产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。
摘要产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。
一、实验原理
(一) 产甲烷菌
厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。产甲烷菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，产甲烷菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
(二) 产甲烷菌的发现历史
自1901—1903年巴斯德研究所的马载（Maze）第一次观察到一种产甲烷菌的微球菌（马氏甲烷球菌）以来，迄今共发现了五十多种产甲烷菌。1974年Bryant 提出产甲烷菌这一名词，为避免这一类细菌与氧化甲烷的好氧菌相混淆。1979年由Balch W.E.等人根据菌株间16SrRNA降解后各寡核苷酸中碱基排列顺序间相似性的大小，提出了一个新的系统分类方法，共分为3个目、4个科、7个属、13个种。
(三) 定义、性质及分布
产甲烷菌（Mathanogens）是一类必须生活在厌氧生境下并伴有甲烷产生的古生菌，其形态和生理、生化特性呈现明显的多样性。它生长的氧化还原电位约为-0.33V，最适生长温度为35—40度，最适pH为6.0-7.2。例如细胞形态有球状、短杆状、长杆状、螺旋状和丝状等；Gram染色反应有阳性、阴性和不定性；生长所需碳源约有10多种，除CO2外，还有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有当产甲烷菌在利用H2作CO2还原剂以产生生物合成所需细胞物质，才能利用CO2作电子受体以产生ATP和CH4。
产甲烷菌广泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和动物的肠道、昆虫的肠道、湿树木、地热泉水、深海火山口、水田和海洋的沉积物、沼泽等厌氧环境中都有产甲烷菌存在。
(四) 产甲烷菌的培养
在培养产甲烷菌时，最需要控制的是厌氧条件，在pH=7.0，O2的浓度与1atm的氧平衡时，O2——O2-反应的电位是0.81V，因此，在-0.33V时，O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。每升饱和了空气的水中含有1.48×10-55个O2。所以说，要保证产甲烷菌培养时的低电位是很重要的。
产甲烷菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术因此他是
世界上第一个分离纯化产甲烷菌的人。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌种都不会干扰厌氧条件。
二、材料、试剂及设备
(一) 材料
已分离纯化的产甲烷菌（Mathanogens）
(二) 设备
生物科研网https://www.doczj.com/doc/cc19075948.html,提醒：高纯氮气，厌氧管，厌氧手套箱，注射器，恒温培养箱，铜柱除氧系统，定量加样器，厌氧罐，超声波破碎仪，酒精灯，冰块，水浴锅，记号笔，振荡器。
(三) 试剂
1. 改良的PRAS无氮培养基，其配方组成为：NH4CL 1g，MgCl20.1g，K2HPO40.4g，KH2PO40.2g，甲酸钠5g，乙酸钠5g，甲醇3.5ml，Ph值为7.0，蒸馏水1000ml，1%的树脂刃天青（还原指示剂）1ml，121摄氏度灭菌20min。使用前每5ml培养基加入1%Na2S（还原剂）和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液（抑制剂）各0.1ml；
2. 糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基（液体）；
3. 冰块 Na2S NaHCO3；
4. 乙醚，吲哚试剂，卢戈氏碘液。
三、实验步骤
(一) 分离与培养
1. 铜柱系统除氧
铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。
2. 预还原培养基及稀释液的制备
在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，于灭氧罐中灭菌备用。
3. 分离
(1) 编号
取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。
(2) 稀释
在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不同样品稀释液。通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。
(3) 滚管分离
① 滚管
将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，当培养基从瓶中取出时，要用N2在培养基内中充气。再在试管中用N2充气，赶走所有管内空气，然后把培养基加入管内，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内，及时拔出充气针头。用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。
② 分离纯化
生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养，培养24h或更长时间或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。
③ 划线分离
将试管橡皮塞的一端在火焰上灼烧一下，挨着打气针塞住管口，在针头快速取下前，通气15-20s，管口一端在火焰上烧片刻。旋紧管塞，划线后的卷管直立保温，使用CO2:H2=80:20,因为CO2比空气重，开启后管塞不致有空气残留。划线后的滚管，置34-37度下培养，便可长出菌落。
4. 镜检与计数
(1) 镜检
挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。
(2) 计数
液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有产甲烷菌的数量。公式如下：
