通信作者：吴俊 Email：wujunpostbox@https://www.doczj.com/doc/e311033865.html, Gas6（growth arrest specific gene 6）是人类发现的一类新的生长因子，它作用于细胞受体，它的受体属于受体酪氨酸激酶家族，它们包括Sky （Tyro3）、Axl 、Mer ，也统称TAMreceptor （Tyro3，Axl ，Mer ）。随着研究的深入，人们发现，Gas6系统具有广泛的生物学作用。1 Gas6及其受体结构，细胞表达情况（图1） Gas6属维生素K 依赖的蛋白质，广泛表达于各类细胞。它和protein S 具有42%同源性[1]。Axl 普遍表达于各类细胞，Tyro3主要表达于中枢神经系统，而Mer 在单核转化的巨噬细胞较丰富。Axl 、Mer 、Tyro3可以在金属蛋白酶作用下切割，成为可溶性受体（soluble Axl ，sAxl ；soluble Mer ，sMer ；soluble T yro3，sT yro3），血浆中可检测到游离受体。2 Gas6与细胞凋亡 Gas6是一种细胞因子，与细胞生长相关。 Gas6系统研究进展 吴俊（北京大学人民医院 检验科，北京 100037） Gas6具有抗血管内皮细胞、平滑肌细胞凋亡的作用，通过Gas6-Axl-PI3K-Akt 起抗凋亡作用。它可介导凋亡细胞吞噬。目前已知，Gas6对于凋亡细胞的吞噬主要是通过受体Mer 来实现的[2]，Mer 表达于巨噬细胞和树突状细胞[2]，凋亡细胞表达磷脂酰丝氨酸，Gas6或protein S 通过维生素K 依赖的Gla domain 结合凋亡细胞表面磷脂酰丝氨酸[3]，通过吞噬细胞表面的Mer 受体，介导吞噬作用。Gas6调节巨噬细胞的成熟、转移[4]，促进内皮细胞生长并抗凋亡[5]。Mer 受体缺陷导致视网膜色素上皮细胞清除障碍[6,7]，可导致色素性视网膜炎甚至失明。精子细胞的成熟和凋亡也需要通过Gas6系统的调控[8]。 凋亡细胞的稳定清除，避免了进一步的坏死而引发的进一步炎性反应和自身免疫的发生。而可溶性的受体sMer 等可以与细胞表面受体竞争配体，因而起到抑制凋亡细胞清除的作用[9]。Mer 受体对于凋亡细胞诱导的T 细胞耐受有促进作用[10]，调节免疫耐受。 ３ Gas6在炎症和自身免疫中的作用 Gas6与多种炎症相关，包括感染性炎症、血栓性炎症、自身免疫性炎症等。Gas6促进炎症状态下细胞间相互作用[11]，促进炎性反应，扩大血栓形成，促进白细胞穿出[12]。Gas6与C-反应蛋白（CRP ）相独立，是炎症相关独立危险因素。败血症休克患者Gas6浓度升高[13]。Ekman C 等[14]证实Gas6/Axl 在血栓性炎症严重肢端缺血患者体内升高，且与疾病预后相关。急性胰腺炎患者Gas6，protein S 升高[15]。对于多重硬化（multiple sclerosis ，MS ）的患者，增加的可溶性受体Axl ，Mer 和金属蛋白酶ADAM17，ADAM10 正相关，与 图1 Gas6，protein S及其作用的受体结构简图 酪氨酸激酶 抗凋亡（神经保护）生存，抗凋亡增生 迂移 黏附 细胞吞噬 抗凋亡 淋巴细胞增生
幽门螺杆菌细胞毒素的鉴定方法 The methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pylori WANG Hua-Bing,DONG Xiu-Yun (Department of Gastroenterology,Peking University Third Hospital,Beijing100083,China) ABSTRACT Objective:To investigate the methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pylori (H.Pylori) clinical isolate.Methods:H.Pylori strain HB1 was isolated from the biopsy specimen of gastric mucosa and identified its cytotoxin by using the techniques of cell culture,PCR and Western blot.Results:HB1 strain induced vacuolation in HeLa cells.The cagA gene was detected by PCR in HB1 strain.The Western blot analysis showed there were two protein bands of 87×103 and 130×103 in H.pylori water extract.Conclusion:H.pylori clinical isolate HB1 was a VacA+CagA+strain. KEY WORDS Helicobacter pylori;Cytotoxin/VacA,CagA;Identify 自1983年澳大利亚学者Marshall和Warren首次从人胃粘膜中成功地分离培养出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）以来，Hp已成为国内外许多专家、学者研究的对象。