生物制药技术中的抗体工程与单克隆抗体制
备
抗体工程和单克隆抗体制备在生物制药技术中扮演着重要的角色。抗体（antibody）是一种由免疫细胞产生的蛋白质，可以识别和结合特定的抗原物质。由于抗体在免疫反应中的关键作用，人们开始研究如何利用抗体在生物药物的制备和治疗中发挥作用。
抗体工程是一项利用基因工程技术改变抗体的结构和功能的研究。通过抗体工程，可以生成具有特定特性和增强效力的抗体。抗体工程的目标包括增强抗体的亲和力、稳定性和特异性，以及减少免疫原性和毒性反应。这些目标的实现通过调整抗体的结构和序列来实现。
单克隆抗体是指一类只对特定抗原物质产生单一免疫应答的抗体。单克隆抗体制备是一项技术，通过体外细胞培养和单克隆抗体蛋白质纯化，大规模制备单克隆抗体。这些抗体可以用于药物治疗、疾病诊断和生物学研究等领域。
抗体工程和单克隆抗体制备的关键步骤包括抗原刺激、混合免疫细胞、克隆和筛选。
首先，抗原刺激是引发免疫反应的关键步骤。研究人员将特定抗原物质注入动物体内，触发机体对该抗原的免疫反应。在免疫细胞的参与下，机体开始产生抗体以应对抗原。
其次，混合免疫细胞是为了将大量产生抗体的细胞筛选出来。研究人员将免疫细胞提取并混合在一起，形成融合细胞。这些融合细胞能够集成母细胞的抗体产生功能。
然后，克隆是将这些融合细胞进行分离和培养，使其每一个细胞单元都能够独
立地产生抗体。研究人员使用稀释法或分选法将单个融合细胞分离出来，并将其分布在培养皿中，以便继续繁殖。
最后，筛选是为了筛选出具有特定特性的单克隆抗体。研究人员使用特定的抗
原进行筛选，以确定哪些单克隆细胞能够产生与抗原结合的抗体。这些具备标记的抗体则被挑选出来进行纯化和进一步的功能评估。
抗体工程和单克隆抗体制备的发展为生物制药技术带来了重要的突破。通过抗
体工程，科学家们可以针对特定疾病制备定制的抗体药物。这些药物具有更高的亲和力和特异性，能够更有效地靶向疾病相关的分子。例如，单克隆抗体药物已在癌症治疗中取得了显著的成功，成为现代抗癌疗法的重要组成部分。
此外，抗体工程还开辟了多种新的应用领域。例如，利用抗体工程可以制备用
于疾病诊断的抗体试剂盒，帮助医生快速诊断和监测疾病。此外，抗体工程还在农业领域发挥着重要作用，通过生物技术改良作物的抗性，提高农作物的产量和质量。
总的来说，抗体工程和单克隆抗体制备技术在生物制药技术中具有重要的意义。通过这些技术，科学家们可以制备具有特定特性和高效力的抗体药物，为疾病治疗提供更有效的方法。未来，随着生物技术和基因工程的不断发展，抗体工程和单克隆抗体制备技术将继续为生物制药技术的发展和突破做出更大的贡献。
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）
↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合 1．细胞融合前准备
生物制药技术中的抗体工程技术介绍 抗体工程技术在生物制药领域扮演了重要的角色，它通过改造和利用抗体的特性，为治疗疾病提供了新的途径。在本文中，我将介绍抗体工程技术在生物制药技术中的应用和相关的进展。 抗体是由机体的免疫系统产生的一类蛋白质，可以识别和结合特定的抗原。因其高度特异性和亲和性，抗体成为治疗疾病的理想候选药物。然而，天然抗体存在一些局限性，比如生产成本高、不稳定性和免疫原性等。为了克服这些问题，科学家们开发了抗体工程技术，通过改造抗体的结构和功能，提高治疗效果和降低副作用。 一种常见的抗体工程技术是单克隆抗体制备技术。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的抗体，对特定抗原具有高度特异性。传统的获取单克隆抗体的方法是从小鼠等动物的脾脏或骨髓中提取B细胞，再经过杂交瘤技术获得。然而，这种方法存在一定的局限性，比如生产周期长、免疫原性问题等。近年来，通过重组DNA技术，科学家们可以制备人源化的单克隆抗体，从而避免了相关问题，并提高了制备效率。 另一种抗体工程技术是通过改造抗体的结构来增强其稳定性和活性。例如，人工合成的Fc区域可以提高抗体的半衰期和结合能力，从而增强了其治疗效果。此外，通过改变抗体分子的结构，可以实现对抗体的亲和性、特异性和生物活性进行精确调控，进一步提高其治疗效果和选择性。 抗体工程技术还可以用于制备具有特定功能的抗体。例如，单克隆抗体可以通过融合其他功能蛋白或药物分子，产生具有双重或多重功能的抗体。这种方法被广泛应用于抗肿瘤药物的研发，通过将细胞毒性物质连接到抗体分子上，实现对肿瘤细胞的靶向杀伤。