产甲烷菌数量cfu/g（mL）样品=A×10ml×X/10×D
A-0.1mL滚管计数的实际平均值，X- 镜检呈现为产甲烷菌的数目，X/10为菌落中产甲烷菌的概率，D是稀释倍数。
(二) 菌种的鉴定
1. 糖发酵试验
糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫 [pH5.2(黄色)—6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。具体实验步骤如下：
(1) 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。
(2) 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。
(3) 24h后观察各管中液体颜色变化及产气情况。
2. 蛋白质分解实验
(1) 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。
(2) 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。
(3) 24h后各管分别进行米伦氏反应、吲哚反应、黄色反应和坂口反应等。
2. 淀粉水解实验
(1) 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。
(2) 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。
(3) 24h后于各管中加入适量卢戈氏碘液观察淀粉的水解情况。
【注意】
1. 注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。
2. 注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。
3. 用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。
4. 树脂刃天青（resazurin）既是还原剂又是指示剂，它可以把培养基中残留的溶解氧去除，其氧化还原电位指示敏感范围为-42mV。有氧时呈紫色或粉红色，无氧时呈无色（培养基的颜色），它是较为理想的氧化还原电位指示剂和培养严格厌氧菌不可缺少的。
5. 培养基中加入的青霉素是用来抑制其它细菌生长的，因为产甲烷菌的细胞壁成分为假肽聚糖，不受青霉素影响。
6. 注射器在使用前必须先用培养基上面的气体冲洗、填充，然后插入培养基的下层，以保证当培养基移入试管时，就处于无氧气体层的下面。
论述产甲烷菌、硝化细菌、硫酸盐还原菌、海洋弧菌、光合细菌、发光细菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌的系统分类地位、生理特性及在市政工程领域作用 1、产甲烷菌 产甲烷菌是专性厌氧菌，属于古菌域，广域古菌界，宽广古生菌门。生理特性包括：1、营养特性：甲烷细菌的能源和碳源物质主要有5种，即H2/CO2、甲酸、甲醇、甲胺和乙酸；2、特殊辅酶：F420：是黄素单核甘酸的类似物，分子量为630的低分子量荧光化合物。它是甲烷细菌持有的辅酶，在形成甲烷过程中起着重要作用。其特点：(1)当用420nm波长的紫外光照射时，能产生自发蓝绿荧光，这一现象可借以鉴定甲烷细菌的存在。（2）中性或碱性条件下易被好氧光解，并使酶失活。CoM:2-硫基乙烷磺酸：其特点：（1）它是甲烷细菌独有的辅酶，可借以鉴定甲烷细菌的存在。（2）它在甲烷形成过程中，起着转移甲基的重要功能。（3）其具有RPG效应.。即促进CO2还原为CH4的效应。3.环境条件：氧化还原电位：参与中温消化的甲烷细菌要求环境中应维持的氧化还原电位应低于350mV；对参与高温消化的甲烷细菌则应低于-500~-600mV。温度：低温菌的适应范围为20~25°C，中温菌为30~45°C，高温菌为45~75°C。PH：大多数中温甲烷细菌的最适pH值范围约在6.8~7.2之间。毒物：凡对厌氧处理过程起抑制或毒害作用的物质，都可称为毒物。在市政工程领域的应用：在污水处理过程中，利用嗜冷产甲烷菌实现低温厌氧生物处理，可从本质上突破低温厌氧工艺的技术瓶颈，进而大大拓展厌氧生物处理技术的应用范围并降低废水处理的成本。厌氧生物处理技术具有较低的建设和运行成本，同时，在处理过程中可回收清洁能源----沼气，是一种可持续的生物处理技术，现有的厌氧生物处理工艺大多要求在中温或高温的范围内进行，通常要对废水与废物进行加热，这种作法消耗能源，削弱了厌氧生物处理的优越性。因此，开展低温下高效厌氧生物处理技术的研究，对于拓展厌氧生物处理技术的应用范围，降低废水、废物的处理成本具有十分重要的意义。 2、硝化细菌 硝化细菌( nitrifying ) 是一种好氧性细菌，包括亚硝化菌和硝化菌。生活在有氧的水中或砂层中，在氮循环水质净化过程中扮演着很重要的角色。生理特性：1、附着性2、营养物质硝化细菌是自营性细菌，所以硝化细菌像植物一样，主食是氨，同时也必须要吸收无机物营养物质，例如，铁，锰，磷，钾，钙，镁等无机离子，以用于代谢合成许多它生长所需的化合物。3、硝化细菌的休眠硝化细菌为了适应饥饿（缺少氨）带来的压力，硝化细菌中的亚硝酸菌会进行休眠，就是说在食物十分缺乏的情况下，它们可以做到暂时终止生理机能进行休眠，而这种休眠可以使亚硝酸菌延长大约两年的寿命。在氨的浓度足够的条件下，经过相当长的时间后，亚硝酸菌才会苏醒。在市政工程领域的应用：在生活污水硝化脱氮处理中，采用硝化细菌强化挂膜的好氧生物滤池和厌氧滤池反应器在仅需水力提升动力消耗的条件下，其运行效果良好。 3、硫酸盐还原菌 硫酸盐还原菌是一种厌氧的微生物。自然界中最常见的硫酸盐还原菌是嗜温的革兰氏阴性、不产芽孢的类型.在淡水及其他含盐量较低的环境中，易分离到