最近Hp毒素在致病性中的重要作用引起人们广泛关注。根据目前的研究，Hp毒素主要有两种，即空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin A,VacA)和毒素相关基因A(Cytotoxin associated gene A,CagA)。根据这两种蛋白可将Hp分为两种主要类型［1］：Ⅰ型菌株含有cagA基因，表达CagA蛋白，并产生空泡毒素；Ⅱ型菌株缺乏cagA基因，不表达CagA蛋白，不产生空泡毒素。这两型菌株分别占研究总样本的56%和16%，其余28%属中间表型，仅表达CagA或VacA。本实验利用已知毒素特性的Hp国际标准株NCTC 11637和NCTC 11639为参照，对临床分离株HB1进行细胞毒素鉴定，以求探索出一套有效的鉴定方法，以便对不同菌株作进一步研究。 1材料与方法 1.1细菌来源 NCTC 11637(VacA+,CagA+)和NCTC 11639(VacA－,CagA+)由中国预防医学科学院流行病学研究所提供；HB1从十二指肠球溃疡患者胃粘膜活检标本中分离。 1.2主要试剂 cag A扩增产物为349 bp片段，引物由中国预防医学科学院流行病学研究所惠赠，序列如下： 5′-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3′ 5′-CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA-3′ 100bp Ladder Marker由北京大学基础医学院病理学系提供。高分子蛋白质分子质量标准为Promega公司产品。第一抗体为混合病人血清，经Helico Blot试剂盒检测CagA抗体及VacA抗体均为阳性。第二抗体（辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG)为中山生物工程公司产品。 1.3HeLa细胞空泡变性实验
幽门螺杆菌的感染与致病机理 近二十多年的研究发现，幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构（WHO/IARC）将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。 ◆Hp感染Hp进入胃后，借助菌体一侧的鞭毛提供动力穿过黏液层。研究表明，Hp在粘稠的环境下具有极强的运动能力，强动力性是Hp致病的重要因素。Hp到达上皮表面后，通过粘附素，牢牢地与上皮细胞连接在一起，避免随食物一起被胃排空。并分泌过氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶，以保护其不受中性粒细胞的杀伤作用。Hp富含尿素酶，通过尿素酶水解尿素产生氨，在菌体周围形成"氨云"保护层，以抵抗胃酸的杀灭作用。 ◆Hp与胃炎正常情况下，胃壁有一系列完善的自我保护机制（胃酸、蛋白酶的分泌功能，不溶性与可溶性粘液层的保护作用，有规律的运动等），能抵御经口而入的千百种微生物的侵袭。自从在胃粘膜上皮细胞表面发现了hp以后，才认识到hp几乎是能够突破这一天然屏障的元凶。goodwin把Hp对胃粘膜屏障在破坏作用比喻作对"屋顶"的破坏给屋内造成灾难那样的后果，故称为"屋漏"学说。目前对hp感染的研究能归入这一学说的资料最多。主要包括：①使hp穿透粘液层在胃上皮细胞表面定居的因素；②对胃上皮细胞等起破坏作用的毒素因子；③各种炎症细胞及炎症介质；④免疫反应物质等。 这些因素构成hp感染的基本病理变化，即各种类型的急、慢性胃炎。其中近年来得到最重要关注的是空泡毒素vaca、细胞毒素相关蛋白质caga，和尿素酶等的作用及其分子生物学研究。 ◆Hp与消化性溃疡hp感染明显地增加了发生十二指肠和胃溃疡的危险性。大约1/6 hp 感染者可能发生消化性溃疡病。治疗hp感染可加速溃疡的愈合和大大降低溃疡的复发率。不用抑酸剂，单用抗hp药物治疗，表明也能有效地治愈胃和十二指肠溃疡。hp感染已经与一些引起溃疡病的原因找到了联系。例如：胃酸增加、十二指肠胃化生、粘膜屏障性质的改变、胃窦粘膜产生炎症代谢产物等。这些患者中的发现已在动物实验中得到初步证明。实际上消化性溃疡涉及几个复杂的相互作用的机制。如细菌的毒力因素（vaca和caga等），宿主的反应性（例：如易感性的遗传、十二指肠上皮的胃化生、粘膜屏障和炎症的相互作用、泌酸反应、神经调节作用）和环境因素（例如饮食、获得感染的年龄）的综合作用导致溃疡的最后结果。过去临床上对溃疡的发生有一句谚语，叫"no acid，no ulcer"。现在，从现代理论来看，"no hp，no ulcer"应得到更多地强调。 ◆Hp与胃癌从近年来对Hp感染的大量研究中提出了许多Hp致胃癌的可能机制：①细菌的代谢产物直接转化粘膜；②类同于病毒的致病机制，hp dna的某些片段转移入宿主细胞，引起转化；③hp引起炎症反应，其本身具有基因毒性作用。在这些机制中，后者似乎与最广泛的资料是一致的。
