细胞生物学实验指导
细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。
实验一普通显微镜及其使用（装片观察）
一、目的要求：
1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。
2、参观了解其他各类显微镜。
二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
三、方法和步骤：
1、介绍普通光学显微镜的构造
机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。
光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。
2、油镜的原理及使用方法
原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。
3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。
4、注意事项：
（1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。
（2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。
5、观察几种细菌标本片。
6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。
四、作业及思考题：
1、油镜的原理是什么？
2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？
实验二、细胞膜的渗透性
实验目的
了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
实验原理
将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。
实验用品
一、器材
50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。
二、材料
羊血。
三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。
实验方法
一、羊血细胞悬液
取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透
明的红色液体，此即稀释的羊血。
二、低渗溶液
取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释羊血，注意观察溶液颜色
的变化，有不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。
三、羊红细胞的渗透性
1、取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？
2、取试管一支，加入0.17mol/L氯化胺10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？
3、分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。步骤同2。
实验结果
并对实验结果进行比较和分析。
实验三、线粒体和液泡系的超活染色与观察
活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。
实验目的
1、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；
2、学习一些细胞器的超活染色技术。
实验原理
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。
实验用品
1、器材
显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
2、试剂
（1）Ringer溶液：
氯化钠0.85g (变温动物用0.65g)
氯化钾0.25g
氯化钾0.25g
氯化钙0.03g
蒸馏水100ml
（2）10%、1/3000中性红溶液：
称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热(30~40℃)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。
（3）1%、1/5000詹纳斯绿B溶液
称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热(30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。
实验材料
人口腔上皮细胞，小麦种子或黄豆幼根根尖。
实验方法
1、人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察
清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上
↓
滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液
↓
用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞
↓
刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中
↓
染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)
↓
盖上盖玻片,显微镜下观察
2、植物细胞液泡系的超活染色与观察
取豆芽的根尖
↓用刀片纵切根尖
放入中性红染液滴中，染色5~10min。
↓
吸去染液，滴一滴Ringer液
↓
盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察)
实验结果
在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
实验报告
（1）. 绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布
（2）. 绘蟾蜍胸骨剑突软骨细胞示液泡系的形态与分布
实验四、叶绿体的分离与荧光观察
实验目的
1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。
2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
实验用品
一、器材
1.主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
2.小型器材: 500ml烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
二、材料新鲜菠菜。
三、试剂0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。
实验方法
一、叶绿体的分离与观察
1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3~5min。
3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。
5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即不叶绿体(混有部分细胞核)。
6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮、
7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。
(1)在普通光镜下观察。
(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。
(3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。
二、菠菜叶手切片观察
用剔须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl 溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。
(1)在普通光镜下观察。
(2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。
(3) 观察间接荧光：向手切片上滴加1～2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后可在荧光显微镜下观察间接荧光。
实验结果
一、叶绿体的分离和观察
1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2. 以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。
3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
二、菠菜叶手切片观察
1. 在普通光镜下可以看到三种细胞(1)表皮细胞: 为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞: 为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞: 为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。
2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。
3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。
作业
1. 在普通光学显微镜下，用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。
2. 在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤镜系统，叶绿体的颜色是否有变化？
实验五、植物染色体标本制备与观察
实验目的
学习植物染色体标本的制备技术，了解Feulgen反应的基本原理,学习其操作方法和压片法,初步掌握细胞分裂各期的主要特点.
核酸是生物最重要的组成成分,核酸分为两大类,即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA).它们在细胞内的分布及化学性质均有所不同.DNA主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内.RNA分布在细胞质和核仁内.但在染色质及染色体中也含有少量
的RNA,核仁中也有少量的DNA.在线粒体,叶绿体等细胞器内除含有RNA外,也含有少量的DNA.
实验原理
Feulgen反应的原理是根据DNA经弱酸(1mol/L)水解后,打开料嘌呤和脱氧核糖连接的键,在脱氧核糖的一端形成有离的醛基.这些醛基就在原位与Schiff试剂结合,形成含醌基( )的化合物,醛基是一个发色团所以具有颜色,因此凡有DNA的部位,就呈现紫红色.
