《细胞生物学实验》
实验一细胞分裂相的观察（3 学时）
一、实验目的：
1、掌握减数分裂标本的制备方法。
2、掌握生殖细胞减数分裂发生过程及各个时期的染色体和细胞变化特点.
3、了解植物生殖细胞的形成过程。
二、实验原理
减数分裂是生殖细胞发生的一种特殊细胞分裂方式，特点是染色体复制一次，细胞分裂两次，形成4个子细胞，每个子细胞染色体数目减半。经过受精作用后，染色体数目恢复，这样在物种延续过程中保证了遗传的相对稳定性和基因的多样性。
三、实验仪器、材料和试剂
（一）仪器、用具：眼科镊子、解剖针、刀片、吸水纸、显微镜、载玻片、盖玻片
（二）材料：普通小麦(Triticum aestivum,2n=2x=42)幼穗、大葱（Allium fistolosum, 2n=2x=16，花序外包绿色总苞者，长2-3cm）、黑麦（Secale cereale, 2n=2x=14，穗长约6-9cm，旗叶与倒耳叶距离3-5cm）；大麦(Hordeum sativum, 2n=2x=14)；玉米(Zea mays, 2n=2x=20)
（三）试剂：苯酚品红、醋酸洋红、结晶紫
A液：碱性品红 3g 溶于100ml 70%乙醇中（4℃冰箱中长期保存）
B液：取A液10ml，加入90ml 5%苯酚水溶液（两周内使用）
取B液45ml，加6ml冰醋酸和6ml 37%甲醛
四、实验方法与步骤：
1、取材：当小麦处于孕穗或期时，选取约3-5cm的幼穗，取材时间在上午6—9时为好。
2、固定：新鲜幼穗可直接观察，也可剥去外部叶鞘，剪下幼穗，投入Carnoy固定液中固定4-24小时后，倒掉固定液用95%、85%酒精换洗2次，每次1h，然后转入70%酒精中保存备用。
3、涂片与染色：取出一段幼穗，置于盛有蒸馏水的培养皿中，剥下一个小穗，取其中一朵小花，夹取其中一个花药置于清洁的载玻片上，用刀片切去花药的两端，加一滴苯酚品红染液，边染色边用镊子、解剖针用力涂抹挤压花药，挤出花粉母细胞，去掉花药等杂物，盖上盖玻片，用吸水纸吸取四周多余染液，即可观察。如果染色过深，可加上一滴70%酒精分色，然后用吸水纸吸去多余染液再观察。
4、减数分裂时相的观察：先在低倍镜找着细胞，然后用高倍镜观察分裂相，绘图。
5、对于好的压片，可永久制片保留：
（1）揭片：将玻片置于-20℃冰箱冷冻30min结冰，或放入液氮处理45～60s，用镊子或解剖刀直接揭开盖片，将有材料面朝上，37℃干燥，将晾干的载片及对应的盖片。
（2）脱水与透明：用由低浓度到高浓度（70％-80％-90％-100％）的梯度酒精冲洗1～2min，或在染缸中脱水2～5min，晾干。
注意：整个脱水透明过程中，必须保持载玻片和盖玻片原来相对的方向和位置，同时注意操作轻巧，以免造成玻片上材料漂失。
（3）封片：在中性树胶中加入1/5～1/4的二甲苯进行稀释，滴一小滴稀释胶在脱水透明后的载玻片中央，将盖玻片盖回原来位置封片。
注意：覆盖盖玻片时，按定位位置水平盖下，使之随着树胶的扩展自然下沉，切不可施加压力或移动盖玻片。如发现封片中树胶有气泡，应让其自然逸出或用针尖烧热后烫一下，使气泡逸出。如树胶滴得过多而逸出盖玻片四周，待树胶凝固后，用脱脂棉蘸二甲苯轻轻擦净逸出的树胶。
封片后平放晾干，镜检，物象清晰符合要求的保存，并贴上标签，注明标本名称、作者姓名和制片日
期。
五、实验结果：
六、作业：
1、绘出你观察的细胞减数分裂相图。
注意：构图和布局、勾画轮廓、点点映衬、标注（右侧，引线平直，下方写图题，加括号表面放大倍数）
2、简述减数分裂各时期的特征
七、附：
减数
分裂过程的分期及特征
1．前期I
细线期：染色体呈细长的染色线，螺旋卷曲分散在细胞核内，沿着整条染色线分布着许多染色粒，形似念珠。在细胞核内，核仁清晰可见。
偶线期：同源染色体彼此接近，发生联会。在细线期末，偶线期初，染色体或染色丝在细胞千的部位发生变化。在植物细胞中，染色丝凝集成块，偏于细胞核的一边，称为凝线期，在这—时期，还出现染色质(丝)穿壁转移运动。在动物细胞中，染色丝的一端聚集到核的一侧，而另一端呈放射状扩散，呈花束状，特称花束期。凝线期或花束期一直延续到偶线期结束粗线期开始为止。
粗线期：同源染色体完成配对，成为二价染色体(或成对的同源染色体)，染色体由于螺旋卷由的结果而缩得很短，每一粗线期的染色体具有两条并列的染色单体，成对的同源染色体含有四条染色单体，称为四分体，核仁附着于特定的染色体上。
双线期：同源染色体之间彼此开始分离，但是在一个或多个点上互相交叉而又保持在一起，形似麻花。在该期，同源染色体的两个染色单体之间发生交换。
终变期：染色体缩得更短，交叉移向染色体的户间或末端，呈现V型、8型、O型或X型。染色体常移到核的周围靠近核膜的地方，是统计染色体的最好时期。该期结束时，伴随着核膜的破裂和核仁的消失。
2．中期I
核膜和核仁已消失，染色体排列在赤道面上，两极出现纺锤体并与染色体的看丝点相连。此时所有四分体都排列在纺锤体的中部。
3．后期I
每个四分体中的两各同源染色体，由于着丝粒的作用而彼此分离．逐渐向两极移动，形成两组染色体。
4. 末期I
当两组染色体移动到两极后又聚集起来，核膜重新出现。在第一次核分裂之后，有些物种紧接着就进行胞质分裂，如百合、洋葱等，但有些物种则不接着进行胞质分裂，而是在第二次核分裂后才进行胞质分裂，如蚕豆、聚合草等。
5．间期
当减数第一次分裂后，两个子细胞(或核)经过一个很短的问期(即中间期)，便进入减数第二次分裂。随着物种的不同，间期的长短不一，有些物种的细胞完全没有间期。
6．前期II一末期II
分裂情况与有丝分裂相同。
在减数第二次分裂后，紧接着进行胞质分裂。至此，一个母细胞分裂成染色体数目减半的四个子细胞。在植物中，减数分裂后，每个小孢子(花粉)母细胞成为四分孢子，每个小孢子脱离母细胞壁成为游离的小孢子，以后继续发育成为成熟花粉(二核或三核花粉)。在动物中，减数分裂结束时．一个精母细胞成为四个精子，每个精子细胞经过一系列的分化，转变成为精子。在雌性方面，—个大孢子母细胞(植物)或卵母细胞(动物)经减数分裂产生”卵及三个极体。
实验二DNA的细胞化学检测方法—Feulgen反应（4学时）
一、实验目的
了解Feulgen反应的原理，掌握Feulgen染色的方法。
二、实验原理
DNA经弱酸（1M HCl）水解，其上的嘌呤碱基和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂反应，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。对照组不经过酸水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专—性。
(
吸水纸。
(二) 材料：洋葱鳞茎或普通小麦根尖。
(三) 试剂
（1) 1 M盐酸的配制：取82.5ml密度1.19g／m1的浓盐酸加蒸馏水至1000m1。
（2) Schiff试剂的配制及保存：称取0.5g碱性品红加入到100m1煮沸的蒸馏水中(用三角烧瓶)，时时振荡，继续煮5min(勿使之沸腾)，使之充分溶解。然后冷却至50℃时用滤纸过滤到磨口棕色试剂瓶中，滤液中加入10ml l M HCl，冷却至25℃时，加入0．5g K2S2O5(偏重亚硫酸钾)．充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h(有时需2—3d)，使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，剧烈振荡lmin，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀．贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钾，使之再转变为无色时，仍可再用。
（3）10％偏重亚硫酸钾
（4）亚硫酸水：取200ml自来水，加10 ml 10％偏重亚硫酸钾水溶液和10m1 lM HCl ，三者于使用前混匀。
（5）5％三氯醋酸
四、实验方法与步骤
(1) 将小麦根尖或鳞茎内表皮放在l M HCl中，加热到60℃水解8－10min。
(2) 蒸馏水水洗。
(3) Schiff试剂遮光染色30mm。
(4) 用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。
(5) 水洗5min。
(6) 将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱内表皮不用压片）
(7) 显微镜检查，细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。
对照片
方法一：CK1:先将材料放在5％三氯乙酸中90℃水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤(2)-(7)制片观察。
方法二：CK2:材料不经l M HCl 水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤(2)-(7)制片观察。
方法三：CK3:材料经l M HCl 水解30 min，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤(2)-(7)制片观察。
五、实验结果：
六、作业：
(1) 绘图示细胞DNA的分布部位。
(2) 说明设立对照的必要性。
实验三细胞膜的渗透性（3学时）
一、实验目的：
1、了解细胞膜的选择渗透性（即半透膜）的特性。
2、了解不同性质溶液对细胞膜透性的影响。
二、实验原理
将红细胞放入等渗溶液或高渗溶液中，由于红细胞细胞膜对各种溶质的透性不同，有的可以溶质渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能提高红细胞内渗透压，促使水分子进入红细胞，引起溶血，由于溶质透入的机制和速度不同，因此溶血时间也不同。溶血现象可作为测量物质进入红血细胞速度的一种指标。
溶血现象发生的快慢与加入细胞的溶质脂溶性大小、极性与非极性、分子量大小有关，具有以下规律：
1、脂溶性物质、非极性物质比水溶性物质、极性物质穿膜快。
2、分子量大、分配系数大的非极性、脂溶性物质穿膜比分子量小、分配系数小的快。
3、疏水的小分子O2、CO2、N2、苯和小的不带电荷的极性分子如尿素、甘油、H2O可自由穿膜。
4、其他大的不带电荷的极性分子和带电无机离子，如葡萄糖、蔗糖、氨基酸、核苷酸、Na+、K+、Cl-等则要通过简单扩散、协助扩散（载体蛋白、通道蛋白）、主动运输等多种方式完成穿膜，穿膜的机制不同，溶血速度差异较大，情况复杂。
非极性化合物易溶于脂溶剂，但在水中溶解度很小。分子量越大，碳链越长，脂溶性越大。一种化合物在脂溶剂中的溶解度与其在水中溶解度之比，称为分配系数。
电解质溶液（如NaCl）与非电解质（如葡萄糖）分子数相等时，电解质产生的渗透压要大的多。具有相同渗透压的某非电解溶液与某电解质溶液浓度之比，称为等渗系数。用i来表示： i＝（葡萄糖的等渗物质的量浓度／NaCl的等渗物质的量浓度）。发生溶血者为低渗液，所以把发生溶血的前一管溶液的浓度近似视为红细胞等渗。
