常用免疫组化试剂介绍 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】
常用免疫组化试剂介绍
一、用于鉴别诊断
(一)上皮源性：
1.细胞角蛋白/cytokeratin.CK：
目前，商品化的细胞角蛋白有20多种，不同的分子量代表不同类型的上皮标志。通常将CK分为两大类型：Ⅰ型（低分子量）；Ⅱ型（高分子量）。理论上讲，大多数单层上皮表达低分子量的CK；复层上皮多表达高分子量的CK；移形上皮（膀胱）和假复层上皮（呼吸道的被覆上皮）既表达低分子量的CK，也表达高分子量的CK。
在癌组织中，低分子量的CK多在腺癌中表达，高分子量的CK多在鳞癌中表达。目前为止，未发现任何一种上皮只含有一种CK，某些上皮可含2-10种不同分子量的CK。因此，目前试图应用单一的CK免疫表型来确定某种特定的上皮性肿瘤是不可能的。同样，应用CK来区别腺癌、类癌和间皮瘤也是困难的。因此，CK 的免疫组化结果判断是一个较为复杂的问题，在应用这类标记物作为腺癌和鳞癌的鉴别应特别注意。有必要时，应联合用多种CK加以综合判断。
CK的阳性表达还包括有间变癌、双向分化的滑膜肉瘤、脊索瘤、胚胎癌、间皮瘤、上皮样肉瘤、胸腺瘤等。
CK的阴性表达有：副节瘤单向分化的滑膜肉瘤、软骨（肉）瘤、精原细胞瘤、淋巴瘤、脑膜瘤、恶黑、恶纤组、软组织肉瘤（除特殊类型外）。
在判断CK免疫组化结果时应注意几点：
（1）CK的单克隆抗体优于多克隆抗体；
（2）CK常出现斑点状的假阳性反应，应注意识别；
（3）虽然大多数CK多在胞浆表达，但CK17多在胞核表达；
（4）绝大多数CK抗体需用胰酶消化，可增加阳性表达率和染色强度；
（5）部分非上皮性肿瘤（平滑肌肉瘤）可见有CK表达，在诊断时应注意；（6）淋巴结、扁桃体和脾组织中的滤泡外的网织细胞含有CK8和18以及desmi n,在判断淋巴结转移癌和肌源性肉瘤转移时应根据组织学综合判断。
2.上皮膜抗原（epithelialmembraneantigen/EMA）：
EMA是上皮细胞分泌的一种乳脂小球膜糖蛋白，广泛存在于人体各种上皮细胞中（也存在于间皮细胞、浆细胞、组织细胞和T细胞淋巴瘤中），其分布与角蛋白相似，但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白，尤其是分化差的癌EMA有时可呈强阳性表达。
EMA可作为上皮源性肿瘤的常用标记物。EMA阳性表达的肿瘤有鳞癌、胃肠道腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、间皮瘤、滑膜肉瘤、甲状腺乳头状癌、上皮样肉瘤等。
在判断EMA免疫组化结果时应注意几点：
（1）EMA虽然是上皮细胞非常敏感的标记，但一些非上皮性肿瘤（如浆细胞、组织细胞和T细胞淋巴瘤）也可阳性表达。因此在癌和其他间叶性肿瘤鉴别时不能作为唯一的参考标记；
（2）EMA对内脏上皮源性肿瘤的敏感性优于体表上皮源性肿瘤，因此在腺癌中的表达明显高于鳞癌。
3.桥粒蛋白：是上皮细胞特有的结构，是一种广谱的上皮性标记。鳞癌、腺癌、移形细胞癌、未分化癌和间皮瘤、尤文氏肉瘤表达。
在判断桥粒蛋白免疫组化结果时应注意几点：
（1）桥粒蛋白也可在心肌、脑膜瘤、卵巢的颗粒细胞瘤和淋巴结的网织细胞中表达；
（2）甲状腺间变癌阳性表达率低；
（3）冰冻切片效果优于石蜡切片。
（二）间叶源性肿瘤的标记
1.波形蛋白Vimentin：