实验材料
大麦、黑麦或小麦种子
实验内容
植物染色体标本的制备及DNA的显示法-Feulgen反应
压片法
细胞有丝分裂相的观察
实验步骤
（一）植物染色体标本的制备
1、将植物种子放在潮湿的滤纸上，20°C发芽，待胚根长至1～2cm时，切取0.5cm 长的根尖部分。
2、预处理：将切下的根尖浸入0.1%秋水酰素液中，室温下处理3～4小时。
3、固定、水解及染色：
Camoy固定剂
固定10-30分钟?95%酒精10分钟?70%酒精10分钟?蒸馏水→(对照) 5%三氯醋酸? 90oC 15分钟
? 1mol/L HCl ←蒸馏水? 1mol/L HCl ? 60 oC 8分钟? Schiff试剂40 -60分钟?亚硫酸水(1,2,3) ?换3次,每次5分钟自来水?将染色后的根尖漂洗干净,悬着染色效果好的材料?蒸馏水?压片?镜检
(二) 压片法
压片的操作步骤如下,把根尖放在载片上,用刀片切取根尖(0.3cm),纵切根尖,加一滴水,用
解剖针将根尖纵向分成若干小条,保留1-2小条,加盖玻片,用铅笔端轻轻敲击盖玻片,使细胞分离,压平呈云雾状.
（三）蚕豆(或洋葱)根尖压片的观察
首先在低倍镜下,区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞,然后,在高倍镜下,观察细胞核的形态,注意在你的片子上,是否有有丝分裂细胞,如有,你能找到细胞分裂期的几个阶段,其特征如何(可参照附录)
做Feulgen反应时,应注意的几个问题
固定剂的选择:一般常选用Carnoy固定液.其他的固定剂如Flemming固定剂及Champy 固定剂等均可用,但不能使用Bouin固定剂.
水解时间:水解时间一定要合适,不宜过长或不足,否则会影响实验结果.如用Carnoy固定液固定的材料,水解时间一般在8-15分钟之间.水解时间的长短要随不同的材料及不同的固定剂而定.
Schiff试剂的质量:在做Feulgen反应时,重要的因素就是Schiff试剂的质量问题.实验时,要注意试剂颜色是否正常,有无SO2的气味.
洗涤剂的重要性:漂洗时,所用的亚硫酸水,最好在每次实验前临时配制,以便保持较浓的SO2.
实验对照组:一定要做对照片,以便说明实验结果的真实性.
操作过程中,用镊子镊取根尖的生长区部位,切勿夹取根冠部位.
鸦片过程中尽量使根尖分生组织细胞保持原来的分布状态.
习题
简述Feulgen反应的原理
欲得到一张好的Feulgen反应制片,制片过程中应注意些什么
绘制细胞分裂图。
实验六植物原生质体的制备
实验目的
1.学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体的形态。
2.学习植物原生质体的融合技术，观察不同方法融合细胞的形态及变化。
实验用品
显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml 离心管，载片，盖片。
实验原理
原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein在1880年提出来的。确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。
植物的花瓣细胞在经过纤维素酶，离折酶处理后，纤维素和果胶成分遭到破坏，造成原生质体脱离细胞壁进入培养液中。
植物花瓣细胞中的大液泡中存在有大量色素，且不同的细胞色素不同，因此可以在不对细胞染色的情况下，通过颜色范围辨认不同细胞的原生质体，以及同种间细胞融合和异种间细胞融合情况。
PEG是一种高分子化合物，由于含有醚键而具有负极性，与水，蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连，在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合，高Ca2+高pH清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
实验试剂
1.洗涤液：
甘露醇0.6 M
CaCl2?2H2O 8 mM
NaH2PO4?H2O 2 Mm
Ph 5.6
实验步骤
1.酶液的制备把纤维素酶（EAS－867）溶于0.5～0.7摩尔/升甘露醇内，加10毫摩/升氯化钙溶液作稳定剂。酶溶解后，经4000转/分离心机沉降原生质体，20分钟后，取上清液。经针筒型过滤器，再经0.45微米微孔滤膜过滤后，在无菌箱内把酶液分装在三角烧瓶内，贮存在冰箱里备用。
2.材料准备把生长在温室，苗龄60天以上的烟草植株，取上中部全展叶，在日光下照射2小时，使它萎蔫。也可以用温室生长的蚕豆叶作同样处理，或用大田收获的胡萝卜，放在0℃以上低温备用。萎蔫后的叶片浸在3%的漂白精片溶液中15～20分钟，再用无菌水冲洗干净，用无菌吸水纸吸干表面水分。
3.酶解用尖头镊子撕去叶片下表皮，剪成小块。胡萝卜则用刀片削去表皮和中柱，取用皮层部，切成小块。以上材料1克，放入盛有10毫升酶溶液的培养皿里，加盖。在28～30℃下保温1.5～3小时。
4.洗涤叶片或其他组织经酶解后会出现圆形的游离原生质体，原生质体悬浮液内有未消化的组织、碎片、细胞和破裂的原生质体。用滤纸或尼龙布滤去粗杂质，再把原生质体悬浮液移到离心管，用手摇离心机转动2分钟，吸去上清液（见图），再加入0.5毫升甘露醇洗涤2～3次，最后就得到较为纯净的原生质体，可以供进一步培养或作其他实验用。
实验七细胞融合方法
实验目的
1、初步掌握动物细胞PEG融合的方法。
2、学习细胞融合及其应用的有关知识。
实验原理
2个或2个以上的细胞合并为1个细胞的现象，称为细胞融合。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合方法。
用PEG处理细胞，能使质膜性质发生改变，导致细胞膜融汇，胞质流通，最后导致细胞融合。
实验器材、材料与试剂
1、仪器：
光学显微镜，离心机，恒温水浴锅，C02培养箱，超净台，倒置显微镜等。
