Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 一、试剂盒说明 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。 二、试剂盒组份 组份 (20 assays) (50 assays) (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC 100 μL 250μL 500 μL Propidium Iodide 100 μL 250μL 500 μL Binding Buffer 10.0 mL 25 mL 50 mL 注：1、Annexin V-FITC 组份建议按需分装小份冻存于-20 ℃，避免反复冻融； 2、Propidium Iodide 和Binding Buffer 组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide 需要避光。 3、Store at -20℃ for 12 months 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS 、不含EDTA 的胰酶消化液 四、使用注意事项 1. 微量试剂取用前请离心集液。 2. Annexin V-FITC ，Propidium Iodide （PI ）避光保存及使用。对于Annexin V-FITC 这个组份，建议您在收到产品之后，分装为小份避光保存于-20℃，即用即取。 3. Propidium Iodide （PI ）有毒，操作时要戴手套。 4. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，不推荐用于检测组织样本。 5. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而 用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止进一步的损伤。 6. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。 7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每 次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 五、 操作方法 1. 悬浮细胞离心（2000rpm 离心5min ）收集；贴壁细胞用不含EDTA 的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不 易过长，否则容易引起假阳性）； -20℃避光 4℃避光 4℃
万方数据
万方数据
万方数据
线粒体与细胞凋亡 作者：周艺群， 谷志远， ZHOU Yi-qun， GU Zhi-yuan 作者单位：浙江大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科,浙江,杭州,310006 刊名： 解剖科学进展 英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2006,12(1) 被引用次数：14次 参考文献(17条) 1.樊廷俊;夏兰;韩贻仁线粒体与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理学报 2001(01) 2.赵云罡;徐建兴线粒体,活性氧和细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(02) 3.蔡循;陈国强;陈竺线粒体跨膜电位与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(01) 4.Hortelano S;Dallaporte B;Zamzami N Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition[外文期刊] 1997(2-3) 5.Marchetti P;Hirsch T;Zamzami N Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis 1996(11) 6.Marchetti P;Castodo M;Susin SA Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis[外文期刊] 1996(03) 7.Susin SA;Zamzami N;Castedo M Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease [外文期刊] 1996(04) 8.Chou JJ;Li H;Salvesen GS Solution structure of BID,an intracellular amplifier of apoptotic signaling[外文期刊] 1999 9.Ji HB;Zhai QW;Liu XY Transcription regulation of bcl-2gene 2000(02) 10.Tsujimoto Y;Shimizu S Bcl-2 family:Life or death switch 2000(01) 11.Zamzami N;Susin SA;Marchetti P Mitochondrial control of nuclear apoptosis 1996(04) 12.Ruth MK;Ella BW;Douglas RG The release of cytochrome c from apoptosis[外文期刊] 1997(5303) 13.Narita M;Shimizu S;ItoT Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondrial 1998(25) 14.Cosulich SC;Savory PJ;Clarke PR Bcl-2 regulates amplification of caspase activation by cytochrome C[外文期刊] 1999(03) 15.Bossy-Wetzel E;Green DR Caspases induce cytochrome C release from mitochondria by activating cytosolic factors[外文期刊] 1999(25) 16.Sutton VR;Davis JE;Cancilla M Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid,but not direct granzyme B-mediated caspase activation[外文期刊] 2000(10) 17.Stoka V;Turk B;Schendel SL Lysosomal protease pathways to apoptosis.Cleavage of bid,not pro-caspases,is the most likely route[外文期刊] 2001(05) 本文读者也读过(10条) 1.杨胜细胞凋亡机制简述[期刊论文]-科技信息（学术版）2007(26) 2.冯俊奇.李秀兰.白人骁.FENG Jun-qi.LI Xiu-lan.BAI Ren-xiao细胞凋亡机制研究进展[期刊论文]-国际生物医学工程杂志2006,29(1)
线粒体的分离
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：