三、实验仪器、材料和试剂：
(一)仪器、用具：小烧杯、试管、试管架、
(二)材料：含适量肝素（20mg×140U/1mlH2O=2800U/ml,用量15U/1ml血液，0.5ml肝素水溶液/50ml 血）的兔血。
(三)试剂：1 M乙二醇水溶液（MW:62，密度：1.11，11.7ml/200ml）、1M 丙三醇水溶液(MW:92，密度：
1.26，14.6ml/200ml)、1 M葡萄糖水溶液(MW:180，36g/200ml)，3 M甲醇(MW:32，密度：0.79，24.3ml/200ml)、3 M乙醇(MW:46.1，密度：0.79，35ml/200ml)、3 M正丙醇(MW:60.1，密度：0.8，45.1ml/200ml)、1/8 M 、1/9 M、1/10 M、1/12 M、1/14 M葡萄糖溶液、1/12 M、1/13 M、1/14 M、1/16 M、1/18 M NaCl溶液。1M NaCl溶液(MW:58.4，5.84g/100ml)
四、实验方法与步骤
1、相对分子质量大小对膜通透性的影响
(1) 在编号的3支试管中，分别用吸管吸入2 ml 1M乙二醇水溶液、1M 丙三醇水溶液、1M葡萄糖高渗液。
(2) 先后分别用注射器滴加两滴血液，用手指按住管口，倒置一次。
(3) 观察溶血时间，最长延至30min。
(4) 将实验结果列入如下所示的表格中。
2、脂溶性大小对细胞膜透性的影响
(1) 编号的3支试管分别加入2m1 3m01／L的甲酵、乙醇、丙醇溶液。
(2) 分别先后加入两滴血液，按住管口倒置一次。
(3) 观察溶血时间。
(4) 将实验结果记入如下所水的表格中。
3、电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响
(1) 将试管编号，注明溶质名称及物质的量浓度。
(2) 按编号分别加入不同浓度的葡萄糖及氯化钠溶液2mL。
(3) 分别先后加入两滴血液，按住管口倒置一次。
(4) 室温放置15min，观察发生溶血的浓度，确定等渗浓度。
(5) 按下表记录实验结果。
(6) 计算等渗摩尔系数。
五、实验结果
表一相对分子质量大小对膜通透性的影响
溶液相对分子量溶血时间
1M乙二醇62
1M 丙三醇92
1M葡萄糖180
表二脂溶性大小对细胞膜透性的影响
表三电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响
i=
六、作业：
1、填写实验数据表
2、分析实验结果原因
七、附：
(一)血浆渗透压
1、渗透压的概念
渗透压（osmotic pressure）是溶液本身的一种特性，是溶液具有的吸引水分子透过半透膜的能力。溶液的渗透压与单位体积溶液中溶质颗粒的数量成正比，而与溶质的种类及颗粒的大小无关。
2、血浆渗透压
血浆的渗透压在37℃约7.63个大气压（相当于770kPa约5789.8mmHg）。血浆渗透压由两部分组成：①晶体渗透压（crystal osmotic pressure），由血浆中小分子物质形成，80%来自Na+和Cl－。由于晶体物质分子量小，溶质颗粒数较多，晶体渗透压约占血浆总渗透压的99.6%。②胶体渗透压（colloid osmotic pressure），由血浆蛋白分子颗粒形成。由于血浆蛋白中白蛋白的数量大于球蛋白，而白蛋白的分子量较小，因此白蛋白的分子数量远多于球蛋白，故血浆胶体渗透压主要由白蛋白形成。胶体渗透压仅占血浆总渗透压的0.4%，约3.3kPa(25mmHg)。
3、血浆渗透压相对稳定的生理意义
（1）血浆晶体渗透压由于血浆与组织液中晶体物质的浓度几乎相等，所以它们的晶体渗透压也基本相等。水分子易通过细胞膜，而各种溶质不易通过。若血浆晶体渗透压与血细胞内液的渗透压不相等，水就会顺渗透压梯度进出于细胞膜，影响细胞的形态和容积，进而影响其功能。因此血浆晶体渗透压对维持细胞内外的水平衡极为重要。
（2）血浆胶体渗透压毛细血管壁通透性很高，允许除蛋白质以外的其它小分子物质自由进出。因此如果血浆或组织液中晶体渗透压发生改变时，两者会很快得到平衡。由于血浆蛋白一般不能通过毛细血管壁，血浆蛋白质的浓度大于组织液中蛋白质的浓度，所以血浆胶体渗透压虽小，但对于维持血管内外的水平衡极为重要。血浆胶体渗透压是一种吸引组织液中水回到血管，保持血管内水分的力量。各种原因导致血浆胶体渗透压下降，均可导致水在组织中潴留，而形成水肿。
4、等渗溶液与等张溶液渗透压与血浆渗透压相等的溶液称为等渗溶液，高于或低于血浆渗透压的称为高渗或低渗溶液。临床上常用于静脉补液的0.85%NaCl溶液(称为生理盐水)和5%的葡萄糖溶液都是等渗溶液。例如NaCl和葡萄糖都不易通过细胞膜，红细胞可在这些等渗溶液中维持正常的形态和容积，因而0.85%的NaCl溶液(0.15M)和5%的葡萄糖(0.28M)又称为等张溶液。等张溶液是指能使红细胞保持正常体积和形状的等渗溶液（也即溶液中的溶质颗粒不易通过红细胞膜）。1.9%尿素溶液虽然也是等渗溶液，但由于尿素易通过细胞膜，红细胞置于其中会立即出现红细胞肿胀、破裂、溶血，所以不是等张溶液。等渗溶液不一定是等张溶液,但等张溶液一定是等渗溶液。
（二）抗凝剂
抗凝剂种类很多，性质各异，必须根据检验止的适当选择，才能获得预期的结果。现将实验常用抗凝剂及其使用方法简述如下：
1、乙二胺四乙酸（EDTA）盐：EDTA有二钠、二钾和三钾盐。均可与钙离子结全成螯合物，从而阻止血液凝固。
EDTA盐经1000C烘干，抗凝作用不变，通常配成15g/L水溶液，每瓶0.4ml，干燥后可抗凝5ml血液。EDTA盐对红、白细胞形态影响很小，根据国际血液学标准公委员会（International committee standard of hematology ,ICSH）1993年文件建议，血细胞计数用EDTA二钾作抗凝剂，用量为EDTA-K2.2H2O 1.5-2.2 mg （4.45±0.85μmol）/ml血液。EDTA-NA与EDTA-K2对血细胞计数影响均较小，但二钠溶解度明显低于二钾，有时影响抗凝效果，其他抗凝剂不适合于血细胞计数。
2、枸椽酸钠(trisodium citrate）:枸椽酸盐可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固。
别名柠檬酸钠，Na3C6H5O7·2H2O，通常，配成109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用，使其活性减低缓，故常用于凝血象的检查，也用于红细胞沉降率的测定。因毒性小，是输积压保养中的成分之一。
由于枸椽酸钠溶液是按体积肥比例加入血液内达到抗凝目的的，而抗凝剂主要是作用于积压浆成分，通常所谓的1：9比例抗凝的概念是提1份体积的抗凝剂作用9份红细胞比积正常血液内的血浆成分而言。所以台果对贫血或红细胞增多症患者的血液仍按1：9的比例加入抗凝剂时，就会发生抗凝剂足或相对过多，这将明显地影响凝象检查结果。为了避免这种现象，有文献报道应根据抗凝剂用量（ml）=0.00185×血量×（100—病人红细胞比积%）这一公式，来计算抗凝剂的用量。
3、草酸钠（sodium oxalate）草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固。
草酸钠通常用0.1mol/L浓度，与血液按1：9比例使用，过去主要用于凝务象检查。实践发现草酸盐对凝备V因子保护功能差，影响凝血酶原时间测定效果；另外由于草酸盐与钙结合形成的是沉淀物，影响自动凝血仪的使用，因此，多数学者认为凝积压象检查选用枸椽酸钠为抗凝剂更为适宜。
4、肝素（heparin）肝素广泛在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。它是一种含硫酸基团的粘多糖，是分散物质，平均分子量为15000（2000-40000）。肝素可加强抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）灭活丝氨酸蛋白酶，从而具有阻止凝血酶形成，对抗凝血酶和阻止血小板聚集等多种作用。每毫升血液抗凝需要肝素15±2.5Iu 。尽管肝素可以保持红细胞的自然形态，但由于其常可引起白细胞聚集关使用涂片在罗氏（）染色时产生蓝色背景，因此肝素抗凝血不适全血液学一般检查。肝素是红细胞透渗脆性试验理想的抗凝剂。
实验四 RNA的细胞化学检测方法—Brachet反应（4学时）
一、实验目的
了解Brachet反应的原理，掌握有关的操作方法。
二、实验原理
甲基绿—派洛宁(methyl green－pyronin)为混合碱性染料，可能是混合染液中的两种染料有竞争作用，同时，两种核酸分子虽然都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与染色质中聚合程度高的DNA 选择结合呈现绿色或蓝色；而派洛宁则与核仁、细胞质中聚合程度较低的RNA选择结合呈现红色，但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色。
三、实验仪器、材料和试剂
(一)仪器、用具：显微镜、镊子
(二)材料：洋葱鳞茎内表皮
(三)试剂
（1) 1M乙酸缓冲液(pH＝4.8)配方：
A液：冰醋酸6ml加蒸馏水至100ml B液：乙酸钠13.5g加蒸馏水至100ml
取A液40ml十B液60ml混匀即为pH＝4.8
（2)Unna试剂：甲基绿—派洛宁染色液
甲液：5％派洛宁水溶液 6m1 2％甲基绿水溶液 6m1 蒸馏水 16ml
乙液：1M乙酸缓冲液(pH＝4.8) 16m1
甲、乙两液分别置4℃冰箱备用，用时甲乙两液混匀
配制注意事项：①派洛宁可加热助溶。②甲基绿批号不同，染色效果差别很大。商品甲基绿常混有甲基紫，影响染色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫为止，最后干燥备用。
四、实验方法与步骤
(1) 用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮—小块，置于载玻片上。
(2) 滴一滴Unna试剂，染色30min。
(3) 蒸馏水洗两次，吸水纸吸去多余的水分。
(4) 盖上盖玻片，镜检。
对照片：撕取洋葱鳞茎内表皮，经5％三氯乙酸90℃水浴处理15min，再经70％乙醇洗片刻然后按步骤(2)-(4)制片观察。
五、实验结果：
六、作业：绘图示细胞中RNA和DNA的分布
实验五液泡系和线粒体的超活染色（3学时）
一、实验目的：
掌握动、植物细胞活体染色的原理和相关的技术。
二、实验原理：