此外，抗体工程技术在免疫诊断和分子影像等领域也发挥着重要作用。通过使 用与特定抗原结合的抗体或改造的抗体，在体外或体内实现对疾病标记物的检测和定量。同时，可以通过标记放射性同位素或荧光物质等标记物，将抗体用于其它生物学研究和医学应用。 需要注意的是，抗体工程技术的应用仍然面临一些挑战和限制。首先，抗体的 规模化生产和纯化仍然是一个技术难题，造成了制备成本高昂。其次，免疫原性和药物稳定性问题也需要进一步解决。此外，对于一些疾病目标，目前还缺乏有效的抗体靶点。因此，未来的研究需要进一步发展和突破，以推动抗体工程技术的应用和发展。 总之，抗体工程技术在生物制药技术中具有重要的应用前景。通过改造抗体的 结构和功能，可以提高其治疗效果和选择性，创造出更加安全高效的抗体药物。未来，随着技术的不断进步，抗体工程技术将为生物制药领域带来更多的创新和突破，为人类的健康提供更多的选择和希望。
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了
五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编97-生物技术工程-细胞工程-动物细胞融合与单克隆抗体的制备（含解 析） 一、单选题 1．（2022·山东·高考真题）如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是（） A．双抗可同时与2种抗原结合 B．利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞 C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原 D．同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞 2．（2021·山东·统考高考真题）一个抗原往往有多个不同的抗原决定簇，一个抗原决定簇只能刺激机体产生一种抗体，由同一抗原刺激产生的不同抗体统称为多抗。将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72 注入小鼠体内，可利用该小鼠的免疫细胞制备抗p72 的单抗，也可以从该小鼠的血清中直接分离出多抗。下列说法正确的是（） A．注入小鼠体内的抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响大 B．单抗制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合 C．利用该小鼠只能制备出一种抗p72 的单抗 D．p72 部分结构改变后会出现原单抗失效而多抗仍有效的情况 3．（2021·江苏·高考真题）下列关于哺乳动物胚胎工程和细胞工程的叙述，错误的是（）A．细胞培养和早期胚胎培养的培养液中通常需要添加血清等物质 B．早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体 C．猴的核移植细胞通过胚胎工程已成功地培育出了克隆猴 D．将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞4．（2020·浙江·高考真题）下列关于病毒的叙述，错误的是（） A．有的病毒经灭活处理后，可用于细胞工程中介导动物细胞的融合 B．适当增加机体内参与免疫的细胞数量与活性，可提高对新型冠状病毒的抵御能力
生物制药技术中的抗体工程与单克隆抗体制 备 抗体工程和单克隆抗体制备在生物制药技术中扮演着重要的角色。抗体（antibody）是一种由免疫细胞产生的蛋白质，可以识别和结合特定的抗原物质。由于抗体在免疫反应中的关键作用，人们开始研究如何利用抗体在生物药物的制备和治疗中发挥作用。 抗体工程是一项利用基因工程技术改变抗体的结构和功能的研究。通过抗体工程，可以生成具有特定特性和增强效力的抗体。抗体工程的目标包括增强抗体的亲和力、稳定性和特异性，以及减少免疫原性和毒性反应。这些目标的实现通过调整抗体的结构和序列来实现。 单克隆抗体是指一类只对特定抗原物质产生单一免疫应答的抗体。单克隆抗体制备是一项技术，通过体外细胞培养和单克隆抗体蛋白质纯化，大规模制备单克隆抗体。这些抗体可以用于药物治疗、疾病诊断和生物学研究等领域。 抗体工程和单克隆抗体制备的关键步骤包括抗原刺激、混合免疫细胞、克隆和筛选。 首先，抗原刺激是引发免疫反应的关键步骤。研究人员将特定抗原物质注入动物体内，触发机体对该抗原的免疫反应。在免疫细胞的参与下，机体开始产生抗体以应对抗原。 其次，混合免疫细胞是为了将大量产生抗体的细胞筛选出来。研究人员将免疫细胞提取并混合在一起，形成融合细胞。这些融合细胞能够集成母细胞的抗体产生功能。