是一种52-58的胞浆蛋白。主要分布于间叶细胞及其起源的肿瘤，是间叶细胞及其肿瘤的特异性标记。横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤和非肌源性软组织肿瘤如纤维肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、恶纤组、精原细胞瘤、雪旺氏瘤和骨肿瘤Vimentin 是一个关键标记。此外，血管球瘤、颗粒细胞肌母细胞瘤、淋巴瘤、白血病和恶黑等均可有Vimentin表达。
在判断Vimentin免疫组化结果时应注意几点：
（1）部分肿瘤（如间皮瘤、滑膜肉瘤、乳腺癌、肺腺癌等）除Vimentin（+）表达外，可同时又有cytokeratin的表达。应结合其组织学形态加以诊断。（2）福尔马林固定的组织标本，vimentin假阴性并不少见，冰冻切片酒精固定的组织可提高其敏感性和可靠性；
（3）vimentin不能单独用于软组织肿瘤的诊断，多提倡与其他特异性标记物联合使用。
2.结蛋白desmin：
是一种分子量为50-55ku的细胞浆蛋白，胚胎和成人横纹肌或平滑肌及其肿瘤均可表达。子宫、皮肤、胃肠道及其他部位的平滑肌多呈（+）表达。现已发现de smin在良性肿瘤的阳性率和染色强度明显高于恶性肿瘤；高分化的平滑肌肉瘤和染色强度明显高于低分化的平滑肌肉瘤。Suster报道5例皮肤是上皮性平滑肌肉瘤均为（-），而actin和vimentin均为（+）反应。因此目前认为，多应用配套抗体，即与其他肌源性抗体联合应用，不能只根据desmin(-)来排除平滑肌肉瘤的诊断。
在判断desmin免疫组化结果时应注意几点:
（1）非常原始的肌源性肿瘤常不表达desmin;
（2）某些非肌源性肿瘤也有desmin表达，如纤维肉瘤、恶纤组、腺泡状软组织肉瘤和个别腺癌
（3）常规福尔马林固定、石蜡包埋的低分化横纹肌肉瘤可能表现假（-）结果；（4）desmin不能用于区别横纹肌肉瘤还是平滑肌肉瘤；
（5）血管平滑肌不表达desmin。
3.肌动蛋白Actin：
是一种具有收缩能力的微丝蛋白，几乎分布于所有的肌型细胞，根据其结构形式的不同，至少有6种不同的类型，即横纹肌型、心肌型、平滑肌型（两种）和非肌源型（两种）。目前商品化的Actin包括有肌肉型（HHF35），在心肌、平滑肌和横纹肌细胞及其肿瘤中均有表达，尤其在低分化的横纹肌肉瘤和平滑肌肉瘤中的表达，其敏感性和特异性均比desmin高;Actin肌源节型，主要用于横纹肌及其肿瘤的诊断；Actin平滑肌型（SmoothMuscle），主要用于平滑肌及其肿瘤（肉瘤）的诊断。
在判断actin免疫组化结果时应注意几点：
（1）三种在肌源性肿瘤的诊断意义上，尚不能作为一个独立的诊断指标，因为三者之间存在交叉反应；
（2）一些非肌源性肿瘤也可有Actin（+）表达，如皮肤、口腔、喉、涎腺肿瘤以及星形细胞瘤等；
（3）部分器官和组织的非肌上皮细胞也有Actin（+）表达，如肺、食管、胃、十二指肠、膀胱的上皮细胞和肝脏、肾、胎盘以及胰岛细胞等；
（4）HHF35也可标记肌上皮细胞，但其敏感性和特异性均不如平滑肌型actin；（5）福尔马林固定的组织，部分病例可有一些非特异性染色。
4.肌红蛋白myoglobin：
myoglobin被认为是存在于正常横纹肌和横纹肌肿瘤中的一种分子量为17.8ku 的胞浆蛋白，可作为横纹肌肉瘤的特异性标记。
在判断myoglobin免疫组化结果时应注意几点：
（1）虽然myoglobin有较高的特异性，但要注意其假（+）反应，尤其是坏死或退变以及残留的正常横纹肌均有myoglobin（+），应注意识别；
（2）某些肿瘤如恶黑、浸润型乳腺癌、软组织淋巴瘤等也有myoglobin（+），这个可能是瘤细胞破坏横纹肌时吞噬了myoglobin所致；
（3）烤片温度过高，>60℃时可能会破坏其抗原，造成假（-）.