2、材料
新鲜鸡红细胞，无菌注射器，6号针头，刻度离心管，试管，载玻片，盖玻片。
3、试剂
50%PEG，Hanks液，甲醇，Giemsa染液，碘酒，75%乙醇
实验方法
(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。
(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml 预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。
(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。
(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置1分钟左右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。
(5)缓慢滴加9ml Hanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴内静置5分钟。
(6)离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。
作业：
1、分析实验结果
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
1. 什么是细胞培养？ 细胞生物学实验 指从动物活体体内取出组织，并将其分散为单个细胞（机械或酶消化），在体外模拟体内的生理环境，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制以及细胞衰老过程等生命现象。 最常见的细胞一般有两种，一种是原代细胞，另一种是传代细胞。 原代细胞是指动物组织经过胰酶或胶原酶等酶类的消化，使其分散，从而获得单个细胞，再使这些单个细胞生长于培养容器中的过程。大多数组织可以制备原代细胞，但制备的方法略有不同，制备的细胞生长快慢及难易程度也不相同。 不同的原代细胞，其形态也不尽相同。一般将10代以内的细胞称之为原代细胞。 传代细胞一般指无限繁殖的细胞系，理论上这类细胞可以无限次的传代。做实验的时候也会经常使用这类细胞，如Hela、293、Vero 等细胞。 2. 细胞的生长周期 游离期：细胞刚接种到新的培养容器中到贴壁前的一段时期，这个时期的长短由细胞类型决定，从几分钟到几个小时不等。 贴壁期：细胞从游离状态变为贴附到培养器皿表面并展现出一定细胞形态的时期。 潜伏期：细胞在完成贴壁后，并不会马上进行增殖，会进行增殖所必须的物质和能量的储备，这个时候称之为潜伏期。
对数生长期：细胞在完成物质和能量储备后，开始大量的增殖的时期。这个时期的细胞活力旺盛，且状态稳定，我们所做的绝大多数实验都是在这个时期开展的。 停止期：随着细胞的生长，细胞密度越来越大，由于营养物质的消耗、细胞间的接触抑制等因素，细胞生长缓慢，甚至停止生长。这个时候，我们就要给细胞进行传代了，使细胞可以继续进行增殖，保持旺盛的活力。 3. 细胞生长所需要营养条件 细胞的培养所需要的营养成份一般来自于基础培养基（比如DMEM培养基）和血清。 基础培养基：主要是提供细胞生长所需要的氨基酸（组成蛋白质的基本单位）、维生素（细胞代谢中辅酶的组成成分）、无机离子（K+，Na+等）、碳水化合物（碳源和能量来源）和一些激素等营养物质。 血清：主要是提供一些基础培养基不能提供的生长因子和低分子的营养物质，此外它还有促进细胞的贴壁、中和有害重金属离子等作用。如果只提供基础培养基而不提供血清，绝大多数细胞是无法生长的。血清对于我们实验的重要性就不言而喻了，那么什么样的血清才算是合格的血清呢？ 合格的血清需要通过各种检测，包括无细菌，无真菌，无支原体检测，无病毒污染。血清一般呈现为淡黄色，透明状液体，由于含有大量的蛋白质等成分，会略有黏稠。以全式金公司的TransSerum EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)为例，它通过了牛腹泻病毒、牛副
生物学实验原理与技术教学大纲 10.1教学任务： 本课程由植物生物学、生理学、微生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、生物化学和分子生物学等方面相关的实验理论知识、实验技术和实验方法组成，是一门与实验课相衔接的实验理论讲授课程，各部分内容在实验课开课前统一进行集中讲授，学生课后预习，为学生进行的实验操作奠定了理论基础。 10.2教学要求： 本课程是各门基础实验课程的前导课，涉及各个实验项目的原理与基本技术方法。因此，要求学生在实验前认真听教师讲解相关基础知识，积极思考、认真记录。课后认真复习、认真回答思考题，并参加每次实验前的预习测试。 10.3教学目的： 使实验课程与理论课程合理衔接，加强学生对实验的相关理论知识的理解与掌握，促进学生充分预习和对即将进行实验的基本技术和基本方法全面的理解。为学生进行的实验操作奠定理论基础。 11．学生应掌握的实验技术及实验能力 本课程是一门与实验课相衔接的实验理论讲授课，涉及8门生物学基础实验课程的实验原理、技术和方法。具体内容包括显微镜技术、分离类胡萝卜素和叶绿素、提取叶绿体色素、观察叶绿素的荧光现象、观察光对叶绿素的破坏作用、测定种子发芽率、观察呼吸运动的调节、麻醉家兔、气管插管、制备蛙类坐骨神经腓肠肌标本、证实反射弧的完整性与反射活动的关系、验证心肌有效不应期较长的特征、观察蛙期前收缩与代偿间歇、钝性分离气管、无菌操作技术、微生物