然后，克隆是将这些融合细胞进行分离和培养，使其每一个细胞单元都能够独 立地产生抗体。研究人员使用稀释法或分选法将单个融合细胞分离出来，并将其分布在培养皿中，以便继续繁殖。 最后，筛选是为了筛选出具有特定特性的单克隆抗体。研究人员使用特定的抗 原进行筛选，以确定哪些单克隆细胞能够产生与抗原结合的抗体。这些具备标记的抗体则被挑选出来进行纯化和进一步的功能评估。 抗体工程和单克隆抗体制备的发展为生物制药技术带来了重要的突破。通过抗 体工程，科学家们可以针对特定疾病制备定制的抗体药物。这些药物具有更高的亲和力和特异性，能够更有效地靶向疾病相关的分子。例如，单克隆抗体药物已在癌症治疗中取得了显著的成功，成为现代抗癌疗法的重要组成部分。 此外，抗体工程还开辟了多种新的应用领域。例如，利用抗体工程可以制备用 于疾病诊断的抗体试剂盒，帮助医生快速诊断和监测疾病。此外，抗体工程还在农业领域发挥着重要作用，通过生物技术改良作物的抗性，提高农作物的产量和质量。 总的来说，抗体工程和单克隆抗体制备技术在生物制药技术中具有重要的意义。通过这些技术，科学家们可以制备具有特定特性和高效力的抗体药物，为疾病治疗提供更有效的方法。未来，随着生物技术和基因工程的不断发展，抗体工程和单克隆抗体制备技术将继续为生物制药技术的发展和突破做出更大的贡献。
克隆技术在生物制药中的应用随着科技的不断进步和人们对生命科学的深入研究，生物制药这一新兴领域得到了快速发展。传统的生物制药生产方式对于某些高难度的药物来说存在一些局限，而克隆技术正是一种有着巨大潜力的替代技术。本文将介绍克隆技术在生物制药领域中的应用，以及它所带来的优势。 一、什么是克隆技术？ 克隆技术是一种基因工程的方法，它可以通过人工手段将多份相同的DNA片段复制成新的基因组。这样就可以制造出相同的生物体来，从而大量生产出某种特定的物质。作为生物制药的一种关键技术，克隆技术在目前的生物制药领域中扮演着越来越重要的角色。 二、克隆技术在生物制药领域中的应用 1、生产转基因动物
转基因动物是指在某些基因上发生了改变的动物。通过克隆技 术可以制造出这种动物，比如说可以制造转基因小鼠和猪，使它 们产生更高质量的蛋白质和抗体，从而用来生产更多的生物制药。 2、生产单克隆抗体 单克隆抗体是一种免疫学研究的成果，它是在单个克隆单元中 生产的抗体分子。克隆技术可以通过人工方式制造出单克隆抗体，从而为抗体药物的生产提供了强有力的支持。这种药物因为具有 治疗效果好、副作用小等优势而受到了广泛的重视。 3、生产重组蛋白 通过克隆技术可以设计并生产出一些高效的重组蛋白质，比如 说重组干扰素、重组生长激素和重组血液因子等。这些蛋白质中 有一些是药物的重要成分，它们可以用于治疗某些特定的疾病， 而且疗效好。 三、克隆技术带来的强大优势
利用克隆技术来制造生物制药，主要有两大优势： 1、生产效率高 与传统生产生物制药的方法相比，利用克隆技术来制造生物制药可以大幅提高生产效率。传统的方法需要等待生物体自行生产蛋白，而克隆技术可以让人工生产的生物体不断地产生蛋白质，从而加快生产速度。 2、生产成本低 随着生物制药的生产需求不断增长，传统的生产方式面临着越来越大的生产成本压力。而利用克隆技术来制造生物制药，则可以降低生产成本。制造出相同的生物体后，可以生成大量制药原材料，达到以少量的成本生产大量的产品的效果。 四、结语 克隆技术在生物制药领域中的应用虽然还处于早期阶段，但是它确实为这个行业带来了新的机遇和突破口。从生产效率和生产
简述单克隆抗体技术的基本原理 单克隆抗体技术是生物技术领域的一项重要技术，在医药研发、诊断和治疗等方面都 有着广泛的应用和前景。单克隆抗体技术的基本原理是通过选择一种特定的免疫细胞，获 取它产生的特异性抗体并使其进行不限制性复制，最终获得具有高度特异性和稳定性的单 克隆抗体。下面将详细介绍单克隆抗体技术的基本原理，包括鼠源性、嵌合型和人源性单 克隆抗体技术，以及单克隆抗体生产的流程和应用。 一、鼠源性单克隆抗体 鼠源性单克隆抗体是最早使用的单克隆抗体，其制备原理是将鼠类动物免疫一种抗原，收集其脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，然后将杂交瘤细胞单克隆化， 即从杂交瘤中分离出单个克隆细胞并培养扩大。鼠源性单克隆抗体的优点是制备简单、产 量高，但由于小鼠免疫系统与人类的巨大差异，鼠源性抗体往往容易引起免疫原性反应， 从而限制了其在临床应用中的使用。 二、嵌合型单克隆抗体 为了克服鼠源性单克隆抗体的局限性，研究人员提出了嵌合型单克隆抗体技术。嵌合 型单克隆抗体是由人源性的Fc区和鼠源性的可变区域组成，它可以确保高度特异性和稳定性的又可以降低免疫原性反应。嵌合型单克隆抗体的制备方法是将人源性的IgG1的Fc片 段与包含鼠源性单克隆抗体的可变区域进行基因重组，最终获得嵌合型单克隆抗体。