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色，但又无毒害的一种染色方法。目的在于显示生活细胞内的某些天然结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质印染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些持殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色。它是由活的功、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
液泡是细胞内浓缩产物的主要场所，有十分重要的功能。中性红（neutral red）是液泡的特殊染色剂，在细胞处于生活状态时，只将液泡染成红色，细胞质和细胞核不被中性红染色。
线粒体时细胞内的一个重要的细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。詹纳斯绿B（Janus green B）对线粒体有专一性染色，是毒性最小的碱性染料。詹纳斯绿B染色是由于线粒体中的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态，呈蓝绿色，而周围的细胞质被还原成无色的色基。
三、实验仪器、材料和试剂
（一）仪器、用具：显微镜、解剖刀、剪刀、镊子、吸管、载玻片、盖玻片、吸水纸、无菌牙签。
（二）材料：人口腔上皮细胞、小麦根尖。
（三）试剂
（1）Ringer试剂
氯化钠0.85g (变温动物用0.65g)
氯化钾0.25g
氯化钙0.03g
蒸馏水100ml
（2）1%、1/3000中性红溶液：
称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热(30~40℃)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。
临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。
（3）1%、1/5000詹纳斯绿B溶液
称取0.5g詹纳斯绿B溶于50ml Ringer溶液中，稍加微热(30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。
四、实验方法与步骤
（一）液泡系的活体染色与观察
1、切取发芽的小麦根尖1-2CM长切纵切面或用刀片压扁。
2、放在载玻片上滴2滴1/ 3000中性红染液，染色5－10分钟。
3、用吸管吸取多余染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，用手指压盖玻片使根尖压扁。
4、镜检。
（二）线粒体的活体染久
1、取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳森绿B染液。
2、用清水漱口数次，用消毒的牙签在原位刮取口腔粘膜表皮，第一次舍去，第二次、第三次放入滴液中染色10－15分钟，不可使染液干燥。
3、盖上盖玻片，吸去多余染液。
4、镜检。
五、实验结果
六、作业：
分别绘图示口腔上皮细胞线粒体或小麦根尖液泡系的形态和分布
实验六叶绿体的分离与荧光观察（4学时）
一、实验目的
1、通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的原理。
二、实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min 的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后,在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0-5℃的条件下进行，如果在室温下,要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发出荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光。有些材料本身不发荧光，当它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发出桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片，盖片和无荧光油。
三、实验仪器、材料和试剂
(一)器材
1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
2、小型器材：烧杯、量筒、滴管、刻度离心管、试管架、纱布若干、无荧光载片和盖片。
(二)材料新鲜菠菜。
(三)试剂0.35mol/L氯化钠溶液、0.01% 吖啶橙。
四、实验方法与步骤
(一)叶绿体的分离与观察
1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称15g于75ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2、利用组织捣碎机匀桨。
3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4、取滤液30ml在1000r/min下离心5min，弃去沉淀。
5、将上清液在3000r/min下离心8min，弃去上清液,沉淀即不叶绿体(混有部分细胞核)。
6、将沉淀1ml用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。
7、取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上,加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。
(1)在普通光镜下观察。
(2)叶绿体的直接荧光观察：以Olympus BX61荧光显微镜为例，用5号滤片(WIB)组合的条件下观察。
(3)叶绿体的间接荧光观察：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上,再滴加一滴0.01% 吖啶橙荧光染料, 加盖片后，以Olympus BX61荧光显微镜为例,在用5号滤片（WIB）组合的条件下观察。
(二)菠菜叶手切片观察
用剔须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上,滴加1～2滴0.35mol/L NaCl溶液,加盖片后轻压,置显微镜下观察。
(1)在普通光镜下观察。
(2)叶绿体的直接荧光观察：以Olympus BX61荧光显微镜为例，用5号滤片(WIB)组合的条件下观察。
(3)叶绿体的间接荧光观察：向手切片上滴加1～2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液，加盖片后，以Olympus BX61荧光显微镜为例,在用5号滤片（WIB）组合的条件下观察。
五、实验结果
(一)叶绿体的分离和观察
1、普通光镜下,可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2、直接荧光观察：叶绿体发出火红色荧光。
3、间接荧光观察：叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
(二)菠菜叶手切片观察
1、在普通光镜下可以看到三种细胞(1)表皮细胞:为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞；(2)保卫细胞:为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞:为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。
2、直接荧光观察:叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。
3、间接荧光观察:叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光，保卫细胞内也可见桔红色荧光。
六、作业
1、写出各种情况下观察叶绿体结果。
2、叶绿体分离时应注意什么问题？
实验七性染色质的检查（3学时）
一、实验目的：
1、掌握检查人类X染色体的制片方法。
2、了解巴氏小体在细胞中的位置及形态。
二、实验原理
在X、Y型性别决定的生物个体中，雌性个体细胞中两条X染色体中的一条要处于异固缩状态，称为Barr小体，以达到雌、雄个体X染色体数量和基因产物的相等。目前X染色质的检查，在医学遗传的研究中，临床和法医诊断上仍具有一定的意义。
三、实验仪器、材料和试剂
（一）仪器、用具：玻片、牙签、吸水纸、显微镜
（二）材料：人类口腔粘膜上皮或毛囊细胞
（三）试剂：1%醋酸地衣红、5M盐酸
四、实验方法与步骤
（一）口腔粘膜细胞Barr氏小体的观察
1、女性口腔粘膜细胞涂片：用清水漱口数次，用消毒的牙签在原位刮取口腔粘膜表皮，第一次舍去，第二次、第三次涂在清洁的载玻片上，放在空气中干燥。
2、固定染色：待涂片干后，滴2滴苯酚品红染液，加盖玻片在室温下静置10-15分钟，倾斜载玻片，倒掉染液。用吸水纸轻轻擦拭干载玻片上的染液。放于显微镜下观察。
3、结果观察：先用低倍镜找到具有核仁（不着色，空泡状）的间期粘膜细胞，后转高倍镜检查典型的巴氏小体为直径1μ的深色小体，常位于核膜附近，形状各样，微凸形、三角形、卵形、短棒形和双球
形，但通常为半球形，被染成深红色。细胞核其它部分染成红色，细胞质不着色。选择细胞轮廓清楚、染色清晰，核大，核质呈均匀细网状的细胞100个，统计巴氏小体的频率，约15%左右，平均16.4%，不超过30～35%，仅含1个X染色质。男性只有0～3%，平均0.7%，小体结构不规范、典型。
（二）发根毛囊细胞Barr氏小体的
取带有发根的头发，长2—3cm，围绕发根部的1圈长2—3mm的白色物体，即是毛囊细胞团，将其放置于载片上。在毛囊细胞处滴加一滴5M HCl，约15-20min以后，可使毛囊细胞得到充分软化。以清水冲洗2-3遍，将酸解液冲洗干净。拿起上述发根的梢部，将其上毛囊细胞轻轻蹭于另一干净载片上即可达到转移的目的。若用刀片或镊子将毛囊细胞刮下，可造成细胞的堆积，同样会出现多层细胞的现象。另外，l根发根的毛囊细胞可以转移到3—4张载片上，以达到充分利用实验材料的目的。观察时又可以看到清晰的单层涂布细胞，便于观察统计。此时，可滴加1滴染液于待测细胞上，注意染液不可过多，以免细胞流失。约10min后，加盖玻片即可进行观察。
五、实验结果
六、作业：统计你所镜检的10－20个口腔粘膜细胞中巴氏小体百分率，绘简图示巴氏小体的位置和形态。