综述 幽门螺杆菌疫苗的研究进展 摘要: 幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, HP)是一种革兰氏阴性螺旋杆菌，能够导致胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴瘤和胃癌。1994年，和HP被世界卫生组织（ＷＨＯ）列为Ⅰ类致癌原。此外,ＨP还与糖尿病、冠心病、血小板减少性紫癜等一些肠道外疾病有重要关系。目前ＨP感染的主要治疗方案是联合应用质子泵抑制剂、铋剂和抗生素的三联疗法，杀灭细菌效率超过９０％。但是，这种治疗方案仍存在以下问题：药物疗法副作用较多，如口腔异味、腹痛、恶心、呕吐等；抗生素耐药菌株的不断增多；对于发展中国家感染人群来说治疗费用相对昂贵等。免疫接种有望成为预防ＨP感染最有效最经济的方法(1)。近年来,HP感染呈上升趋势,有效疫苗的研制是根除HP的最简单、经济、快捷的手段。随着疫苗研究的深入,诸如灭活全菌疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗、DNA疫苗及缓释疫苗等相继问世,其优、缺点也比较明显。本文对以上几种疫苗的研究进展作一综述。 关键词：幽门螺杆菌疫苗 一. 研究幽门螺杆菌疫苗的迫切性 早在1994年,WHO就已将幽门螺杆菌(Heli-cobacterpylori,HP)确认为一级致癌因子,但长期以来对HP感染的药物治疗一直受到治愈率低、费用昂贵、病人依从性差及耐药菌株出现等诸多因素的制约,使现阶段全球感染人数仍呈上升趋势。HP疫苗的研制和应用对有效
控制及降低HP感染率、发病率会起到举足轻重的作用(2)。二．Hpylori疫苗开发策略 由于Hpylori仅感染胃上皮细胞表面,它们的发病由病原菌的粘附、定居和繁殖所决定,其感染局限于循环抗体难以达到的地方。因此,这类疫苗应主要着眼于产生分泌性抗体,阻止细菌对胃粘膜上皮细胞的粘附。 这种疫苗以经血循环途径给予通常是无效的,疫苗只是通过与感染相同的途径给予,才能在通常的感染部位诱导出足够的分泌型抗体。疫苗接种应能诱导针对大量表面蛋白的强烈的粘膜免疫应答。而疫苗引起的免疫主要针对H pylori开始粘附过程的关键性抗原结构,即阻断Hpylori在胃粘膜的粘附。 Hpylori的毒力因子有许多种,如尿素酶、热休克蛋白、VacA、CagA、过氧化氢酶等,从理论上讲,不大可能运用“减法”策略研制一种成功的减毒疫苗,因此, “加法”策略是Hpylori疫苗研究过程中应用的最佳选择。由此可见,Hpylori疫苗开发策略必须建立在经充分鉴定的、高度保守的纯化抗原上,并能诱导有效的粘膜免疫应答。 三. 幽门螺杆菌疫苗的进展 1.HP全菌灭活菌苗 Czinn和Nedrud首先证实Hpylori全菌蛋白抗原联合霍乱毒素(Cholera Toxin,CT)可预防小鼠和雪貂感染Hpylori,并表明预防性疫苗与胃肠道IgG和IgA反应有关。1999年Goto等用超声处理的H pylori悉尼株全菌抗原+CT口服接种C57BL/6小鼠,取胃组织做细菌
CHO细胞表达系统研究进展 影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达谓节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有一定作用。研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构来实现。 转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此，表达载体的元件组成及结构是ClIO细胞高效表达外源基因的关键因素之一。借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便而高效地用于外源基因的表达。目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子一增强子元件、转录剪切和Poly A信号等。 1、启动子 启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、L TR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子> LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。 来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启动子等。在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前
19世纪末，人们发现在胃粘膜中存在一种螺旋形的微生物，以后虽有不少类似的报道，但均未受到应有的重视。直到1983年澳大利亚学者Warren和Marshall报告了从人胃粘膜中分离到幽门螺杆菌〔（Helicobacter pylori,Hp；当时称之谓幽门弯曲菌（Campylobacter pylori,Cp）〕，认为该菌与慢性胃炎和消化性溃疡有关。 我国于1984年开展Hp的研究工作，近15年来，通过我国医学工作者的努力，在Hp 的基础与临床研究方面，均取得了重要的进展，现扼要综述如下。 一、幽门螺杆菌的病原学与遗传变异 1985年上海第二医科大学张振华在国内首先分离培养了Hp,并对其生物学性状作了研究。发现该菌与弯曲菌属在一些重要的酶类（尿素酶、DNA酶、碱性磷酸酶、亮氨酰胺肽酶等）、超微结构、菌体蛋白质SDS-PAGE、菌体脂肪酸组成及耐热抗原等方面存在着本 质上的差异。 1987年中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所陈晶晶等对300例各型胃病患者进行了Hp检查，阳性率为65%。