免疫组库项目计划书
一项目背景
免疫系统拥有 6 个主要类型的蛋白，分为免疫球蛋白的轻链和重链、TCRα， TCRβ， TCRγ和TCRδ，每一种免疫蛋白拥有彼此间细微差异的数量巨大的亚型。对于某一种特定的感染或
疾病，免疫系统中的 B 细胞和 T 细胞会作出特异性的免疫反应，产生对抗抗原的特异性BCR 和TCR 序列。记忆性的免疫细胞会长期存在免疫系统中以便当抗原再次入侵时能快速做出
反应。这样人们可以寻找不同病毒、细菌或真菌引起免疫反应的特定的BCR/TCR 基因序列。
免疫组库（Immune Repertoire ，IR）是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所
有功能多样性 B 细胞和 T 细胞的总和。它反映机体免疫系统在特定时间内应对外界刺激应答
的能力，可以准确而全面地反映机体免疫系统的健康状况。免疫组库测序是以T/B 淋巴细胞为研究目标，多重 PCR（或 5’RACE）结合高通量测序为技术手段，全面评估免疫系统的多
样性，识别并量化体内免疫应答增殖克隆，在抗体发掘、疫苗设计、认识免疫系统发育、感染
性疾病治疗、自身免疫系统疾病治疗以及癌症的免疫治疗等领域有着潜在的应用价值。
二市场调查
免疫组库测序技术现在已经成熟，市场也较大，目前市场上有许多公司开展，比如：华大基
因，北京迈诺基因，上海伯豪生物，北京百迈客生物，上海晶能生物，苏州泓迅生物等。
三技术路线
免疫组库测序的技术已经成熟，有许多商业化试剂盒，数据分析也已经流程化。
1.总技术路线
收集样本
磁珠法分离T 细胞和 B 细胞
提取 mRNA
多重 PCR扩增构建文库
高通量测序
生物信息分析
2.项目实施细节
目前 clontech 公司有商业化的免疫组库文库构建试剂盒SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit , 考虑到前期的技术风险，推荐购买此商业试剂盒减少技术磨合的时间。
测序 TCR CDR3推荐 PE101， BCR CDR3推荐 PE151
3. 项目周期
从收到标本到给出实验报告，目前市场上的公司都是30 天
收集样本，质控 3 天
文库构建10 天
上机测序5天
数据分析12天
四项目用仪器
实验仪器主要用途
制冰机制冰
电冰箱试剂的储存
高速台式离心机试剂的离心
Mini 式离心机瞬离试剂
旋涡式混合振荡器混匀试剂
电子分析天平试剂的称量
核酸检测仪核酸纯度和浓度的检测
PCR仪PCR
电泳仪和水平电泳槽琼脂糖凝胶电泳
凝胶成像仪核酸琼脂糖凝胶电泳的检测和分析
蒸汽式高压湿热消毒器试剂、实验耗材及用具的消毒
电热鼓风干燥箱实验用品的干燥
恒温水浴锅提供恒温环境
电脑用于数据分析
第二代测序仪测序
五项目的风险
目前国内要开通医学高通测序检测，需要国家认证的 CFDA证书，实验室需要符合CLIA认证。
免疫组库项目计划书 一项目背景 免疫系统拥有 6 个主要类型的蛋白，分为免疫球蛋白的轻链和重链、TCRα， TCRβ， TCRγ和TCRδ，每一种免疫蛋白拥有彼此间细微差异的数量巨大的亚型。对于某一种特定的感染或 疾病，免疫系统中的 B 细胞和 T 细胞会作出特异性的免疫反应，产生对抗抗原的特异性BCR 和TCR 序列。记忆性的免疫细胞会长期存在免疫系统中以便当抗原再次入侵时能快速做出 反应。这样人们可以寻找不同病毒、细菌或真菌引起免疫反应的特定的BCR/TCR 基因序列。 免疫组库（Immune Repertoire ，IR）是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所 有功能多样性 B 细胞和 T 细胞的总和。它反映机体免疫系统在特定时间内应对外界刺激应答 的能力，可以准确而全面地反映机体免疫系统的健康状况。免疫组库测序是以T/B 淋巴细胞为研究目标，多重 PCR（或 5’RACE）结合高通量测序为技术手段，全面评估免疫系统的多 样性，识别并量化体内免疫应答增殖克隆，在抗体发掘、疫苗设计、认识免疫系统发育、感染 性疾病治疗、自身免疫系统疾病治疗以及癌症的免疫治疗等领域有着潜在的应用价值。 二市场调查 免疫组库测序技术现在已经成熟，市场也较大，目前市场上有许多公司开展，比如：华大基 因，北京迈诺基因，上海伯豪生物，北京百迈客生物，上海晶能生物，苏州泓迅生物等。 三技术路线 免疫组库测序的技术已经成熟，有许多商业化试剂盒，数据分析也已经流程化。 1.总技术路线 收集样本 磁珠法分离T 细胞和 B 细胞 提取 mRNA 多重 PCR扩增构建文库 高通量测序 生物信息分析