（三）神经和内分泌细胞标记：1胶质纤维酸性蛋白GFAP：是一种分子量为4 7ku的酸性蛋白。研究发现：GFAP不仅在星形神经胶质细胞及其肿瘤中存在，还见于各种类型的星形细胞瘤、混合性胶质瘤、多形性成胶质瘤、室管膜下巨细胞性星形细胞瘤、异位星形细胞瘤、松果体瘤和髓母细胞瘤中向胶质分化，以及含胶质成分的神经鞘瘤等肿瘤中。在判断GFAP免疫组化结果时应注意几点：（1）GFAP不仅在星形细胞和胶质细胞中表达，其他脑肿瘤如成血管细胞瘤等也可表达，尤其是伴有星形细胞分化时，因此应注意识别。（2）GFAP作为中枢神经肿瘤的诊断和分类时，应密切结合HE的形态学改变，尤其是儿童的脑肿瘤。（3）GFAP（+）细胞的染色强度和数量与肿瘤分化程度有关，高分化的（+）表达较好，低分化的表达较弱甚至（-）。2.神经纤维细丝蛋白NF：是神经元特异性中间丝蛋白，主要存在于神经细胞内，故作为神经细胞分化的标志。肾上腺内外嗜铬细胞瘤等也可呈（+）反应。神经节胶质细胞瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤等（-）；另外，恶黑也可呈（+）。3.S-100蛋白：早期人们认为，S-100是一种神经系统特异性蛋白存在于胶质细胞和雪旺氏细胞及其肿瘤中，后来的研究证明：S-100也存在于一些非神经源性的正常细胞和肿瘤中，如脂肪组织、脂肪瘤，偶见
于脂肪肉瘤；软骨细胞、软骨瘤以及一部分软骨肉瘤等。几乎所有的黑色素瘤S -100（+）。S-100蛋白染色强度与瘤细胞的分化程度关系不大。在判断S-100免疫组化结果时应注意几点：（1）S-100蛋白可在一些非神经源性细胞中表达，包括低分化癌，因此在神经系统肿瘤的诊断时应考虑到这点；（2）S-100蛋白阳性定位在一些细胞中可为胞浆，一些细胞为胞核，另一些细胞为胞浆/胞核共存；（3）由于S-100蛋白敏感性高，特异性差，所以在诊断上应用受到限制。
4.神经元特异性烯醇酶NSE：
原先认为NSE只存在于神经元中，现已证明，除神经元外，NSE也广泛存在于各种正常的神经内分泌细胞和许多相应的神经内分泌肿瘤中，包括不同部位的类癌、甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤、副节瘤、胰岛细胞瘤、垂体腺瘤、肺的小细胞癌和皮肤的Merkel癌。而雪旺氏瘤、神经纤维瘤和成神经细胞瘤（-）。NSE （+）表达为胞浆弥漫性着色。现有的资料表明，NSE可在平滑肌、肌上皮细胞、肾小管细胞、淋巴细胞、支气管上皮细胞和Ⅱ型肺泡细胞中表达，因此NSE 的特异性引起怀疑。
在判断NSE免疫组化结果时应注意几点：
（1）非神经元性肿瘤也有NSE（+）表达，包括胶质瘤、脑膜瘤、雪旺氏瘤、脉络丛乳头状瘤、神经瘤、乳腺纤维腺瘤、乳腺癌和肾细胞癌等；
（2）NSE在神经病理学中的诊断价值应根据各种特殊病变加以认识；
（3）虽然NSE在神经源性肿瘤的表达比神经纤维丝蛋白NF更为常见，但不能作为中枢神经系统肿瘤的特异性标记物；
（4）由于NSE特异性差，因此不能单独使用，应与其他相应的标记物联合使用。
（5）原始的神经内胚层来源的肿瘤常呈（-）。
5.突触素Syn：
是一种突触前酸性转膜蛋白，分子量为38ku。SY可在许多神经源性和神经内分泌肿瘤中表达，如髓母细胞瘤、成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、副节瘤、节细胞神经瘤、垂体腺瘤、甲状旁腺瘤、肺和胃肠道类癌、胰岛细胞瘤、甲状腺髓样癌等大多数神经内分泌肿瘤。
在髓母细胞瘤的IHC中，SY比NF更为敏感。同时，SY比嗜铬素A更敏感，比N SE更特异。对胰岛细胞及其肿瘤的诊断比嗜铬素A更可靠。目前尚未发现SY在非神经源性肿瘤和非神经内分泌肿瘤表达的报道。
在判断Syn免疫组化结果时应注意几点：
（1）冰冻切片效果最好，福尔马林固定、石蜡包埋的组织也可，但固定时间不宜过长，一般不超过24h；
（2）如果突触素含量低，用PAP法和ABC法可能检测不出（+）结果，最好使用S-P法或与其相似的检测系统。
6.嗜铬素A/CgA：
是一组分子量为68-120ku的可溶性酸性蛋白。存在于各种正常神经内分泌细胞及其肿瘤中，包括垂体腺瘤、胰岛细胞瘤、嗜铬细胞瘤、甲状腺髓样癌、甲状旁腺瘤和类癌等。
目前认为，CgA和SY是对神经内分泌肿瘤特异的标记物。
在判断CgA免疫组化结果时应注意几点：
(1)CgA（+）表达不能说明肿瘤的组织来源?