用血液双相培养基测定了Hp的生长曲线，起始接种浓度为1.02×102cfu/ml，第4天达2.87×105cfu/ml，以后又开始下降，从Hp染色体DNA酶切图谱分析，表明Hp与空肠弯曲菌用BagⅢ、BamHⅠ、Xb aⅠ和PstⅠ酶切，均显示出两菌 的不同带型。 有关Hp对组织粘附特异性研究，第一军医大学周殿元等（1997）在Barrett食道上皮化生区发现Hp定植，我们（1996）发现Hp菌对胎儿胃粘膜的胃窦和胃体下部有较强的粘附 能力。 近年北京医科大学王蔚虹（1997）和中山医科大学陈 湖（1997）等应用PCR扩增技术，所得产物以2%琼脂糖凝胶电泳分析（RAPD分析）鉴定Hp，可用于区别不同来源的Hp菌株。北京医科大学（1997）应用PCR单链构象多态技术（PCR-SSCP），南京医科大学（1997）用CagA/VacA毒素基因测定及上海第二医科大学（1997）应用菌体蛋白电泳和免疫印迹法对该菌进行了分型研究。如采用毒素基因分型，Hp可分为CagA+Vac A+、CagA +VacA-、CagA-VacA+和CagA-VacA-4种亚型，我们（1996）将Hp的SDS-PAGE表型分型，综合112株的共同条带特征，可将Hp分为Ⅰ～Ⅳ型，而其中Ⅳ型又分为Ⅳ1～Ⅳ5五个亚型。 我们认为这种分型方法有利于Hp的致病性与菌苗的研究。 贾继辉等（1994）发现，Hp的L型与其它细菌的L型一样，形态不均一，呈多形性。用HindⅢ酶切分析，显示Hp-L型和细菌型的酶谱基本相同，南方医院（1996）发现Hp的变异体在体外可长期传代，而冷冻保存后则难以复苏，用特定的无血培养基可以促进形态
滴金法检测幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A 抗体 试剂盒的研制及应用 侯 瑜1,张 菊2,李质馨1,田洪艳1,刘晓冬1,徐 冶1 (1.第四军医大学吉林军医学院组胚教研室,吉林 132013;2.第四军医大学全军基因诊断技术研究所,陕西西安 710033) 摘要:目的 建立一种快速、简易的检测血清中抗幽门螺杆菌(Hp )细胞毒素相关蛋白A (CagA )抗体的胶体金免疫渗滤法(DIGFA )。方法 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记葡萄球菌A 蛋白(SPA ),将重组的CagA 抗原固定于硝酸纤维素膜上,制成免疫渗滤试剂盒。血清中抗CagA 抗体与试剂盒上金标记物及硝酸纤维素膜上的固相抗原结合后,形成肉眼可见的红色斑点。结果 用DIGFA 与酶联免疫吸附试验(EL ISA )试剂盒对比检测了326份血清标本中抗CagA 抗体,本方法的特异性为95.8%,敏感性为97.3%,两种方法符合率为96.6%。结论 DIGFA 检测血清中的抗CagA 抗体特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有广泛应用价值。关键词:幽门螺杆菌;细胞毒素相关蛋白A ;胶体金;渗滤法;抗体 中图分类号:R573 文献标识码:B 文章编号:176128259(2003)0520520202收稿日期:2002210216 修回日期:2003201202 作者简介:侯瑜(19642),女(汉族),学士,实验师. 幽门螺杆菌(helicobacter pylori ,Hp )的发现是20世纪 80年代医学史的重大事件,它为认识某些胃肠疾病的病因及 发病机制带来了新的概念。现已确认HP 是慢性胃炎的主要致病因子,与消化性溃疡的发生密切相关1,世界卫生组织已将其列为一类致癌因子。目前,根据HP 菌株是否产生细胞空泡毒素(vaculating cytotoxinA ,VacA ),将HP 分为毒性株与非毒性株两大类。产毒株HP 除产生VacA 外,还往往含有细胞毒素相关蛋白基因A (cytotoxin associated gene A ,CagA ), CagA 可能与VacA 的转录、折叠、运转及功能有关2,3。Ca 2gA +HP 菌株占HP 的50%以上,它与消化性溃疡病的发生密 切相关,与胃癌的关系也很密切。目前国内尚缺乏CagA 阳性感染的流行病学资料,HP 感染的治疗方案复杂,早期诊断治疗效果好。因此,早期诊断CagA +HP 感染具有重要意义,而建立CagA +HP 阳性感染的准确检测方法更显得十分必要。 1 材料和方法 1.1 材料 氯金酸(HAuCl ?Cl 3?4H 2O ,成都化学试剂厂产 品);葡萄球菌A 蛋白(SPA ,上海申索生物制品公司);细胞毒素相关蛋白A (CagA ,本所制备的基因工程产品);酶联免疫吸附试验检测抗CagA 2IgG 试剂盒(上海晶莹生物制品公司);血清标本(第四军医大学西京医院消化科门诊及西安市中心医院消化内科提供);低温高速离心机(德国Z323K );点膜器(美国bio 2Dot 公司)。 1.2 方法 1.2.1 15nm 胶体金的制备 参照文献4\〗进行。步骤 为:去离子水溶解氯金酸,使其终浓度为0.2g ?L -1,煮沸后每 100mL 加入10g ?L -1柠檬酸三钠水溶液4mL ,继续煮沸7min ,待冷却后电镜观察胶体金的颗粒直径和形状。