简单染色方法、血球计数板的使用、灭菌锅的使用方法、微生物分离纯化技术常规微生物涂片观察技术微生物培养技术、菌种保藏技术、无菌操作技术、微生物简单染色方法、血球计数板的使用、灭菌锅的使用方法、微生物分离纯化技术、常规微生物涂片观察技术、微生物培养技术、菌种保藏技术、显微镜技术、观察胀泡的形成、鉴别纺锤体、鉴别姐妹染色单体、植物染色体制片技术、染色体臂形成、观察细胞内多糖的分布、观察细胞内DNA的分布、原代细胞培养、传代细胞培养、细胞的消化分散、观察细胞融合的现象、詹纳斯绿染色、PEG诱导鸡静脉血的化学融合、植物组织培养技术、制作石蜡切片及HE染色、核酸的乙醇沉淀、测定RNA含量、测定核酸含量、定磷法测定核酸的含量、地衣酚法测定RNA含量、预处理组织、匀浆组织、提取核酸、核酸核蛋白（RNP）苯酚分离、剥离凝胶板、自溶处理、超声破碎、制冰盐浴、目测酶活力、免疫小鼠、颈部皮下注射抗原、腹腔注射抗原、统计处理数据、梯度稀释血清、离心分离血清、摘眼球取血、测抗体效价、体外重组DNA、连接DNA片段、凝胶回收DNA、CaCl2法制备感受态、转化外源DNA、PCR扩增、DNA琼脂糖凝胶电泳、碱裂解法提取质粒、蓝白斑筛选、限制性内切酶使用等。 本课程还加入了安全环保及习惯教育内容。主要内容包括火灾预防与逃生常识，触电防护知识，烧烫伤处理方法，实验室有毒废弃物处理常识，实验动物尸体处理常识，实验习惯教育及实验室环保教育等。 12．开设实验项目 开设实验项目一览表
细胞生物学实验 实验一不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测[实验目的] 通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。 通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。 [实验原理] 应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节)，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。 该实验完成需时6学时。 [实验材料、试剂和仪器] 一、仪器 普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃温箱、镜台测微尺、目镜测微尺等。 二、材料 洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。 三、试剂 生理盐水，10μg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存） [实验步骤] 一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。 2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。 3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。 4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。 5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。 二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导目录 一．显微镜的使用 实验一、几种光学显微镜的使用 实验二、参观电子显微镜及生物超薄切片标本制备 二．细胞形态结构 实验三、细胞大小的形态观察——测微尺的使用 实验四、细胞活体染色技术 实验五、植物细胞骨架光学显微观察 实验六、胞间连丝观察 三．细胞化学 实验七、鉴定RNA的细胞化学方法——Branchet反应 实验八、DNA显色的观察——Feulgen反应 实验九、固绿染色法鉴定细胞内酸性蛋白与碱性蛋白 实验十、多糖及过氧化酶的显示 实验十一、核仁组成区的银染显示与观察 四．细胞生理 实验十二、细胞膜的通透性 实验十三、细胞电泳 五．细胞和组织培养技术 实验十四、植物原生质体的分离和融合 实验十五、植物细胞的培养与观察 实验十六、动物细胞融合 实验十七、动物细胞的培养与观察 六．细胞化学成分的分离 实验十八、细胞器的分离、纯化——细胞分级分离 实验十九、荧光的细胞化学测定 实验二十、细胞活力的鉴别 实验一几种光学显微镜的使用
一、实验目的 了解几种光学显微镜的结构、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通显微镜提高分辨力的方法。 二、实验原理 (一)基本原理 一般实验室经常使用的光学显微镜都是由物镜、目镜、聚光器和光阑组成，普通显微镜它们的放大原理及光路图如下： AB物体．A1B l第一次成像，A2B2第二次成像，O l目镜．O2物镜， F1为O l的前焦点，F2为O2的前焦点 各种光学显微镜的光学放大原理基本相同，各种特殊用途的光镜不过只是在光源、物镜、聚光器等方面作了改动，或在其它方面增设了某些特殊的设备。 (二)几种光学显微镜 l、普通光学显微镜： 普通光学显微镜也叫复式显微镜，是最常见，最简单的显微镜。它适于观察一般固定的，有色的透明度较高的标本。其最大分辨力一般为0.2微米，从构造上可分光学、机械和电子三大系统。 2、暗视野显微镜： 暗视野显微镜是以丁达尔现象(Tyndall phenomenon)(即光的微粒散射现象)为基础设计的,它使用了特殊的聚光器进行斜射照明,因光源中心束不直入物镜，所以视野黑暗，而被检细胞器因斜射照明发生衍射和反射，所以发亮可见。暗视野显微镜可用增加光照方法增加物体与背景的反差，因而可观察到0．2—0．004微米直径的微小粒子，但它分不清被检物的细微构造，它常用于观察物体的存在与运动。而暗视野显微镜与普通光学显微镜的区别，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有别。确切地说，称暗视野显微镜为暗视野照明更为贴切。它是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜。使视野背景暗黑，样品明亮的照明方法。 3、相差显微镜： 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