七、附：在XY型性决定的生物个体中，雌性个体的细胞中有两条X染色体，而雄性个体的细胞中仅有一条X染色体。由于两种个体在X染色体的数量上是不相等的，因而雌、雄个体X染色体上的基因产物也可能是不相等的。针对这一现象，Muller于1932年提出剂量补偿效应，说明可以使具有两份基因的个体和具有一份基因的个体表现出相同表型的一种遗传机制的观点。1949年，M．L．Barr等人发现，在猫的雌性个体内，神经细胞核膜内缘有一染色很深的小体(后来定名为x小体或Barr氏小体)，而雄性个体细胞中则没有。以后在人类女性口腔上皮细胞中，也发现了类似的结构。经研究认为这是失活的异固缩状态的x染色质，并发现它属于延迟复制的染色体。X小体的数目在正常女性中是X染色体数目减去一。经观察，X小体一般1-1.5微米，呈三角形或卵圆形。20世纪60年代以来，不少学者曾提出了一些假说来解释这一现象。其中比较著名的假说是由M．F．Lyon于1961年提出的Lyon假说（Lyon hypothesis）：1.正常雌性哺乳动物的体细胞中，两条X染色体中只有一条在遗传上有活性，另一条在遗传上无活性。2.X染色体的失活是随机的。3.失活发生在胚胎发育早期，X染色体一经失活，其后代细胞中该染色体均处于失活状态。4.杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体。一些学者以另一些事实来反对Lyon的假说。因为X染色体的失活是个比较复杂的生物学问题，目前对这一现象仍然存在着一些难以解释的疑点。例如，是否所有组织的全部细胞中，在任何时间都存在这种X小体，失活的X小体是如何进行复制的等等。
实验八植物染色体标本的制备与观察（10学时）
一、实验目的
1、掌握常规压片法制备植物染色体标本。
2、了解中期染色体的形态和结构以及染色体的生物学意义。
二、实验原理
染色体是细胞分裂时期遗传物质存在的特定形式，是染色质紧密包装的结果，对染色体的观察在研究生物进化、发育、遗传和异变中有十分重要的作用。
植物染色体标本的制备，常用分生组织如根尖、茎尖和嫩叶做材料。常规压片法仍是当今观察植物染色体常见的方法，其程序包括取材、预处理、固定、解离、染色和压片等步骤，简单易操作，但是染色体易变形、难分散开。
三、实验仪器、材料和试剂
（一）仪器、用具：培养箱、显微镜、剪刀、镊子、刀片、培养皿、滤纸、吸水纸、青霉素瓶、染色缸、载玻片、盖玻片、玻璃板、酒精灯。
（二）材料：蚕豆(Vicia faba, 2n=2x=12)、黑麦(Secale cereale, 2n=2x=14)、大麦(Hordeum sativum, 2n=2x=14)、普通小麦(Triticum aestivum, 2n=2x=42)、玉米(Zea mays, 2n=2x=20)、豌豆(Pisum sativum, 2n=2x=14)、洋葱（Aillum cepa，2n＝16）等根尖。
（三）试剂
1、Carnoy固定液、1%秋水仙素(或对二氯苯)。
2、苯酚品红染色液(配制方法见实验1)。
四、实验方法与步骤
压片法制备染色体标本：
(1) 取材：把蚕豆种子预先浸泡12h，然后转入垫有湿润滤纸的培养皿中上面蒙上湿纱布，置25℃温箱中暗培养发根，经过48h后幼根长至1—2cm左右，于上午9—11时剪下根尖。
(2) 预处理：将剪下的根尖置于对二氯苯饱和水溶液或0.1％秋水仙素溶液中，浸泡处理2-4 h。
(3) 固定：用水洗净处理过的根尖，经Carnoy固定液中固定2-4h，转入70％乙醇中，4℃保存备用。
(4) 解离：取出根尖，用蒸馏水洗净，放入l M HCl中60℃解离8－10min，再用蒸馏水洗净。
(5) 染色：改良苯酚品红染色5—10min。
(6) 压片：把根尖放在载玻片上、切取分生区部分、加一滴45 %醋酸，盖上盖玻片，用力垂直猛压，盖玻片上放上一滤纸，用铅笔上的橡皮头轻轻敲打盖片，使细胞和染色体分散。
（7）镜检
五、实验结果
六、作业：绘制出中期染色体图。
实验九细胞骨架观察（4学时）
一、实验目的
掌握植物细胞骨架的结构特征及其制备技术。
二、实验原理
细胞骨架（cytoskeleton）是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管（MT，20－25nm）、微丝（MF，5－7nm）和中间纤维（IF，8－11nm）。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的观察多用1% Triton X-100处理细胞，可使细胞膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提掉，而细胞骨架系统的蛋白质不受破坏被保存，经戊二醛固定，考马斯亮兰R250染色后，微管不够稳定，其他类型纤维太细，无法分辨，只能观察到由微丝组成的微丝束（40nm）为网状结构。
三、实验仪器、材料和试剂
（一）仪器、用具：光学显微镜，镊子，剪刀，试管，表面皿，滴管，载玻片，盖玻片，染色缸，烧杯。
（二）材料：新鲜洋葱鳞茎
（三）试剂
1）M缓冲液（pH 7.2）：
50mmol/L咪唑(MW:68.08，3.4g/L) (缓冲剂)
50mmol/L KCl(MW:74.55, 3.73g/L)
0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30, 0.1g/L)或MgCl2(MW:95.3, 0.05g/L)
1mmol/L EGTA(MW:380.36, 0.38g/L) （和EDTA敖合Ca2＋，并在Mg2＋存在时，骨架纤维保持聚
合状态并较为舒张）
0.1mmol/L EDTA (MW:292.25, 0.29g/L)或EDTA·Na2（MW:372.24,0.37g/L）
1mmol/L DTT(MW:154.3, 0.15g/L)
用1M HCl调至pH7.2
2）0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.3）：
PB 50ml
NaCl 0.15M
蒸馏水至1L
100ml 0.2 M磷酸缓冲液（PB）（pH7.3）：0.2 M Na2HPO477ml 0.2 M NaH2PO4 23ml
0.2 M Na2HPO4：Na2HPO4·2H2O（MW：178.05，3.561 g/100mL）或Na2HPO4·12H2O（MW：358.22，7.164 g/100mL）
0.2 M NaH2PO4：NaH2PO4·H2O （MW：138.01，2.76 g/100mL）或NaH2PO4·2H2O（MW：156.03，3.12 g/100mL）
3）1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于M-缓冲液
4）3% 戊二醛100mL: 取50% 戊二醛6mL ,PBS 94mL
5）0.2% 考马斯亮蓝R250染液：
考马斯亮蓝R250 0.2g（0.04g/20mL）
甲醇46.5mL（9.3ml/20mL）
冰乙酸7mL（1.4ml/20mL）
蒸馏水46.5 mL（9.3ml/20mL）
四、实验方法与步骤
（1）撕取洋葱鳞茎内表皮(约l cm2大小若干片)置于装有pH7.3 磷酸盐缓冲液的50m1烧杯中，使其下沉。
（2）吸去磷酸盐缓冲液，用1％Triton－l00处理20—30min。
（3）吸去Triton－l00，用M缓冲液洗3次，每次10min。
（4）3％戊二醛固定0.5—1h。
（5）pH7.3磷酸盐缓冲液洗2次，每次10min。
（6）0.2％考马斯亮蓝R250染色20一30 min。
（7）用蒸馏水洗1—2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。
五、结果
六、作业：
绘图示细胞骨架的形态
实验十植物染色体分带技术（10学时）
一、实验目的
掌握植物染色体分带的原理与方法，了解这一技术的重要意义。
二、实验原理
植物染色体分带是借助特殊的处理程序，使染色体的一定部位显示出深浅不同的染色带纹。这些带纹具有物种及不同染色体的特异性，每条染色体上带的数目、部位、宽窄与浓淡具有相对的稳定性，从而在以往的染色体形态特征之外叉增添了一类新标记，可以更有效地鉴别染色体和染色体的结构与功能。事实证明，几乎所有的植物染色体都能显带, 植物染色体显带的原理和动物染色体显带原理相似，是由于特殊的染料和染色体上的结构成分发生特异反应而产生的，并且因所用染料与处理条件不同可产生不同的带型，因此有c带、N带、G带等不同的显带技术。C带又称为结构异染色体带，主要显示着丝粒、端粒、核仁组织区或染色体臂上的结构异染色质。N带能使染色体核仁组织区特异着色，而G带技术能显示出植物染色体上的中间带，从而为种间鉴定、染色体或染色体亚单位的识别，以及基因定位的研究展示了新的前景。
三、实验仪器、材料和试剂
（1）仪器、用具：显微镜及显微照相装置、天平、温箱、恒温水浴箱、量筒、烧杯、染色缸、冰冻载玻片、玻璃板、切片盒。
（2）材料：玉米、黑麦、大麦、蚕豆、洋葱的染色体制片。
（3）试剂
1）Gemsa原液。
2）饱和Ba（OH）2溶液。5-8%饱各氢氧化钡溶液，称取氢氧化钡5-8g ，加入100ml煮沸的蒸馏水搅匀，待冷却后过滤备用。
3）2 SSC盐溶液(0.3mol/L 氯化钠+0.03mol/L 柠檬酸钠)同，称取氯化钠17.532g ，柠檬酸钠8.823g 置于容量瓶中，加蒸馏水至1000ml。
4）1 mol／L NaH2PO4溶液。
5）1/15 mol／L磷酸缓冲液（配法见实验28）。
6）0.01％胰蛋白酶（用生理盐水配制）。
7）8rnol／L尿素溶液。
8）0.1mol/L盐酸，用滴定管量到浓盐酸8.25ml，加蒸馏水定容至1000ml。
四、方法与步骤
（一）植物染色体Giemsa C带技术
1.染色体标本制备
按照去壁低渗法制备染色体标本，制好的标本需要空气干燥3～7d。
2.显带处理
（1）饱和Ba（OH）2溶液处理5～10min（20～25℃）。
（2）蒸馏水彻底冲洗，以清除Ba（OH）2。
（3）2×SSC盐溶液6o～65℃保温2h。
（4）蒸馏水冲洗5min，空气干燥。
（5）pH 6.8磷酸缓冲液与Giemsa原液按20∶1混合，染色30min，自来水冲洗，空气干燥。
（6）镜检，拍照，带型分析。
（二）植物染色体Giemsa N带技术
1.染色体标本制备
按照去壁低渗法制备染色体标本，制好的标本需要空气干燥3～7d。
2.显带处理
（1）将储存一周以内的染色体标本，用1 mol／L NaH2PO4溶液（94±1）℃处理6～15min。准确的处理时间需自己摸索。
（2）50℃左右蒸馏水冲洗3次。
（3）空气干燥。
（4）pH 6.8磷酸缓冲液与Giemsa原液按20∶1混合，染色30～6omin，染色时间随处理时间不同而异，NaH2PO4处理时间稍长，染色时间就要延长。
（5）自来水冲洗，空气干燥。
（6）镜检，拍照，带型分析。
（三）植物染色体Giemsa G带技术(选做)
1.染色体标本制备
按照去壁低渗法制备染色体标本，预处理时可用饱和α一溴化萘或用0.02‰秋水仙素处理1.5～2h，然后70～80℃烘箱烤2h。
2.显带处理