(2)CgA的敏感性不如NSE，在部分神经内分泌肿瘤中，如胰岛细胞瘤、生长抑素瘤、分泌催乳素和皮质醇的垂体腺瘤可以不表达；
(3)CgA（-）不能排除激素细胞的存在和神经内分泌肿瘤的诊断；
(4)肺小细胞癌、皮肤的Merkel细胞瘤和成神经细胞瘤，CgA的（+）程度不一，灶性表达或（-），只能说明这些肿瘤细胞中含分泌颗粒少而已。
（四）淋巴造血细胞的标记在全身各系统疾病的病理诊断中，淋巴组织的病理诊断难度是最大的。在目前应用的单克隆抗体中，淋巴细胞抗体的种类最多，下面介绍几个常用的：
1.白细胞共同抗原LCA：
2.B细胞常用的标记：CD20（L26）：90%B细胞NHL、少数T细胞NHL均阳性，非造血细胞来源的肿瘤（胸腺瘤除外）阴性。
3.T淋巴细胞常见标记：CD45RO：阳性细胞见于T细胞、有些B细胞、单核细胞、粒细胞。
（五）肿瘤相关抗原：1.癌胚抗原CEA：最先被认为是结肠癌的特异性抗原，随着研究的深入，发现许多上皮性肿瘤尤其是内胚层来源的肿瘤如胃肠道癌、肺癌、胰腺癌、胆管癌和乳腺癌等均可见CEA表达；同时一些正常的上皮细胞也有表达。在判断CEA免疫组化结果时应注意几点：（1）CEA（+）不能作为确认肿瘤的组织来源的标记；（2）到目前为止，CEA不能用作良、恶性上皮性肿瘤的鉴别诊断；（3）不管是单克隆还是多克隆抗CEA抗体，在某些肿瘤中可表现有非特异性染色，应注意识别。2.甲胎蛋白AFP：AFP是由胚胎卵黄囊细胞、胚胎肝细胞和胎儿肠道细胞合成的一种糖蛋白。临床上常以血中AFP水平增加作为原发性肝细胞癌诊断的重要的指标之一。AFP在肝癌的（+）表达只占60%+-，而一些非肿瘤性的肝细胞（如肝硬化和肝炎）以及转移性肿瘤的癌旁肝细胞也有AFP 表达。在生殖细胞肿瘤中，内胚窦癌和混合性生殖细胞肿瘤，以及胚胎癌中的卵黄囊成分可见AFP（+）表达。在判断AFP免疫组化结果时应注意几点：（1）AF P（-）不能排除肝细胞癌的诊断；（2）发生在骶尾部、腹膜后、纵隔或松果体
的一些生殖细胞肿瘤，在常规HE染色中常诊断未分化癌，因此有必要作AFP或HCG免疫组化染色，排除有无生殖细胞肿瘤的可能。（3）有报道一些非肝性肿瘤如肺癌、乳腺癌和胃肠道癌，尤其是胃肝样腺癌，AFP可呈（+）。3前列腺特异性抗原PSA：PSA是前列腺上皮细胞特有的一种分子量为33ku的糖蛋白，它存在于正常、增生和肿瘤性前列腺上皮细胞中。在判断PSA免疫组化结果时应注意几点：（1）PSA不能作为良、恶性前列腺病变的诊断标记；（2）少数前列腺癌PSA（-），因此多与PAP（前列腺酸性磷酸酶）同时检测，以提高诊断准确率。
二、激素类：
（一）雌激素受体ER和孕激素受体PR：
ER和PR与乳腺癌预后和内分泌治疗的关系已得到公认，目前已成为乳腺癌的常规检查项目。一般来说，ER和PR（+）的肿瘤缓解率高，复发率低，存活时间长。即使ER和PR中只有一个（+）的病人，其预后也好于两个受体全（-）的病人。
（二）激素调节蛋白PS2：
三、其他类（一）细胞增殖活性的评价：一般认为肿瘤的增殖活性越高，侵袭性就越强。传统的评价方法缺乏客观性。目前应用较为普遍的有用免疫组化等方法检测与细胞增殖有关的核抗原。Ki-67、PCNA均是与细胞增殖有关的核抗原，处于静止期（G0期）的细胞无Ki-67和PCNA。Ki-67和PCNA免疫组化染色均显示核阳性，通常以标记指数（即阳性细胞数占总数的百分比）来区分细胞增殖活性的高低。一般约定，阳性细胞大于？小于25%（+），25%-50%（++），50%-7 5%（+++），大于75%（++++）。
（二）癌基因1.c-erbB-2(Her-2/neu)cerB-2是与乳腺癌关系最密切的一种癌基因。在不同类型乳腺癌中的阳性率差别很大。阳性率较高的类型有浸润性导管癌（22%）、而浸润性小叶癌和小管癌阳性率很低，仅为7%。正常乳腺上皮、间质细胞和乳腺良性病变一般不表达c-erbB-2。最近有人发现，c-erbB-2阳性的肿瘤对常规化疗不敏感，但对Hercetin的治疗有效。C-erbB-2与乳腺癌预后的关系尚有争议，在淋巴结有转移的病人，c-erbB-2阳性通常预示预后不良，但在无淋巴结转移的病人中，c-erbB-2与预后的关系尚不明确。3.Bcl-2Bcl-2最先是在造血系统中发现的一个原癌基因，它通过抑制细胞的死亡而参与肿瘤的发生，Bcl-2的基因产物有阻断细胞调亡的作用近年来的研究发现，Bcl-2基因及其产物在许多正常组织及癌变组织中均有表达。Bcl-2的免疫组化定位在滤泡性淋巴瘤与反应性淋巴滤泡增生的鉴别诊断中具有重要的价值。反应性淋巴中，淋巴帽区Bcl-2强阳性，但生发中心区几乎为阴性；而滤泡性淋巴瘤呈现相反的反应类型，即恶性滤泡呈强阳性，其周围细胞弱
给临床作宣传最好分成大类进行介绍：
1，肿瘤的分类和低分化恶性肿瘤的鉴别诊断.（Classificationanddiagnosis ofpoorlydifferentiatedmalignanttumors）2，鉴别转移癌的原发部位（Identi ficationoftheprimarysiteoforiginofametastatictumor.）3，淋巴瘤和白血病的分类（Classificationoflymphomasandleukemias.）4，确定感染源（Identif icationofinfectiousagents.）5，预后因素分析（Assessmentofprognosticfac tors.）与临床治疗与判断预后有关。包括：（1）乳腺癌ER/PRc-erbB-2检测（2）各种肿瘤细胞耐药性检测，Pgp,TopoII,GST-Pi等检测用于指导临床个性化的化疗（3）细胞增殖活性的判断Ki67,PCNA检测
增加的内容：
二、激素类：（一）雌激素受体ER和孕激素受体PR：ER和PR与乳腺癌预后和内分泌治疗的关系已得到公认，目前已成为乳腺癌的常规检查项目。一般来说，ER和PR（+）的肿瘤缓解率高，复发率低，存活时间长。即使ER和PR中只有一个（+）的病人，其预后也好于两个受体全（-）的病人。