第一章概述 利用微生物提高原油采收率技术（Microbial Enhanced Oil Recovery 简称MEOR）是通过微生物产品或微生物的繁殖及其代谢产物对油藏作用来开采原油，是利用微生物提高原油采收率的各种技术的总称。凡是与微生物有关的采油技术均属于MEOR。因此，广义地讲，MEOR 包括地面发酵法（地面法）和微生物地下发酵法（油层法）两种。 地面法是利用微生物产品如生物聚合物和生物表面活性剂作为油田用化学剂进行驱油，又称生物工艺法，目前此技术已趋成熟；微生物地下发酵法是利用微生物繁殖作用及其代谢产物对油藏流体的作用提高采收率，狭义上通常说的微生物驱油是指微生物地下发酵法。 微生物地下发酵法根据利用的微生物的来源不同，又可分为本源微生物驱油和外源微生物驱油。外源微生物驱油是在室内筛选出自然采油菌或采用生物基因工程合成培育出工程采油菌，经地面培养后注入油藏。前苏联在这方面做了不少实验研究，我国微生物采油领域也多采用此方法。本源微生物驱油是通过向地层中注入营养激活剂或在必要时注入一定量的空气，激活油藏中的已存在的有益微生物菌群，如石油烃降解菌、脱氮菌、产甲烷菌等，来达到提高采收率的目的。本源微生物采油比外源微生物驱更能适应油藏环境，不需要菌种保藏和菌液生产。微生物地下发酵法比注入人工合成的有机聚合物或凝胶更为有效，对油水分离和原油性质无影响，经济环保，设备简单，施工简便，控水增油效果好，有效期长，效益高。 微生物驱油技术与其它三次采油方法相比具有以下优点： (1)注入的微生物和培养基价格便宜，成本低，来源广，容易获得，便于应用，可以针对具体的油藏灵活调整微生物配方； (2)微生物具有自我复制功能，注入到油藏中的细菌通过生长、繁殖，可以在一个很长的时期内起作用； (3)几种机理同时起作用，效果显著，因此在现场试验中往往将具有不同功能的细菌一起注入地下，使它们共同起作用； (4)设备与注入工艺简单，与注水驱替注入方式类似，微生物驱油现场试验不需要大型地面设备，注入工艺也很简单，因此，施工非常方便，成本低廉；
细菌鉴定的方法和步骤 细菌鉴定是确定或确认细菌属种的过程，它是微生物学中非常重要的一部分，有助于了解细菌的特征、生态习性和其对人类的影响。下面，我将介绍细菌鉴定的一般方法和步骤。 一、准备实验室条件和材料 在进行细菌鉴定之前，需要准备好实验室条件和所需的材料。实验室应具备洁净、无菌环境，预防细菌污染。所需的材料包括培养基、培养皿、平板、显微镜、油浸物镜、背景颜色固定剂、染色试剂、耗材等。同时，实验人员需要佩戴实验手套和口罩，保证操作的无菌性。 二、选择适当的培养基 不同的细菌在不同的培养基上生长出不同的菌落，因此选择适当的培养基是细菌鉴定的关键。常用的培养基有营养琼脂培养基、血琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基等。根据需要鉴定的菌株特性和需求，选择适当的培养基。 三、样品采集和拮抗 在开始鉴定之前，需要采集样品并进行扩培。样品来源可以是病人的体液、环境中的土壤、水源、食品等。样品采集最好是在无菌环境中进行，避免外来的细菌干扰结果。 四、制备纯培养物
为了获得纯种细菌，需要将样品进行拮抗并分离。拮抗是指将细菌分离成单独的菌落，并在新的培养基上获得单个菌种的纯培养物。常用的方法有稀释再悬浮平板法、分离斑点法、筛选法等。通过将菌落接种到培养基上，经过单菌的选择和培养，最终得到纯种菌株。 五、观察菌落特征 观察菌落形态是进行细菌鉴定的重要步骤之一。菌落特征包括菌落大小、形状、质地、边缘、颜色等。通常使用肉眼或显微镜对菌落进行观察，并记录下菌落的特征。 六、进行染色处理 染色是细菌鉴定中常用的方法之一。根据细菌细胞壁的性质，通常使用革兰氏染色、苏木精-伊红染色等常规方法进行染色处理。通过染色，可以初步了解细菌的形态、结构和染色特性。 七、观察细胞的形态和结构 将已染色的细菌样本放置在显微镜下，使用油浸物镜进行镜片调焦。观察细菌细胞的形态特征，如形状（球形、棒状、螺旋形等）、大小、连杆性等。此外，还可以观察细菌细胞的结构、附属结构（如鞭毛、菌毛等）以及内部结构（如胞浆、核质等）。 八、进行生物化学试验和酶活性测试
产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。 摘要产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。 一、实验原理 (一) 产甲烷菌 厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。产甲烷菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，产甲烷菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。 (二) 产甲烷菌的发现历史 自1901—1903年巴斯德研究所的马载（Maze）第一次观察到一种产甲烷菌的微球菌（马氏甲烷球菌）以来，迄今共发现了五十多种产甲烷菌。1974年Bryant 提出产甲烷菌这一名词，为避免这一类细菌与氧化甲烷的好氧菌相混淆。1979年由Balch W.E.等人根据菌株间16SrRNA降解后各寡核苷酸中碱基排列顺序间相似性的大小，提出了一个新的系统分类方法，共分为3个目、4个科、7个属、13个种。 (三) 定义、性质及分布 产甲烷菌（Mathanogens）是一类必须生活在厌氧生境下并伴有甲烷产生的古生菌，其形态和生理、生化特性呈现明显的多样性。它生长的氧化还原电位约为-0.33V，最适生长温度为35—40度，最适pH为6.0-7.2。例如细胞形态有球状、短杆状、长杆状、螺旋状和丝状等；Gram染色反应有阳性、阴性和不定性；生长所需碳源约有10多种，除CO2外，还有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有当产甲烷菌在利用H2作CO2还原剂以产生生物合成所需细胞物质，才能利用CO2作电子受体以产生ATP和CH4。 产甲烷菌广泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和动物的肠道、昆虫的肠道、湿树木、地热泉水、深海火山口、水田和海洋的沉积物、沼泽等厌氧环境中都有产甲烷菌存在。 (四) 产甲烷菌的培养
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏 一、实验目的和要求 1.了解微生物的分离纯化方法。 2.学习检测水中大肠菌群的方法。 3.学习微生物的保藏及鉴定方法。 4.熟悉革兰氏染 二、实验原理 多管发酵法 多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。 1.初发酵试验 水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。48小时后仍不产气的为阴性结果。 2.平板分离 初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。 3.复发酵试验 以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。 三、实验器材及试剂 1.水样 污水样本 2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。 3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等 四、实验方法及步骤 1.第一天 实验前的准备 1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL，并加入产气管。配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温