1.2.2 免疫胶体金的制备 取粒直径为15nm 的胶体金溶液100mL ,用0.1m ol ?L -1K 2CO 3调至pH6.2,在搅拌状态下加入SPA (1g ?L -1)0.6mL ,继续搅拌10min ;加入50g ?L -1BSA 10mL ,继续搅拌5min 。4℃下3000r ?min -1离心5min ,弃沉淀, 上清液以12000r ?min -1离心15min ,小心吸弃上清液,沉淀即为制备的胶体金。用20mL 悬浮液悬浮沉淀,4℃保存待用。 1.2.3 免疫渗滤试剂盒的制备 试剂盒由吸水材料、硝酸纤 维膜和渗滤装置三部分组成。在硝酸纤维素膜上固相CagA 抗原,待干后用50g ?L -1BSA 封闭2h ,用0.01mol ?L -1PBS 洗涤3次,干燥后依次(吸水材料、滤纸、硝酸纤维素膜)装入自制的渗滤装置,加干燥剂封闭,4℃保存。 1.2.4 抗HP 2CagA IgG 的检测 以新鲜血清最好,用0.01mol ?L -1PBS 先将硝酸纤维素膜活化,再将0.015～0.03mL 血清滴加在硝酸纤维素膜上,待完全渗入后,用0.01m ol ?L -1PBS 洗涤三滴,将已标记好的胶体金滴加在硝酸纤维素膜上,待完全渗入,再用0.01mol ?L -1PBS 洗涤三滴即可。结果判定:以试剂盒硝酸纤维素膜上出现红色致密斑块且边缘清晰者为阳性,反之则为阴性。结果确定时间为3～5min 。 2 结 果 2.1 胶体金直径的电镜观察 用预先处理好的覆盖有For 2mvar 膜的镍网浸入胶体金溶液中,取出放置空气干燥,然后 在透射电镜下观察,可见胶体金颗粒大小均匀一致,颗粒直径为15nm 。 2.2 试剂盒的特异性及敏感度 采用本实验所建立的DIG 2FA 与EL ISA 试剂盒对比检测西京医院及市中心医院326例 患者血清中的抗HP 2CagA IgG ,结果见表1。 第24卷第5期2003年10月西安交通大学学报(医学版) J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Sciences )V ol.24N o.5Oct.2003
乳酸杆菌基因表达系统的研究进展 徐义刚1,2,崔丽春1 (1.东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040; 2.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030) 摘要乳酸杆菌是人及动物肠道中重要的益生菌,被公认为安全级(generall y recognized as safe,GRA S)微生物。乳酸杆菌表达系统是近几年发展起来的一种表达系统,随着乳酸杆菌分子生物学的发展、各类表达调控元件的分离,相继发展了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体和整合载体。乳酸杆菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力,以乳酸杆菌为载体,作为外源基因的传递和表达系统,研制口服疫苗,刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答,具有重要开发前景。 关键词乳酸杆菌;外源基因;表达系统 中图分类号Q939.11+7文献标识码A文章编号1005-7021(2007)03-0087-05 Progress on G ene E xpressi on Syste m of Lact obacill us XU Y-i gang1,2,C U I L-i chun1 (1.N ort h e a stF orest ry Univ.H arbin150040;2.C oll.of Veteri nary M e d.N ort h e a st Agric.Un i v.H arbi n150030) A bstrac t Lactobacill us is a k i nd o f i m portant prob i o ti c i n gastro-i ntesti nal tracts o f hu m an and most an i m a l s,and t hey are conside red to be safe bacter i a w it h a GRA S(generall y regarded as safe)status.T he express i on syste m s o f Lactobacillus is a k i nd of expression sy stem tha t have been deve l oped i n recent yea rs,and as t he deve l op m en t of mo-lecu l ar b i o l ogy o f Lactobacillus,and the sepa ration o f var i ous expressi on regu l a t o ry ele m ents,t he c l on i ng vector,the expressi on vector,and the i ntegrati on v ector have been deve loped one a fter ano t https://www.doczj.com/doc/e311033865.html,ctobacillus possesses