雌、孕激素受体（ER/PR）雌、孕激素受体因抗体克隆号的不同，人种不同，组织固定方法的不同，其阳性率也不同，文献报道不一，范围50%左右，而且乳腺癌组织类型不同，阳性率不一。但雌、孕激素受体含量的测定，对乳腺癌病人内分泌治疗的意义是肯定的，激素受体阳性的乳腺癌预后优于阴性者，阳性者对内分泌治疗反应好、无瘤生存期延长。如果女性乳腺癌细胞中雌、孕激素受体表达阳性，病人可以进行三苯氧胺的治疗。雌孕激素促进癌细胞的生长,携带雌孕激素受体的癌细胞是通过激素促进生长的,三苯氧胺的治疗有封闭癌细胞中雌孕激素受体的功能，癌组织的增生可以通过三苯氧胺治疗来阻止其生长。因此，免疫组化测定雌孕激素受体的表达情况，可以预测三苯氧胺治疗的意义。
肿瘤耐药指标
肿瘤细胞耐药性肿瘤细胞从正常细胞继承和发展了对药物的耐受性。如果肿瘤一旦产生对化疗药物的耐受，将成为化疗成功的主要障碍。
p糖蛋白是一种依赖于ATP的药物外泵，它能将肿瘤细胞内的化疗药物泵出细胞外，从而导致细胞内药物浓度降低，细胞便产生对这种药物的耐受性。
Topo-IITopo-II酶能导致DNA断裂，并催化DNA链通过缺口，增殖期Topo-II
活性比静止期细胞高100倍。瘤细胞Topo-II表达比正常细胞也显着增高，Topo -II抑制剂以Topo-II酶为作用靶，并与之形成复合物，从而抑制Topo-II酶活性，抑制肿瘤增殖。Topo-II酶活性下降或突变，则瘤细胞便对Topo-II抑制剂类化疗药物产生耐药性。
GST-piGST-pi与包括化疗药物如卡氮芥、丝裂蒽等抗癌药物在内的许多药物的代谢有关，降低细胞内GST水平，可增加细胞毒性药物的细胞毒作用，相反细胞内GST水平增加，则化疗药物的细胞毒性作用则下降，即产生对这些化疗药物的耐药性。
常用免疫组化标记物公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
常用免疫组化指标的意义 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 多数腺癌表达CEA Rb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。 E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应 Hep par 1,肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极
免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料的基本要求 2013-01-04 01:48 免疫组织化学抗体试剂及检测试剂是指一类利用免疫学原理结合酶催化底物显色的化学方法，检测组织标本中抗原的检测试剂。此类试剂为待测抗原特异性单克隆或多克隆抗体，或抗体与显色系统、对照试剂、质控片及其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂盒。该类产品检测项目繁多，应用广泛，检测过程为多步骤检测，影响因素多，在临床上主要用于检测细胞的特异性抗原以确定细胞的表型。该类产品的预期用途与诊断、鉴别诊断、预后判断、指导用药相关，按照三类体外诊断试剂管理。 基于该类产品临床应用的重要性及特殊性，根据目前注册申报工作的需要、依据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》、《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》以及《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的相关规定，结合临床及病理检测中的应用实践、临床病理专家和生产企业的建议，现对免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料提出以下基本要求（对于本要求未提及的部分，申请人均应依据相关法规要求提交注册申报资料）。 本《要求》是在目前科学技术认识水平及现阶段免疫组化类产品技术审评基础上形成的，审评人员会密切关注相关技术的最新进展，随着认识的提高将适时调整。由于该类产品种类繁多，《基本要求》不能涵盖所有该类产品的特殊情况，如某些要求不适用，申请人也可采用其他方式证明产品的技术性能，建议申请人对此进行详细说明，并
提交相应的性能验证资料。 依据免疫组化不同标志物的临床应用情况，将其分为二个大类：A类：Her2/Neu、ER、PR、ALK、CD117、c-met、CD20、EGFR等与临床治疗、用药密切相关的标志物；其他全新标记物，具有新的临床意义。 B类：临床使用多个指标综合诊治的标志物之一，与辅助诊断、鉴别诊断、病情监测、预后相关标志物：如：Ki67、CK5/6等。 一、产品说明书 1. 【产品名称】：单独的第一抗体试剂通用名称建议采取以下命名方式：待测抗原特异性抗体+试剂（免疫组织化学法）。抗体与显色系统、对照试剂、质控片及其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂盒通用名称建议采用以下命名方式：待测抗原+检测试剂盒（免疫组织化学法）。如：雌激素受体抗体试剂（免疫组织化学法）、孕酮受体检测试剂盒（免疫组织化学法）。 2. 【预期用途】：应明确检测的样本类型（冰冻和/或石蜡包埋等）；明确抗体的类型、克隆号、阳性着色特点；明确临床用途（诊断、鉴别诊断、预后判断、指导用药）；指明“对任何阳性或阴性结果的解读，应
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