分离和鉴定微生物的方法 微生物是一种充满生命力的生物体，它们无处不在，在自然界 中发挥着不可替代的作用。但是，随着人类活动的不断扩大，人 们逐渐认识到微生物对人类生命健康的潜在威胁。因此，需要分 离和鉴定微生物，以了解其特征和功能，从而保护人们的健康与 安全。 一、分离微生物的方法 分离微生物是微生物学研究的基础，它通常包括以下步骤： 1. 采样：根据研究目的和样本来源的不同，可以选择不同的采 样方法，如直接采集、培养物、土壤、水和空气等。 2. 稀释涂布：根据采样量的大小和样本来源的不同，可以将样 本进行适当的稀释处理，然后涂布在培养基上。 3. 培养：将涂布的样本置于适当的培养条件下，如温度、湿度、氧气含量和营养成分等，培养期间观察和记录微生物的生长情况。
4. 纯化：从培养物中选取单一的菌种，通过传代和筛选的方法，使其获得纯种状态。 5. 保存：对保留的纯菌种进行存储和传承。 二、鉴定微生物的方法 鉴定微生物是指对已分离出的微生物进行鉴定和分类，以确定 其种属、亚种或生物型。通常包括以下步骤： 1. 形态学特征：通过对微生物形态的观察和描述，如大小、形状、色素、菌落形态等，初步鉴定其种属。 2. 生理生化特征：利用微生物生长与代谢的特性，如对不同碳源、氮源和微量元素的利用，产生的酶类和代谢产物，以及对常 见药物的敏感性和抗性等，进一步鉴定其亚种或生物型。 3. 分子生物学特征：利用分子生物学技术，如DNA序列分析、PCR扩增和序列比对等，对微生物进行基因型鉴定，解决传统鉴 定技术无法区分的问题。
三、常见的微生物分离和鉴定方法 1. 培养方法：是微生物分离和鉴定的最基本和重要方法，主要 应用于细菌和真菌的鉴定。包括富营养培养基和选择性培养基， 常用的有Mcleod、MacConkey、Sabouraud等。 2. 快速检测方法：是以快速、高效、准确为主要特点的微生物 检测方法。包括免疫学方法、核酸检测方法、质谱分析方法等。 3. 超微结构分析方法：是通过电子显微镜观察微生物的超微结构，如形态、细胞壁、胞膜、内质网、菌核等，进一步鉴定和分 类微生物。 4. 药敏试验方法：是测定微生物对不同类别的药物敏感性和抗 性的方法，通过改变菌株对药物的反应情况，确定其药物敏感性。 总之，微生物的分离和鉴定方法应根据具体情况进行选择和应用，以确保科学、准确和有效。微生物学研究的深入，将有助于
菌种鉴定方法及步骤 菌种鉴定是微生物学中的重要研究内容之一，它主要是通过对菌株的形态、生理生化特性以及分子生物学特征进行综合分析，来确定菌株属于哪一类别。菌种鉴定的准确性对于微生物学研究和应用都具有重要意义。下面将介绍菌种鉴定的一般方法及步骤。 一、形态学鉴定 1.菌落形态观察：将菌株接种在合适的培养基上，培养一定时间后，观察菌落的形态特征，包括菌落的形状、颜色、质地等。 2.细胞形态观察：将菌株制备成适当的涂片，使用显微镜观察菌体的形态特征，包括细胞的形状、大小、排列方式等。 二、生理生化特性鉴定 1.生长条件观察：菌株在不同培养条件下的生长情况对其鉴定有重要意义。可通过调节培养基的pH值、温度、营养成分等条件，观察菌株在不同环境下的生长情况。 2.代谢产物检测：菌株的代谢产物可以通过化学方法检测，如氧化酶、酸碱指示剂等。 三、分子生物学特征鉴定 1.16S rRNA序列分析：16S rRNA是细菌特有的序列，通过测序并与数据库中已知的16S rRNA序列比对，可以确定菌株的亲缘关系。 2.DNA指纹图谱分析：通过PCR扩增菌株的DNA片段，然后使用
凝胶电泳或者高通量测序技术进行分析，可以得到菌株的DNA指纹图谱，从而进行鉴定。 菌种鉴定的方法及步骤主要包括形态学鉴定、生理生化特性鉴定和分子生物学特征鉴定。其中，形态学鉴定主要通过观察菌落和菌体的形态特征来确定菌株的分类；生理生化特性鉴定则是通过观察菌株在不同环境条件下的生长情况和代谢产物来进行鉴定；分子生物学特征鉴定则是通过分析菌株的DNA序列以及DNA指纹图谱来确定其亲缘关系。这些鉴定方法可以相互补充，提高鉴定的准确性。在实际应用中，可以根据不同需求选择合适的方法进行菌种鉴定，以确保准确性和可靠性。
产甲烷细菌标记基因 前言 产甲烷细菌是一类能够产生甲烷气体的微生物，在环境中起到重要的生态作用。为了更好地了解这些细菌的生态特征和活动规律，科学家们一直在寻找一种可以准确标记产甲烷细菌的方法。本文将讨论现有的一些标记基因技术以及未来可能的发展方向。 现有标记基因技术 1. 16S rRNA基因 16S rRNA基因是一种常用的细菌特异性标记基因，通过对其序列进行PCR扩增和 测序，可以获得产甲烷细菌的相对丰度信息。这种方法简单易行，适用于对细菌群落的整体分析。然而，16S rRNA序列在分类水平较低时分辨率较低，有时难以准 确地鉴定产甲烷细菌的物种。 2. pmoA基因 pmoA基因编码催化产甲烷细菌甲烷氧化酶的亚基，是产甲烷细菌的特征基因。通 过PCR扩增和测序pmoA基因，可以获得产甲烷细菌的物种信息。与16S rRNA基因相比，pmoA基因具有更高的分辨率，能够更准确地鉴定产甲烷细菌的物种。然而，由于pmoA基因在不同物种间的序列变异性较大，需要设计多套引物才能覆盖所有 可能的产甲烷细菌。 3. mcrA基因 mcrA基因编码甲烷合酶的亚基，同样是产甲烷细菌的特征基因。与pmoA基因相似，通过PCR扩增和测序mcrA基因可以准确鉴定产甲烷细菌的物种。不同的是，mcrA 基因在不同产甲烷细菌间的序列保守性较高，只需要设计一套引物即可覆盖大多数产甲烷细菌。因此，mcrA基因被认为是一种更理想的产甲烷细菌标记基因。