many properties such as i m mune ad j uvant,adsorpti on mucosa,ant-i b ile ac i d capab ili ty;take Lactobacillus as a vector trans-fero r and expressi on syste m s o f exogenous gene to study ora l vacc i ne,sti m u l ate mucosa i m m une syste m to produce e-f fecti ve i m mune responses,a ll o f these possess i m portant deve l op m ent prospect. K eywords Lact obacillus;exogenous gene;expressi on syste m 乳酸菌(Lactic ac i d bacteria,LAB)是人及动物肠道中极为重要的益生菌群之一,该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌,是乳品工业发酵的重要菌类,是在食品、医药工程领域具有重要应用前景的食品级微生物,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。20世纪80年代,人们开始致力于乳酸菌生物学性质和分子机制的研究,乳酸杆菌在农业、食品领域所具有的重大经济意义及对人体和动物健康的重要性,越来越引起人们的关注。随着乳酸杆菌分子生物学的发展和电转基因技术的建立,以及各类表达调控元件的分离和克隆,已经建立和发展了一系列乳酸杆菌基因表达载体和传递系统,为探索其新的应用潜力提供了基础,其中利用乳酸杆菌作为抗原传递载体进行粘膜疫苗免疫的研究,是该领域研究的前沿和热点。本文主要对乳酸杆菌表达系统方面的进展作一综述。 1乳酸杆菌作为外源基因表达宿主菌的优势 乳酸杆菌作为主要的益生菌广泛应用于食品及饲料加工业,在功能食品、医疗保健、微生态制剂等领域的应用具有诱人的前景[1]。目前,乳酸杆菌制剂已被应用于肠道的微生态治疗[2]。乳酸 收稿日期:2006-09-19 作者简介:徐义刚男,博士。从事病原微生物与免疫学研究。87 微生物学杂志2007年5月第27卷3期J OURNAL OF M ICROBIOLOGY M ay2007V o.l27N o.3
口腔中幽门螺杆菌的研究进展 2011-08-25 14:06 口腔宿主为幽门螺杆菌（Hp）的存在提供各种适宜条件，常规根除Hp 三联疗法对口腔Hp不敏感，本文就改善Hp诊断方法和探讨口腔中Hp的重要作用作一简要综述。 一、幽门螺杆菌的发现及意义1893年，Bizzozero首次报道在狗的胃腺内发现有一种螺旋形微生物（Spiralorganism），之后的学者相继在猫、大鼠、狗、猴的胃肠道溃疡内观察到“螺旋体”（Spirochactes）。1906年，Kreintz在胃癌患者的胃内观察到一种螺旋体，人们并未重视。1917年，Kelle发现口腔牙菌斑中有“螺旋体”的存在。直到1983年，Marshall和Warren从慢性活动性胃炎患者的胃粘膜活检组织中发现一种螺旋形细菌，最初被命名为幽门弯曲菌（Campylobacterpylori，Cp），该菌的超微结构（螺旋与胞周纤维）、生化代谢特征，尤其是16srRNA基因序列与已知弯曲菌差异很大，而与其它猫、狗等胃内分离的螺旋菌近似，故1989年，Goodwin提出一新属名——螺杆菌（Helilobacter，H），并确定Cp是这一属中的代表菌种，称幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp），同年Kragdern等从胃炎患者的牙菌斑中分离出Hp，其后许多学者采用不同方法从牙菌斑、唾液、牙周粘膜等处分离出Hp或检测到Hp特异基因医学教育网搜集整理。 螺杆菌属累及人类的有6种，4种定植于肠道，感染率极低，且在组织病理学上意义不显著，而定植在胃粘膜的有2种即Hp和海尔曼螺杆菌（Helicobacterhelimanni）。现认为Hp是胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃粘膜相关性淋巴组织瘤的重要致病因素。此外，Hp感染与功能性消化不良、恶性贫血、溃疡性食管炎均有关联，英国学者Mendall认为成人冠心病与Hp血清阳性有关。目前有研究认为Hp是口臭的病原菌且与复发性口腔溃疡有关。 二、Hp的生物学特点Hp是一种微需氧的革兰氏阴性细菌。体外培养可由典型的S形、C形、海鸥状向长丝体、球形体、巨形体改变，在一定条件下长丝体可恢复其典型形态，但在抗菌治疗或其他不利因素下可变为返祖困难的球形体。细菌培养需动物血液或血清，37℃，PH7.0～7.2，微需氧条件2～7天，见针尖透明无色菌落。生化反应不活泼，不分解糖类，经尿素酶、氧化酶、触酶试验阳性证实。Hp全长基因约1.6～1.71MbP，G+C含量为34.1%～37.5%，最早由Langenberg报告用HindⅢ限制性内切酶分析Hp全基因的差异，Hp至少可分为两型：Ⅰ型能表达空泡细胞毒素（VacuolatingCytotoxin，VacA）和细胞毒素相关蛋白（Cytotoxinassociatedprotein，CagA），它们可诱导表皮细胞形成空泡，同时伴有抗体CagA的免疫显性细胞毒素，Ⅱ型不能表达VacA和CagA.