HER2检测试剂盒（免疫组化法）说明书 【产品名称】 通用名称：HER2检测试剂盒（免疫组化法） 英文名称：HercepTest? for Automated Link Platforms 【包装规格】 50测试/盒 【预期用途】 用于常规经福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌组织的组织学评估和HER2的过表达的半定量检测。以及经福尔马林固定、石蜡包埋的胃腺癌组织切片，包括胃食管连接处肿瘤中的HER2的过表达检测。 该抗体着色为棕色DAB染色，定位于细胞膜。是一种半定量免疫组化分析方法，适用于考虑接受曲妥单抗治疗患者的辅助评价方法。 人HER2基因（也称之为ERBB2或NEU）编码蛋白通常称之为HER2或p185HER2。HER2蛋白是一种膜受体酪氨酸激酶，与表皮生长因子受体（EGFR或HER1）具有同源性(1-8)。HER2蛋白通常由各种表皮细胞表达，是一种正常组织成分（8）。 部分乳腺癌患者，HER2蛋白过表达是其恶性转化及肿瘤进展过程的一部分（9）。乳腺癌细胞的表面过表达HER2，提示可能是抗体治疗的一个靶点。曲妥单抗是一种人源的单克隆抗体（10），该抗体能够HER2蛋白高亲和力结合，而且，体内和体外研究已经证实，这种结合可以抑制过表达HER2蛋白的细胞的生长。 大量研究结果表明胃癌中HER2蛋白过表达，HER2基因扩增（31）。无论是IHC还是FISH检测结果中，大约20%的胃癌患者HER2阳性。体内和体外前期临床研究表明，曲妥单抗在不同的胃癌模型上被证实有效，从而带动了多项临床研究（31-35）。在一项III期BO18255临床研究中，ToGA试验，HER2-阳性患者，以及不能手术治疗局部进展期胃癌，胃部复发性/转移性胃癌，或胃食管连接处癌，这些患者被随机地分配接受5-FU或卡培他滨以及顺铂治疗，既可以单独应用也可以与曲妥单抗联合应用。在一项III期BO18255临床研究中，ToGA试验，不能手术治疗局部进展期胃癌，胃部复发性/转移性胃癌，或胃食管连接处癌等HER2-阳性患者被随机地分配接受5-FU或卡培他滨以及顺铂治疗，可单独应用也可与曲妥单抗联合应用。联合治疗的患者整体生存率（OS）有显著性差异（36,37）。曲妥单抗是一种人源化的单克隆抗体（10），可与HER2蛋白高亲和力结合，体内和体外研究均显示，其可抑制肿瘤细胞的生长（32-35）。 【检测原理】 HercepTest?检测试剂盒包含对常规处理的、石蜡包埋的样本进行两步法免疫组化染色所需要的全部试剂。兔抗人HER2蛋白一抗孵育后，该试剂盒采用基于葡聚糖技术的即用型显色试剂。该试剂包含羊抗兔二抗和偶联至葡聚糖多聚体骨架上的辣根过氧化酶分子。因此，不需要再依次使用连接抗体，人免疫球蛋白显色试剂和胎牛血清之间的交叉反应也因为使用固相吸附材料而消除。依次填加的色素原的酶转换，也使得显色反应发生于抗原所在部位。标本需要复染和封片。反应结果在光学显微镜下观察。质控玻片包含3个福尔马林固定、石蜡包埋的人类乳腺癌细胞系，染色强度分别在0、1+、以及3+，提供用于对染色结果进行评估。这些细胞的染色强度与其所表达的受体密度一致。
免疫细胞化学常用试剂 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m
配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液 试剂：多聚甲醛20g 饱和苦味酸 150ml Karasson-Schwlt’s PB至1000ml 配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。 该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。 5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 （Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
免疫组化 免疫组化是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。 免疫组化试剂盒： Vector Laboratories公司VECTASTAIN@ ABC免疫组化试剂盒： Vector公司于1977年率先开发出了生物素-亲和素系统，该产品系列是检测方法上的重要革命。其后，公司发展出ABC技术（Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术），并建立了著名的VECTASTAIN?ABC系统，目前，该系统被视为最灵敏、最可靠与最有效的染色系统，并被广泛应用于免疫组织化学、免疫电镜、原位杂交与凝集素化学中。ABC技术利用生物素和卵白素具有极高亲和性的生物学特征，将卵白素和生物素化辣根酶按照一定的比例混合，形成ABC复合物。该法亦被称作三步法，第一步为biotin化二抗和一抗结合，第二步为avidin（亲和素，A液）和二抗上的biotin结合，第三步为HRP偶联的biotin（B液）和avidin结合，而HRP再催化底物显色完成染色。试剂盒组份： 2ml试剂A（Avidin DH溶液） 2ml试剂B（生物素化的酶） 1ml生物素化的二抗（1.5mg anti-IgG/0.5mg anti-IgM抗体/2.1mg通用抗体） 3ml阻断血清 其中standard试剂盒只含有试剂A和试剂B VECTASTAIN?ABC系列产品 VECTASTAIN?ABC-HRP Kits（辣根过氧化物酶）最通用的系统，使用范围广VECTASTAIN?ABC-AP Kits（碱性磷酸酶）灵敏度较高，染色密度较低，适于形态学染色非常重要的组织 VECTASTAIN?ABC-GO Kits（葡萄糖氧化酶）灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或AP 含量比较高的组织，常与HRP或AP系统配合进行双染。 VECTASTAIN?ABC Kits（辣根过氧化物酶）灵敏度高，特别适用于神经组织
