磷酸化蛋白质组如何鉴定
接着上次的内容，今天，小编跟您聊聊磷酸化蛋白质组鉴定！
蛋白质翻译后修饰（PTMs）几乎参与了细胞所有正常生命活动的过程，并发挥十分重要的调控作用。蛋白修饰已经成为国际上蛋白质研究的一个极其重要的领域，目前研究比较成熟的有磷酸化、乙酰化、糖基化、泛素化等。
蛋白质磷酸化是生物体中最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体的生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程，一直是生物学研究的重点与热点。根据客户需求，金开瑞蛋白质组平台可提供磷酸化蛋白质组全谱鉴定、label-free定量技术服务。
磷酸化蛋白质组全谱鉴定以组织、细胞等较为复杂样本为研究对象，目的在于鉴定样品中发生磷酸化的蛋白质以及相应的磷酸化位点。首先对蛋白样本进行酶解，TiO2或IMAC-Fe 或IMAC-Ti富集磷酸化多肽，5600-plus质谱检测，利用得到的质谱谱图与相应数据库搜索比较，从而得到肽段序列结果，同时通过生物信息软件计算出磷酸化位点。对于磷酸化位点鉴定，为了增加定位修饰位点的准确性，金开瑞采用较流行的Ascore算法对发生在各位点的磷酸化修饰做进一步打分评估，从而正确辨别真实修饰位点。
技术路线：
技术特点：
●富集方法特异性高，对低PH溶液、去垢剂、盐类、其它低分子污染物有更高的耐受性，容易与非磷酸化肽段分离；
●通量大，一次可以鉴定1000个以上磷酸化位点。
适用范围：
●已知物种基因组序列、ESTs序列或蛋白质序列全库；
●无其他特别要求。
经典案例：
题目：Identification of tyrosine-phosphorylated proteins associated withlung cancer metastasis using label-free quantitative analyses.（用Label-free定量技术鉴定肺癌转移相关的酪氨酸磷酸化蛋白）
期刊：Journalof proteome research
主要技术：Label-free定量技术
文章摘要：酪氨酸磷酸化（P-酪氨酸）蛋白可参与肺癌的侵袭和转移，但目前已被报道的数量还较少。本文采用Label-free定量技术进行大规模研究酪氨酸磷酸化蛋白及其参与转移过程的情况，共鉴定到来自276个磷酸化蛋白的335个P-Tyr位点。Label-free定量结果显示，有36个磷酸化肽在不同酪氨酸磷酸化蛋白侵袭能力的样品间呈现显著差异。从这些肽段中提取了两个新的位点保守序列和4个已知的特定激酶和磷酸化motif序列：EGFR, Src, JAK2和TC-PTP。通过对P-络氨酸蛋白的蛋白相互作用分析发现，有11个蛋白连接在包含EGFR, c-Src, c-Myc和STAT的互作网络中，该网络已被确认与肺癌转移相关。这11个蛋白中有7个之前未报道，这将提供一个更好的、全面的了解肺癌的侵袭/转移的机制及治疗方法。
图：新发现的三个motif展示
Wu HY, Tseng VS et al. Identification of tyrosine-phosphorylated proteins associated with lung cancer metastasis using label-free quantitative analyses.Journal of proteome research
图：表达量发生显著变化的酪氨酸磷酸化蛋白的网络互作图
Wu HY, Tseng VS et al. Identification of tyrosine-phosphorylated proteins associated with lung cancer metastasis using label-free quantitative analyses. Journal of proteome research
参考文献：Wu HY, Tseng VS, Chen LC,Chang HY, Chuang IC, Tsay YG, Liao PC:Identification of tyrosine-phosphorylated proteins associated with lung cancer metastasis using label-free quantitative analyses.Journal of proteome research 2010,9(8):4102-4112.