实验三线粒体的分离、超活染色与观察 一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。 二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法 （一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书 货号：T2190 规格：20次 保存：-20oC保存，荧光标记液需避光保存。 产品简介： 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。产品内容： 1.TdT酶100μl 2.荧光标记液900μl 3.TdT酶稀释液(选用)500μl
从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法 所需缓冲液： RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液） 10mM NaCl（Mr=58.44） 2.5mM MgCl2（Mr=20 3.3） 10mM Tris-Cl（PH8.0） 调PH值至7.4 配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。 2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液） 525mM甘露醇（Mr=182.17） 175mM 蔗糖（Mr=342.3） 12.5mM Tris-Cl（PH8.0） 2.5mM EDTA（PH8.0） 调PH值至7.4 配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。 1×MS缓冲液 210mM甘露醇 70mM 蔗糖 5mM Tris-Cl（PH8.0） 1mM EDTA（PH8.0） 调PH值至7.4 配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。 注意事项： 溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。 从细胞中分离线粒体： 1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。 2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。 3．细胞一破碎，立刻加入2ml 2.5×MS缓冲液至终浓度为1×MS。 4．750g离心10min以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。 5．将上清转移至另一离心管中，重沉淀细胞核一次。 6．将上清转移至另一离心管中，10000g离心20min沉淀线粒体。 7．弃上清，用1 ml 1×MS缓冲液重悬沉淀，750g离心10min，取上清，10000g离心20min，弃上清，用适当体积的1×MS缓冲液重悬沉淀。
凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用)（BIOTIN标记POD法,适用于细胞、组织样本） 使用说明书 一、TUNEL制品说明 凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA 的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。 本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。 本试剂盒特点 ●操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有Proteinase K 和DAB。 ●高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。 ●高特异性：能特异性染色凋亡细胞。 ●快速操作：整体操作约需3小时。 ●用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。 ●方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。 ●高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性
使用注意事项 1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。 2．因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。 3．为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。 4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。 5. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。 6. 固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟或至过夜，以改善细胞的渗透性。 7. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。 8. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。 9. DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。 二、TUNEL试剂盒组分 试剂盒以外自备仪器和试剂
线粒体与细胞凋亡 苑金香(潍坊学院生物系山东潍坊261043) 摘要 细胞凋亡是一种由基因控制的自主性死亡过程。近年来研究发现,线粒体在细胞凋亡过程中起重要作用,它可以通过改变膜通透性、释放凋亡活性物质等介导细胞凋亡。 关键词 线粒体 细胞凋亡 线粒体作为真核细胞能量代谢中心已为人熟知,然而近年来的研究发现,线粒体在细胞的另一重要生理活动 细胞凋亡中还扮演着重要角色。细胞凋亡即细胞程序性死亡(programmed cell death),是一种由基因编程调控的细胞主动自杀过程,细胞凋亡在胚胎发育、机体内环境的稳定、细菌和病毒感染细胞的清除过程中起重要作用,许多疾病的发生与细胞凋亡失控有关,而线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用。 1 线粒体膜的通透性改变与细胞凋亡 线粒体起着启动细胞凋亡的重要作用,其主要机制与线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transi tion pore,mtPTP)开放有关,mtPTP位于线粒体内膜和外膜的交界处,是一种由多种蛋白组成的复合体。mtPTP参与调节线粒体基质中的Ca2+、pH值电荷等,维持线粒体内环境的稳定性,保持氧化还原通路的畅通。mtPTP平时允许不大于0.15 104的小分子物质通过。当线粒体内Ca2+超载、自由基对线粒体膜造成氧化损伤,或者是能量产生下降时,均可引起mtPTP开放。在细胞凋亡发生早期,线粒体膜mtPTP打开,线粒体内膜电位( m)降低,一方面使得线粒体内的死亡促进因子(deathe-promoting factor,DPF)释放出来,促进凋亡的进行;另一方面,又使得细胞质进入线粒体基质,由此引起膜质子的转运异常,导致线粒体处于高渗状态,线粒体基质扩张,细胞骨架蛋白受压,直接导致细胞凋亡。 2 线粒体释放物与细胞凋亡 研究发现,线粒体内含有许多促死亡因子,包括细胞色素C,凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF),胱冬酶原及其他线粒体蛋白等。