高效液相色谱法在分析检测上的应用
目录
1引言 (1)
引言 (1)
2高效液相色谱分析原理 (1)
2.1高效液相色谱分析的流程 (1)
2.2高效液相色谱的分离过程 (1)
2.3高效液相色谱的类型 (2)
2.3.1吸附色谱 (2)
2.3.2分配色谱 (2)
2.3.3离子交换色谱 (3)
2.3.4凝胶色谱 (3)
3高效液相色谱法在分析检测上的应用 (4)
3.1食品中山梨酸、苯甲酸的测定 (4)
3.1.1测定原理 (4)
3.1.2试剂和溶液 (4)
3.1.3.测定方法 (4)
3.2 高效液相色谱法测定青梅花、枝、叶中绿原酸类化合物 (5)
3.2.1 对照品溶液配制 (5)
3.2.3 青梅样品的测定 (6)
4结论 (6)
参考文献 (7)
1引言
高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100 μm的吸附剂（硅胶、氧化铝等）。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小（5 μm-10 μm）、传质快、柱效高。高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。
2高效液相色谱分析原理
2.1高效液相色谱分析的流程
由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
2.2高效液相色谱的分离过程
同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系
数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。
2.3高效液相色谱的类型
2.3.1吸附色谱
在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。通常，样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机溶剂并是非离子型的，强离子样品是不适宜的。
吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础，按照样品的极性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的浓度为10%或更少一些。如有可能，可进一步减小百分数。因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性，减弱吸附能力，并使重现困难。
2.3.2分配色谱
1 正相分配色谱
正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品，但正相分配色谱不适合于离子型物质。
2.反相分配色谱
这种方法目前应用非常广泛，应用的范围也很广，在反相分配色谱中，样品的非极性部分起保留作用。
通过使用的流动相是水-甲醇和水-乙腈，通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离，但如果样品带有离子型基团，需要在流动相中加入盐或调节流动相的pH值，例如，如果样品有一个-COOH 基团，使流动相的pH值是偏向酸性的，由于抑制了-COOH基团的电离而加强了保留。这个方法叫离子抑止法，如果样品有强离子基，有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。在调节pH值中，保持pH值在填料说明书手册中所规定的范围内，大多数化学键式的二氧化硅使用在PH＝2-9，然而，当加入盐以后，最好使其pH＝7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能应用非常广泛的pH值。
2.3.3离子交换色谱
这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的，按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。
离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。在离子交换色谱中，流动相的盐的浓度、PH及盐的种类等都对保留值有很大的影响。在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器，在高效液相色谱中不能使用Nacl或其他的氯化物盐类。根据测量波长有些盐也不能使用，例如，醋酸吸收大约在210 nm当检测处在短波端的时候，用醋酸作流动相是不合适的。
2.3.4凝胶色谱
凝胶色谱不同于以上三种分离方法。凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。
因为在样品中，小尺寸的分子深深地渗透到微孔中，所以迟流出，而大尺寸的分子没有渗透到微孔中，就很快流出。通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相，叫做凝胶渗透色谱。凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。
凝胶渗透色谱（Gel permeation chromatography），简称GPC。此一类的色谱，使用于有机性溶媒的样品中，如PVC PS ABS等等，而所用的洗脱液有THF,chloroform等等。
凝胶过滤色谱（Gel Filltrarion chromatiography），简称GFC。此一种类的层析法，使用于水溶媒的试剂中，如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、缓冲液等等。
凝胶的种类很多，按其原料来源可分为有机胶和无机胶。按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。
3高效液相色谱法在分析检测上的应用
3.1食品中山梨酸、苯甲酸的测定
3.1.1测定原理