嵌合 型单克隆抗体优点是高度特异性和稳定性、免疫原性反应小。嵌合型单克隆抗体的制备过 程较为复杂，且其效价可能比鼠源性单克隆抗体略低。 随着生物技术的不断发展，研究人员逐渐开始研制具有人源性的单克隆抗体，其能够 更加充分地体现在人体内生物学免疫动态，从而降低了潜在的体内免疫原性反应。人源性 单克隆抗体制备方法有两种，一种是在小鼠背景中将人源性单克隆抗体进行筛选和生产， 另一种是通过人免疫系统获得人源性单克隆抗体。人免疫系统产生抗体的原理与小鼠类似，但需要额外进行一系列的筛选和优化步骤，以保证细胞系的干净和稳定性。由于人源性单 克隆抗体与人体内的免疫系统具有良好的兼容性和相似性，因此在临床应用中具有极高的 价值。 四、单克隆抗体生产流程 单克隆抗体的生产流程步骤主要包括抗原的制备和纯化、免疫动物的制备、细胞融合、杂交瘤的克隆、分析和纯化等过程。 1. 抗原的制备和纯化：抗原是获得单克隆抗体的前提条件，其制备必须满足一定的 纯度和特异性。一般抗原的制备通过细胞培养、人工合成化合物或从动物收集，然后通过 一定的生化分离操作获得纯化的抗原。
抗体工程和单克隆抗体的生产 抗体是一种重要的生物大分子，由免疫细胞合成而成，具有很强的特异性和高度的亲和力。抗体通过与特定抗原结合，从而发挥体内保护作用。在医学上，抗体被广泛应用于疾病的诊断、预防和治疗。然而，自然界中抗体的种类和数量非常有限，为了满足不同的医学需求，需要通过人工方法生产抗体。抗体工程和单克隆抗体技术就是现代生物技术中应用最为广泛的生产抗体的方法之一。 抗体工程是通过对抗体分子进行基因重组或基因突变，达到改变抗体特性和增强其生物活性的技术。抗体工程的目的是按需生产具有特定抗原特异性的抗体。抗体工程技术主要有两种方法：载体介导的基因转染和基因编辑。前者是将重组的抗体基因导入宿主细胞中，利用宿主细胞的生物合成系统来生产抗体。后者则是通过定向编辑抗体基因序列，改变抗体分子的结构和特性。 单克隆抗体是具有唯一同一的抗体分子结构的抗体。单克隆抗体生产技术是在动物体内或体外制备抗体的过程中，经细胞杂交技术和体外培养反应等手段，从许多抗体分子中筛选出特异性最强的那一株抗体，然后进行纯化和制备。单克隆抗体具有较高的特异性和亲和性，可用于诊断、治疗和研究等领域。 抗体工程和单克隆抗体技术的发展，促进了抗体在医学研究和生产中的应用。通常，这些技术包括基因克隆、重组技术、细胞培养和抗体纯化等环节。其中，细胞培养技术是制备抗体的重要环节之一。 细胞培养是一种在体外培养细胞增殖和生产物质的技术。在抗体生产中，细胞培养技术可以用于大规模生产抗体。细胞培养生产抗体的流程一般包括以下几个环节： 1. 细胞系的选择和筛选：首先需要选择合适的细胞系，如脾细胞、淋巴细胞或骨髓瘤细胞等，进行抗体生产。然后通过细胞杂交技术、变异筛选、单克隆化等手段，从中筛选出产生特异性抗体的细胞系，建立稳定的细胞株。
从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及 改造策略的研究进展 摘要：近年来，单克隆抗体是生物制药领域研究和发展最快的领域之一，单克隆抗体具有地耐药性、高效性、专一性等多种优越特性而受到各界关注，随着单克隆抗体制备技术的不断出现，对其稳定性和亲和力提出了更高的要求，本项目从全人源单克隆技术出发，探讨其改造策略以及未来发展方向 关键字：鼠源，全人源，单克隆抗体 单克隆抗体是一种由人类通过采用各种化学技术或者人工方式制备，由单一b 受体细胞的单克隆抗体细胞产生的一种抗体。其高度均一，且仅针对某一特定受体抗原上的表位。单克隆免疫抗体的制备方法主要具有产物纯度高、交叉免疫反应少、制备时间和成本低、结构均一、特异性强等特点，其主要生物学机理功能主要特点是与抗原分子结合后不能产生间接免疫受体分子或直接阻断配体。当前已有40多种单抗体克隆免疫抗体被广泛用于自身自体免疫功能性疾病、肿瘤和器官移植等各个方面，效果显著。 1全人源单克隆抗体制备技术 自从1975年，KOHLER等人通过杂交瘤技术成功获得了具有抗原特异性的鼠源性单克隆抗体，从而开启了单克隆抗体开发的新纪元。随着多年发展，单克隆抗体已经成为人们疾病诊治的重要工具。而鼠源性抗体来源于小鼠，在对人体使用时，存在着诸多缺陷，为解决此类问题，全人源单克隆抗体被提出，是未来单克隆抗体的主要研究方向之一，目前使用较为广泛的全人源单克隆抗体制备技术有以下几种： 1.1噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术至1990年成功实施以来，经过30年的发展，已经成为该 领域应用最广的制备技术之一。