特异性与灵感性，可测定微量的抗原或抗体，但方法比较复杂，可应用于诊断疾病与鉴定微生物等。
（六） 免疫荧光抗体法
免疫荧光抗体，就是血清学方法结合显微示踪的技术。用已知抗体去鉴定未知抗原，或已知抗原去鉴定未知抗体，
这是血清学方法的基本内容。在前面已述及关于抗原与抗体结合时可发生可见作为判断抗原与抗体已方式反应的根据。而在有些情况下，抗原与抗体虽然方式了结合，但是不可见的，例如抗原与抗体是在固定的微生物涂片上或组织内，即使相应的抗原和抗体已方式结合而它们的反应就是不可见的。如果使抗原或抗体能带上一种颜色，而这种颜色又不影响抗原和抗体结合的特异活性，那么，人么年就可借染色的可见与否来判断抗原与抗体是否发生结合放映。用什么燃料来标记，经过许多科学家的研究，认为荧光染料只需要极微量，就可以在显微镜下将它们显示出来。因为人的视觉，对荧光在黑暗的背景衬托下，具有较高的灵感性，并在实践中证明荧光染料不会影响抗原抗体结合反应的特异活性。因此，近年来在微生物学及免疫学范围内，以广泛地应用了荧光抗体技术。荧光抗体的方法有直接法、间接法、补体法和特殊染色法等。
1. 直接法
将抗原固定在载玻片上，然后用荧光抗体（标记抗体）染色一定时间后，用水冲洗。如果抗体被相应的抗原结合，则抗体被固定在抗原上，够则即被水冲洗掉。在荧光显微镜下观察，在抗原部位有荧光激发者，即为阳性；无荧光者，即为阴性。这是荧光抗体技术中最简单的基本方法，其优、缺点如下：
优点：方法较简便，所需时间短。特异性高，如果荧光抗体染色量适当，很少发生非特异性染色反应。
缺点：仅适用于用已知抗体检测未知抗原。一种标记的抗体只能检测一种抗原，欲检测多重抗原，必须制备多种的标记抗体。敏感性较差。
2. 间接法
将已知未标记的抗体加到未知的抗原（已固定与玻片）上，或用未知抗体加到已知的抗原（已固定与玻片）上，隔一定时间后冲洗，这是第一阶段。其后，即滴加抗球蛋白抗体（荧光染料标记过的），这是第二阶段。如果在第一阶段中，抗原与抗体已在玻片上结合，后加的标记抗球蛋白抗体即被固定下来。在第一阶段中的抗体对它所相应的抗原来说，是起着抗体作用；在加入标记抗球蛋白抗体后，它一抗球蛋白结合，它就起了抗原作用，因此，标记的抗球蛋白的抗体必须与第一阶段的抗体同种动物的血清球蛋白来制备免疫血清。这方法中的荧光抗体染色并不在第一次抗体上，而在第二次抗体上，所以称为简洁法。其优、缺点如下。
优点：能够检测未知抗原或未知抗体。用一种标记抗球蛋白抗体，就能适用于同种动物的血清抗体。敏感性较直接法高。
缺点：方法比较麻烦，必须作较多的对照。特异性较差。
3. 补体法
利用补体
结合反应的原理，并用荧光染料标记在抗补体抗体上，借此检测未知的抗原或未知的抗体（血清）。方法与上述间接法相似。即将未标记的抗体和补体加于抗原上，使形成抗原 -抗体 -补体三者结合的复合物，经冲洗后，即加上标记的抗补体抗体，使它能和抗原 -抗体 -补体复合物结合，在观察时，即显示出荧光。补体一般都取自豚鼠血清。本方法的优、缺点如下。
优点：能够检测未知抗原和未知抗体。同一种标记抗补体抗体就能检测所有的抗原抗体，与血清所属动物的种别无关。敏感性高。
缺点：特异性较差。操作比较麻烦，必须有较多的对照。补体容易失效，不易保存。
以上三种荧光抗体染色方法的原理可参阅图 5-7。