蛋白质磷酸化概述 蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增值的基础。很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用，而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。此外，在所以有核生物中，细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。磷酸化作用也控制着分化和发育，如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。最后，新陈代谢受磷酸化作用的调节控制，尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。因而，形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能，他们常常不约而同，有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。 研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐（32Pi）进行生物合成标记。这种方法非常简单，而只将标记物中加入到培养基中。在节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。该方法能达到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。 大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。这三种羟基磷酸氨基酸在
酸性PH条件下化学性质稳定，酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。在节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合，它们可以是以磷酸－酶的中间体或稳定修饰物的形式存在，这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定，不能用对酸稳定磷酸氨基酸的标准技术来研究，它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围，读者可以参考《酶学方法》（Methods in Enzymolcgy）第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。 磷酸酪氨酸不是含量丰富的磷酸氨基酸，因而一般很难在用32Pi标记的样品中检出，尤其是当样品中含有大量在丝氨酸残基上磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难。凝胶电泳分级后的样品以碱处理，使RNA水解并使磷酸丝氨酸脱磷酸，可以大大提高磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检出率，在节中描述一种碱处理的简单方法。 如果蛋白质被磷酸化，无需借助生物合成标记方法也可鉴定磷酸氨基酸。例如，蛋白质中所含的稀有的磷酸酪氨酸可用抗磷酸酪氨酸的抗体来检测，其特异性和敏感性相当高。更普遍的是，蛋白质的磷酸化常常使蛋白质在SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳中的迁移率发生变化，而且几乎总是改变它的等电点。将蛋白质和磷酸酶共同温育后，从凝胶迁移率的变动可以推论出非标记蛋白质存在磷酸化残基。这种方法在内源性ATP以[γ-32P]ATP进行标记的效率很差时很实用，如目的蛋白是来源于某些难以进行生物合成标记的组织或来源于体外翻译的情
摘要 磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，蛋白质磷酸化和去磷酸化为真核细胞提供了调节机制。随着高通量鉴定磷酸化蛋白质技术的发展，尤其是质谱技术在蛋白质组学中的应用，磷酸化修饰数据不断积累，从现有数据中挖掘规律从而对未知蛋白质进行磷酸化修饰位点预测的条件日益成熟。将计算方法引入磷酸化蛋白质组学的研究中，将有利于发现新的磷酸化修饰规律并为生物学实验提供验证信息，从而推动磷酸化蛋白质组学的发展。 计算智能领域的方法可以很好地应用于位点预测问题。但对于生物信息学来说，除了给出较为准确的预测结果外，还需要给出对判断结果易于理解的解释才能够增加预测方法的可信度。规则抽取不但可以提供合理的解释来指导生物学实验，而且可以从现有数据中发现新的具有生物学意义的磷酸化修饰规律为磷酸化蛋白质的进一步研究提供有价值的参考信息。 本文深入分析了磷酸化修饰位点数据的特点，采用支持向量机分类方法试验和比较了多种特征构造提取、特征选择和分类方法的有效性；提出用AdaBoost 方法对筛选后的氨基酸性质和邻近序列位置进行特征选择并进行分类器训练，形成了新的磷酸化位点预测算法AproPhos，该算法在特异性高于已有预测算法（约2个百分点）的基础上，大大提高了预测的灵敏度（约10个百分点）。同时设计了一种新的基于AdaBoost方法的规则抽取方法，可以给出可理解的修饰位点邻近序列上氨基酸性质分布规律，并对分类结果进行解释。AproPhos及其规则抽取算法扩展了磷酸化位点预测方法在实际中的应用范围，既可以用于提供充分信息的位点预测，又可以用来提高磷酸化蛋白质质谱鉴定效率。 最后本文提出了一种利用串联质谱同位素信息进行分子式预测的算法和系统FFP(Fragment ion Formula Prediction)，无论从计算效率上还是预测精度上较以前的方法都有了很大的提高。使分子式预测可以广泛用于质谱的预处理和蛋白质（包括磷酸化蛋白质）的鉴定，提高鉴定效率。 关键词：磷酸化，位点预测，规则抽取，SVM，AdaBoost