噬菌体抗体库技术的应用原理是使用PCR技术 （聚合酶链式反应技术），将人体抗体编码的基因序列通过技术进行扩增，然后 将抗体的基因序列插入到噬菌体中的适当位置，并通过建立一个噬菌体抗体库， 让人体抗体和另一个噬菌体外壳上的蛋白进行相融，将两者互相融合的蛋白质形 式展示在噬菌体的表面。噬菌体抗体库技术将通过构建好的抗体库与抗原进行结合，并通过抗原与抗体的差异性相互结合的基因组原理，通过筛选，挑出一种能 与目的抗原进行结合的噬菌体，在通过噬菌体基因测序，得到一种新的基因序列,并将其通过基因组技术应用于全人源抗体中。 目前，噬菌体抗体库技术已经构建了多个不同类型的抗体库，并运用在多个 临床领域。噬菌体筛选抗体基因库筛选技术的主要特点在于可以筛选出的抗体生 命周期短、筛选抗体容量大、基因型和抗体代谢型的形式之间具有高度统一性， 通过对新型噬菌体筛选抗体基因库筛选技术的深入研究推广运用，能够分离得到 几乎所有的抗原特异性全人源抗体，但其缺点是亲和力较低，难以用于临床治疗，因此，近几年此技术的研究重点也是从增加抗体的亲和力为主，利用多种基因测 序技术增加抗体库的多样性，使其能够广泛运用。 1.2转基因小鼠技术 转基因小鼠技术于1989年被首次使用，研究者将人的基因座转入小鼠体内，通过人体基因与小鼠基因的重排并表达，证明可以利用转基因小鼠制备技术进行 人类抗体的研究。目前研究人员通过酵母人工染色体技术和基因敲除技术构建全 人源抗体转基因小鼠，并通过产业化运作，极大的推动了治疗性抗体的市场化。 转基因小鼠技术的基本原理是：将相应的基因工程技术运用到小鼠体内，破 坏其体内的抗体基因，并将人抗体基因转入小鼠体内，从而获得相应的抗体。该 技术通过小鼠进行，在一定程度上，保证了抗体转换的完整性和可选择的多样性 以及亲和力，从而使该技术由更好的稳定性。 目前转基因小鼠技术已经有3类，微基因座、人工染色体及转染色体，通过 这3类技术的运用，成功利用转基因小鼠技术生产出治疗多种疾病的全人源单克
单克隆抗体的原理、发展历程及制备流程综述 通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,加上单细胞克隆在临床和诊断上的巨大作用,单克隆抗体技术已经是现在生物领域研究的重要组成部分。此文就单抗隆技术的原理、发展和研究方向等进行了综述,并对其存在的不足作了概述。 1.单克隆抗体原理 抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。 2.单克隆抗体的发展
1975年，英国的科学家Kohler和Milstein合作将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现形成的杂交细胞既能在体外无限增殖，又能持续的分泌特异性的抗体，通过克隆化的培养可获得纯的细胞可以产生单克隆抗体。因此在1984年获得了诺贝尔医学和生理学奖。 在单克隆技术出现之后，许多研究者发现了这一技术的前景，纷纷投入到这一领域的研究。该技术也飞速的发展起来，到二十世纪八十年代中期，单克隆技术已日臻完善，开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。 特别是在2000年后，人类基因组草图绘制的完成，生命科学的发展将进入后基因组时代。可以肯定的是，在未来的一段时间，人们对各种单克隆抗体的的需求会有一个很大的增长，继而，单克隆技术会有一个很大的发展。 2.1.单克隆抗体的应用 2.1.1.作为亲合层析的配体 单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。 2.1.2作为生物治疗的导向武器 质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。 2.1. 3. 作为免疫抑制剂 抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。 2.1.4作为研究工作中的探针
生物技术制药概括和研究进展 简述生物技术、生物药物和生物技术药物的概念生物技术：利用各种生命系统，如各种生物有机体（包括微生物和动、植物）、其组成部分（包括器官、组织、细胞和细胞器）以及细胞内含物（包括核酸、蛋白质、多糖以及各种次生代谢物）来生产特定的生物产品。（The use of living systems, such as organisms, tissue cultures, live cells, or cell enzymes, to make a defined biological product）生物药物：利用生物体内的初级或次级代谢产物、生物组织或整个生物体生产的用于预防、诊断或治疗疾病的医用品（来源于细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物的活性物质）生物技术药物：利用DNA 重组技术、单克隆抗体技术以及其他生物技术研制开发的蛋白质、抗体或核酸类药物 生物技术药物的种类及常见的生物技术药物是什么? 