样品加温除去二氧化碳和乙醇，调ＰＨ至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。
3.1.2试剂和溶液
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水，溶液为水溶液。
（1）甲醇：优级纯，如果是分析纯，需重蒸。
（2）稀氨水：1+1 溶液，氨水加水等体积混匀。
（3）0.02 mol/L乙酸铰溶液：称取1.54 g乙酸按，加水至1000 ml，溶解，经滤膜（0.45 nm）过滤。
（4）20 g/L碳酸氢钠溶液：称取2 g碳酸氢钠（优级纯）加水至100 mL，振摇溶解。
（5）苯甲酸标准储备液：准确称取0.1g 苯甲酸，加20g/L碳酸氢钠溶液5ml，加热溶解，移入100 ml 容量瓶中，加水定客至100 ml，摇匀，此溶液苯甲酸含量为1mg/mL，作为储备液。
（6）山梨酸标准储备液：准确称取0.1g山梨酸，加碳酸氢钠溶液（20g/L）5ml，加热溶解，移入100 ml 容量瓶中，加水定容至100 ml，山梨酸含量为1mg/ml，作为储备溶液。
（7）苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液10 ml放入100 ml容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1ｇ／ml。经滤膜（0.45m）过滤（同时测定糖精钠时，可加入糖精钠标准储备液）。
3.1.3.测定方法
（１）样品处理
１.汽水、饮料、果汁类：（汽水需微温搅拌除去二氧化碳）吸取2.0 ml 样品，加入已装有中性氧化铝的小柱中，过滤，弃去初滤液，然后用流动相洗脱苯甲酸，接收于25 ml带塞量简中，洗脱至刻度，摇匀。此液通过微孔滤膜后进样。
2.配制酒类：称取10.0g 样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水（1+1）
调节pH约7，加水定容至适当体积，经滤膜（0.45nm）过滤。
（２）高效液相色谱参考条件
1.色谱柱：YWG-C18 4.6*150mm ，或其他型号c18柱。
2.流动相：甲醇+乙酸铰溶液（0.02 mol/L）（5+9）。
3.流速：1.0 ml/min。
4.进样量：10 ul。
5.检测器：紫外检测器，波长230mm，灵敏度0.2AUFS。根据保留时间定性、外标峰面积法定量。
3.2 高效液相色谱法测定青梅花、枝、叶中绿原酸类化合物
梅(Prunus mume Sieb. Et Zucc)是蔷薇科(Rosaceae)樱桃属植物，园艺栽培上将梅分为花梅和果梅，果梅又分为白梅、青梅和红梅，其中青梅是我国主要的栽培品种。青梅在世界上的分布不广，至今仅局限于中国、日本、韩国及泰国等亚洲国家，而我国是青梅的原产地，也是世界上适合栽种青梅地域最广的国家。青梅的各个部位除了具有不同的食用价值以外[1-2]，在医药保健等领域也具有较高的使用价值[3-8]。早在秦汉时代著的《神农本草经》中就记载了青梅的花、枝、叶在医药
上的功效，而明代《本草纲目》中则详细记载了青梅不同部位的药用价值：花能开清神思、助雅致，叶可治痢疾及霍乱，枝可治风痹等。绿原酸类化合物(chlorogenic acids，CA)是由奎尼酸(quinic acid)与某种反式苯丙烯酸(cinnamic acids)组成的一类酯类化合物[9-10]，通常这种苯丙烯酸(cinnamic acids)为咖啡酸(caffeic acid)，即以咖啡酰奎尼酸类为主。
3.2.1 对照品溶液配制
分别精密称取新绿原酸、绿原酸及隐绿原酸的对照品各 5.0 mg ，置于 5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，得到混合对照品溶液。
3.2.2 色谱条件
流动相：乙腈(A)和体积分数2% 的冰醋酸溶液(B)，采用Luna C 18 column(150 mm ×4.6 mm，5 μm)分析柱，梯度洗脱条件见表1，流速为0.7 mL/min；检测波长为328 n m，柱温为4 0 ℃。
3.2.3 青梅样品的测定
按照文献所建立的提取方法[11]，得到青梅花、枝、叶的 3 0 % 乙醇提取物。再分别称取青梅花、枝、叶的30% 乙醇提取物0.05g 溶于50% 甲醇溶液中，定容至5 0 m L ，青梅提取物样品质量浓度为 1.0mg/mL，用0.45μm 微孔滤膜过滤，上机测定其中绿原酸类物质含量。
4结论
本文综述了高效液相色谱检测方法，并列举实例分析仪器条件、样品提取条件，研究并确定个实验条件，并提高分析灵敏度和方法的准确性。文献调研说明高效液相色谱法在物质的额定性定量方面准确、可靠，具有较高的实用性，为在众多领域的研究了提供了有力的技术支撑。另外，高效液相色谱的与其他仪器的联用将是以后高效液相色谱的主要应用方向，并有研究报道，在众多领域展现出可观的应用前景。
参考文献
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高效液相色谱的发展及其应用 摘要：了解高效液相色谱[1]的发展历史，知道高效液相色谱的组成结构、操作 原理以及方法等等。掌握它的分类方法，通过比较得出高效液相色谱分析方法的优点与缺点。明确高效液相色谱的应用，最终分析结果。 关键词：高效液相色谱；发展历史；应用 高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 1、高效液相色谱的发展历史 1.1高效液相色谱的历史 高效液相色谱作为色谱分析法的一个分支，是在二十世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型分离分析技术。1960年中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱。 1.2高效液相色谱与其它色谱的比较[2] 1.2.1与经典液相色谱的比较 经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，柱效低，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。 1.2.2与气相色谱法的比较 高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸气压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析。 2、高效液相色谱 2.1高效液相色谱的特点 2.1.1高效液相色谱的优点 1.分辨率高于其它色谱法，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果； 2.速度快，十几分钟到几十分钟可完成； 3.重复性高、样品不被破坏、易回收； 4.高效相色谱柱可反复使用； 5.自动化操作，分析精确度高；