（1）胰蛋白酶法：储存1～3d的染色体标本，用0.85％生理盐水浸数秒，然后用0.01％胰蛋白酶（生理盐水配制）处理10～30s，0.85％生理盐水冲洗2次，30∶1 Giemsa染色5～8min，自来水冲洗，空气干燥，镜检。
（2）尿素法：储存1～3d的染色体标本，用8mol／L尿素（2份8mol／L尿素十1份pH6.8磷酸缓冲液混合）处理40s～5min（视材料和标本而定），30∶1 Giemsa染色5～8min，自来水冲洗，空气干燥，镜检。
（3）胰蛋白酶一尿素法：储存1～3d的染色体标本，用0.85％生理盐水浸数秒，然后用0.01%胰蛋白酶处理5～40s，0.85％生理盐水冲洗2次，然后用8mol／L尿素处理5～15s，生理盐水冲洗2次，30∶l Giemsa 染色5～8min，自来水冲洗，空气干燥，镜检。
五、作业
交带型片一张。
实验十一扫描电子显微镜样品制备与观察（12学时）
一、实验目的
（1）了解对扫描电子显微镜生物样品的基本要求。
（2）了解常规扫描电子显微镜样品制备过程及原理。
二、实验原理
由于观察目的不同，除了使用相同的固定液之外，SEM生物样品制备与TEM有较大的差异。为了得到无损、真实而清晰的表面形貌结构，在SEM样品制备的全过程中都必须十分小心地保护被观察面，因此在二次电子表面形貌成像工作状态下，必须满足下述四项基本要求：①样品的被观察面应充分的暴露出来（在所要求的二次电子图像分辨率水平上），无污染、无皱缩、无明显的人工损伤及附加结构。②镀一层均匀的重金属导电材料（金、铂、钯铱合金等），造成被观察表面的“质量一厚度”（pt）一致性。“厚度”既要大于等于入射电子束进入样品的扩散深度，又不能掩盖样品本身的凹凸形貌结构。同时，样品表面的
二次电子发射率要高。③样品、样品与样品托之间导电性要好。④能耐受高能量的入射电子束和高真空，不变形、不升华。
在取材时，针对不同的样品、不同的观察要求，采取不同的技术，使被观察表面充分地暴露出来；脱水时，为了避免观察表面皱缩变形，设计了特殊的干燥方法；此外，还必须对样品进行导电处理，在样品表面喷镀一层厚度适当、均匀的金属膜。
三、实验仪器、材料和试剂
（1）仪器、用具：临界点干燥器、离子溅射仪、超声波清洗机、电吹风机、磁力搅拌器、干燥器、抛光膏、刀片、剪刀、镊子、样品盒、酒精灯、牙签、竹签、培养皿、烧杯、量筒、量杯、注射器、载玻片、脱脂棉、导电胶。
（2）材料:鼠空腔器官内自然表面。
（3）试剂:2.5％戊二醛溶液、1％OsO4溶液、0.2mol／L PBS溶液、醋酸异戊酯、液体CO2、双蒸水。
四、方法与步骤
（1）准备样品托：用抛光膏擦净样品托，然后用丙酮洗净抛光膏，电吹风吹干备用。
（2）取材：注意保护好被观察表面，彻底清洗干净，暴露出最佳位置。样品体积应依据观察要求及样品托大小等酌情而定。
（3）固定、漂洗和脱水：由于SEM是观察样品某一表面形貌的，所以固定时间可以比TEM短。另外，脱水时，到纯乙醇级即可。漂洗可参考TEM样品制备。
（4）用醋酸异戊酯置换乙醇：弃去乙醇，用酯酸异戊酯与纯乙醇1∶1的混合液浸10～20min弃去混合液进入纯醋酸异戊酯，浸10～20min。
（5）CO2置换醋酸异戊酯及临界点干燥：从纯醋酸异戊酯中取出样品，保持湿状态时置入临界点干燥仪（critical point dryer）的样品盒并放进样品室（预冷）。盖紧样品室，充入液体CO2，液面高出盒面。社慢排出气体CO2。直至样品保持湿润、周围有少量液体CO2为止。重复充液排气2～3次。然后，向样品盒内注人液体CO2（高度不超过80％），加热、加压、排气。取出样品放入干燥器内备用。临界点干燥是利用水和气的临界状态下表面张力为零的特性，使样品中的液体气化而干燥，避免了表面张力对结构的破坏。
（6）黏贴样品：用少量导电胶涂在样品托上，用镊子轻夹样品侧面，观察面朝上置于样品托上。
（7）离子溅射镀膜：把样品托插入离子溅射仪真空室样品台上，操作溅射仪，可使样品表面覆盖一层10～15nm厚的金属膜。溅射镀膜的基本原理是，高能粒子轰击金属靶（金、铂、钯铱合金等），靶金属原子获能后由靶表面逸出而沉积在样品表面，形成连续的导电膜。这种金属膜不仅可以导电，受激产生较强的二次电子发射，而且使样品表面具有“质量一厚度”的一致性。严格地控制膜的厚度，是获得清晰、真实的二次电子表面形貌成像效果的重要条件。
五、作业
（1）简述在二次电子表面形貌成像时，对扫描电子显微镜生物样品的基本要求。
（2）简述扫描电子显微镜生物样品制备的过程。
附: 扫描电子显微镜使用
【实验目的】
（1）了解扫描电子显微镜的结构、基本性能及工作原理。
（2）了解扫描电子显微镜的使用技术。
【实验原理】
扫描电子显微镜（scanning electron microsoope，SEM）的分辨本领虽然不如透射电镜（TEM），但却具有很强的立体感，可以在亚细胞水平上生动地显现生物样品的三维结构，适于观察样品的表面形貌，在生物学上，通常用于观察研究组织和细胞表面的三维立体显微及亚显微结构。
SEM与TEM相同的是都采用电子束作为光源，电磁场作为透镜。所不同的主要是电子束、电子束照射样品的方式和被用来成像的信号电子不同。SEM主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像。这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即是使用逐
点成像的方法获得放大像。
【实验仪器、材料】
（1）仪器：扫描电子显微镜（SIEMENS＝AUTOSCAN）。
（2）材料：制备好生物样品，用导电胶粘在托上。·
【方法与步骤】
（一）扫描电镜的结构与工作原理
SEM由电子光学系统（镜筒）、扫描系统、信号检测及显示系统、供电系统、真空系统五部分组成。其中，镜筒是由电子枪和几级电磁透镜和样品室组成的（图2-3）。
在SEM镜筒中所有电磁透镜均位于样品土方，主要起聚焦电子束的作用，而且一直工作在聚焦状态（TEM一般工作在散焦状态），形成的电子束比TEM细三个数量级，可达3～10nm或更细，所以，有“探针”之称。扫描系统控制“探针”在样品表面逐点逐行地扫描，逐点逐行地发生电子散射，二次电子信号逐点逐行地从样品表面逸出。在适当控制其他变量（加速电压等），同时制备样品使其“质量一厚度”具有一致性的条件下，可以使样品两次电子逸出率仅仅取决于样品表面形貌参数。通过二次电子检测及显示系统，使镜筒内样品上每一点的两次电子信号强弱与CRT上相应的每一点像素的亮度变化一致。那么在扫描系统的控制下，“探针”在样品上的扫描与CRT电子束的扫描完全同步，样品上每一点的二次电子数量都对应着CRT上一个像素的亮度，二次电子信号强，像素则亮，反之，则暗。这样，显示样品表面形貌的二次电子显微像就形成了。
（二）扫描电镜的使用（演示教学）
（1）打开电源，抽真空。
（2）演示取放样品。
（3）演示加速电压选择、观察区域选择、放大倍数选择、倾斜选择、工作距离选择、图像聚焦及拍照记录。
（4）关机操作。
【作业】简述扫描电子显微镜二次电子表面形貌成像原理。
细胞生物学实验： 《细胞生物学实验》是高等教育出版社出版的一本书籍，作者是王崇英、高清祥。 内容简介： 《细胞生物学实验(第3版)》在保留第2版简明、可操作性强等特点的基础上，删除了相对陈旧和不适用的实验，增加了反映目前细胞生物学研究现状和发展趋势的实验，并对每个实验的结构体系进行了调整，强化了要点提示及注意事项，增加了预期实验结果。全书共3篇7章42个实验和11个附录。第一篇7个实验介绍了“普通光学显微镜”、“特殊光学显微镜”、“激光扫描共聚焦荧光显微镜”、“双光子激光扫描荧光显微镜”和“电子显微镜”的原理及使用方法；第二和第三篇从基础性、综合性和设计性实验层面安排了35个实验，涵盖了“细胞形态结构和生理活动”、“细胞分裂与染色体标本制备”、“细胞培养、遗传转化及基因表达”、“染色体分析技术”以及“细胞周期与细胞凋亡”等内容，旨在培养学生的基本实验技能和综合创新能力；附录部分提供了“实验室注意事项”、“实验报告的书写要求”、“离心机转数与离心力换算表及公式”、“常用缓冲液的配制”和“常用细胞生物学词汇”等资料。书后附有部分实验的彩色图片和照片。《细胞生物学实验(第3版)》配有数字课程（基础版）网站。网站内容包括部分实验内容的录像片段、彩色图片和照片，供学有余力的学生学习和教师教学参考。《细胞生物学实验(第3版)》适合作为综合性大学、师范、农林、医学等院校相关专业本科生的细
胞生物学实验教材使用，也可供研究生、相关科研及实验技术人员参考。 目录： 第一篇显微镜技术 光学显微镜及其使用 普通光学显微镜及其使用 特殊光学显微镜及其使用 暗视野显微镜 相差显微镜 偏振光显微镜 微分干涉相差显微镜 荧光显微镜 激光扫描共聚焦荧光显微镜和双光子激光扫描荧光显微镜 激光扫描共聚焦荧光显微镜 双光子激光扫描荧光显微镜 电子显微镜及其使用 透射电子显微镜技术 透射电子显微镜的原理、用途与使用方法 透射电子显微镜样品制备(超薄切片) 扫描电子显微镜技术 扫描电子显微镜的原理、用途与使用方法 扫描电子显微镜样品制备
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导目录 一．显微镜的使用 实验一、几种光学显微镜的使用 实验二、参观电子显微镜及生物超薄切片标本制备 二．细胞形态结构 实验三、细胞大小的形态观察——测微尺的使用 实验四、细胞活体染色技术 实验五、植物细胞骨架光学显微观察 实验六、胞间连丝观察 三．细胞化学 实验七、鉴定RNA的细胞化学方法——Branchet反应 实验八、DNA显色的观察——Feulgen反应 实验九、固绿染色法鉴定细胞内酸性蛋白与碱性蛋白 实验十、多糖及过氧化酶的显示 实验十一、核仁组成区的银染显示与观察 四．细胞生理 实验十二、细胞膜的通透性 实验十三、细胞电泳 五．细胞和组织培养技术 实验十四、植物原生质体的分离和融合 实验十五、植物细胞的培养与观察 实验十六、动物细胞融合 实验十七、动物细胞的培养与观察 六．细胞化学成分的分离 实验十八、细胞器的分离、纯化——细胞分级分离 实验十九、荧光的细胞化学测定 实验二十、细胞活力的鉴别 实验一几种光学显微镜的使用