生物技术药物可分为：重组蛋白药物、治疗性抗体、核酸药物和其他生物技术药物重组蛋白药物－细胞因子类：干扰素类，白细胞介素类，集落刺激因子类，肿瘤坏死因子类，红细胞生成素，生长因子类 －激素类：胰岛素，生长激素，降钙素，心钠素和利钠多肽家族－溶血栓类：链激酶，尿激酶，葡激酶，组织型纤溶酶原激活剂－可溶性受体（指细胞膜受体胞外与配体结合的膜外区，由于多种原因自胞膜脱落但仍保留和配基结合能力的受体）：肿瘤坏死因子可溶性受体，白细胞介素－1 可溶性受体，白细胞介素－ 4 可溶性受体 －血液代用品：人血清白蛋白，血红蛋白－导向毒素类：细胞因子导向毒素，单克隆抗 体导向毒素 生物技术药物与传统药物相比有哪些重要特点? 特点：分子量大，分子结构复杂；存在种属特异性；用量小，活性强，相对其他药物副作用小、毒性低、安全性较高；不稳定，易变性，易失活，也易被微生物污染和酶解破坏；生产过程中，基因、生产菌株或细胞系以及生产条件的稳定性要求高，如发生变化将造成生物活性的变化；免疫原性：来源于动物的药物可在人中产生免疫和过敏反应；在人体内半衰期短，降解快，降解部位广泛；生物技术药物的批次间一致性和安全性的变化大于化学药品生物技术制药与传统制药相比的优点：可使活性蛋白或多肽在各种生物反应器中高效表达，可获得天然来源难以得到的生理活性物质，使之成为新药，如人生长激素，胰岛素等；可获得足够数量的生物活性物质以对其结构、功能和性质进行深入研究，从而改造天然生理活性物质，提高生理活性，开发更多的新型生理活性物质；如对白介素 2 和tPA 的改造；通过对微生物的改造，可获得新型化合物，扩大药物来源，如红霉素衍生物的研究。 简述生物技术药物研发的热点热点： 八、、八、、• 应用基因工程抗体抑制肿瘤， 应用导向IL-2 受体的融合毒素治疗肿瘤， 应用基因治疗法治疗肿瘤，如应用丫-干扰素基因治疗骨髓瘤。 自身免疫性疾病 冠心病
单克隆抗体制备步骤及注意事项 一、脾细胞的准备： 1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。无菌操作取出脾脏，置于盛有 5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。 2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。 3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。再以同样的方法洗涤离心一 次。 4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液 备用。 注意事项： ➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。 二、骨髓瘤细胞的准备： 1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。 2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。 3.制备细胞悬液，计活细胞数。 4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。 注意事项：
➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。 ➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。 ➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%。细胞的最大密度不得超过106个/mL。 ➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时。➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。 ➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。 三、细胞融合： 1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。 2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。 3.