高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，
高效液相色谱在生物制药中的应用 高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。 1.高效液相色谱的介绍 高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。高效液相色谱有5种类型： 1、吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2、分配色谱（Partition Chromatography） 3、离子色谱（Ion Chromatography） 4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）
高效液相色谱的应用呵发展前景 液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过 改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快. 分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC) HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。 高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。 对于高效液相色谱的发展前景应该是非常乐观的，现在的社会的发展节奏很快，各个领域对于分析检验的需求很多，而分析检验中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。所以她的发展情景很乐观。理由有几点 1，随着科技的发展，技术的日臻完善，较之以前色谱分析的方法有了很大程度的提高，很多科学家在对于一些分析上的难点有了新的突破，这样一个 不断完善的技术在以后的社会发展中一定会扮演着一个重要的角色。 2，最近,一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相色谱分析法上,使得高效液相色谱的应用更广泛,并充分利用高效快速.选择性好.灵敏度高等优 点,建立更加系统的成分分析方法.通过与质谱联用.梯度洗脱.柱切换技 术.配合先进的检测技术,以及与分子生物学.现代分子药理学相结合,必
高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.
高效液相色谱法在生命科学中的应用 高效液相色谱在生命科学中的应用范围越来越广，高效液相色谱由于具有高选择性、高灵敏度，并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点，已成为医药研究的有力工具。如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药物成分的定性和定量测定、新型高效手性药物中手性对映体含量的测定以及药物代谢物的测定等方面都需要用到HPLC的不同测定方法予以解决。而目前高效液相色谱的蒸发现了它在生命科学中的重要地位。光散射检测器的应用更体现了它在生命科学中的重要地位。1天然药物分析 天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行分离鉴定，再测定有效成分的含量；通过指纹图谱建立识别模式，可以判定药材的质量高低。 2 天然药物及复方成药分析 复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。增免扶正片系由当归、党参、黄芪（图3）等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑血管疾病、神经衰弱、
慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。 由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％以上的速度增长。HPLC分析必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。 3 抗生素分析 抗生素是由微生物或其他方法产生的化学物质，在高度稀释的情况下仍具有抑制或杀灭其他微生物的性能。抗生素的分离、分析和定量测定是药物分析中较困难的领域。采用较多的方法是微生物法、分光光度法和化学方法，但所需时间较长、专一性较差。 HPLC分析技术近年来在抗生素的质量控制中已广泛应用。对结构、组分等较清楚的药物，HPLC分析将逐步取代传统的生物测定。目前，各国药典中应用HPLC技术对抗生素进行质量控制的项目包括鉴别、组分分析、含量测定和相关物质测定等。 4 在鉴别中的应用 在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含 量测定项下记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别.