一、实验目的 了解几种光学显微镜的结构、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通显微镜提高分辨力的方法。 二、实验原理 (一)基本原理 一般实验室经常使用的光学显微镜都是由物镜、目镜、聚光器和光阑组成，普通显微镜它们的放大原理及光路图如下： AB物体．A1B l第一次成像，A2B2第二次成像，O l目镜．O2物镜， F1为O l的前焦点，F2为O2的前焦点 各种光学显微镜的光学放大原理基本相同，各种特殊用途的光镜不过只是在光源、物镜、聚光器等方面作了改动，或在其它方面增设了某些特殊的设备。 (二)几种光学显微镜 l、普通光学显微镜： 普通光学显微镜也叫复式显微镜，是最常见，最简单的显微镜。它适于观察一般固定的，有色的透明度较高的标本。其最大分辨力一般为0.2微米，从构造上可分光学、机械和电子三大系统。 2、暗视野显微镜： 暗视野显微镜是以丁达尔现象(Tyndall phenomenon)(即光的微粒散射现象)为基础设计的,它使用了特殊的聚光器进行斜射照明,因光源中心束不直入物镜，所以视野黑暗，而被检细胞器因斜射照明发生衍射和反射，所以发亮可见。暗视野显微镜可用增加光照方法增加物体与背景的反差，因而可观察到0．2—0．004微米直径的微小粒子，但它分不清被检物的细微构造，它常用于观察物体的存在与运动。而暗视野显微镜与普通光学显微镜的区别，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有别。确切地说，称暗视野显微镜为暗视野照明更为贴切。它是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜。使视野背景暗黑，样品明亮的照明方法。 3、相差显微镜： 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
1. 什么是细胞培养？ 细胞生物学实验 指从动物活体体内取出组织，并将其分散为单个细胞（机械或酶消化），在体外模拟体内的生理环境，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制以及细胞衰老过程等生命现象。 最常见的细胞一般有两种，一种是原代细胞，另一种是传代细胞。 原代细胞是指动物组织经过胰酶或胶原酶等酶类的消化，使其分散，从而获得单个细胞，再使这些单个细胞生长于培养容器中的过程。大多数组织可以制备原代细胞，但制备的方法略有不同，制备的细胞生长快慢及难易程度也不相同。 不同的原代细胞，其形态也不尽相同。一般将10代以内的细胞称之为原代细胞。 传代细胞一般指无限繁殖的细胞系，理论上这类细胞可以无限次的传代。做实验的时候也会经常使用这类细胞，如Hela、293、Vero 等细胞。 2. 细胞的生长周期 游离期：细胞刚接种到新的培养容器中到贴壁前的一段时期，这个时期的长短由细胞类型决定，从几分钟到几个小时不等。 贴壁期：细胞从游离状态变为贴附到培养器皿表面并展现出一定细胞形态的时期。 潜伏期：细胞在完成贴壁后，并不会马上进行增殖，会进行增殖所必须的物质和能量的储备，这个时候称之为潜伏期。
对数生长期：细胞在完成物质和能量储备后，开始大量的增殖的时期。这个时期的细胞活力旺盛，且状态稳定，我们所做的绝大多数实验都是在这个时期开展的。 停止期：随着细胞的生长，细胞密度越来越大，由于营养物质的消耗、细胞间的接触抑制等因素，细胞生长缓慢，甚至停止生长。这个时候，我们就要给细胞进行传代了，使细胞可以继续进行增殖，保持旺盛的活力。 3. 细胞生长所需要营养条件 细胞的培养所需要的营养成份一般来自于基础培养基（比如DMEM培养基）和血清。 基础培养基：主要是提供细胞生长所需要的氨基酸（组成蛋白质的基本单位）、维生素（细胞代谢中辅酶的组成成分）、无机离子（K+，Na+等）、碳水化合物（碳源和能量来源）和一些激素等营养物质。 血清：主要是提供一些基础培养基不能提供的生长因子和低分子的营养物质，此外它还有促进细胞的贴壁、中和有害重金属离子等作用。如果只提供基础培养基而不提供血清，绝大多数细胞是无法生长的。血清对于我们实验的重要性就不言而喻了，那么什么样的血清才算是合格的血清呢？ 合格的血清需要通过各种检测，包括无细菌，无真菌，无支原体检测，无病毒污染。血清一般呈现为淡黄色，透明状液体，由于含有大量的蛋白质等成分，会略有黏稠。以全式金公司的TransSerum EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)为例，它通过了牛腹泻病毒、牛副
细胞生物学实验 实验一不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测[实验目的] 通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。 通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。 [实验原理] 应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节)，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。 该实验完成需时6学时。 [实验材料、试剂和仪器] 一、仪器 普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃温箱、镜台测微尺、目镜测微尺等。 二、材料 洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。 三、试剂 生理盐水，10μg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存） [实验步骤] 一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。 2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。 3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。 4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。 5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。 二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生
细胞生物学实验测试题 1、试述荧光显微镜的原理和用途。（并操作） 原理：荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。 （滤光镜片：获得所需波长的激发光；光源：高压汞灯） 用途：荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光； 另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研 究的工具之一。 2、试述酸性磷酸酶显示法的原理及主要步骤。 原理：酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的标志酶，通常酸性磷酸酶在pH 为5左右时发挥作用能水解磷酸酯而释放出磷酸基，PO43-与底物中硝酸 铅反应生成磷酸铅沉淀物。由于这些沉淀物是无色的，需再与黄色的硫化 铵反应，生成棕黄色到棕黑色的硫化铅沉淀而被显示出来。其反应过程如 下： β-甘油磷酸钠+酸性磷酸酶→甘油+PO43- PO43-+Pb(NO3)2 →Pb3(PO4)2↓ Pb3(PO4)2+(NH4)2S →PbS↓(棕黑色) 主要步骤： 1、前处理：获取小白鼠或大白兔腹腔液（猪肝） 2、制片： （1）、将腹腔液（肝细胞悬液）滴一滴于冰冻的干净载玻片上，用牙签涂开，自然干燥。 （2）、放入10%中性福尔马林固定液中固定30min。 （3）、蒸馏水中漂洗,3-5次。（洗去固定液） （4）、磷酸酶作用液，37°C，30Min。 （5）、蒸馏水中漂洗3次，5min一次。（洗去游离铅离子） （6）、1%硫化铵处理（3-5min）; （7）、吉姆沙染液复染15min;（使细胞核、轮廓显示出来） （8）、制片观察。 结果：阳性细胞内有大小不等的棕色或棕黑色的颗粒即为酸性磷酸酶。 对照实验：标本放入作用液前先用高温（50℃）处理 30min，使酶失去活 性，做好标记，其他步骤相同。 3、试述DNA的Feulgen染色法的原理及主要步骤。 原理：DNA经稀盐酸（1mol/L HCL溶液）处理后，可使嘌呤碱与脱氧
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
实验室规则和要求 一般规定 1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。 2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚 趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。 3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食 物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外 套及杂物等。 4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每 组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数 清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦 拭，并随时保持环境清洁。 5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的 注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实 验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下 自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。 6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。 实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验 室。 7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验 室前记得洗手。 8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变 措施。
药品 1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料， 查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免 污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、 -巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉 尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好 习惯。 5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂 糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。 6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 仪器 1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸， 勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开 盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电 源。