实验室规则和要求 一般规定 1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。 2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚 趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。 3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食 物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外 套及杂物等。 4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每 组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数 清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦 拭，并随时保持环境清洁。 5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的 注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实 验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下 自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。 6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。 实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验 室。 7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验 室前记得洗手。 8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变 措施。
药品 1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料， 查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免 污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、 -巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉 尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好 习惯。 5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂 糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。 6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 仪器 1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸， 勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开 盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电 源。
细胞生物学发展简史公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
细胞生物学发展简史 一细胞的发现和细胞学说的建立 1665年，英国学者Robert Hooke用自制的显微镜观察栎树软木塞的薄切片，发现了其中有许多蜂窝状的小室，并将这些小室命名为cell。实际上当时看到的是植物细胞的细胞壁。此后，生物学家用cell一词描述生物体的基本结构单位，中文翻译为细胞。Hooke对有关细胞的首次描述见于1665年他的《显微图谱》中，因此人们认为细胞的发现是在1665年。 真正观察活细胞的是荷兰科学家Antony von Leeuwenhoek，他用设计较好的显微镜观察池塘水中的原生动物、蛙肠道内的原生动物、人类和哺乳动物的精子，并于1674年在观察鱼的红细胞时描述了细胞核的结构。 由以上可见，细胞生物学的基础建立于17世纪，并且Hooke和Leeuwenhoek两位科学家为此做出了重要贡献。 在Hooke发现细胞后的近170年中，人们用光学显微镜相继发现了一些不同类型的细胞，但对细胞的认识基本上没什么新的进展。直到19世纪30年代，显微镜制造技术有了明显的改进，分辨率提高到1μm以内；同时还由于切片机的制造成功，从而对细胞的观察有了许多新的进展，细胞核、核仁、细胞的原生质等被揭示，人们才真正认识到细胞的生物学意义。 1838~1839年，德国植物学家Scheleiden（1838年）和动物学家Schwann （1839年）总结前人的工作，综合了植物和动物组织中细胞的结构，提出了“细胞学说（cell theory）”，指出“一切生物，从单细胞生物到高等动、植物都是由细胞组成的；细胞是生物体结构和功能的基本单位”。后来德国科学家