高效液相色谱法的计算方法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1、对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2、系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。 (1) 色谱柱的理论板数(N，用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。 在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2)，按n＝5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。 (2) 分离度(R)
实例解析——高效液相色谱(HPLC) 一、原理 利用不同物质在两相中（液液、液固、离子交换、尺寸排阻）具有不同的分配系数，当二者相对运动时候，物质在两相中反复多次分配，从而使得物质得到完全分离 二、适用范围 高沸点、热不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物、离子型样品、生化样品三、特点 高压、高效、高灵敏度 四、仪器组成 流动液贮存提供脱气，输液系统、进样系统、分离系统、检测系统，控制记录系统贮液瓶、高压泵、进样器、分离柱、检测器、记录仪 五、仪器选择 由实验条件确定是选用二元高压还是四元低压、一般来说，二元高压的准确度较高。四元低压是先将样品按比例混合再泵入，而二元高压是先泵入不同比例的溶剂再混合。确定采用的脱气系统，一般采用在线脱气。确定进样方式，人工手动六通阀进样，还是进样针自动进样，一个适用于少量样品，一个适用于大量样品。 选择检测器，如果是有较强的紫外吸收的可用紫外可见检测器(二极管阵列检测器)，如果是芳香族化合物，可选用荧光检测器，对于离子可采用电导检测器。 六、实验条件优化 配置待测物质的标准溶液 1、色谱柱的确定 分析样本确定是采用何种类型的色谱柱 (1)分配色谱，两项间分配系数 流动相选用极性的物质（甲醇、乙腈、水）则固定相选择非极性物质。一般用 C18 ODS柱。 (2)吸附色谱， (3)离子交换色谱 各种离子与树脂上交换集团的交换能力不同。固定相：离子交换树脂，流动相 为无机酸、无机碱。常用于分离离子或者可解离的化合物 (4)排阻色谱法 配置含待测物质的标准品溶液，采用不同C18柱分离，检测，对照不同色谱图像，可得到分离效能最高的色谱柱 2、最佳流动相梯度洗脱程序的确定 梯度洗脱：按照一定的程度，不断改变流动相中个溶剂组成的比例以改变流动相的 极性。将色谱柱上不同的组分洗脱出来。 配置不同的梯度洗脱方案，用标准溶液进行试验，并选取能达到最高分离效能的梯 度洗过方案作为最佳流动相梯度洗脱程序 3、流动相的确定 在分离效能相似条件下选择更经济、毒性小的流动相 4、流速确定 流速太大，待分离组分来不及与固定相充分作用，故其中的组分较易被洗脱下来，出峰时间变短，而且柱压比较高，会引起泵负荷的增加，进而导致色谱柱的使用命
高效液相色谱法在环境分析中的应用 摘要 高效液相色谱（HPLC)是现代分析化学中最重要的分离方法之一。近几年由于化学工业的发展和天然化合物的开发,使得环境污染越来越严重。高效液相色谱由于其高灵敏度、高效、分析速度快等优点而广泛应用于环境中各物质的监测。本文介绍了高效液相色谱的组成、基本原理，列举了目前利用高效液相色谱法测定环境样品中多环芳烃、酚类化合物、多氯联苯、邻苯二甲酸脂、有机农药等有机污染物的测定条件及分离结果。展示了这项技术在该领域的应用并展望了液相色谱分析技术的发展前景。 关键词:高效液相色谱；有机污染物；环境分析；发展前景 Abstract High performance liquid chromatography ( HPLC ) is one of the most important separation methodsis in the modern analytical chemistry. In recent years because of the development of chemical industry and natural compounds , the environment pollution is more and more serious. High performance liquid chromatography with its high sensitivity, high efficiency, and fast analysis speed has widely applied in the monitoring environment substance. The composition of high performance liquid chromatography and basic principle are introduced in the paper.And at the moment, high performance liquid chromatography method is used in the organic pollutants determination conditions and separation results of environmental samples,such as phenolic compounds, PCBs, phthalic acid ester, organic pesticides and so on.It shows the application of this technique in the field and the development prospects of liquid chromatography analysis technology . Keywords :HPLC ; Organic Pollutants ;Environmental analysis; Development prospect 1.前言 目前，由于化学工业的发展和天然化合物的开发,使得环境污染越来越严重。据报道,被确认为环境污染物的已超过350 种[1],人们能在水中、空气中、污泥里、鱼、禽体内发现这些污染物。通过食物链,它们将进一步污染肉类、蛋类、粮食、蔬菜等。环境