实验一普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1了解显微镜的基本构造和使用方法 2 掌握油镜的原理和使用方法 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 1．显微镜的基本构造 光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。 2．显微镜的放大倍数和分辨率 放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3．油镜的使用原理 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、器材 1．永久切片 2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四、操作步骤 1．观察前的准备 （1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光源 2．显微镜观察
（1）低倍镜观察 （2）高倍镜观察 （3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3．显微镜用毕后的处理 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。 五、思考题 1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？ 2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 实验二胞间连丝的观察 一、实验目的 观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识． 二、实验原理 植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。 三、实验材料 红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片 四、实验步骤
细胞生物学实验讲义 实验一不同细胞形态观察、大小测量，结构比较 一、实验目的 利用光学显微系统对生命的基本组成单位——细胞进行观察，了解不同细胞的形态、结构和大小区别。 二、实验原理 细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行研究，首先要从其形态结构入手。所以，要借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。 三、实验内容和步骤 A、血涂片的制作 1．取末梢血1 滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的载玻片作为推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载玻片保持30～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。 2．操作 ①将干燥血片用甲醇固定3-5分钟。 ②将固定的血片置于被pH6.4 -6.8磷酸盐缓冲液稀释10-20倍的Giemsa染液中，浸染10-30分钟（标本较少可用滴染法）。 ③取出用水冲洗，待干后镜检。 注意： ①取血滴不宜过多，以免涂片过厚，影响观察。 ②要使涂片厚薄均匀、拿片角度和速度都要适中，用力要均匀。涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。 ③涂片一般在后半部为好，白细胞在边缘和尾端较多。 B、洋葱表皮临时制片的制作 1.准备：擦净载玻片和盖玻片 2.制片 1)把载玻片平放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水 2)用刀片在洋葱鳞片叶内侧表皮上，划出2-5平方毫米的小方格，然后用镊
子撕下方格内的表皮放在载玻片的水滴中。 3)用镊子将表皮展平。 4)用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的水滴，慢慢放平。3.染色 1)用滴管在盖玻片的一侧滴适量稀释的碘酒。 2)用吸水纸在盖玻片的另一侧吸染液。 4.观察 C、人的口腔上皮细胞临时制片的制作 1.准备：擦净载玻片和盖玻片 2.制片 1)把载玻片平放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水。 2)用凉开水漱口，取消毒牙签在口腔侧壁上轻刮几下，将刮下的碎屑在载 玻片的液滴中涂抹均匀。 3)用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的液滴，慢慢放平。 3.染色 a)用滴管在盖玻片的一侧滴适量碘液。 b)用吸水纸在盖玻片的另一侧吸碘液。 4.观察 四、实验准备 1.器材：普通光学显微镜，牙签、酒精棉球、载玻片。 2.材料：洋葱表皮，口腔上皮，血涂片，永久制片。 3.试剂：碘液，Giemsa染液，生理盐水，甲醇，香柏油。 五、作业 描绘你所观察到的各种细胞的结构及大小（以比例尺表示）。 1、血液涂片（必做）。 2、永久制片，洋葱表皮，人口腔上皮选做其一。 实验二植物细胞微丝束的观察 一、实验目的 掌握考马斯亮蓝R250染植物细胞内微丝束的方法。了解在微丝束细胞内的分布特点。 二、实验原理
细胞生物学实验教案 【经典学习资料，收藏必备】
实验一、细胞形态结构与几种细胞器的观察 【实验目的】 在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构，掌握生物绘图的方法。 【实验原理】 细胞在形态上是多种多样的，有球形、椭圆形、扁平形、立方形、梭形、星形等。虽然细胞的形状各异，但是它们却有共同的基本结构特点，都由细胞膜（动物）、细胞壁（植物）、细胞质和细胞核组成。细胞中的各种细胞器，如线粒体、高尔基体、中心体、核仁、染色体等，一般经过一定固定染色处理后，大多数在光学显微镜下是可以看见的（图）。细胞器的形态结构在普通光学显微镜下与电子显微镜下所看到的结构有很大的差别。 （自拍图） （a）（b） （c）（d） 图 1 细胞形态结构 a. 柿胚乳细胞示胞间连丝； b. 马蛔虫受精卵分裂中期示中心粒； c. 兔的神经细胞中高尔基体； d.小鼠肝细胞线粒体 【实验仪器、材料和试剂】 1. 仪器：复式显微镜、擦镜纸 2．材料：洋葱根尖切片、小白鼠肝切片、兔神经节切片、马蛔虫受精卵切片3．香柏油或石蜡油、二甲苯 【方法与步骤】
一、洋葱根尖切片细胞的观察 先用低倍镜观察根尖的纵切面，注意分生区、伸长区、成熟区细胞的异同，然后再仔细观察细胞的形态结构，特别注意细胞的形状、大小，以及细胞壁、细胞核、核仁、细胞质、液泡的形态结构。 二、兔神经节细胞切片高尔基体的观察 先在低倍镜下找到兔神经节细胞，然后转用高倍镜观察，可看到细胞内淡黄色的背景上有黄褐色的细胞核，核的周围分布着许多深褐色的（硝酸银镀染）高尔基体，呈弯曲的线状，颗粒状，少量分散在细胞质。 三、小白鼠肝细胞切片线粒体的观察 先用低倍镜后用高倍镜观察，可见到许多肝小叶，每小叶有许多紧密排列成索状的多角形的肝细胞，细胞中央有大而圆的细胞核。这时，转用油镜观察，可见到细胞质内分布着许多被苏木精染成深紫色的线粒体，呈颗粒状和线状。 四、马蛔虫受精卵切片中心体的观察 1．取马蛔虫受精卵切片，在显微镜下找到充满子宫腔的受精卵，每个马蛔虫受精卵外围有一层较厚的卵膜，膜内有宽大的围卵腔，各围卵腔内有处在不同分裂期的卵细胞。找到分裂中期的细胞，在细胞中央被染成蓝色条状或棒状的结构，这就是染色体。在染色体两侧可见各有一个较小的，亦被染成蓝色的小粒，称中心粒。在中心粒的周围可见呈放射状的星丝。 实验一、细胞的显微测量 【实验目的】 掌握显微测微计的基本原理及使用方法。 【实验原理】 细胞长度、面积、体积的测量是研究正常的或病理组织细胞的基本方法之一。在显微镜下用来测量细胞长度的工具叫显微测量计，由目镜测微尺（ocular micrometer）和镜台测微尺（stage micrometer）组成，两尺要配合使用。目镜测微尺是放在目镜内的一直径为2cm圆形玻片上，里面有100等分格的刻度尺。每一小格表示的实际长度随不同的显微镜、不同放大倍数的物镜而不同。镜台测微尺是一块特制的载玻片，在它的中央由一片圆形盖片封固着一具有精细刻度的标尺，标尺全长为lmm，分为100等份的小格，每小格的长度为0.01 mm（10μm），标尺的外围有一小黑环，便于找到标尺的位置。显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格所表示的实际长度。在测量细胞时，移去镜台测微尺，换上被测标本，用目镜测微尺即可测得观察标本的实际长度。 【实验仪器、材料和试剂】 （一）仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、解剖剪、解剖镊、注射器、载玻片、盖玻片、试管、无菌采血针 （二）材料：血涂片 （三）试剂：生理盐水、瑞氏（Wright）染色液 【方法与步骤】
细胞培养基本理论 一细胞培养概述 细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。 克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。 组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。 特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。 器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。 特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。 细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后， 生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异 呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态. 细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞 处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞 贴壁型细胞形态比较 成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源 上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期 多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等
