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寡核苷酸图谱分析 寡核苷酸图谱分析是指核酸或核酸片段经T1核酸酶切割后电泳，少数较大分子量的酶切核酸片段在聚丙烯酰胺凝胶上分布特点的比较。因为它是通过少数核酸片段来了解整个核酸的特征，如同根据指纹特点判断案情一样，因此又称为指纹图分析(Analysis of fingerprint map)。该法最大优点为比较简便，敏感性高，能显示出核酸间细小的差别，但缺点是无法对差别大的两条来源不同的核酸进行比较。目前该种方法已在病毒学研究中得到了广泛的应用，特别是对RNA病毒分类、鉴定病毒遗传变异等，在流行病学调查中具有重要意义。 (一) 原理提纯后的病毒核酸，通过适当的酶切，可产生大小不同的片段，经放射性同位素标记(或在病毒培养时标记)后，进行垂直双相电泳，再经放射自显影，可得到特征性的图谱，即寡核苷酸指纹图谱。所用的酶一般是T1核糖核酸酶，这种酶是一种RNA限制酶，特异性地作用于鸟嘌呤核苷酸的3’磷酸基团，切割与其邻近核苷酸相连的5’磷酯键，最终产物为带3’磷酸鸟嘌呤末端的寡核苷酸，即每断片的3’末端为鸟嘌呤并带有磷酸，而5’末端就暴露出羟基团。然后在T4多核苷酸激酶的作用下，用32P－ATP标记寡核苷酸的5’末端，最后用饱和酚和酵母RNA混合液终止激酶的作用。在pH3.5条件下，从上到下进行第一相电泳，依片段所带电荷的不同将其分开，其后在pH8.2条件下，从右到左进行第二相电泳，可根据片段长短的不同将其分开，通过自显影，便可在底片上看到片段的位置和数目，借此对不同的病毒株的核酸进行分析比较。在电泳中一般采用两种指示剂：一种为溴酚蓝(BPB)，它的大小相当于8-10个核苷酸，在pH3.5时呈绿色，在pH8.2时呈蓝色；另一种为联苯胺(Xylene Cyanol，简称XC)，其大小相当于25个核苷酸，在pH3.5时为蓝色，pH8.2时为绿色，它周围的点为重点观察区。由于 12-14个碱基以上的核苷酸片段特异性高，太短的片段特异性低，因此，图谱上部的斑点由于片段较小难以进行分析，多取图谱下端或整个图的下1/3处斑点进行比较，一般取50-70个斑点。 (二) 基本方法 1.病毒的增殖与核酸的提纯用适当的组织培养细胞繁殖病毒，有些病毒也可用鸡胚进行繁殖，以饱和酚法提纯病毒核酸。 2.核糖核酸酶切和同位素标记常用的酶是T1核糖核酸酶(故该技术又称为T1－寡核苷酸指纹图谱)，将该酶与病毒 RNA以一定比例混合，置37℃消化30-40分钟。经消化后的核酸变为大小不等的片段，片段的大小与鸟苷酸的含量有关。消化步骤为：于Eppendorf管中加入1?l去离子水，加1?g病毒RNA，加1?l 2倍浓缩的消化缓冲液( 40m mol/L pH7.5 Tris-HCl，2m mol/L EDTA )，置沸水中煮60-90秒，快速置冰浴中冷却，加入2?l T1酶(5IU/?l)，混合后置37℃水浴30-40分钟。标记的方法有两种：一是内标记，即在病毒培养液中加入32P－正磷酸盐或32P－ATP，使增殖的病
Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点
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GACGTC CTGCAG Acc65I 识别位点 GTMKAC CAKMTG AccI 识别位点 GTMKAC CAKMTG AciI 识别位点 CCGC GGCG AclI 识别位点 AACGTT TTGCAA AcuI 识别位点 CTGAAG GACTTC AfeI 识别位点 AGCGCT TCGCGA CTTAAG GAATTC AflIII 识别位点 ACRYGT TGYRCA AgeI 识别位点 ACCGGT TGGCCA AhdI 识别位点 GACNNNNNGTC CTGNNNNNCAG AleI 识别位点 CACNNNNGTG GTGNNNNCAC AluI 识别位点 AGCT TCGA AlwI 识别位点 GGATC CCTAG
CAGNNNCTG GTCNNNGAC ApaI 识别位点 GGGCCC CCCGGG ApaLI 识别位点 GTGCAC CACGTG ApeKI 识别位点 GCWGC CGWCG ApoI 识别位点 RAATTY YTTAAR AscI 识别位点 GGCGCGCC CCGCGCGG AseI 识别位点 ATTAAT TAATTA GCGATCGC CGCTAGCG AvaI 识别位点 CYCGRG GRGCYC AvaII 识别位点 GGWCC CCWGG AvrII 识别位点 CCTAGG GGATCC BaeI 识别位点 NACNGTAYCN BamHI 识别位点 GGATCC CCTAGG BanI 识别位点 GGYRCC CCRYGG
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI， 为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
AatII 识别位点 Acc65I 识别位点 AccI 识别位点 AciI 识别位点 AclI 识别位点 AcuI 识别位点 AfeI 识别位点 AflII 识别位点 AflIII 识别位点 AgeI 识别位点 AhdI 识别位点 AleI 识别位点 AluI 识别位点 AlwI 识别位点 AlwNI 识别位点 ApaI 识别位点 ApaLI 识别位点 ApeKI 识别位点 ApoI 识别位点 AscI 识别位点 AseI 识别位点 AsiSI 识别位点
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BmtI 识别位点 BpmI 识别位点 Bpu10I 识别位点 BpuEI 识别位点 BsaAI 识别位点 BsaBI 识别位点 BsaHI 识别位点 BsaI 识别位点 BsaJI 识别位点 BsaWI 识别位点 BsaXI 识别位点 BseRI 识别位点 BseYI 识别位点 BsgI 识别位点 BsiEI 识别位点 BsiHKAI 识别位点 BsiWI 识别位点 BslI 识别位点 BsmAI 识别位点 BsmBI 识别位点 BsmFI 识别位点 BsmI 识别位点
一、实验目的 1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法； 2、掌握碱裂解法提取质粒的方法； 3、了解紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理、方法； 4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作。 二、实验原理 1.PCR： PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA 的过程。 ①延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链； ②变性：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链； ③退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 2. 质粒DNA的提取与定量——碱裂解法： A、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； B、高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；
C、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。 D、定量检测原理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应； 而且物质对光的吸收是具有选择性的； 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。 3.酶切鉴定：利用限制性内切酶。 4、琼脂糖凝胶电泳： A、琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度； B、DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动； C、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。 三、材料与方法： (一)、材料 1、样品： 菌液(大肠杆菌DH5a菌株)、引物、2*Premix Taq、灭菌离子水、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α 2、试剂： LB培养基、AXYGEN试剂盒(溶液S1、S2、S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液EB)、电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 500、无菌水、10*M酶切缓冲液Buf R、HindⅢ(15U/ul)、EcoR I (12U/ul) 3、仪器与器材： PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管、凝胶电泳系统、凝胶成像系统、