标记基因技术的应用现状 1. 环境样品中的产甲烷细菌 利用上述标记基因技术，科学家们对各种环境样品中的产甲烷细菌进行了研究。例如，他们通过对沉积物、湖泊水体和河流水体等样品中的产甲烷细菌进行标记基因分析，发现了丰富的产甲烷细菌群落，并且鉴定出了多个新的产甲烷细菌物种。 2. 产甲烷细菌的生态功能 产甲烷细菌在地球生态系统中起到重要的作用，对其功能的研究也得益于标记基因技术的应用。通过对产甲烷细菌标记基因的分析，科学家们揭示了其在甲烷产生和甲烷氧化等方面的不同功能和代谢途径。这些研究为进一步了解产甲烷细菌的生态功能提供了重要线索。 未来的发展方向 1. 更高分辨率的标记基因 虽然现有的标记基因技术已经能够对产甲烷细菌进行比较准确的鉴定，但仍有提高分辨率的空间。科学家们可以进一步挖掘产甲烷细菌的其他特征基因，设计更为特异的引物，从而提高标记基因的鉴定精确度和准确性。 2. 高通量测序技术的应用 随着高通量测序技术的快速发展，我们可以更快速、更经济地获取产甲烷细菌标记基因的测序数据。这不仅可以加快产甲烷细菌的物种鉴定和功能解析，还可以更全面地了解产甲烷细菌在不同环境中的分布和变化规律。 3. 细菌分布的时空变化研究 通过对不同时期和不同空间尺度上的产甲烷细菌标记基因进行分析，可以揭示产甲烷细菌的时空分布规律。这对于理解产甲烷细菌在全球变化背景下的响应和适应机制具有重要意义。
原甲烷氧化菌在微表面中的分离培养及其应 用 前言： 原甲烷氧化菌（MOB）是一种异养微生物，主要存在于一些湖泊、海洋、河 流和土壤等环境中。该菌能够利用甲烷作为能源，将其转化为生物质，并释放出 CO2和H2O。MOB广泛存在于自然界中，因此其对于生态环境的影响是非常重要的。为了更好地研究MOB在自然环境中的行为以及相关应用，需要对其进行分离 培养。 一、原甲烷氧化菌的分离与鉴定 MOB是一种可能存在于许多自然环境中的细菌，为了分离这种菌株需要进行 一系列的技术。首先需要采集到含有MOB的样品，然后通过分离技术分离出 MOB菌株。在分离过程中可以利用一些特殊的组成分离筛选培养基，促进分离过 程的进行。分离出MOB菌株之后，还需要进行鉴定工作，如16S rRNA序列比对、生物学特性识别等。 二、原甲烷氧化菌的培养条件 MOB是一种异养微生物，在培养过程中需要特定的培养条件才能生长繁殖。 一般而言，MOB需要环境中存在足够的氧气，并需要温度在10℃到30℃之间。此外，MOB还需要合适的营养物质，特别是硝酸盐、亚硝酸盐和铁等元素对其生长 起到关键作用。 三、原甲烷氧化菌在微表面中的分离培养 MOB在自然环境中广泛存在于微表面上，因此研究其在微表面中的行为有助 于更好地了解它们在自然界中的分布和作用。在微表面中分离MOB的方法主要有
微滴法、微波法和纳米骨架法等。其中，微滴法是一种较为简单的分离方法，可以将含有MOB的样品滴入到微滴中，通过观察微滴的形态以及MOB的分布情况来 进行分离和鉴定。此外，还可以通过微波法和纳米骨架法等分离技术来获得高质量的MOB菌株。 四、原甲烷氧化菌的应用 MOB具有重要的环境意义和科学研究价值，因此其应用十分广泛。首先，在 环境修复方面，MOB可以降解甲烷等有害气体，减少温室气体和污染物的排放量。此外，在油田开发中，MOB可以通过转化甲烷为生物质，避免甲烷过量排放，从 而降低石油开采对环境的影响。在水质监测方面，MOB可以作为一种重要的生物 指标，判定水体中甲烷污染的程度。 总结： 原甲烷氧化菌是一种重要的异养微生物，具有广泛的分布和应用价值。为了更 好地研究MOB在自然环境中的行为以及相关应用，需要对其进行分离培养。 MOB在微表面中的分离培养有助于更好地了解其在自然界中的分布和作用。通过 对MOB的分离培养和应用研究，有助于深入了解其在生态环境中的作用，为人们 更好地保护环境、开发资源提供了重要的科学依据。
甲烷菌的生态和生物化学特性 甲烷是一种极为重要的地球大气气体，它在温室效应、气候变化等方面都扮演 着关键性的角色。在自然界中，甲烷常常由甲烷菌产生。甲烷菌是一类无色无味、微小而又神奇的微生物，它们通常生存在深海或湿地等处，发挥着至关重要的作用。本文就甲烷菌的生态和生物化学特性进行详细介绍。 一、甲烷菌的生态分布 甲烷菌广泛存在于自然界的许多环境中，包括水体、沉积物和土壤等。其中， 水体和沉积物是甲烷菌的主要栖息地。甲烷菌在这些环境中可以通过与其他微生物形成复杂的共生关系来生存。 1、水体中的甲烷菌 水体中的甲烷菌主要分布在浅海、深海和淡水湖泊等处。在浅海和深海中，甲 烷菌通常生长在富含有机底物的沉积物表面，这是因为这些底物可以为甲烷菌提供氧化甲烷所需的能量。在淡水湖泊中，甲烷菌主要生长在沉积物中。此外，甲烷菌还可以生长在河流尾部、湿地和沼泽等生态系统中。这些环境中的甲烷菌通常会利用有机物质、硫酸盐和二氧化碳等化合物来合成甲烷。 2、沉积物中的甲烷菌 沉积物中的甲烷菌主要生长在含有丰富有机质的水体底部。它们与其他微生物 一起形成复杂的生态系统，在这个系统中，甲烷菌从其他微生物的代谢产物中获得能量，并将其转化为甲烷。这个过程被称作甲烷发酵。沉积物中的甲烷菌不仅能够形成巨大的甲烷气泡，还可以将甲烷转化为二氧化碳和水，为其他微生物的代谢提供能量。 二、甲烷菌的营养代谢特性
与其他微生物相比，甲烷菌的营养代谢特性非常特殊。它们依赖于甲烷作为主 要的能量来源，并利用一些代谢途径将其转化为有机物质。以下是甲烷菌的两种代谢途径： 1、甲烷氧化还原途径 甲烷氧化还原途径是甲烷菌将甲烷转化为有机物质的主要途径之一。在这个途 径中，甲烷菌将甲烷氧化为一氧化碳和水，并将其合成为亚甲基四羧酸和二氧化碳。在这个过程中，甲烷菌需要不断从外界获取氧，以维持氧化甲烷的过程正常进行。 2、醇异构化途径 醇异构化途径是甲烷菌将甲烷转化为有机物质的另一种途径。在这个途径中， 甲烷菌将甲烷氧化成甲醇，再将甲醇转化成甲醛。最后，甲醛再被 further 氧化成 有机酸和二氧化碳。相比甲烷氧化还原途径，这种途径对氧的需求更低，更适合于一些缺氧的环境中。 三、甲烷菌在环境中的作用 甲烷菌在自然界中扮演着极为重要的角色。它们在地球大气中的甲烷循环中发 挥着关键性的作用，同时也对浮游动物和水生植物的生长发挥着重要的作用。 1、甲烷菌与生态环境的关系 甲烷菌与生态环境的关系十分密切。它们能够分解水体和沉积物中的氨基酸和 蛋白质等有机物，将它们转化为甲烷。同时，甲烷菌还可以将有机物转化成二氧化碳和水，为其他微生物的代谢提供能量，促进环境中的生态系统的稳定和循环。 2、甲烷菌在能量来源转化中的作用 甲烷菌在地球大气中的甲烷循环中发挥着关键性的作用。它们通过将甲烷氧化 为一氧化碳和水来释放能量，并将其合成为亚甲基四羧酸和二氧化碳。这个过程可以为其他微生物的代谢提供能量，促进环境中的生物循环。