生效日期20140101 负责姓名职位签名/日期 起草何瑞清QC 审核梁天静QC主管 批准张小伶质量部经理 分发部门： 部门份数部门份数QC室1 1 目的 建立高效液相色谱法检验程序 2 范围 本程序适用于高效液相色谱法检验标准操作 3 职责 3.1QC人员：严格按本程序操作 3.2QC主管：严格按本程序检查 4 内容 4.1 定义及概述 4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一 定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压 输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流 动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪 或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。 由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有 分离性能高，分析速度快的特点。 4.1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的 药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分
子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反 应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于 正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相 或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合 硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子 交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 4.1.3 仪器的组成和一般要求： 4.1.3.1 仪器的组成：高压输液泵、色谱柱、检测器、积分仪、打印机。 4.1.3.2 对仪器的一般要求： ——所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱 的填充剂和流动相的组分按各品种项下的规 定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅 胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用， 辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶 也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色 谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色 谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为 紫外吸收检测器。 ——在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符 合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。（紫外 分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸 收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不 置任何物质），测定其吸收度。溶剂和吸收池 所吸收度，在220～240nm范围内不得超过 0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在 251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以 上时不得超过0.05。）
高效液相色谱法在药品质量分析中的应用进展 [摘要]高效液相色谱法一种能够对较为复杂的混合进行分离的技术，因此，被广泛应用于药品质量分析中。本文主要对高效液相色谱法的分离原理、高效液相色谱技术的发展及其在药品质量分析中的应用等进行阐述。 [关键词]高效液相色谱法；药品质量分析；灵敏度
目录 引言 (2) 1.高效液相色谱法的分离原理及特点 (3) 2 高效液相色谱技术的发展 (3) 3 高效液相色谱法在药品质量分析中主要应用 (4) 3.1 药品有效成分含量的检测。 (4) 3.2 药品中杂质含量的检测。 (4) 3.3 抗生素含量的检测。 (4) 4 高效液相色谱法在药品质量控制中的应用进展 (5) 5超高效液相色谱的到来 (5) 参考文献 (6) 引言 高效液相色谱是一种具有迅速和高度分辨能力的柱色谱技术。它是20世纪70年代以来迅速发展起来的分离分析生化样品最有效的技术手段。是在经典的液相柱色谱的基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种柱色谱技术被称为高效液相色谱法或称高压液相色谱法、高速液相色谱法、现代液相色谱法等。( highperformance liquid chromatography，HPLC)。虽然气相色谱的应用领域十分广泛，但仍不能解决大量的恢复性差和热不稳定的化合物的分离难题。经典的