大鼠ASIC1A ASIC1A 免疫组化试剂盒免疫组化试剂盒 该试剂盒以HRP 标记的链霉亲和素复合物（HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）为基础，可用于检测细胞、组织内的特异性ASIC1A 抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的ASIC1A 一抗与相应靶抗原结合后，用生物化二抗与一抗特异性结合，最后加入HRP-SA，形成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA 复合物，显微镜下观察成像。 试剂盒所含试剂试剂盒所含试剂：： 试剂A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（选用） 试剂B 封闭缓冲液（封闭用） 20 mL 试剂C （原装进口分装）已稀释的即用型ASIC1A 一抗（2.5ml） 试剂D （原装进口分装）生物素化羊抗兔IgG 1支 （浓度1.5 mg/mL，稀释比为1:300~1:500）50 μL+抗体稀释液20ml 试剂E HRP-SA 复合物1支（浓度1 μM，稀释比1:50~1:200）100 μL 试剂F DAB 显色液 5ml 用户自备试剂用户自备试剂：： 1． 10mM TBS（pH7.2~7.4） 三羟基氨基甲烷1.21g 氯化钠7.6g 加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH 值至7.2~7.4，最后定容至1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%体积比） 2．抗原修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液） 10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液 柠檬酸0.38g 柠檬酸三钠2.45g 加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH 值至6.0，最后定容至1000mL 或：0.5M EDTA 修复液（pH8.0） EDTA·2H2O 186.1g 柠檬酸三钠2.45g 加蒸馏水700mL，用10mM NaOH 调pH 值至8.0，最后定容至1000Ml 3. 缓冲甘油封固剂10 mL 4. Tween 20 5 mL 石蜡包埋组织切片免疫染色石蜡包埋组织切片免疫染色 实验步骤实验步骤（（建议方案建议方案）：）： 石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度 1.烤片： 将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr； 2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min； 3.水化： 切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min； 4.抗原修复： 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min，TBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）* 注：有些抗原勿需修复，直接进入第5步封闭。 5.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育30 min； 6.加一抗：滴加用试剂C（即用型一抗），37℃湿盒孵育2 hr 或4℃过夜； 7.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）； 8.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育10 min； 9.加二抗： 滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗（试剂D），37℃湿盒中孵育30 min； 10.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）； 11.封闭： 滴加试剂Tween 20，37℃湿盒孵育封闭20 min； 12.加HRP-SA： 滴加用抗体稀释液稀释的试剂E（1：50~200，终浓度5~20 nM），37℃湿盒中孵育30 min； 13.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min），TBS 洗涤（2×5 min）； 14.显色：应用DAB 溶液（试剂F）显色； 15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明； 16.封片： 待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；
免疫组化技术 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 分类（常用） 1、免疫荧光方法 最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
1