《微生物学》课程论文 论文题目：产甲烷杆菌的研究和其利用前景工艺学学院：生命与地理科学学院 专业：生物科学 班级：S10A 学号：20101911131 姓名：刘韬 成绩：
目录 1 产甲烷菌的分类................................................................................................................................ - 2 - 2.产甲烷菌的生态多样性.................................................................................................................... - 2 - 3．生长繁殖特别缓慢.......................................................................................................................... - 3 - 4.产甲烷菌代谢途径............................................................................................................................ - 3 - 5.甲烷合成的途径................................................................................................................................ - 3 - 6.沼气池中产甲烷杆菌和不产甲烷菌的关系.................................................................................... - 4 - 6.1不产甲烷细菌为产甲烷菌提供生长基质和产甲烷所需的底物 ......................................... - 4 - 6.2不产甲烷细菌为产甲烷菌创造适宜的厌氧环境................................................................. - 4 - 6.3不产甲烷细菌为产甲烷菌清除有毒物质............................................................................. - 4 - 6.4产甲烷菌为不产甲烷细菌生化反应解除反馈抑制............................................................. - 4 - 6.5共同维持沼气发酵环境中的适宜pH值............................................................................... - 5 - 6.6不产甲烷细菌构建了产甲烷菌的“古环境” ....................................................................... - 5 - 7.产甲烷杆菌的应用前景.................................................................................................................... - 5 - 7.1废水处理................................................................................................................................. - 5 - 7.2酿酒工业上的应用................................................................................................................. - 5 - 7.3产甲烷菌在煤层气开发中的应用......................................................................................... - 6 - 8. 结语................................................................................................................................................ - 6 - 参考文献................................................................................................................................................ - 6 -
产甲烷菌 胡俊英 222010328210116 动医二班 摘要：产甲烷菌（Methanogenus），是专性厌氧菌，属于古菌域，广域古菌界，宽广古生菌门。1974年《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）中将其归属于1科、3属、9种。截至1992年已发展为3目、7科、19属、70种。截至2009年已发展为4目、12科、31属。 1979年，Balch和Wolfe通过16S rRNA测序将产甲烷菌发展为3目（甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目）4科7属14种。 1993年，Boone将甲烷八叠球菌科上升为一个目，建立了火热产甲烷菌目，至此产甲烷菌发展为5目10科25属59种。 2001年，Bergey's Manual of Systematic Bacteriology将产甲烷菌放在宽广古生菌门（Euryarchaeota）中，至此产甲烷菌发展为3纲，5目，10科，26属，78种。 产甲烷菌属于古菌域（Archaea），广域古菌界（Euryarchaeon），宽广古生菌门（Euryarchaeota）。 