液相色谱仍然是用于分析这类化合物的手段。直到20 世纪60 年代后期，由于新型柱填料高压输液泵和高灵敏度检测器的出现，才使液相色谱快速发展起来，并发展成为高效液相色谱。高效液相色谱可分为多种，按照固定相的不同可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型[1]。高效液相色谱在药品质量分析的应用中具有分离快速、分离效果好及灵敏度高等优势[2]，本文主要对高效液相色谱法的分离原理、高效液相色谱技术的发展及其在药品质量分析中的应用等进行阐述。 1.高效液相色谱法的分离原理及特点 高效液相色谱法是根据混合物中的各个组成成分在固定相和流动相之间的分配比例的不同，实现成分之间的分离的[3]。高效液相色谱仪根据检测器的不同，分为紫外检测器、示差检测器、蒸发光散射检测器、二极管阵列检测及荧光检测器等[4]，适用于不同特点混合物的分析，扩大了高效液相色谱法的分析范围，使此方法应用更加广泛。此外，由于可以通过改变流动相的种类、配比、调节流动相的酸碱度达到改善色谱峰峰型的目的，进一步提高高效液相色谱的分离效果、提高检测灵敏度，保证检测结果准确性。高效液相色谱检测器由于可以保证被分离物质的完整性，可以作为分离、纯化的手段，进一步与质谱仪连用，互为优势，为药品质量分析提供更加可靠、方便的检测方法。 2 高效液相色谱技术的发展 高效液相色谱法是一种新近发展起来的一种分离检测方法，通过近些年的不断发展，可以作为一种稳定的分离技术广泛应用于制药领域及其他多个领域。经统计，已知化合物的70%-80%都可用于液相色谱法进行分析[5]，理论上适用于高沸点、热稳定性差及分子量较大的化合的分析。随着技术的不断完善，自动化、高效能、高灵敏度、高选择性等方向的发展已经逐渐成为高效液相色谱技术的主
气相色谱法与高效液相色谱法 比较气相色谱法与高效液相色谱法分离原理、仪器构造及应用范围的不同 点。 一、分离原理： 1.气相：气相色谱是一种物理的分离方法。利用被测物质各组分在不同两相 间分配系数（溶解度）的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行 反复多次的分配，使原来只有微小的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到 分离。 2.液相：高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理 论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米 塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连 续检测。 二、应用范围： 1.气相：气相色谱法具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等 优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气 相色谱法进行分析。一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍 生化法或裂解法。 2.液相：高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不 受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的 约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
三、仪器构造： 1.气相：由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。 1.1 柱箱：色谱柱是气相色谱仪的心脏，样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离，从而达到分析的目的，柱箱的作用就是安装色谱柱。 由于色谱柱的两端分别连接进样器和检测器，因此进样器和检测器的下端（接头）均插入柱箱。 柱箱能够安装各种填充柱和毛细管柱，并且操作方便。 色谱柱（样品）需要在一定的温度条件下工作，因此采用微机对柱箱进行温度控制。并且由于设计合理，柱箱内的梯度很小。 对于一些成份复杂、沸程较宽的样品，柱箱还可进行三阶程序升温控制。且程序设定后自动运行无需人工干预，降温时还能自动后开门排热。 1.2 进样器： 进样器的作用是将样品送入色谱柱。如果是液体样品，进样器还必须将其汽化，因此采用微机对进样器进行温度控制。 根据不同种类的色谱柱及不同的进样方式，共有五种进样器可供 选择： 1.填充柱进样器 2.毛细管不分流进样器附件
高效液相色谱法在分析检测上的应用 目录 1引言 (1) 引言 (1) 2高效液相色谱分析原理 (1) 2.1高效液相色谱分析的流程 (1) 2.2高效液相色谱的分离过程 (1) 2.3高效液相色谱的类型 (2) 2.3.1吸附色谱 (2) 2.3.2分配色谱 (2) 2.3.3离子交换色谱 (3) 2.3.4凝胶色谱 (3) 3高效液相色谱法在分析检测上的应用 (4) 3.1食品中山梨酸、苯甲酸的测定 (4) 3.1.1测定原理 (4) 3.1.2试剂和溶液 (4) 3.1.3.测定方法 (4) 3.2 高效液相色谱法测定青梅花、枝、叶中绿原酸类化合物 (5) 3.2.1 对照品溶液配制 (5) 3.2.3 青梅样品的测定 (6) 4结论 (6) 参考文献 (7)
1引言 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100 μm的吸附剂（硅胶、氧化铝等）。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小（5 μm-10 μm）、传质快、柱效高。高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。 2高效液相色谱分析原理 2.1高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 2.2高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系