实验一普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1了解显微镜的基本构造和使用方法 2 掌握油镜的原理和使用方法 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 1．显微镜的基本构造 光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。 2．显微镜的放大倍数和分辨率 放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3．油镜的使用原理 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、器材 1．永久切片 2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四、操作步骤 1．观察前的准备 （1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光源 2．显微镜观察
（1）低倍镜观察 （2）高倍镜观察 （3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3．显微镜用毕后的处理 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。 五、思考题 1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？ 2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 实验二胞间连丝的观察 一、实验目的 观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识． 二、实验原理 植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。 三、实验材料 红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片 四、实验步骤
16考研厦大生科院初试第一，分享备考经验+复试环节 本人是华侨大学的，2016届考厦大生科院，是聚英厦大考研网的学员，今年以初试第一，复试第七名的成绩考进厦门大学生命科学院，广大研友的要求分享一下我的备考经验：包括初试经验分享（已更新），考研时间规划和所用书籍，包括初复试环节和复习注意事项，十分详尽，希望同学们做好笔记~ 环节一、初试 1.考研初试分数分配 初试科目： 英语：100 政治100 832生物化学：150 620细胞生物学150 厦大生科院近几年分数线： 2014年：322分2015年：310分2016年：310分 近几年生命科学院专业课压分比较严重，所以与厦大理科基本保持一致，而厦大理科线每年浮动小，如果没有重大改革，分数线不会有较大变化。总体来说，厦大生科院较之其他学院，虽然分数线比较低，但试卷题目难度大，而且招生特点是宁缺毋滥，近两年都收不满，都需要调剂，调剂的原则上要求考生是985/211的院校出身。 2.620细胞生物学的初试情况 2016年620试卷分数分配 选择题15题，30分；名词解释5题，30分；问答题2题，30分；英译汉3题，30分；实验题3题，30分。 其中选择题、名词解释、问答题最基础，但是以16年情况来看，出的偏题怪题比较多，这类题型主要来自中科院生物学的往年考研题，大家可以关注一下。而英译汉的题型要求熟记基本名词解释的英文，重点掌握关于癌症和癌细胞、生态系统。实验题基本上是厦大生命科学院常用的一些实验技术，重点掌握蛋白质与蛋白质之间的相互作用。另外2015年及之前每年都有考到RNA干扰，但2016年没考，该技术很可能会被基因编辑CRISPR所取代，16年复试有考，要重视这个动向。 关于初试的目标分数，建议至少要考到320分，因为如果初试分数太低，复试很容易被淘汰。由于厦大生科院专业课压分比较严重，主观题给的分数低，政治和英语的平均分最好都要过60,620分子生物细胞学和832生物化学平均要达到100分，这样总分加起来：60+60+100+100=320分，初试基本上没有问题。 在这里推荐一下聚英厦大的英语政治的暑期强化班和最后冲刺班，会邀请北京的大牛老师像陈正康、李海洋来讲课，一方面你可以把握一下考试重点在哪里，另一方面尤其是英语可以学到很多非常实用的应试技巧。专业课的话，推荐聚英官网的《620分子细胞生物学复习全书》和《620分子细胞生物学实验用书》，可以帮你梳理知识点，把握核心考点。 2017厦大生科院考研资料
实验一显微镜的结构及使用 [实验目的] （一）熟悉显微镜的结构及各部件性能。 （二）掌握显微镜的使用方法。 （三）了解显微镜的维护方法。 [实验原理] 虽然显微镜的目镜和物镜的结构很复杂，但它的作用相当于一个凸透镜，其成像原理和光路图如图1所示，被检物体AB放在物镜（O1）下方的1—2倍焦距之间，则在物镜（O1）后形成一个倒立的放大实像A1B1，这个实像正好位于目镜（O2）的下焦点之内，通过目镜后形成一个放大的虚像A2B2，这个虚像通过调焦装置使其落在眼睛的明视距离处，即25cm,使所看到的物体最清晰，也就是说虚像A2B2是在眼球晶状体的两倍焦距之外，通过眼球后在视网膜形成一个倒立的A2B2缩小像A3B3。 [实验器材]擦镜纸字母装片羊毛交叉擦片普通光学显微镜二甲苯香柏油 三内容与方法： 普通光学显微镜(Microscope)的外形和结构因类型不同略有差异，但基本结构和功能是相似的。（图2） （一）微镜的基本结构及功能：光学显微镜由机械部分、照明部分和光学部分构成。1.机械部分： （1）镜座：位于底部的金属座。一般为马蹄形，用以支持和稳定整个镜体。 （2）镜柱：镜座与镜臂相连的短柱。 （3）镜臂：镜柱上方弯曲部分，是取用显微镜时握拿的部位。 （4）镜筒：在镜臂的上方倾斜的金属园筒，上端装有目镜、下端转折处装有棱镜，使光线转折450。其上有一固定螺钉将镜筒连接于镜臂上方。 （5）调节器：在镜柱两侧有大小两个螺旋，大螺旋为粗调节器，转动时能使载物台快速升降。调节范围较大，适于低倍镜调焦用。小螺旋为细调节器，转动是载物台仅缓慢升降，调节范围较小，适于调节物象的清晰度。此外，在右侧粗调节器内侧有一窄环，称粗调松紧调节轮，用以调节粗调节器的松紧度。向外转时偏紧，向内转时偏松。左侧粗调节器内侧有一粗调限位调节环凸柄，向上推紧时，镜台上的最高点被固定（这两个环一般不需调节）。（6）旋转盘：又称物镜转换器，安装在镜筒下端，为一可旋转的圆盘，上有4个圆孔，