DNA指纹图谱分析实验 一. 实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二. 实验原理 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA?指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、?肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA?指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA 指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，?如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。
基因酷质粒图谱https://www.doczj.com/doc/f34991595.html,/bbs/forum-38-1.html，收藏了将近800种质粒的图谱及相关信息 特向大家推荐，介绍及使用方法见： https://www.doczj.com/doc/f34991595.html,/bbs/thread-417-1-1.html 质粒图谱信息 一.九种表达载体 Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA 二.克隆载体 pTZ19R DNA pUC57 DNA PMD18T PQE30 pUC18 pUC19 pTrcHisA pTrxFus pRSET-A pRSET-B pVAX1 PBR322 pbv220 pBluescript II KS (+) L4440 pCAMBIA-1301 pMAL-p2X pGD926 三.PET系列表达载体 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression System 33b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems plus Competent Cells Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET GST Fusion Systems 41 and 42 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Vector DNA Protein Purification ? Purification Systems ? Strep?Tactin Resins and Purification Kits 四.PGEX系列表达载体
实验五质粒DNA的微量提取及酶切鉴定 字体: 质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的环形双链DNA 分子。 一、质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解；质粒DNA的分离和纯化。 1、细菌的生长和质粒的扩增 从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或TB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉素可以抑制宿主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。 （问题：提取质粒时，对于不同拷贝的质粒，应如何进行细菌的培养？为什么？）2、细菌的收集、裂解和质粒DNA的分离 细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。 质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异： a.大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。 b.从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA 是共价闭合的环状分子。 利用溶菌酶和加热处理的方法，使细菌的线状染色体DNA变性，通过离心，可以使染色体DNA和变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒分子仍留于上清中。问题1：某些大肠杆菌的菌株不能用加热的方法裂解。 （1）易产生多糖的如大肠杆菌菌株，如HB101和TG1等。尤其是HB101的一些变种和衍生物，在用去污剂或加热裂解时可释放处相对大量的糖，从而影响质粒的纯化，抑制多种限制性内切酶的活性。 （2）表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+），如HB101。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA 会被降解。但通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可易避免此问题。 3、质粒DNA的纯化 纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基本性质。多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心一直是制备大量质粒DNA的方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀（聚乙二醇和LiCI 分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白和RNA，达到纯化的目的。
A系列 AatII识别位点 Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点
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实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定 【实验原理】 分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。 本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。 对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。 【实验步骤】 本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。 1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。 2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。 3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。 4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。 5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。12000rpm离心10min。 6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。 7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。 8. 重复上一步， 9. 空管离2min。将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。 10. 滴加50ul elution buffer（EB）至膜中央，室温放置2min后，12000rpm离心1min。离心管中即为纯化后的质粒。 11.构建重组质粒酶切体系，限制性内切酶反应一般在灭菌的15 ml PCR离心管中进行。 在冰浴上建立酶切反应体系（20 μl）
实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定 一、质粒DNA的提取 [原理]分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 [试剂] 1.溶液I： 50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。 2.溶液II： 200mmol/L NaOH 、1% SDS。 3.溶液III： pH4.8醋酸钾缓冲液（60 ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml 蒸馏水） 4.TE缓冲液pH8.0 5.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/ml RNaseA。 6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。 7.1×LB溶液 8.100μg/ml氨苄青霉素 [器材] 1.TGL-16型台式高速离心机