Ⅰ型和Ⅱ型细菌分别占56%和16%，而其余的中间表达型仅表达其中一种毒力因子。不同Hp间存在明显的蛋白抗原差异和LOS（脂寡糖）/LPS（脂多糖）表达差异，Ⅰ型细胞的肠溶物还有引起胃粘膜损伤并进而激惹严重疾病的因子之一。 Hp感染时，胃粘膜上皮层和固有层中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润，癌基因及抑癌基因（C-met，ras，p16和p53等）突变及表达异常，从胃炎、癌前病变向胃癌发展中，Hp可引起胃粘膜上皮功能凋亡失衡，根除Hp 可使胃粘膜上皮增殖活性降低恢复正常。 三、Hp的流行病学人类口腔中可感染Hp并发展成胃炎。随着Hp感染血清学诊断的建立，在1986年就有大规模的流行病学调查。现已明确Hp感染
136 北京，2009年10月 A P C 联合学术年会论文集 基金项目：国家“八六三”计划节能与新能源汽车重大专项项目（2008AA11A121） 作者简介：邓义斌，男，1979.10，广西壮族自治区鹿寨县人，华中科技大学博士生，主要研究方向为热流控制与管理；dengyb_whut@https://www.doczj.com/doc/e311033865.html, 汽车热管理系统及其研究进展 邓义斌1,2 ，黄荣华1 ，王兆文1 ，程 伟3 (1． 华中科技大学能源与动力工程学院 湖北武汉 430074，2．武汉理工大学能源与动力工程学院 湖北武汉 430063，3．东风商用车研发中心 湖北武汉 430056 ) 摘 要：汽车热管理技术是汽车提高经济性和动力性、保证关键部件安全运行和车辆行驶安全的重要途径。介绍了汽车热管理的内涵和研究内容；报告了汽车热管理的发展现状与相应的仿真和试验研究方法；阐述了进行汽车热管理集成研究的重要性；指出只有深入研究系统的流动与传热机理，综合利用废热，从整车热管理集成的高度来进行优化匹配设计，才能发挥汽车热管理系统的最大优势。 关键词：汽车 热管理 节能 传热 发动机 中图法分类号：TK407 文献标识码：A Development in the Study of Vehicle Thermal Management System Deng Yibin 1,2 Huang Ronghua 1 Wang Zhaowen 1 Cheng Wei 31. School of Energy & Power Engineering, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430070, China 2. School of Energy & Power Engineering, Wuhan University of Technology, Wuhan 430063, China 3. Dongfeng Motor Corporation, Wuhan 430056, China Abstract: Thermal management has become a significant approach to improve the economy and dynamic of vehicle, to ensure the safety of vital assembly and automobile driving. This paper, firstly, introduced concepts and the main research contents of vehicle thermal management, then summarized the development of vehicle thermal management and simulation and experimental research methods corresponding to it. Finally, it pointed out that by the investigation on thermal management system integration with vehicle body, the actual performance of vehicle can be advanced. Key words: vehicle; thermal manageme nt; energy conservation; energy conservation; engine 1 汽车热管理的内涵 运用热力学原理提高整个系统或装置的能量利 用率，减少废热损失、提高系统的稳定性和可靠性的相关技术，从整体的角度来管理热量称为热管理。热管理是从被动地控制温度到主动地管理能量的思想转变，是提高热力系统设计整体性的重要研究方法。热管理的概念提出多年，已在汽车、集成电路、高能激光器、飞机、大型航天器和空间站中应用。 汽车热管理是在能源危机的出现、日益严格的汽车排放法规以及人们对汽车舒适性高要求的背景下应运而生的[1-5]。汽车热管理是从系统集成和整体角度，统筹热管理系统与热管理对象、整车的关系，采用综合控制和系统管理的方法，将各个系统或部件如冷却系统、润滑系统、空调系统等集成一个有效的热管理系统，控制和优化汽车的热量传递过程， 保证各关键部件和系统安全高效运行，完善的管理 并合理利用热能，降低废热排放，提高能源利用效率，减少环境污染。热管理在汽车节能、环保和安全等方面具有突出的战略地位，热管理技术成为汽车节能、提高经济性和保障安全性的重要措施。 2 汽车热管理的研究内容与研究现状 汽车热管理的主要研究内容包括热管理对象热特性研究、热管理系统集成以及热能综合利用等；广泛意义上包括对所有车载热源系统进行综合管理与优化，其中车载热源系统包括发动机的冷却系统、润滑系统、进排气系统和发动机机舱空气流动系统以及驾驶室的空调暖风系统等等，综合考虑空气侧与车载热源系统之间热量传递过程。涉及到冷却介质、热交换器、风扇、泵、底盘空气流动、传感器与执行机构、材料与加工、整车空气动力学、安全