免疫组库高通量测序技术检测ALL-MRD的研究进展 【摘要】急性淋巴细胞白血病（ALL）占儿童恶性肿瘤性疾病的首位，尽管儿童ALL治疗已 取得很大进展，但复发仍是我们面临的难题。白血病的微小残留病（MRD）状态是复发的根源。研究表明，对患者进行定期MRD检测具有重要的临床指导意义。目前临床上通过实时 定量PCR、流式细胞术和原位荧光杂交等技术检测白血病微小残留病（MRD），但是这些技 术都有各自的局限，导致一定程度的漏检或假阳性。免疫组库高通量测序技术（IR-SEQ）的 高灵敏度和高特异性，能够更加全面地检测MRD。本文将对IR-SEQ技术在检测ALL-MRD中 的研究进展进行综述。 【关键词】急性淋巴细胞白血病；微小残留病；免疫组库；高通量测序 急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）在儿童所有恶性肿瘤性疾病中占 据首位，且有逐年增加的趋势，我国每年约有1.5-2万名新发儿童白血病，其中急性淋巴细 胞白血病占80%左右，是小儿时期最常见的白血病类型，发病高峰年龄为3～4岁，是严重 威胁小儿生命和健康的疾病之一。 随着诊疗技术水平的增高，人们对儿童白血病经过形态学、免疫学、遗传学及分子生物学检 测综合分析（MICM分型）的方法对急性白血病进行了精确的诊断和分型、分层治疗使得儿 童ALL的诊疗水平方面得到了质的飞跃，但仍有20%～30%患儿在缓解后复发[1-3]，这与体 内仍存在形态学无法检测的残留白血病细胞，即微小残留白血病（minimal residual disease，MRD）有关。因此，在治疗过程中对白血病患者进行定期MRD检测，具有重要的临床指导 意义。目前用于临床评估MRD的技术包括流式细胞术（flow cytometry，FCM）、实时定量PCR（real-time quantification polymerase chain reaction，RQ-PCR）和原位荧光杂交等技术[4]，但是这些技术都有各自的局限，导致一定程度的漏检或假阳性，也都无法监测治疗过程中病 人整体的免疫系统重建情况。免疫组库测序技术（immune repertoires sequencing，IR-SEQ） 的高灵敏度和高特异性，能够更加全面地检测MRD，在一定程度上弥补传统方法的不足。 1 免疫组库高通量测序技术的介绍 1.1 高通量测序 高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS），第二代测序技术，又被称为“下一代 测序”（next generation sequencing，NGS）[5]。二代测序技术具有很高的通量，能够同时并 行检测几十万到几百万的DNA分子[6，7]，能够用来对进行基因组水平的转录组或者基因组 的分析。二代测序一般采用连接酶或者聚合酶，一般是同步化三磷酸核苷酸的洗脱和同步化 的荧光检测方法相结合，采用“边合成边测序”的方法，输出短的连续性的DNA片段序列。根 据测序原理和技术的不同，主要的技术平台包括以下几种：Roche/454 FLX、Illumina Hiseq系 列和ABI SOLID系列。其中，应用做广泛的，仍然是Hiseq系列。 Illumina Hiseq测序技术其前身是solexa测序技术，依靠其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性 末端终结”技术，能够实现样本制备的自动化和高通量的碱基大规模平行测序。主要的步骤是：1）将待测的DNA制备成一定大小的DNA片段的文库，在片段的两端加上接头；2）将模板DNA加到芯片上，进行桥式扩增，形成DNA簇；3）进行边合成边测序。边合成边测序的核 心的原理是，在合成新的DNA互补链时，加入改造后的DNA聚合酶和带有荧光标记的4种dNTP，这些dNTP是“可逆性终止子”，其3’端带有化学修饰的部分，未切除掉该修饰时，不 能连接下一个碱基，能够保证每轮反应只连接一个核苷酸。在掺入单个碱基后，用激光扫描 整个芯片，读取每条模板序列所聚合上的核苷酸种类，之后切除掉末端修饰，掺入下一个碱基，这样，统计每个循环的碱基种类，就得到了所测DNA片段的信息。
我觉得我们的技术因为扩增覆盖面大（敏感性强）而且扩增是半定量的，不会因为扩增引起免疫组库测序偏向，而且还能避免B细胞的hypermutation引起的扩增失败，所以在技术上我们还是有很多优势的 Stanford 诺贝尔得奖者Andrew Fire 他们组的论文在Translational Medicine 上面发表；加拿大一组科学家在Robert Holt 领导下也发表了免疫组库测序的文章；更早还有Quake组对Zebrafish 抗体做高通量测序的文章 研究疫苗，我觉得关键问题就是搞懂免疫记忆：免疫记忆是如何形成的？用什么方式记录？记录在那里？如何回顾这个记忆？ 我们不妨这样随想一下：假设体内的免疫系统是由我来掌管的部队，遇到一个可能反复入侵的敌人，我该如何制订防范计划？ 免疫记忆，应该是把反抗入侵的成功经验记录下来。这样，当这股敌人再次入侵时，我就可以用预先准备好的方案去对付他们了。 那么，都有什么信息是需要记录下来的？ 重要的信息应该有敌人的入侵的部位（呼吸道），入侵的敌人量（病毒或者细菌量），敌人的主攻方法，他们的兵器；上次“反扫荡”我们所用的兵力（动员免疫资源的程度），兵种（T细胞，B细胞等等），火药配备（IgG? IgA? IgM?)