2.1.5ml塑料离心管 3.离心管架 4.微量移液器 5.常用玻璃器皿 [操作步骤] 1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。 2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。 3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。 4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。 5.用台式高速离心机，10 000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。 6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。 7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。 9.加入50μl含RNase A 20μg/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20℃备用。 二、质粒DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定 [原理]限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。 Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的
ApaI识别位点Acc65I识别位点 ApaLI识别位点AccI识别位点 ApeKI识别位点AciI识别位点 ApoI识别位点AclI识别位点 AscI识别位点AcuI识别位点 AseI识别位点AfeI识别位点 AsiSI识别位点AflII识别位点 AvaI识别位点AflIII识别位点 AvaII识别位点AgeI识别位点 AvrII识别位点AhdI识别位点 BaeI识别位点AleI识别位点 BamHI识别位点AluI识别位点 BanI识别位点AlwI识别位点 BanII识别位点AlwNI识别位点
BmrI识别位点BbvCI识别位点 BmtI识别位点BbvI识别位点 BpmI识别位点BccI识别位点 Bpu10I识别位点BceAI识别位点 BpuEI识别位点BcgI识别位点 BsaAI识别位点BciVI识别位点 BsaBI识别位点BclI识别位点 BsaHI识别位点BfaI识别位点 BsaI识别位点BfuAI识别位点 BsaJI识别位点BglI识别位点 BsaWI识别位点BglII识别位点 BsaXI识别位点BlpI识别位点 BseRI识别位点Bme1580I识别位点 BseYI识别位点BmgBI识别位点
BspMI识别位点BsiEI识别位点 BspQI识别位点BsiHKAI识别位点 BsrBI识别位点BsiWI识别位点 BsrDI识别位点BslI识别位点 BsrFI识别位点BsmAI识别位点 BsrGI识别位点BsmBI识别位点 BsrI识别位点BsmFI识别位点 BssHII识别位点BsmI识别位点 BssKI识别位点BsoBI识别位点 BssSI识别位点Bsp1286I识别位点 BstAPI识别位点BspCNI识别位点 BstBI识别位点BspDI识别位点 BstEII识别位点BspEI识别位点 BstNI识别位点BspHI识别位点
酶切基础知识 酶切 DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。 DNA酶切及凝胶电泳 一.DNA的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 二. 凝胶电泳 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine. ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3' BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GCATG^C 3' XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' T^CTAGA 3' XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^TCGAG 3' 当然，上面总结的这些肯定不全，要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法： 1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；NEB网站上提供的识别序列图表下载 2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；
限制性内切酶酶切注意事项 在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的 条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题： 1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活 性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。 2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。 3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。 4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。 5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。 6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。 7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应； ②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。 8.用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与 λDNA存在位点的数目比较后，决定用酶量。对于超螺旋DNA，基因组DNA、琼脂糖包埋的DNA，使用的酶单位活性应适当加大。 9. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。 10.酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10mM 的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。 11.D NA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。 12.要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量，酶反应才能有效地进行。 13.反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。 14.高于37℃或需长时间保温时，可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。 15.反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。 16.反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。 17.用已硅化的离心管进行酶切反应，可获得更佳的酶切效果，否则DNA可能粘附于管壁而影响酶切效果。 18.终止酶反应可根据需要采用不同的方法：①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA 的终止液终止反应；②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65℃保温20-30分钟，以灭活酶终止反应。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀获得较纯DNA进行下一步酶学操作。