幽门螺杆菌的致病机理 现已明确，幽门螺杆菌（Ｈｐ）与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和黏膜相关性淋巴样组织（ＭＡＬＴ）淋巴瘤密切相关。Ｈｐ呈螺旋形，有鞭毛、适应性的酶和蛋白，这使它能在胃内酸性环境中定植和生存。Ｈｐ产生的毒素和有毒性作用的酶能破坏胃黏膜屏障，还能使机体产生炎症和免疫反应，增加胃泌素的分泌，最终导致一系列疾病的发生。 Ｈｐ的自然定植部位在胃黏膜上皮表面和胃黏液的底层。Ｈｐ在胃窦部数量最多，胃体和胃底则较少。胃腔内高酸度环境下，多种细菌均可被胃酸杀灭，正常的胃液中仅可分离出少量细菌。Ｈｐ要到达胃黏膜上皮表面和黏液底层这个特殊的生态圈内进行定植首先要靠动力穿过黏液层，还要抵抗胃酸和其他不利因素的杀灭作用。 Ｈｐ能快速穿过胃腔的酸性 环境到达中性的黏液层，并穿过黏液层，覆盖在胃黏膜上。Ｈｐ呈螺旋状，其两端较钝，其中一端有４～６根鞭毛。螺旋状为Ｈｐ在黏稠的胃黏液中运动提供了基础，而其鞭毛的摆动则提供了足够的动力。鞭毛是Ｈｐ的动力器官，每根鞭毛均有鞘，对鞭毛起保护作用，对胃酸亦有一定的抵抗力。 Ｈｐ能在酸性环境中生存是其定植的关键。尿素酶是Ｈｐ产生的一种能将尿素水解为氨和二氧化碳的酶，它对于Ｈｐ的定植和生存起着重要的作用。尿素酶分解尿素产生的氨可在Ｈｐ周围形成“氨云”，中和其周围的胃酸，而二氧化碳则以 碳酸氢盐的形式进入血液，然后从呼吸道排出。此外，Ｈｐ体内的一种热休克蛋白、Ｈｐ产生的Ｐ型三磷酸腺苷酶及抑制胃酸分泌的蛋白对于Ｈｐ的生存也起一定的作用。 Ｈｐ感染后，中性粒细 胞会移行至上皮处杀灭Ｈｐ。Ｈｐ产生的过氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和过氧化氢酶能保护其不受中性粒细胞的杀伤作用。中性粒细胞的吞噬空泡中含有过氧化物，通过脂质过氧化和蛋白变性而起杀菌作用。Ｈｐ的ＳＯＤ能把过氧化物转化为ＨＯ，然后通过过氧化氢酶把ＨＯ分解为ＨＯ和Ｏ，从而避免了白细胞的杀伤。 Ｈｐ一旦穿过黏液层， 就会粘附在胃上皮表面。Ｈｐ与上皮细胞接触后会促使肌动蛋白收缩，形成粘着蒂样改变。Ｈｐ紧密粘附于胃上皮表面可避免使其与胃内的食物一道被排空，亦使其毒素容易作用于上皮细胞。Ｈｐ的这种特异性的粘附反映了它存在粘附因子，而胃上皮细胞存在粘附因子的特异性受体。 在正常的胃黏膜上，由黏膜上皮 分泌的黏液、上皮细胞和细胞连接组成了胃黏膜屏障，起到阻止Ｈ反向弥散的作用。当黏膜受到Ｈｐ的损害时，就会造成Ｈ反向弥散，导致黏膜损伤和溃疡形成。Ｈｐ产生的毒素和有毒性作用的酶，以及Ｈｐ诱导的黏膜炎症反应，均能造成胃黏膜屏障的损伤。 Ｈｐ产生的细胞毒素能造成不同程度的细胞空泡变性。这种空泡毒素被称为ＶａｃＡ，此毒素存在于所有的Ｈｐ菌株中，但仅有６５％的菌株有活性的表达。还有一种物质与ＶａｃＡ同时存在，被称为细胞毒素相关基因Ａ（ＣａｇＡ）。ＣａｇＡ的基因仅出现于ＶａｃＡ产生细胞毒素效应的菌株中，是ＶａｃＡ产生效果的标志，尚不知ＣａｇＡ的确切功能。 尿素酶除了对Ｈｐ本身起保护作用外，还能损害胃黏膜屏障。尿素酶产生的氨能降低黏液中黏蛋白的含量，破坏黏液的离子完整性，削弱屏障功能，造成Ｈ反向弥散。氨还能破坏需氧细胞的三羧酸循环，干扰其能量代谢，造成细胞变性。氨可与中性粒细胞产生的ＨＣｌＯ结合形成ＮＨＯＨ和ＮＨＣｌ等毒性产物。 Ｈｐ能产生一种溶解黏液的酶。胃黏液的降解会促进Ｈ的反向弥散，造成黏膜损害；黏液的黏稠度降低有利于Ｈｐ的运动，使Ｈｐ易于定植；黏液分解后还可产生Ｈｐ生长的某些营养物质。 Ｈｐ产生的脂多糖（ＬＰＳ）能抑制层粘连蛋白和嵌有脂质的层粘连蛋白受体的结合，这种抑制与脂多糖的量呈正相关。由于层粘连蛋白是维持上皮完整性所需的一种细胞外基 动 力对胃酸的抵抗作用保护性酶粘附作用细胞毒素 尿素酶 黏液酶 脂多糖 ２２２２２２２２ ＋＋＋＋幽门螺杆菌的定植 损害胃黏膜屏障 Ｈｐ还会产生一种抑制胃酸分泌的蛋白，使局部胃酸分泌减少，亦有利于它的定植。郭 巍 CHINESECOMMUNITYDOCTORS 中国社区医师 年第期（第卷总第期） 20042220268８１３００３１吉林大学中日联谊医院
基因工程制药综述 班级：生技132 姓名： 学号：
大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体内过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、 RNA 转录组、蛋白质组、代谢调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体 pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双