废水中磷酸根测定 1．试剂： 1) 盐酸（1+1水溶液）硝酸高氯酸 2) 钒钼酸铵显色剂：称取偏钒酸铵1.25g，加硝酸250ml，另称取钼酸铵25g，加水400ml 加热溶解，在冷却的条件下，将两种溶液混合，用水定容成1000ml。避光保存，若生成沉淀，则不能继续使用。（注：钼酸铵倒入偏钒酸铵中）。 3) 磷标准液：将磷酸二氢钾在105℃干燥1h，在干燥器中冷却后称取0.2195g溶解于水，定量转入1000ml容量瓶中，加入硝酸3ml，用水稀释至刻度，摇匀，即为50mg/L的磷标准液。 2. 试样的分解 干法: 与Ca测定试样的制备方法一致，在实际中，Ca，P 使用同一分解液. 3. 标准曲线的制备： 准确移取磷酸标准液，取0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0ml于50ml容量瓶中，各加钒钼酸铵显色剂10ml，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10min以上，以0ml溶液为参比，用10mm 比色池，在420nm波长下，用分光光度计测定各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 4．试样的测定： 准确移取试样分解液0.5ml—10ml（含磷量50—750mg）于50ml容量瓶中，加入钒钼酸胺显色剂10ml，按5的方法显色和比色测定，测得试样分解液的吸光度，用标准曲线查得试样分解液的含磷量。 一般先要将植物样品的消化，再蒸馏、吸收和滴定。
6.废水中磷酸根 取2.0ml到50ml容量瓶中，加入钒钼酸胺显色剂10ml，按3的方法显色和比色测定，测得试样分解液的吸光度为0.133，用标准曲线查得试样分解液的含磷量为60.728ug/ml，最终算的含磷酸根为186.102ug/ml。
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
基于质谱的蛋白质组学技术在微生物鉴定中的应用 Application of Proteomics based on Mass Spectrum in the microorganism identification / classification 微生物这类非常微小而又种类繁多的生物与我们的生活息息相关，近20年来，新的传染病不断出现，如传染性非典型肺炎（SARS）、艾滋病（HIV）、军团菌病、莱姆病（Lyme）、埃博拉出血热（Ebola）、拉沙热（Lassa）、O139型霍乱、致病性大肠杆菌O157:H7引起的出血性肠炎、肠弯曲菌肠炎、汉坦病毒、B组轮状病毒腹泻、疯牛病（克-雅氏病）、禽流感等等，这些新传染病的出现严重威胁人类的身体健康，给人类社会带来了难以估量的后果。同时，随着经济贸易的全球化，国际旅游业的飞速发展也加速了一些传染病的全球化进程，加快了新发传染病的传播速度，也使一些过去得到控制的传染病如结核、多抗药性的链球菌属感染等重新蔓延。当然，除过病原菌以外，腐败菌、有益菌及环境微生物等与我们的健康和生活亦密切相关，这种微生物的多样性为全球制药产业、环境治理、食品工业以及生物技术的发展提供了丰富的资源储备，同时也对人类的健康构成极大的威胁，所以快速、准确鉴定微生物日益成为临床、环境和工业领域的迫切需要，各个国家从来都是不遗余力的在建立、健全菌种资源保存库的同时，积极研究开发快速、准确鉴定微生物身份的新技术和新方法，致力于建立健全微生物资源保存库和鉴定标准库，在临床上为传染病的快速筛查、检测、分离、鉴定、追踪、预警、治疗和预后具有重要意义。目前，尽管微生物鉴定系统实现了鉴定过程的规范化和程序化，将微生物对底物的生化类型与已建立数据库类型相比较来鉴定微生物，但其反应准确性受接种物浓度、孵育条件和试验解释等的影响。自20世纪80～90年代以来，微生物鉴定系统不断发展，自动化程度不断提高，尤其是基于质谱技术的蛋白质组技术和代谢组技术在微生物研究领域的介入，使得微生物鉴定达到了快速、准确、大规模、高通量的水平。 一、微生物鉴定系统方法的发展 （一）微生物鉴定的传统方法 微生物传统的鉴定方法是建立在微生物的形态学、生态学、细胞生理和生化以及基因的基础上的，主要包括以下几类： 1.生化方法 该法检测微生物实际上是测定微生物特异性酶。由于各种微生物所具有的酶系统不完全相同，对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物内酶的有无，从而达到检测特定微生物的目的。 2.免疫学技术 免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞、特定抗原(抗体)的定性
磷酸化蛋白的高效富集 在线酶解与快速鉴定 项目申请人：袁敏婷黄懿 指导教师：杨芃原 摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。 关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解 1.引言 蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。 蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。 在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸
蛋白质组：一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套蛋白质 蛋白质组学：应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能 F-2D-DIGE荧光差异显示双向凝胶电泳 在传统双向凝胶电泳基础上发展起来的定量分析凝胶上蛋白质点的新方法 具体操作步骤： 首先将待比较的两种样品提取的总蛋白分别与两种不同的荧光标记试剂（Cy2, C y3或Cy5）进行共价标记，然后将不同荧光染料标记的两种待比较的蛋白质样品等量混合，上样进行双向电泳，2D凝胶在成像仪上用两种不同波长激发，并将两种样品的荧光图谱显示成像，用2D分析软件进行定量分析。将显示有明显差异的蛋白点切下后进行鉴定分析，从而确定差异表达的蛋白质 PF-2D:以蛋白质组或复杂的蛋白质混合物为分离对象，通过一维色谱聚焦（即将复杂蛋白质混合物按蛋白质的等电点差异进行分离）和二维无孔硅胶反相HPLC分离色谱（即按蛋白质的疏水性差异进行分离）模式进行分级分离，软件将液相色谱的分离图转换为双向电泳形式，一维为等电聚焦结果，二维为分子量分离结果，为蛋白质组学研究提供了一个创新的技术平台。 从头测序（Do novo sequencing）:不使用来自蛋白质数据库的信息，直接解释串联质谱数据的方法和技术 通过20种氨基酸残基的质量等信息以及主要类型离子谱峰间的质荷比（M/Z）差值来构造序列。这类蛋白质鉴定方法就称为蛋白质的从头测序。 Tandem mass spectrometry串联质谱:由2台质谱仪经1个碰撞室串联而成。首先利用第一台质谱仪选择特殊离子，在进入第二台质谱仪之前，先进入碰撞室与加入其中的气体（氮气或氦气）产生碰撞形成各种离子，再利用第二台质谱仪依各离子的质核比不同而分离，形成第二次质谱，可作为离子结构判断的依据 肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprint）PMF:指特定的蛋白酶对蛋白质进行酶解后的质谱分析得到一套多肽质量图谱，这种特性就象指纹一样，每种蛋白都具有特定的质量肽谱。碰撞诱导解离（CID）:在三级四级杆质谱中，第一级Q1和第三级Q3四级杆是质量过滤器，第二级四级杆Q2仅施加射频电压，充当产生碎片离子的碰撞室，从Q1传送来的肽离子在碰撞室内经惰性气体如Ar和N2的碰撞诱导产生正离子，这一过程称为碰撞诱导解离 肽序列标签(Peptide sequence tag, PST)技术 蛋白质由20种氨基酸组成，5～6个氨基酸残基的序列片段在一个蛋白质组成中具有很高的特异性,这个片段称为PST，可用于蛋白质鉴定。源后衰变(PSD):母离子在源内离子化后，在飞行过程中会产生一系列的亚稳离子，恰这些离子主要是沿多肽骨架断裂形成，产生的这些碎片离子在理论上包含着这一肽段的氨基酸序列信息。由于这一过程发生在源内离子化之后，所以称为源后衰变。 蛋白质芯片:通过微加工和微电子技术对固相载体进行特殊的化学处理，将大量已知的蛋白质如抗原、抗体、受体、配体等有序的固定在载体上，使其与待检蛋白质分子进行特异性结合或反应，经洗涤和检测信号的强弱判断样品中的靶分子数量和特征，从而实现对蛋白质组分的准确、快速和大信息量的筛检。 蛋白质组样品的全息制备: 就是要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但由于蛋白质种类多、丰度不一和物理化学特性不同等，要达到真正的全息制备是有难度的. 蛋白质组学的主要技术，简述它们的基本原理 双向电泳质谱酵母双杂交噬菌体显示技术蛋白质芯片技术荧光差异显示双向电泳同位素亲和标签生物信息学色谱-质谱联用Edman 降解法
磷酸根的测定 一、原理 1、原理： 在酸性溶液中，经过氧化性酸的消化，将各种形态的磷转化成磷酸根离子（PO43-）。 随之用钼酸铵和酒石酸锑钾与之反应，生成磷钼锑杂多酸、再用抗坏血酸把它们还原为深色钼蓝。 2、干扰 砷酸盐与磷酸盐一样也生成钼蓝。μg/ml的砷就会干扰测定。六价铬、二价铜、亚硝酸盐能使结果低。 二、仪器与试剂 分光光度计吸量管2ml 移液管10ml 容量瓶100ml 锥形瓶250ml 比色管25ml 擦镜纸吸水纸过硫酸铵（固体）2mol/L硫酸2mol/L盐酸 6mol/L氢氧化钠1%酚酞 钼酸铵溶液：溶解20g（NH4）6MoO24·4H2O于500ml蒸馏水中，用塑料瓶在4℃时保存。 抗坏血酸溶液：L（溶解1.76g抗坏血酸于100ml蒸馏水中，转入棕色瓶， 如在4℃时保存，可维持一个星期不变）。 混合试剂：50ml 2mol/L硫酸，5ml酒石酸锑钾溶液，15ml钼酸铵溶液和30ml抗坏血酸溶液。混合前先让上述溶液达到室温，并按上述次序混合。在加入酒石酸锑钾或钼酸铵后，如混合试剂有混浊，须摇动混合试剂，并放置几分钟，至澄清为止。如在4℃时保存，至少能维持一个星期不变。 磷酸盐贮备液（1mg/ml磷）：称取1.098g KH2PO4，溶解后转入250ml容量瓶，稀释至刻度，即得ml磷溶液。 磷酸盐标准液：量取贮备液于100ml容量瓶中，稀释至刻度，得磷含量为 10μg/ml的工作液。 三、实验步骤 1、水样处理：