4. 特殊染色法
（ 1）双重染色法 若在同一标本中，检测两种不同抗原的相应抗体时，就采用双重染色法。即应用两种不同的荧光素，标记不同的抗体，染色时，可混合染色或先后染色。目前用于双重染色的荧光素是异硫氰酸荧光黄，即 Fluorescein isothiocyanate(FITC)和四乙基罗达明，即 Lissamine rhodamine B200(RB200)或四甲基异硫氰酸罗达明，即 Tetramethyl rhdomineisothiocyanate(TMRITC).双重染色法可用在同一标本中，以区分两种不同的微生物，或同一种微生物的两种不同型的抗原，或在同一组织中区分两种不同免疫球胆百。
（ 2）衬托染色法 为了显示特异免疫荧光的可见性，使用一种非特异的对照染色来衬托。衬托染色的方法有两种：一种方法是用异硫氰酸荧光黄，使目的物显示免疫荧光，并用四甲基异硫氰酸罗达明编辑牛血清蛋白作非特异的衬托染色。另一种方法是直接用荧光色素溶液，如伊文氏蓝溶液、结晶紫溶液等，作衬托染色。
（ 3）滤膜集菌染色法 用特殊制备的黑色滤膜收集水中或空气中或其他液体材料中的细菌。集菌后，在滤膜上加上荧光抗体染色，经冲洗，而后将已染色的黑色滤膜移置载片上，用甘油封片，滤膜经甘油浸透，即呈透明，置于荧光显微镜下，即可观察结果。这方法主要用于细菌学检验，其提点是在细菌检验中，可以不经过培养，快速地得检验结果。
（ 4）荧光染色法应用于荧光定量 细胞与荧光抗体结合后，经过集中、洗涤，细胞溶解，然后用荧光计测定溶液的荧光强度，借此，就可用于鉴定细菌或测定免疫细胞上的免疫球蛋白的含量。
（ 5）免疫酶染色法 免疫酶染色方法的基本原理与免疫荧光染色法基本相似。她是用酶来标记抗体球蛋白，一般常采用辣根过氧化酶（ Horseradish peroxide）替代荧光素来标记抗体球蛋白从而检测抗原。不仅可用普通显微镜观察，而且也能
用电子显微镜观察，但染色过程你叫复杂。
第八节 动 物 试 验
动物试验常应用于病原微生物致病力的测定，病原微生物的分离，免疫血清的制备和病原菌种鉴定等各个方面。
一、病原微生物致病力的测定
人、动物或人畜共有的病原微生物，经分离培养获得纯菌种后，为了研究其对机体的病理机制，如发病的症状、组织病变以及毒性的大小等等，一般均采用动物试验，这是一项重要的研究方法。在实验室中进行动物试验时，常应用的动物有：小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、鸽、鸡、鸭、猫等。至于选用什么动物，以及对动物的体重、年龄、性别等要求，主要根据不同动物的特点和试验对某种动物是否有易感性来决定的，并根据不同动物的特点和试验操作上的方便，可选用适当的接种方法。关于接种动物的几种方法，在前面已叙述过。试验动物的材料，可取自培养的活菌液，或取自微生物的代谢产物，或两者的混合物。接种后的动物，必须隔离饲养。在饲养过程中，如体温、体重、食欲、排泄等的改变，并详细记录结果。