，友军（比如先天免疫系统的参与等），抗击时间和出兵的时机，运兵路线，粮草等。 那么，人体（动物）的免疫系统又是如何记录这些信息的？是否也要考虑到这么多的方面？这么复杂的“作战计划”是如何储存在免疫记忆中的？又是如何被完美地回招出来的？记忆又是如何保存而不被忘记的？记忆的空间是否有限？记忆的时间是否有限？ 教科书上讲的Response to antigen recall 部分很笼统，这里面还有很多细节是我们所不知道的。那么，从大的方面看，教科书上的假说都正确吗？我们看到的数据有那些是和教科书相符的，那些又是不符的？不符的如何解释？是修改原先的假说还是另外提出假说？ 当我们手头掌握了只有少数人才有的工具（免疫组库高通量测序技术）的时候，就好比站在一望无际等待收割的麦田边，启动了大型全自动收割机，等待收获的喜悦的时刻。因为我们看到的数据量之大，之全，之广是前人梦寐以求的。这是我们的幸运，也是我们的责任。许多疫苗都属于所谓的减毒活疫苗：如麻疹减毒活疫苗、甲型肝炎减毒活疫苗、乙型脑炎减毒活疫苗、风疹减毒活疫苗、口服脊髓灰质炎减毒活疫苗、口服狂犬病减毒活疫苗等。 这类疫苗的好处就是接种者能获得长期或者终身保护作用，不过安全性是个问题。 有人猜测，减毒活疫苗效果好的原因可能是它更贴近野生型病毒的感染进入途径，所以所刺激出来的免疫反应也更完整，全面，完美。而用合成蛋白作为抗原的疫苗不能有效地挑起机体完整的免疫反应，所以不是产生出来的士兵兵种不对（该产生分泌型的IgA 结果产生出了IgG), 就是把训练出的士兵送到了错误的战场（呼吸道疾病的抗体送到消化道去了）。或者是军区之间步调不协调（T细胞，B细胞，和先天免疫的一些功能细胞之间的协调不够好）。
一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项
一文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项... 导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：“想拿高分文章，不学免疫组化怎么行？”免疫组化王子毛博旁边插话：“是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲...... 免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry），是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐
亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值1.5者为(+++)。4.图像分析仪 如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析仪。图像分析仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想隆重推荐的是一款图像分析软件：Image J。毛博当年在米国做博士猴的时候，就是用的这款软件。这是NIH开发的免费软件。一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发到了1.50版。网上可以免费下载。其界面非常简洁，如下图所示。现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。步骤如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成了2个细胞。然后，就可以正式开始分
免疫组化实验结果的判定和分析 免疫组化实验结果的判定和分析 就实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析、图片的确定与选取、相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容。只有严格的实验设计、标准的实验操作、专业化的结果分析才能满足客户的要求，更好地为客户提供最优质的服务。免疫组化结果的判定原则：1?必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 2?抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内；EMA 应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。 3?阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏 度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。 4?尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这 类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。 