关键词：产甲烷细菌，厌氧分离技术，产甲烷作用 产甲烷菌（Methanogenus），是专性厌氧菌，属于古菌域，广域古菌界，宽广古生菌门。1974年《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）中将其归属于1科、3属、9种。截至1992年已发展为3目、7科、19属、70种。截至2009年已发展为4目、12科、31属。 1979年，Balch和Wolfe通过16S rRNA测序将产甲烷菌发展为3目（甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目）4科7属14种。 1993年，Boone将甲烷八叠球菌科上升为一个目，建立了火热产甲烷菌目，至此产甲烷菌发展为5目10科25属59种。 2001年，Bergey's Manual of Systematic Bacteriology将产甲烷菌放在宽广古生菌门（Euryarchaeota）中，至此产甲烷菌发展为3纲，5目，10科，26属，78种。 产甲烷菌属于古菌域（Archaea），广域古菌界（Euryarchaeon），宽广古生菌门（Euryarchaeota）。 已知产甲烷细菌约有10多种，主要有产甲烷杆菌、甲烷八叠球菌、产甲烷螺菌和瘤胃甲烷杆菌等。 这类细菌常见于沼泽、池溏污泥中，在食草动物的盲肠、瘤胃中也有大量的产甲烷细菌，常随粪便排出，所以在沼气池中可用塘泥和牲畜粪便接种。我国农村不少地区已建起了许多小型沼气池，利用沼气做饭、照明，既解决了燃料困难， 又减少了环境污染。 分布在污泥、泥沼和哺乳动物消化道等的代谢产物为甲烷（甲烷发酵）的细菌。马氏甲烷球菌（Methanococcus）、甲烷甲烷八叠球菌（Me thano-sarcina）、反刍甲烷杆菌（Methanobacterium）等都是不生孢子的专性厌氧细菌。在核蛋白体RNA碱顺序、细胞壁成分及脂质种类方面与一般细菌有不同处
甲烷菌群落的构建与应用 甲烷菌是一种生长在无氧环境下的微生物，它们通过代谢产生甲烷气体，所以 被称为甲烷产生菌。他们广泛存在于土壤、沉积物和水体中，扮演着生态系统中重要的角色。甲烷菌可以通过一系列的反应链将有机物质分解成甲烷和二氧化碳，其中甲烷是一种温室气体，对气候变化有着重要的影响。 甲烷菌在环境工程和生命科学研究方面有着重要的应用。在工业生产中，甲烷 菌可以被应用于生物发酵、能源生产、污水处理和废物处理中。在生命科学领域，甲烷菌的研究可以帮助我们更好地理解微生物多样性、代谢途径以及生态系统的相互作用。 构建甲烷菌群落的方法有许多种，其中常用的包括群落传递、连续培养和变压 培养等。群落传递是指在培养皿中将甲烷菌传递到新的培养基中，以保持菌群的稳定性。连续培养是指将甲烷菌种子菌连续接种，以维持菌群的生长和活力。变压培养是一种利用高压力进行培养的方法，可以有效地提高甲烷菌的生长速率和产甲烷量。 在应用方面，甲烷菌可以被用作工业能源的来源。通过将甲烷菌置于发酵罐中，可以进行甲烷发酵反应，从而获得甲烷气体。这种方法可以替代传统的燃煤、燃油等能源，减少碳排放和对环境的污染。此外，甲烷菌的应用还可以帮助我们更好地处理废水和污水。在污水处理的过程中，甲烷菌可以帮助分解有机物、氮和磷等物质，从而有效地减少污染物的含量。 在生命科学领域，甲烷菌的研究也有着广泛的应用。甲烷菌代谢途径的研究可 以帮助我们更好地了解微生物的代谢特征和生态系统功能。同时，甲烷菌的遗传学研究也可以帮助我们更好地理解它们的遗传特征和调控机制。
总的来说，甲烷菌群落的构建与应用在环境工程和生命科学研究中都具有广泛的应用价值。通过研究和应用甲烷菌，我们可以帮助减少碳排放和环境污染，同时也可以更好地了解微生物多样性和生态系统互动。
产甲烷菌的富集培养原理 产甲烷菌（methanogenic archaea）是一类厌氧微生物，它们可以利用有机废物发酵产生甲烷气体。产甲烷菌广泛存在于自然界中的湖泊、沼泽、污水处理厂等环境中。富集培养产甲烷菌是研究和利用这种微生物的重要途径之一。 产甲烷菌的富集培养原理主要包括以下几个步骤： 1. 筛选适宜的培养基和条件：产甲烷菌是厌氧微生物，所以在富集培养过程中，必须提供适宜的培养基和条件。一般情况下，采用液体培养基，其中包含有机废物（如酒精、醋酸、葡萄糖等）作为产甲烷菌的碳源。同时，培养基中也需要添加适量的无机盐（如氯化钠、硫酸盐等）和缺氧条件。 2. 富集菌种：富集菌种是指从环境样品中选择并富集产甲烷菌的过程。一般情况下，我们可以从湖泊、沼泽等天然环境中采集土壤或水样作为起始材料。然后将样品转移到含有贫氧环境和适宜培养基的培养瓶中，经过一系列的稀释和传代培养，以逐步富集产甲烷菌。富集过程中还可以利用一些特定的筛选方法（如含有抑制甲醇菌等）来选择目标菌株。 3. 制备纯培养：经过多次传代培养和鉴定，最终可以获得由单一菌株组成的纯培养。一般情况下，通过孤立菌落的方法，从富集培养液中选择单一的产甲烷菌菌落，然后经过多次传代培养，最终获得纯培养。
4. 生理特性和代谢途径研究：获得纯培养后，可以对产甲烷菌进行更详细的研究，包括其生长特性、代谢途径、环境适应性等方面。通过测量产甲烷菌的生长曲线、产甲烷量、产氢量等参数，可以了解产甲烷菌的生理特性。通过测定其代谢途径，可以了解产甲烷菌是如何将有机废物转化为甲烷气体的。 总之，通过富集培养产甲烷菌，可以获得较纯的产甲烷菌培养，并进行进一步的研究，为产甲烷菌的利用与应用提供基础。这对于我们研究甲烷生成机制、污水处理、生物能源等方面具有重要的意义。同时，产甲烷菌的富集培养也是微生物学研究中常用的方法，可以为其他微生物的富集培养提供参考。
基于GenBank中16S rRNA分析的产甲烷菌的地域分布特 征 晏磊;郎传平;王伟东;王彦杰 【摘要】通过从GenBank中搜集产甲烷菌,探讨产甲烷菌的地域分布特征.目前,收集到的甲烷杆菌纲,甲烷球菌纲和甲烷火菌纲产甲烷菌16S rRNA序列235条,相似性分析后剩余191条.综合分析产甲烷菌16S rRNA的全长、前段、中段和后段的系统进化树可发现,全球不同地域来源的产甲烷菌的分布有一定的特征,甲烷球菌纲的产甲烷菌多来源于海洋沉积物,甲烷微菌纲和甲烷杆菌纲的来源比较广泛,但也有一定的偏好性,沉淀物和动物来源的产甲烷菌具有明显差别,而同为淡水、油田或是稻田的产甲烷菌的相似性却较高.基于此推测产甲烷菌的起源可能是多源的,环境可能作为进化压力在产甲烷菌的长期进化过程中扮演重要的角色. 【期刊名称】《黑龙江八一农垦大学学报》 【年(卷),期】2017(029)005 【总页数】7页(P59-65) 【关键词】产甲烷菌;16SrRNA序列分析;地域分布;系统发育 【作者】晏磊;郎传平;王伟东;王彦杰 【作者单位】黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆 163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆 163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆 163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆 163319 【正文语种】中文