细胞生物学实验 班级：生科142 姓名：旷江 学号：10143131 组号： 2 小组成员：旷江、韦立尧、莫霞指导老师：范立强、李鹏飞 华东理工大学 应用生物学系
摘要 本次细胞生物学实验通过细胞形态与结构的观察技术，细胞化学，细胞生理，细胞培养与分析，细胞周期分析，细胞成分分离与分析，细胞增殖与染色等技术对动植物细胞进行细胞形态结构的观察、细胞生理过程的研究、细胞培养与细胞分析、细胞冻存与复苏等，以此来研究动植物细胞的结构、功能和各种生命规律。 关键词：细胞增殖、细胞染色、冻存复苏、生理过程、形态结构
Abstract The cell biology experiment was carried out by cell morphology and structure observation technique, cytochemistry, cell physiology, cell culture and analysis, cell cycle analysis, cell fractionation and analysis, cell proliferation and staining. Observation of cell physiological processes, cell culture and cell analysis, cell cryopreservation and resuscitation, in order to study the structure of animals and plants, functions and a variety of laws of life. Key words: cell proliferation, cell staining, cryopreservation, physiological processes, morphological structur
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization）
冻存细胞的复苏 1、于液氮罐中取出冻存管。 2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。 3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。 4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。 5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。 组织块法培养骨骼肌细胞 1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。 2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。 3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。 5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 贴壁细胞的传代和冻存 1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。 2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。 3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待 见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。 4、加培养液终止消化。 5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。 6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。 7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。 8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。 9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃ 2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。 细胞计数
第五章物质的跨膜运输与信号传递 一．教学目标：1深刻理解被动运输、主动运输和内吞外排的概念，以及物质跨膜运输的重要意义；2．理解细胞信号传递的主要特点，掌握甾类激素信号 通路、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号通路和EGF受体信号通路的主 要环节。 二．重点：跨膜运输的方式和细胞通讯的信号通路。 三．难点：跨膜运输的机制。 四．授课方式与教学方法：讲授、讨论、多媒体辅助教学。 五．教学内容: 细胞膜是细胞与细胞外环境之间的一种选择性通透屏障，物质的跨膜运输对细胞的生存和生长至关重要。多细胞生物是一个繁忙而有序的细胞社会，这种社会性的维持不仅依赖于细胞的物质代谢与能量代谢，还有赖于细胞通讯与信号传递，以协调细胞的行为。 第一节物质的跨膜运输 一.被动运输（passive transport） ◆定义：通过简单扩散或协助扩散实现物质由高浓度向低浓度方向的跨膜转运。转运的动力来自物质的浓度梯 度，不需要细胞提供能量。 ◆类型：简单扩散（simple diffusion）、协助扩散（facilitated diffusion） ◆膜转运蛋白： ?1.载体蛋白（carrier proteins）——通透酶（permease）性质； 介导被动运输与主动运输。 ?2.通道蛋白（channel proteins）——具有离子选择性，转运速率高；离子通道是门控的；只介导被动运输膜转运蛋白通道蛋白(被动运输)膜转运蛋白 载体蛋白单运输 (被动运输+主动运输) 共运输 协同运输 对向运输 细胞膜上的运输蛋白： 载体蛋白：通过构象变化运输物质 通道蛋白：形成通道、运输物质 载体蛋白:膜上一类转运蛋白，可特异的、可逆的与某物质结合，通过构象变化将物质从膜的一侧运到另一侧。又称通透酶，与运输物质的结合与酶的动力学相似。 通道蛋白:形成亲水的通道，允许一定大小和一定电荷的离子通过。因运转的几乎都是离子，又称离子通道. 通道蛋白形成通道：
第二节细胞生物学实验方法与技术 细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与调控细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。 一、细胞培养常用方法 1、细胞原代培养（primay culture）又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。 2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。 二、器官培养方法 器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。 器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。 三、放射自显影术测定 放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。 四、染色体分析技术 染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础； 3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体
细胞生物学实验汇总
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：
实验一、二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【方法步骤】 1．制备土豆凝集素液和红细胞悬浮液，制备无血清的鸡红细胞悬液，使凝集素液和红细胞悬液混合，静置后，在光镜（低倍）下观察凝集素使红细胞凝集的现象。（以PBS 缓冲液加2％血细胞作对照实验）[土豆凝集素的制备：称取土豆去皮块茎2g , 加10 mL PBS 缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 载玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2％红细胞液,充分混匀静置20 min , 低倍显微镜下观察血球凝集现象。] 2．观察10%的鸡红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体 3．观察溶血现象取一支试管，再加入4ml 蒸馏水，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。 4．观察鸡红细胞对不同物质的通透性 （1）取一支试管，和0.17M 的Nacl 溶液4ml，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需要的时间（从加入4ml 溶液算起） （2）按上述方法分别加入下列9种溶液是否导致红细胞溶血并记录实验结果。 ①0.17M 氯化铵②0.17M 硝酸钠③0.17M 硫酸钠④0.17M 醋酸胺 ⑤0.17M 草酸铵⑥0.17M 葡萄糖⑦0.17M 甘油⑧0.17M 乙醇 ⑨0.17M 丙酮 【实验结果】 1、土豆凝集素能使鸡红细胞凝集，PBS 对照液中红细胞分散均匀。对照组未凝血，实验组凝血。 2、氯化钠、硝酸钠、硫酸钠溶液不溶。醋酸铵>草酸铵>氯化铵>乙醇>甘油>丙酮>葡萄糖。膜通透性大小主要取决于分子大小和分子极性。小分子比大分子容易通过，非极性比极性易通过，带电荷离子高度不透。