这些因子从线粒体中释放出来以后,以不同的方式参与到细胞凋亡的过程,影响细胞凋亡的进程。 2.1 细胞色素C的释放与细胞凋亡 1996年德克萨斯西南医学院研究中心王晓东研究小组发现细胞色素C参与细胞凋亡的过程。当细胞受凋亡信号刺激后,细胞色素C能迅速从线粒体释放到胞浆中,在细胞色素C含量丰富的细胞中,细胞将进入快速凋亡机制,释放出来的细胞色素C参与激活凋亡的酶通路,细胞内仍有许多未释放的细胞色素C,它们维持电子传递和有氧呼吸,从而产生足够的ATP,为细胞凋亡提供足够的能量。而在细胞色素C含量较少的细胞中,由于细胞色素C的大量释放,使电子传递链受阻,ATP产量骤减,无法提供足够的能量,因而使细胞走向与凋亡完全不同的坏死过程。 72h,凋亡细胞数从6.65%增加到16.42%;若处理96h 后,凋亡细胞数从4.71%增加到21.94%,这说明染料木黄酮可诱导前裂腺癌细胞的凋亡,通过这种办法可预防前列腺癌的发生。 另外,许多不同种类的化学物质(如亚硝胺类、杂环胺类、多环氮氢化物和糖醛核呋喃等)、外界微生物的侵袭、高温和放射线等化学的、物理的和生物的因素是影响癌细胞的生长和凋亡的外源性调节因素。还有一些常规使用的肿瘤化疗药物(如顺铂、维甲酸、羟基脲等)和 射线都可诱导多种肿瘤细胞凋亡。 4 结论 在正常机体内,细胞增殖和细胞凋亡处于一种动态平衡。故癌的发生和细胞的生与死密切相关。一方面,细胞的过度增殖导致了癌的发生,一些化学预防剂抑制癌发生的一个重要机制就是抑制细胞增殖;另一方面,细胞凋亡过程的失调也是癌发生的另一原因。研究细胞凋亡与癌发生的关系,进而诱导细胞凋亡对癌的预防具有重要的意义。 参考文献 1 Davis JN et al.Nutr Cancer,1998,32:123 131. 2 Li M et al.Cancer Epidemiol Biom Prev,2000,9(6):545 550. 3 方福德等.分子生物学前沿技术.北京医科大学、中国协 和医科大学联合出版社,1998,76 174. 4 贾旭东.细胞增殖和细胞凋亡和癌的发生和预防.国外 医学卫生学分册,2001,28(2):65 68. (B H) 17 2003年第38卷第5期 生 物 学 通 报
实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 产品简介： 碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(T dT-mediated d U TP N ick-E nd L abeling)法检测细胞凋亡的原理。 注：FITC是fluorescein isothiocyanate的缩写，实际上大多数情况下所谓的FITC即为fluorescein。 本试剂盒有如下优点。(1) 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。(2) 特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。(3) 快速：仅需约1-2个小时即可完成。(4) 方便：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。(5) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。 本试剂盒足够检测20个样品。 保存条件： -20℃保存，荧光标记液需避光保存。 注意事项： 需自备用于洗涤细胞的PBS或HBSS，用于封片的抗荧光淬灭封片液(P0126)，用于固定的4%多聚甲醛或向碧云天订购免疫染色固定液(P0098)，同时需自备含0.1％ Triton X-100的PBS或向碧云天订购免疫染色洗涤液(P0106)。 如果用于石蜡切片的检测，需自备蛋白酶K，二甲苯。蛋白酶K(ST533)可以向碧云天订购。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.对于贴壁细胞或细胞涂片： a.PBS或HBSS洗涤一次。 b.如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。 c.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。 d.用PBS或HBSS洗涤一次。 e.加入含0.1％ Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。 f.转步骤5。 2.对于悬浮细胞或细胞悬液： a.收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。 b.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或 水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。 c.用PBS或HBSS洗涤一次。
按照起始caspase的不同，可将哺乳细胞的凋亡分为三种基本的途径。 一种称为外在途径（extrinsic pathway），由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因 子受体家族（tumour necrosis factor receptor，TNF-R）引发; 另一种称为内在途径（intrinsic pathway）或线粒体途径（mitochondrial pathway），由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所起始（Nicholson, 1999；Denault和Salvesen，2003）; 第三种途径是内质网应激所导致的caspase-12的活化，从而导致凋亡。 细胞凋亡的途径 摘要细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。通过细胞凋亡，机体可消除损伤、衰老与突变的细胞来维持自身的稳态平衡和各种器官及系统的正常功能。由于细胞凋亡是一种复杂的生理及病理现象，所以在其发生的3个阶段中涉及不同的信号转导途径及其调控。 关键词细胞凋亡线粒体内质网caspase家族NO 疾病 细胞凋亡（apoptosis）是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是受基因调控的细胞主动性死亡过程，是细胞核受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应，然后凋亡的细胞将被吞噬细胞吞噬。经研究发现，不管是单细胞生物还是多细胞生物，细胞凋亡被称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]。是因为细胞死亡往往受到细胞内的某种遗传机制决定的“死亡程序”控制的。也会因为它的失调，机体也会失去稳定性，引发人类疾病如肿瘤、免疫系统等疾病[2]。由于它保证多细胞生物的健康生存过程中的重要性，引起了人们对其途径的广泛深入的研究，成为目前生命科学研究的热点之一。但其凋亡的途径不是很清楚，本文从多个方面概述了细胞凋亡途径。 1 细胞凋亡形态学上的特征 细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr教授根据形态学特征最先提出的[3],主要强调的是这种细胞凋亡是自然界中的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。