从水体中取出有代表性的水样。量取水样200ml二份，分别加入250ml锥形瓶中，（另取100ml蒸馏水与之对比照），分别加入1ml 2mol/L硫酸，2g过硫酸铵，微沸约1小时，补加蒸馏水使体积为25～30ml，（如锥形瓶内有白色凝聚物，应用蒸馏水将其冲入溶液中），再加热数分钟。冷却后，加1滴酚酞，并用6mol/L氢氧化钠将溶液中和至微红色。再滴加2mol/L盐酸使粉红色刚好褪去，转入100ml容量瓶中，加水稀释至刻度。吸取25ml转移至50ml比色管中，加1ml混合试剂，摇匀，放置10分钟，使之显色，加水稀释至刻度再摇匀，放置10分钟，用不1厘米比色皿以试剂空白作参比，测定880nm处的吸光度。 2、标准曲线的绘制： 分别吸取10μg/ml磷标准溶液，，，，，，于50ml比色管中，加水稀释至25ml，加入混合试剂，摇匀后放置10分钟，加水至刻度，再摇匀，10分钟后，用不1厘米比色皿，以试剂空白作参比，测定880nm处的吸光度。 四、结果处理： 由标准曲线查到磷的含量，按下式计算水体中磷含量： P（g/L）＝Pi / V ×10-3 Pi：由标准曲线上查得磷含量（μg） V：测定时吸取水样的体积（体实验为V＝） （注：水样较浑浊时，空白溶液除酒石酸锑钾和抗坏血酸不加外，其余都加）
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述 蛋白质组学相关技术及发展文献综述张粒植物学211070161概念及相关内容1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组proteome这个概念该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”1。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质2。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。2蛋白质组学的分类蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能这将有助于识别各种特异蛋白3目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛其运用技术主要是双相凝胶电泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技术以及图像分析系统当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变这些技术可以直接测定蛋白质的含量并有助于发现蛋白质翻译后的修饰如糖基化和磷酸化等4。结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法同时研究者也将此方法不断改进5。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的4。3蛋白质组学相关技术目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛其分析通常有三个步骤第一步运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质第二步应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质第三步应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。3.1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳其中应用最多的是双向电泳技术其他还有SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱通常使用高效液相色谱HPLC和二维液相色谱2D-LC。另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。 3.1.1双相凝胶电泳双相凝胶电泳two-dimensional gel elec—trophoresis2DE这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术产生于20世纪70年代中叶但主要的技术进步如实验的重复性、可操作性蛋白质的溶解性、特异性等是在近lO年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦IEF电泳根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。等电点pI是蛋白质所带静电荷为零时的pH周围pH小于其pI时蛋白质带正电荷大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF时蛋白质处于一个pH梯度中在电场的作用下蛋白质将移向其静电荷为零的点静电荷为正的蛋白将移向负极静电荷为负的将移向正极直到到达其等电点如果蛋白质在其等电点附近扩散那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应它可以在等电点附近浓集蛋白从而分离电荷差别极微的蛋白。pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下两性电解质可形成一个pH梯度。但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差80年代以后研究人员研制了固定pH梯度的胶条IPG。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂不同分子的浓度决定pH的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电所带电荷与蛋白质的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS-PAGE装置有水平和垂直两种形式垂直装置可同时跑多块胶如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II系统可同时跑12块胶提高了操作的平行性。经过2DE