用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散。 4.将离心管置于37℃水浴中，吸取1mL预热的50% PEG，缓慢滴入离心管内，30秒内加 完，边加边轻轻搅拌，作用1～5min。 5.沿管壁滴加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL，2mL，3mL， 4mL，5mL和10mL，同时边滴加边轻轻转动离心管。 6.800r/min条件下离心5～10min，弃上清。 7.将沉淀细胞轻轻混悬于含有20%的小牛血清的HAT选择培养液中，使细胞重悬。切记不 能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术 掌握： 1.杂交瘤技术的基本原理 2.抗体工程的基本技术 一、单克隆抗体技术（Monoclonal antibody，McAb） （一）概述： 克隆（clone）：由单个细胞繁殖、扩增而形成性状均一的细胞集落的过程称为克隆。 多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）：大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）：由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体 − −→ 单个克隆→ B − ）淋巴细胞 化学性质单一、特异性 强的抗体（单克隆抗体 细胞群 ①哺乳动物在感染病原体后，体内会形成多种相应的B淋巴细胞（浆细胞），因而产生多种特异性抗体。 ②每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。 多克隆抗体：劣势：均一性差、特异性低、排斥副反应强。 单克隆抗体：优势：活性专一、特异性强、纯度高、副反应弱。 （二）杂交瘤技术的基本原理 1.杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。 2.细胞的选择与融合： (1)亲本1：经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。 (2)亲本2：肿瘤细胞，通常选择多发性骨髓瘤细胞（Sp2/0）。其具备以下特点为： ①与B细胞为同一体系，可增加融合的成功率 ②稳定、易培养 ③自身不分泌Ig或CK ④融合率高 ⑤是HGPRT缺陷株 3.融合剂（fusogen） ①引起融合的病毒：副粘病毒 ②化学制剂：聚乙二醇（PEG） ③细胞电融合技术：电脉冲 （三）选择培养基的应用 1.细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可能出现以下情况： ①脾细胞与瘤细胞 ②瘤细胞与瘤细胞 ③脾细胞与脾细胞 ④未融合的瘤细胞 ⑤未融合的脾细胞 ⑥细胞多聚体形式 2.杂交瘤细胞的选择性培养基——HAT培养基 细胞的DNA合成一般有两条途径： (1)主要途径： 糖和氨基酸→核苷酸→DNA (2) 替代途径：
抗体工程制药（单克隆抗体） 抗体是由成熟B 细胞产生的。抗体的应用：①研究：免疫荧光发检测特定抗原②查验特定病原体③医疗： 带有毒素的抗杀伤特定细胞。 McAb 在免疫导向疗法中存在的问题： A 、McAb 均是鼠源性抗体，可产生人抗鼠抗体（HAMA ），加速了排斥反映，在人体内的半衰期只有5-6h ， 难以维持有效药物作用靶组织时刻； B 、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的医治浓度。 需要解决的问题：A 、降低McAb 的免疫源性；B 、降低McAb 的相对分子质量。 基因工程包括以下内容 ①基因克隆技术将全套抗体Ｈ链和Ｌ链Ｖ区基因克隆出来，进行原核表达，挑选特异性的基因 ②噬菌体抗体库技术；③含人免疫球蛋白的转基因小鼠 广州地域销售抗体占全国的30%，第二是北京和上海（罗氏占绝对优势，鼠抗人CD3单抗是我国唯一品种）。 多克隆抗体：抗原注入—受体动物—产生多种B 细胞—取得多种抗原（通过那个流程咱们能够得出多克隆 抗体的B 细胞是不用和骨髓瘤细胞杂交的也自然不用挑选） 制备单克隆抗体的大体原理 ： 制备：抗原—受体动物—致敏B 细胞+骨髓瘤细胞（PEG ）—杂交瘤（细胞培育（HAT 培育基）—阳性挑 选—①体内培育②体外培育）—单克隆抗体；（杂交瘤细胞是为能再生成单抗，细胞活力高；这确实是什么 缘故书上说单克隆抗体的技术原理是基于动物细胞融合技术得以实现的） （1）抗原与动物免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原；不需纯化；化学合成或提纯；微生物或细胞可直接作为抗原 免疫动物：BALB/c 小鼠和Lou 大鼠；Balb/c 小鼠，8-12周龄；雄性；动物与骨髓瘤同品系；佐剂:弗氏完 全佐剂与弗氏不完全佐剂 免疫方式（Attetion:是免疫不是培育）：①体内免疫:免疫原性强,抗原量多.