线虫细胞核和线粒体提取 N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。 1.细胞核分离 细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。 方法如下： 1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合 2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。 3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。 4.以10000rpm短暂离心5-10秒。 5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中 6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次 7.用棉布过滤匀浆 8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。 10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。 11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。 12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。 核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。 13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。 14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。 分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。 2.线粒体提取 查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下： 1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。 2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。 3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。 4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。 5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。 6.小心地清除上清液 7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法) 产品简介： Leagene细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一种采用经典的碘化丙啶染色(PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中与直接和的荧光染料，无碱基特异性。碘化丙啶与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。 碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。 细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型。细胞凋亡时，出现凋亡细胞皱缩、染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的前向光散射低于正常。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。细胞坏死时细胞多表现为细胞肿胀，因此前向光散射高于正常，对侧向光散射高于正常。 Leagene Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测，亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。 主要成分：
细胞的凋亡 凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis , IAPs)是细胞内一类独特的抗凋亡蛋白家族,包括XIAP，c-IAP1，c-IAP2，神经元凋亡抑制蛋白(NIAP) ,ML-IAP, Apollon和survivin。IAPs通过在体外或体内抑制不同的caspases而抗细胞凋亡。与其他的可抑制上游 caspases的蛋白不同, IAPs是唯一的内源性 caspase 抑制物【1】。 Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白家族中的成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，于1997年由耶鲁大学Alfieri【2】等用效应细胞蛋白酶受体1(effector-cell protease receptor 1, ERP-1)在人类基因库的杂交中分离出来，Survivin大量表达于胚胎及婴幼儿组织中，在正常的分化组织中几乎检测不到【3】，然而却在60余种肿瘤细胞株和大部分人体肿瘤组织过度表达。 1.Survivin的分子结构 IAP家族蛋白一般在N末端含有 2～3个串联的含有 Cys/ His的保守冠状病毒IAP重复序列结构域(Baculovirus IAP Repeat, BIR)，发挥着极为重要的凋亡抑制作用。IAPs家族发挥抗凋亡作用的机理是通过BIR功能区之间的连接序列直接与Caspases家族蛋白结合，抑制细胞凋亡的发生。多数IAPs的C末端还含有一个环指状结构域(RING-finger domain)能够与两个锌原子形成配位键。这一锌指结构对于IAPs家族蛋白抗凋亡的功能密切相关。只有包含BIR2功能区的IAPs蛋白分子才具有结合和抑制死亡蛋白酶的功能，单一BIR1， BIR3或环指结构以及它们的任意组合蛋白体均无此效应。 Ambrosini 等【4】测定并绘出了Survivin基因完整的基因图谱，全长14796 bp，位于距离端粒约3%的位置。Survivin 基因与EPR-1 基因的编码区序列高度互补，位于染色体17q25的同一基因族，含有3个内含子和4个外显子，编码产生1个由142个氨基酸组成的胞浆蛋白，分子量约为16. 5kD。Survivin只含有一个BIR区域，C末端有一个α卷曲螺旋结构，不含环指状结构域【5】。 Survivin是唯一具有剪接异构体的IAP基因，一个是序列中缺少外显子3的survivin-ΔEX3；另一个是把部分内含子2作为隐蔽的外显子的survivin-2B。两者序列的改变导致了相应蛋白质结构和功能发生了显著变化，survivin-ΔEX3仍保留抗凋亡特性，survivin-2B抗凋亡功能则显著下降[6]。2004年Badran A等[7]发现survivin的另一新剪接异构体survivin-3B，survivin-3B 含有5个外显子，比survivin多3B外显子， survivin-3B包含单一的BIR，这对于其抗调亡作用致关重要。最近，包含两个外显子，3'为197bp的内含子的survivin-2α发现【8】。其终止密码在第2内含子，编码产生74个氨基酸的蛋白质。survivin的剪接异构体的功能尚不清楚，初步认为survivin-ΔEX3与线粒体依赖性凋亡通路有关，另外，证实survivin-2α能减弱survivin的抗凋亡活性[7]。 Survivin的异构体如图1。