生物学一级学科（专业）攻读硕士学位研究生培养方案 （专业代码：） 一、培养目标 本学科培养的研究生，要热爱祖国，崇尚科学，诚实守信；应能较好地掌握辨证唯物主义的原理与方法，具有良好的科学素养和合作精神，学风严谨，谦虚、进取、敬业，有较强的事业心和社会责任感；具有健康的身体和心理素质。 本学科研究生应掌握扎实宽广的生物学基础理论和系统的各自相关的专业知识与实验科研技能，掌握一门外语（一般为英语）；具有从事科学研究工作或独立担负专门技术工作的能力。毕业后可从事生命学科及相关学科的科研、教学、环境保护及科技管理等方面的工作。 二、二级学科各专业及研究方向 1. 植物学 2. 动物学 3. 微生物学 4. 遗传学 5. 发育生物学 6. 细胞生物学 7. 生物化学与分子生物学 8. 海洋生物学 9. 生物物理学
三、学制与学习年限 全日制硕士研究生的学制为3年，在校学习期限为2-4年。3年制硕士研究生可申请提前毕业，最长提前时间不能超过一年。成绩优秀，提前完成论文、且在SCI刊物上发表与毕业论文有关的研究论文者，硕士论文经学位委员会指定的3人以上指导小组预答辩，推荐进行硕士论文答辩方可向学校申请。 四、培养方式 1．根据宽口径、厚基础的原则，本学科按生物学一级学科招收硕士研究生，按一级学科开设专业基础课程，在学生进入到实验室后，由导师或导师组对学生进行专业知识和专业技能的培训，完成相应的专业学习。 2．本学科鼓励开展硕士研究生的“三种经历”工作，即海外学习经历、第二校园经历和社会实践经历，在海外学习经历、第二校园经历中实行双导师合作培养。 五、应修总学分数 硕士生的课程学习一般为一年，应修总学分不少于30学分，其中必修课不少于22学分（含前沿讲座与社会实践），选修课不少于8学分；具体课程见课程设置一览表。 六、课程的类别及设置 硕士研究生课程分为必修课与选修课两大类，具体课程见课程设置一览表。 1、必修课22学分
细胞培养基本理论 一细胞培养概述 细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。 克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。 组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。 特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。 器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。 特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。 细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后， 生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异 呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态. 细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞 处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞 贴壁型细胞形态比较 成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源 上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期 多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等
细胞生物学实验 1 考核方式 平时实验记录，实验报告，实验操作，考试笔试 2 考核内容 仪器设备使用；所开设实验：实验原理、步骤作用、试剂作用、结果分析、注意事项、实验异常原因分析；其它：实验安全，试剂使用注意事项，试剂配制，试剂标签包括的内容，等等。 2.1仪器设备使用 本课程重点掌握：普通双目显微镜，离心机，微量取液器，组织匀浆机 一般通用仪器：电子天平，恒温水浴，恒温培养厢，低温冰箱，烧杯，量筒，容量瓶，离心管，血球计数板。 生物技术专业加：系统显微镜及其自动曝光系统 2.2 开设实验 细胞化学：细胞总体蛋白和碱性蛋白的定位 理解运用固绿染色原理（例：pH5.5固绿染色的是哪些蛋白质？） 蛋白质两性电解质性质 固绿染色特点 细胞内蛋白质酸碱性 10%福尔马林作用？ 5%三氯乙酸作用？ 染色异常的原因分析 实验成功需要注意事项？ 细胞化学：孚尔根（Feulgen）DNA染色法 理解运用实验原理。 固定液有什么作用？ 热盐酸处理的作用？ Schiff试剂的有效成分是什么？ 漂洗液的有效成分是什么，有什么作用？ 显示DNA时，根材料的哪部分最好？ 显微镜下怎样分辨细胞的间、前、中、后、末五个时期？ 一个良好的压片至少具备哪些特征？（列举3个） 实验成功的关键是什么？ 细胞生理：细胞膜的通透性 理解运用实验原理。 能够从实验数据推理，得出结论。（例：从下表中数据和描述，你能得出什么结论？）从EXCEL制图。 三线表制作。 图表格式的规范。（例：指出下表格式的欠规范之处）。 细胞分离技术：叶绿体的分离及荧光观察 掌握细胞分离的一般原理。取样原则？保护方法？细胞裂解方法及选择？ 差速离心。
细胞生物学实验 班级：生科142 姓名：旷江 学号：10143131 组号： 2 小组成员：旷江、韦立尧、莫霞指导老师：范立强、李鹏飞 华东理工大学 应用生物学系
摘要 本次细胞生物学实验通过细胞形态与结构的观察技术，细胞化学，细胞生理，细胞培养与分析，细胞周期分析，细胞成分分离与分析，细胞增殖与染色等技术对动植物细胞进行细胞形态结构的观察、细胞生理过程的研究、细胞培养与细胞分析、细胞冻存与复苏等，以此来研究动植物细胞的结构、功能和各种生命规律。 关键词：细胞增殖、细胞染色、冻存复苏、生理过程、形态结构