皮下,腹腔注射免疫。②体外免疫: 不能用体内免疫的杂交瘤细胞株、不稳固 初步免疫和增强免疫→测定抗体效价→处死小鼠,去脾细胞 （2）细胞融合 —骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 (HGPRT)缺点型）应和免疫动物属于同一品系，如此杂交 率高 —饲养细胞：在组织培育中，单个或少数分散的细胞不易生长繁衍，假设加入其他活细胞那么可增进这些 细胞生长繁衍，所加入的细胞称饲养细胞。经常使用的有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。 —用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具有融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强 且长期稳固等特点 —PEG 浓度在10%-60%范围内的PEG 都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO ， 以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必需严格限制接触时刻。 （3）挑选与抗体查验 附：HAT: 次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) HGPRT ：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶激酶（TK ）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT ）。如细胞含有此两种酶那么可启动补 救（应急）途径。 次黄嘌呤,胸腺嘧啶在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶作用下合成DNA 的合成，并可克服氨基蝶呤的 阻断． —在HA T 培育液中，骨髓瘤细胞缺乏TK 或HGPRT 而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡， 整体水平抗体生成技术 细胞工程抗体生成技术 基因工程抗体生成技术 多克隆抗体(抗血清)(Polyclonal antibody 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定簇刺激多株B 细胞增殖分化所产生的, 单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)通过B 细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体 特点:单一特异;可重复;大量供应、不需纯抗原;灵敏度高 嵌合抗体、改形抗体、“小型 化抗体”（单链抗体）、组合抗 体库技术、噬菌体抗体库技 术、Ig 基因转基因小鼠、抗体 真核表达技术
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程 一、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。
说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。 PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。 2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合（Cell fusion）
【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。 （3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。 （4）主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM （Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。 不完全RPMI-1640培养基： 不完全DMEM培养基：