【中图分类】Q938 甲烷是一种温室气体，更是新的清洁能源。产甲烷菌是甲烷的主要来源，也是一类极端厌氧古细菌，属水生古细菌门（Euryarchaeota）。甲烷细菌有球形、杆形、螺旋形，八叠球状等，还有的能连成长链状[1]。产甲烷菌属于严格厌氧微生物， 常和伴生菌生活在一起，菌体大小形态都十分相似，在一般光学显微镜下不好判明。而且其生长繁殖特别缓慢，故而培养分离比较困难。美国著名微生物学家Hungate曾在上世纪50年代培养分离甲烷细菌并获得成功[2]。其后世界上很多 研究者对甲烷细菌进行了培养分离工作，并对Hungate所建立的分离方法进行了改良，使甲烷细菌相比过去更易于培养分离。产甲烷菌存在于严格厌氧环境，如人类的消化系统和反刍动物的瘤胃、动物粪便、厌氧污泥和沼气反应器、湖泊或海底沉积物、深部油层和煤层等环境中均有分布。此外，产甲烷菌还存在于某些极端环境中[3]，其数量丰富，种类繁多。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》（第九版）截至2016年产甲烷菌已经发展为4纲5目[5]，分别为甲烷杆菌纲（Methanobacteria），甲烷球菌纲（Methanococci），甲烷微菌纲（Methanomicrobia），甲烷火菌纲（Methanopyri），尤其是甲烷微菌纲包括产甲烷菌数目最多。通过对其基因组学的研究使得对其代谢特点和分类与其地域分布的联系被了解。 16S rRNA经常被用来作为原核生物系统发育以及多样性研究的标志性基因，用表型方法鉴定有困难的原核生物，用16S rRNA序列分析能进行快速准确的鉴定[4]。目前为止，中国，日本，印度，德国，中国台湾，美国，俄罗斯，太平洋，印度洋以及大西洋等世界各处均有发现产甲烷菌。因而，通过对GenBank中搜索到的235条产甲烷菌序列的16S rRNA的分析，了解产甲烷菌的地域分布特征，进而 探寻到产甲烷菌进化起源。 1.1 数据来源
实验十二厌氧性细菌（厌氧培养方法） 厌氧性细菌（Anaerobicbacteria）是一大群必须在无氧或低氧环境中才能生长繁殖的细菌；一般情况下，这类细菌在无氧条件下比在有氧环境中生长好，不能在空气（氧气浓度大于18%）和（或）二氧化碳浓度小于10%以下的固体培养基表面生长。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢多以无氧发酵的方式进行。它能引起人体不同部位的感染，包括阑尾炎、胆囊炎、中耳炎、口腔感染、心内膜炎、子宫内膜炎、脑脓肿、心肌坏死、骨髓炎、腹膜炎、脓胸、输卵管炎、脓毒性关节炎、肝脓肿、鼻窦炎、肠道手术或创伤后伤口感染、盆腔炎以及菌血症等。（一）无芽胞厌氧菌主要种类及生物学性状 无芽胞厌氧菌共有23个属，与人类疾病相关的主要有10个属。 1.革兰阴性厌氧杆菌有8个属，类杆菌属中的脆弱类杆菌最为重要。形态呈多形性，有荚膜。除类杆菌在培养基上生长迅速外，其余均生长缓慢。 2.革兰阴性厌氧菌有3个属，其中以韦荣菌属最重要。为咽喉部主要厌氧菌，但在临床厌氧菌分离标本中，分离率小于1%，且为混合感染菌之一。其他革兰阴性球菌极少分离到。 3.革兰阳性厌氧菌有5个属，其中有临床意义的是消化链球菌属，主要寄居在阴道。本菌属细菌生长缓慢，培养需5～7天。 4.革兰阳性厌氧杆菌有7个属，其中以下列3个属为主： （1）丙酸杆菌属：小杆菌，无鞭毛，能在普通培养基上生长，需要2～5天，与人类有关的有3个种，以痤疮丙酸杆菌最为常见。 （2）双歧杆菌：呈多形性，有分枝，无动力，严格厌氧，耐酸。29个种中有10个种与人类有关，其中只有齿双歧杆菌与龋齿和牙周炎有关。其他种极少从临床标本中分离到。 （3）优杆菌属：单一形态或多形态，动力不定，严格厌氧，生化反应活泼，生长缓慢，常需培养7天，最常见的是迟钝优杆菌。 （二）微生物学检查 要从感染灶深部采取标本。最好是切取感染灶组织或活检标本，立即送检医.学教育网搜集整理。 1.直接涂片镜检：将采集的标本直接涂片染色镜检，观察细菌形态、染色及菌量，为进一步培养以及初步诊断提供依据。 2.分离培养与鉴定：分离培养是鉴定无芽胞厌氧菌感染的关键步骤。标本应立即接种相应的培养基，最常用的培养基是以牛心脑浸液为基础的血平板。置37℃厌氧培养2～3天，如无菌生长，继续培养1周。如有菌生长则进一步利用有氧和无氧环境分别传代培养，证实为专性厌氧菌后，再经生化反应进行鉴定。 厌氧菌广泛分布于自然界以及人和动物的体内，具有以下特点： 1、种类繁多，分类方法多。 （1）按照形态厌氧性细菌分为芽胞厌氧菌和无芽胞厌氧菌两大类。芽胞厌氧菌只有一个菌属，即梭状芽胞杆菌属，共有100多个种；无芽胞厌氧菌有40多个菌属，300多个种和亚种。 （2）根据对O₂的耐受程度，可将厌氧菌分为3大类：（1）对氧极端敏感的厌氧菌：代表菌种为月形单胞菌。这类细菌对厌氧条件要求很高，在空气中暴露10min即死亡，临床上很难分离出；（2）中度厌氧菌：代表菌种为脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌等临床分离常见的厌氧菌。它们在空气中暴露60～90min或在脓汁抽出72h后仍然能分离出来；（3）耐氧厌氧菌：代表菌种为溶组织梭菌。这类细菌不能利用氧，在无氧条件下生长好，而在有氧条件下生长不佳。也有按照其对氧的耐受的程度不同，可分为专性厌氧菌和兼性厌氧菌等。专性厌氧菌（Obligate anaerobe），是指在无氧的环境中才能生长繁殖的细菌。此类细菌缺乏完善的呼吸酶系统，只能进行无氧发酵，不但不能利用分子氧，而且游离氧对其还有毒性作用。如破伤风杆菌、肉毒杆菌、产生荚膜杆菌等。只能在没有游离氧存在的环境中生存的微生物。甲烷菌即属此类细菌。人们利用甲烷菌等产生沼气，利用厌氧菌处理各种有机废物和废水。