有些病原微生物或其代谢产物接种于易感动物后，在短期内即发病并可引起死亡。例如一些沙门氏菌含有强的内毒素，以陈旧的沙门氏菌的培养滤液于家兔静脉，一般可使家兔在 24～ 36h内死亡。用猪霍乱沙门氏菌液使小白鼠经口感染，小白鼠在 8～ 10d后死亡；用同样菌液注射家兔，约在 5～ 9d后死亡。将金黄色葡萄球菌培养滤液经过煮沸后，注射幼猫静脉后 15～ 30min，即出现呕吐，下痢等现象。用黄曲霉素喂家雏，发现每只一次仅喂 4ug，连续 3～ 4d，即死亡。
有些病原微生物的毒素，因含量微小，必须经过长期连续地侵入动物机体后，才逐渐发生病变以至死亡。这种情况是属于慢性中毒物质，只有通过较长期的动物试验才能观察到，例如黄曲霉毒素的慢性中毒试验。
观察动物试验的结果，除了动物在接种后的发病过程中所表现出来的一些可见的或可以被检测的症状外，最主要的还必须通过动物解剖来检查组织病变的详细情况和进行微生物学的检验才能地出正确的结论。动物的剖检可在死后立即进行，有时可在发病过程中进行。未死的动物先经麻醉后再行剖检，在剖检时，必须进行无菌操作以防止污染。
二、病原微生物的分离
利用某些动物对某些病原微生物具有易感性的特点，进行病原微生物的分离。例如：取 0.1ml含有猪丹毒丝菌的材料制成的乳剂，注射于鸽的胸肌或小白鼠的皮下，经 2～ 4d后，可引起死亡。在死后剖检脾脏、肝脏、心血管等脏器，即有
大量的、纯的猪丹毒丝菌存在，借此分离，就可获得纯菌。
三、免疫血清的制备
动物机体受到异种抗原性物质刺激后，就会产生相应的抗体，这种抗体就存在于该动物的血清内，这种血清就称为免疫血清。免疫动物以内感的抗原要力求纯化，这样才能在制备免疫血清中获得特异性高的抗体。
制备免疫血清，多用家兔和羊，免疫效果较好，而且能够制备较多的血清。应选用健康壮龄和雄性的动物。
接种免疫的部位有皮写、皮内、肌肉、腹腔和静脉等，每次接种一般可采用一种或两种部位。接种抗原的剂量，主要根据动物的大小，家兔的周期和抗原的性质。动物体重大的，剂量可以大些；体重小的应减量。免疫周期长的，剂量可以比较小些，接种次数可以多几次；短周期，则剂量增大，次数减少。但有毒性的抗原，剂量应小。
例如制备抗细菌血清贸易细菌作抗原，细菌可用活的，或经过用甲醛、热、酒精等灭活的菌体，均可供动物免疫用。有时常与福氏免疫佐剂（ Freund`s sdjuvant）合用，可以增强抗体的产生。免疫部位可采用多种部位（皮下、肌肉、脚掌、淋巴结等），每次注射的细菌量（家兔免疫）一般为 10 ～ 10 个。一般常采用每周接种 2～ 3次，共 3～ 5周，在最后一次接种后约 10d左右，即可采血分离血清。当血清的凝集价到达 1： 1000以上时，即可用来作标记抗体。
四、鉴定病毒的动物保护试验
通过动物，用已知免疫血清鉴定未知病毒。例如为了鉴别猪传染性水泡病毒和口蹄疫病毒，就可采用动物保护试验。试验动物选用初生乳鼠，分成两大组。每组乳鼠分别注射已知猪传染性水泡病血清、口蹄疫血清，在每组中留下部分乳鼠不注射血清，作病毒对照。接种血清后，隔 6～ 12h，再接种被检病毒浸出液。两组中已注射血清的乳鼠中，留下部分乳鼠不注射病毒满座血清对照，其他都组社病毒，包括病毒对照的乳鼠在内。观察 6～ 7d，如果注射猪传染性水泡病血清和被检病毒材料的如数先后相继发病死亡，而注射口蹄疫血清和病毒的乳鼠组无死亡，同时，血清对照和病毒对照都是准确的，则说明被检病毒是属于口蹄疫病毒，因为该组乳鼠已经过被动免疫，对动物起了保护作用。所以这种动物试验，就称为动物保护试验。