组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）： Components Final concentration Tris-HCl 50mM pH7.4 NaCl 150mM EDTA 2mM EGTA 2mM Triton X-100 0.2% NP-40 0.3% PMSF 100uM NaVO3 1mM NaF 250mM Leupeptin 10ug/ml Aprotinin 2ug/ml DTT 1mM 组织线粒体的分离 1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓 冲液中， 2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分， 3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎， 4) 4℃，电动匀浆机，600rpm 上下3 次， 5) 1000g 4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中， 6) 重复上面步骤一次， 7) 10,00Og 4℃离心10min,沉淀即为线粒体， 8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次， 9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours）， 10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。 分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法) 低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentration Hepes(KOH) 20mM pH7.2 Sucrose 210mM Mannitol 70mM EDTA 1mM EGTA 1mM
从动物组织中粗提线粒体 一、实验目的： 从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。 二、实验准备 Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具 三、实验步骤： 1．实验前一天小鼠禁食过夜。线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。 2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml预冷的IBc烧杯中； 3．预冷的IBc洗去多余的血液。洗4-5次至IBc澄清。 4．冰上将肝脏剪碎 5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器 6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间 7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃ 8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃ 9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃ 10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬 11．7000g，离心10min 4 ℃ 12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。用1ml移液管重悬避免出现气泡。 13．转移至14ml离心管，置于冰上。线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。 14．Bradford法测定线粒体浓度。 四、试剂配方 Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml 10 ml 0.1M Tris–MOPS 1 ml 0.1M EGTA/Tris 20 ml 1M sucrose 100 ml ddH2O，pH 7.4 储液： 1 M sucrose： 342.3 g sucrose 1L ddH2O Mix, 20 ml分装-20 C保存. 0.1MTris/MOPS： 12.1 g Tris； 500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4 C. 0.1 M EGTA/Tris： 38.1 g EGTA； 500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C. 五、注意事项 1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性； 2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬，线
细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒 简介： 细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒(Hoechst Staining Kit)是一种采用经典的Hoechst33258进行细胞凋亡检测的快速简便的试剂盒。当细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。Hoechst Staining Kit 经常用于培养的贴壁或悬浮细胞以及组织切片的细胞凋亡检测。该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁细胞 1、取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS 或生理盐水洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次。 2、加入干预条件使细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入Hoechst 固定液0.5ml 。 3、去除固定液，用PBS 或生理盐水洗，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。 4、加入Hoechst 33258染色液0.5ml 孵育。也宜用摇床，或手动晃动数次。 5、弃染色液，用PBS 或生理盐水洗，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。 6、滴一滴抗荧封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，尽量避免气泡。 7、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm 左右，发射波长460nm 左右。 (二)悬浮细胞 1、离心收集细胞样品于1.5ml 离心管内并弃液，加入Hoechst 固定液0.5ml ，缓缓悬起细胞固定。 2、低速离心去除固定液，用PBS 或生理盐水洗。洗涤时手动晃动数次。 3、低速离心离心后吸去大部分液体保留约50μl 液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上， 编号 名称 DA0032 100T Storage 试剂(A): Hoechst 固定液 50ml RT 试剂(B): Hoechst 染色液 50ml -20℃ 避光 试剂(C): 荧光封片剂 5ml 4℃ 避光 使用说明书 1份