1DEPC水(1‰) 1000ml 水 1ml DEPC 根据需要确定要配的体积，泡实验器具的DEPC水静止4小时后备用，泡24小时。配液体的DEPC水37℃过夜，送至高压，然后配相关溶液。 20.1M tris(ph 7.5) 12.114g tris 1000ml DEPC水 用HCL调ph至7.5，高压备用。 3 4%PFA的配制(ph 7.0)40g PFA 1000ml 0.1m tris(DEPC水配制高压) 将溶液持续加热至60℃左右，搅拌之至完全溶解，注意温度不要超过65℃，否则PFA降解失效。 30.2% 甘油/0.1M tris 20ml 甘油 980ml 0.1Mtris 4 20XSSC Nacl 175.3g （ph 7.0）柠檬酸钠88.2g DEPC水1000ml 分别稀释至2XSSC和0.2XSSC备用 5 HEPES 溶液HEPES 23.8g (ph6.8-8.0)DEPC H2O 100ml 6 50X Denhaldt′s 液 聚蔗糖（Ficoll 400）0.2g 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinypyrrolidone) 0.2g 牛血清蛋白（BSA）0.2g DEPC 水20ml 7 预杂交buffer Deinoized formanmid 5ml 20X SSC 1.5ml 1M HEPES 0.5ml 50X Denhanldt′s液1ml 龟精DNA 0.6ml(4ug/ul) DEPC水 1.4ml 龟精DNA 要先95℃10-15min加热变性，随即冰浴。杂交buffer分装后-20℃保存。 8Washing buffer (ph7.5) maleic acid 5.8g NACL 4.4g Tween（吐温） 1.5ml 定容至500ml溶质浓度最后分别为0.1M maleic acid 0.15M nacl 0.3% Tween 9Maleic acid buffer (ph7.5) Maleic acid 5.8g Nacl 4.4g 定容至500ml 溶质的浓度最后分别为0.1M maleic acid 0.15M nacl 10Detection buffer
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
免疫细胞化学常用试剂介绍 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m 配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
自动化免疫组化染色机种类介绍 免疫组化的传统技术正在受到新的快速高敏的新技术的挑战，一方面是新试剂的推出，如SP、EPOS、Envision和CSA，另一方面是自动免疫组化染色机的问世。免疫组化技术正进入一个新的发展阶段。从先进国家免疫组化规范化或标准化的进程来看，自动免疫组化染色机的应用几乎贯穿始终，早在20世纪末已得到极大的普及，然而国内的自动免疫组化染色机应用则在近几年才得以发展。浙江省肿瘤医院作为省内较早应用的少数单位之一，在自动化免疫组化染色的使用和质量控制方面获得些许经验，在此做简单的介绍交流。 自动化免疫组化染色技术是由电脑控制整个染色程序的免疫组化染色机，具有自动加抗体、自动冲洗、显色、复染及预处理等功能，有全自动和半自动、封闭型和半开放型之分。根据不同仪器大小，每次染色20～240张切片不等，整个染色程序约需60～90min左右，它不仅可以应用于免疫组化染色，某些仪器还可应用于组织化学染色、特殊染色及原位分子杂交染色。目前较为理想的仪器为Roche公司、Lecia公司及Thermo公司的产品等。下面对不同机型的自动免疫组化染色机的特点分述如下。 Thermo公司的LabVision Autostainer 该机型属开放式半自动系统类型，用户可任意编辑所需试剂及模板，内建试剂兼容性检测。切片特殊染色模板可任意调整试剂量、孵育时间。体系开放保证可适就性强，即可同时运行不同检测试剂盒和不同的染色程序及不同厂商生的的一抗。使用单一探头，探头材料为特氟伦包被不锈钢，检测探头交叉污染残留物 <10-6 ，且分样精度>99%(总体积)。联合使用配套的抗原修复仪，可实现脱蜡与抗原修复一步完成。DAKO公司的 Autostainer系LabVision Autostainer贴牌产品，配合使用DAKO的Flex检测系统可获得极为敏感的免疫组化结果。早期的Biogenex i6000TM全自动染色仪亦属该类型产品，不同的是其加样头采用标准的Tip头加样，完全避免交叉污染的风险。 Lecia公司的Bond-Max
免疫组化ABC试剂盒(VECTOR)操作流程 一、工作液准备 1、封闭血清（黄色小瓶子）：3滴原液+10mL的缓冲液混合，装入黄色的大瓶子； 2、生物素二抗（蓝色小瓶子）：1滴原液+10mL的缓冲液混合，装入蓝色的大瓶子； 3、ABC复合物：2滴A液加入10mL的缓冲液混合后，加入2滴B液混匀后装入标有ABC 的大瓶子。此处反应需要30min。1滴大概50uL 4、试剂（自备） 二甲苯、PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、一抗稀释液：3%BSA in TBS，pH7.4 DAB工作液：1ml PBS加入50ul DAB stock solution 、50ul Hydrogen Peroxide solution充分混匀 二、步骤 1.脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。 1）组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min； 2）无水乙醇中浸泡5min； 3）95%乙醇中浸泡5min； 4）70%乙醇中浸泡5min； 2.PBS洗两次各5min。 3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。 4.PBS洗5min。 5.用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。 6.滴加封闭血清工作液，室温封闭20min，以减少非特异背景，无需冲洗只需吸去多余血清。 7.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。 8.PBS洗3次每次2min。 9.滴加生物素二抗工作液，室温度孵育30min。 10.PBS洗3次每次2min。 11.滴加ABC复合物（提前30min，A液与B液等量混合），室温孵育30min。