浅谈蛋白质磷酸化 摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。 关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测 随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。 一、蛋白质磷酸化的概述 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷
磷酸根的测定 8.1概要 在0.6M 42SO H 的酸度下，磷酸盐与钼酸盐和偏钒酸盐形成的磷钒钼酸，其反应为：→+++4234402442232)(222SO H VO NH O M NH SO H O H n SO NH O nH O M O V O P 24242305252)26()(2322-++??? 磷钒钼酸可在420nm 的波长下测定。 本法适用于炉水磷酸盐的测定，相对误差为%2±。 8.2仪器、试剂 8.2.1钼钒酸显色液： 8.2.1.1 称取50g 钼酸铵和2.5g 偏钒酸铵，溶于400ml 除盐水中。 8.2.1.2 取195ml 浓硫酸，在不断搅拌下渐渐加入到250ml 除盐水中，并冷却至室温。将 8.2.1.2液倒入8.2.1.1溶液中，用除盐水稀释至1L 。 8.2.2 ND —2109型数显式磷酸根分析仪 8.2.2.1 仪器测定原理： 仪器根据光电比色原理进行测量，其理论依据是朗伯—比尔定律：当一束平行单色光，通过有色溶液时，一部分光被溶液吸收，若液层厚度不变，光能被吸收的强度与溶液中有色物质的浓度成正比。 8.2.2.2主要技术参数： （1）测量范围为0—20mg/L （2）基本误差：±2.5% （全量程） （3）重复性：变异系数R SD ＜0.5% （4）稳定性：每小时飘移≤±0.5% （5）热平衡时间：≤70分钟 8.3测定方法 8.3.1上下标调整：
接通电源，仪器在约70分钟达到热平衡后（1）打开杯盖，操作杆处于“排液”位置，倒入17ml除盐水（2）将操作杆放到“样品送入”位置，待溢流口有液体溢流后，重复（1）操作，按仪器的上下标数调整上下标，下标调整——将光闸拉出，用调零点调整旋钮调到仪器下标值，上标的调整——将光闸推入，用终点电位器调节上标，反复多次调整。 8.3.2 取水样100ml注入锥形瓶中，加入2.5ml钼钒酸显色液，摇匀放置2min，将已显色的样品分三次送入比色池，第1、2次为冲洗系统用，第3次读数为仪器的分析值。 为了提高分析速度及减少系统对样品干扰，当一个样品分析完毕后，快速排液：样品分析完后，将操作杆置于“全排空”位置，液体快速排出，并能听到抽气声此系统为正常。 8.4 仪器的校准 8.4.1 试剂的配制 （1）磷酸盐贮备溶液（1ml含1mgPO43-）: 称取105℃干燥过的磷酸二氢钾1.433g溶于少量的除盐水中并稀释至1L。 （2）磷酸盐工作液（1ml含0.1mgPO43-）：取上述标准溶液用除盐水准确稀释至20mgPO43- （3）用20mgPO43-的标准液，同一瓶除盐水稀释成2.5、5、10、20mg/LPO43-的标准液，每种样配制100ml。 （4）将配好的一组磷酸盐标准液，分别注入相应编号的锥形瓶中，各加入2.5ml钼钒酸显色液摇匀放置2min即为发好色的标准溶液。 8.4.2 仪器的校准 （1）仪器刻度的校准：仪器通电70分钟热平衡后，通入已发好色零点水，即已发好色的除盐水，并调整零点电位器使仪器指示为零，在通入20mg/LPO43-已发色的终点标准水，并调整终点电位器使仪器指示值为20mg/LPO43-。反复校准零终点后，通入PO43-含量从小到大的发色的标准液，并得到合格的基本误差值。 （2）仪器上下标准的确定：当仪器刻度调整合格后，再通入最小不少于5次的除盐水，此时的仪器指示值为仪器的下标。然后将光闸推入，此时仪器的指示值为仪器的上标。 8.4.3 仪器的维护和保养 8.4.3.1 维护 （1）作为实验室仪器时，每次分析后用无硅水冲洗3~5次，使用完后将操作杆置于“全排空”位置，每三个月用5% 氨水清洗一次。
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来[60, 61]。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集[62] 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，从而鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/ 苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较少。 图片来源：https://www.doczj.com/doc/d64166667.html,/wiki/Phosphoproteomics