5?对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合 分析。 对照染色设计： （一）对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三种： ①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽； ②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）； ③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液pH 和离子强度不当等。假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有： ①自发荧光或内源酶等干扰； ②抗体试剂不纯（特别是一抗）； ③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等； ④Fc 受体的干扰，等等。 （二）对照的种类及其选用目的对照染色大致可分为四类：即阳性组织对照、阴性组织和阴性试剂对照及自身对照。 ?阳性组织对照指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。 ?阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的 是除外假阳性。 ?阴性试剂对照 是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。 ⑴ 空白对照 指以缓冲液（PBS、TBS 等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。 ⑵ 取代对照 指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体（靶生物缺如的）取代第一抗
用Image-pro plus（IPP）分析免疫组化图片 免疫组化的定量研究的理论上是可行的，但是实际应用起来影响因素太多。国外基本上没有对免疫组化定量的，最多只是半定量研究。建议只用免疫组化做定性和定位研究。但是目前关于免疫组化蛋白定量分析也比较多而且使结果更加直观，简单介绍一下使用方法和注意事项，共同学习。 用IPP分析免疫组化图片过程 ?选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of interesting）?测量该区域的IOD。 ?选择并测量有效统计区域的面积 ?计算选择区域内的光密度平均值IOD/area（density mean） ?计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。 ?用统计学方法分析各实验组的平均density mean之间是否有显著 性差异。 拍照注意事项： ?正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色滤光片， 灯丝电压为10V左右。一般的显微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。 ?不能通过调整光圈的方法减低亮度，这会影响到图象的清晰度。 光圈与聚光镜要按照柯勒方法调整以保证照片的清晰. ?不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的灰度滤光片还行。6%的
灰度滤光片会导致色彩失真。 ?如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从而使得 测量结果不准确。 ?为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该一次拍摄完成。不 能分数次拍摄。若能给显微镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光源亮度的稳定。 ?要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。 ?拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左 右 ?可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230 的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。 把空白灰度值调到230相当于在分光光度计上调节100%透射。 免疫组化阳性细胞计数方法：image pro plus 6.0软件 1.打开图片，点击count and measure objects 图标