Abstract The cell biology experiment was carried out by cell morphology and structure observation technique, cytochemistry, cell physiology, cell culture and analysis, cell cycle analysis, cell fractionation and analysis, cell proliferation and staining. Observation of cell physiological processes, cell culture and cell analysis, cell cryopreservation and resuscitation, in order to study the structure of animals and plants, functions and a variety of laws of life. Key words: cell proliferation, cell staining, cryopreservation, physiological processes, morphological structur
细胞生物学学习体会 通过网络课程学习,有幸聆听到王金发教授对《细胞生物学》课程的讲授，使我不仅学到了细胞生物学专业新的知识与研究技术、方法,而且在教学方面也受益非浅。下面就我的学习谈一些体会。 一、全面学习了细胞生物学的专业知识 《细胞生物学》是一门包容量大、发展迅速的学科。内容涉及生物膜的结构与功能；内膜系统区室化形成及各种细胞器的结构与功能；细胞信号转导；细胞核、染色体以及基因表达；细胞骨架体系；细胞增殖及其调控；细胞分化、癌变及其调控；细胞的衰老与程序性死亡；细胞的起源与进化；细胞工程技术等多个方面。 (一)对细胞生物学的专业知识有了更深的认识。 1、细胞通讯方面 记得第一次听王老师的课就是讲授细胞的通讯，在多细胞生物中，细胞不是孤立存在的，而是生活在细胞社会中，它们必须协调一致，才能维持机体的正常生理机能，它们的协调是通过细胞通讯来完成的。细胞通讯是通过信号分子与受体的识别，从而在靶细胞内产生一系列反应的过程。信号分子有第一信使和第二信使之分，第二信使位于细胞内，由第一信使与受体识别后最先在胞内产生的，它主要与细胞内受体作用，所以受体也可分为表面受体和胞内受体。信号分子与受体的识别作用具有特异性。细胞信号传递所发生的反应有快速反应和慢速反应。快速反应是信号分子与受体作用后直接引起细胞内的一系列代谢反应；慢速反应则需要引起基因表达，再表现出各种代谢反应。细胞通讯过程是个复杂的过程，一个细胞的周围有上百种不同的信号分子，细胞要对这些信号分子进行分析，做出正确的反应。信号转换的研究在近年很热门，但进展缓慢，主要是因为信号转换的复杂性，不同信号的组合产生的效应是不一样的。 2、蛋白质的合成和分选机理 蛋白质的合成是在核糖体上，有两种合成体系，一种是在细胞质中游离的核糖体上，另一种是在膜旁核糖体上合成，它们合成的蛋白质将分布到不同的部
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization）
冻存细胞的复苏 1、于液氮罐中取出冻存管。 2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。 3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。 4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。 5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。 组织块法培养骨骼肌细胞 1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。 2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。 3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。 5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 贴壁细胞的传代和冻存 1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。 2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。 3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待 见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。 4、加培养液终止消化。 5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。 6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。 7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。 8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。 9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃ 2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。 细胞计数