2D 电泳及质谱鉴定技术服务 ----生工带您走进蛋白质组学时代 ? 实验原理： 1、 双向凝胶电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离的分析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，用相关软件（ImageMaster 等）进行图谱差异分析，找到差别点。然后把差异点切出，进行脱色、酶解。最后样品进入质谱测试，得到质谱原始数据文件。通过搜库可得到差异蛋白质的详细信息。 2、 ABI 4800 串联质谱（MALDI-TOF-TOF-MS ）是目前对SDS-PAGE 胶上的蛋白条带和2D 胶上差异点蛋白，切取并经过酶解后进行鉴定最常用的质谱，它在肽指纹图谱(一级质谱)的基础上选择强度最大的10个峰进行进行二级质谱，对肽段碎片的分子量精确测定，再将一级和二级质谱数据整合并使用GPS 3.6（Applied Biosystems ）和Mascot2.1(Matrix Science)对质谱数据进行分析和蛋白鉴定。其提供的专一性信息丰富，对于数据库的检索，特别是对数据量丰富、冗余信息多的数据库的检索，其鉴定结果比肽指纹图谱可靠的多，该ABI 4800也可以不经过酶解直接对蛋白进行分子量精确测定 。 ? 主要步骤： 1、 样品制备（蛋白提取）：主要包括植物、动物细胞或组织等的破碎、离心以及定量。 2、 第一向IEF 等电聚焦实验。 3、 第二向SDS-PAGE 实验。 4、 硝酸银染色或考马斯亮蓝染色。 5、 图像分析及数据处理。 6、 提供双向电泳的正式实验报告。 7、 选取感兴趣的蛋白点进行酶解。 8、 对酶解后蛋白进行质谱技术分析（Maldi-Tof-Tof/MS ）。 9、 提供质谱的正式实验报告。 经典蛋白质组学研究策略
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来. 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC 柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。 1.3 TiO2色谱 近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注。2004年，Pinkse等人将二氧化钛（TiO2）技术引进磷酸化蛋白质组学领域，利用TiO2与磷酸肽上磷酸基团的亲和能力实现对磷酸肽的相对富集，并建立了通过TiO2作为预分离的2D-NanoLCESI-MS/MS 技术平台。虽然该技术在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术，但仍然存在非特异性吸附等问题。后来，人们又利用纳米材料比表面积大的特点，对TiO2纳米级材料进行了开发
请简述蛋白质组学研究的基本步骤 1.蛋白质样品的制备：蛋白质样品的制备是蛋白质组学研究的首要环节，也是最为重要的部分。蛋白质样品的质量直接影响到科学研究的真实性和可信度。 2.蛋白质的分离：双向凝胶电泳技术是目前最基础和常用的蛋白质分离方法，它能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。双向电泳分为等电聚焦电泳和SDS-PAGE两个步骤，即先进行等电聚焦电泳，按照pI的不同将蛋白分离，然后再进行SDS-PAGE按照分子量的大小不同对蛋白进行分离。IPG胶条的应用，大大提高了双向电泳的重复性。 3. 蛋白质双向电泳凝胶的染色。目前双向电泳凝胶的染色的方法有3种，分别为考马斯亮蓝染色法、银染法和荧光染色法。考马斯亮蓝染色法，操作简便，无毒性，染色后的背景及对比度良好，与下游的蛋白质鉴定方法兼容，但灵敏度较低，可以检测到30～100 ng蛋白质。银染法是一种较为流行的染色方法，银染成本较低，灵敏度高，可检测少到2～5ng的蛋白。荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，与质谱兼容性好，而其灵敏度与银染相仿，但线性范围要远高于银染，这使二维电泳分离蛋白质的荧光检测受到普遍关注和应用。 4.双向电泳凝胶图像的采集与分析：图像采集系统通过投射扫描根据吸光度的大小获碍蛋白质点的光密度信息。一般来说，该光密度值与蛋白质点的表达丰度成正比，以便于软件分析时的定量比较。完成图像采集后采用ImageMaster等图像分析软件进行分析。分析步骤：蛋白质点检测、背景消减、归一化处理、蛋白质点匹配。 5.蛋白质鉴定：蛋白质鉴定是蛋白质组学研究中的核心内容。目前蛋白质鉴定技术主要有Edman 降解法测序、质谱。质谱是目前最常用的蛋白质鉴定方法。质谱技术的基本原理是带电粒子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子的质量与携带电荷之比质荷比( m/z) 的不同而变化，可以据此来判断粒子的质量和特性。质谱完成后利用蛋白质的各种属性参数如相对分子质量、等电点、序列、氨基酸组成、肽质量指纹谱等在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。
磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。