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Pull Down 实验流程
1.混合两种预测相互作用的蛋白。（Protein-A-GST &Protein-B-HIS ，下面实验用GST 树脂IP ，用Western Blot 检测HIS ；反之亦然。如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down 。）
2. 加入1 mL Binding Buffer 。
Binding Buffer ：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）
100 mM NaCl
0.25% Triton-X 100
35 mM β-Me （巯基乙醇）
3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h 。
4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin 结合2-4 h 。
5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min ，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。第一次弃去的上清样品记为Washing-Protein-A/ Protein-B ，用于SDS-PAGE 电泳时的对照。
6. 加入1 mL Binding Buffer ，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min ，4 ℃，150-200 g 离心2 min ，吸弃上清。
7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。
8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的 Loading Buffer ，95℃金属浴5-10 min ，150-200 g 离心5 min ，样品记为上样跑SDS-PAGE 电泳。
电泳样品顺序： Marker ，Protein-A-GST ，Protein-B-HIS ，Washing-Protein-A/ Protein-B ，Pull Down -Protein-A/ Protein-B 此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。
用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：
（input ，蛋白量为后两者的1/10）
Marker ，Protein-B-HIS ， GST +Protein-B-HIS ，Protein-A-GST +Protein-B-HIS
Marker ，Protein-A-GST ， HIS +Protein-A-GST ，Protein-B-HIS +Protein-B-GST
9. 转PVDF 膜，350 mA 恒流，2 h 左右。（PVDF 膜用之前，用甲醇泡2 min ）
10. 做Western Blot 过程：
预杂交1 h 以上；杂交一抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min ；杂交二抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min 。
11. 显影：
用1 mL 发光液A + 1 mL 发光液B 浸润PVDF 膜，然后固定，显影液显影1 min （时间可以适当调整），水洗，定影1 min 。
12. 扫描杂交胶片结果。
重结晶和过滤实验 一、实验目的 １、学习重结晶法提纯固态有机化合物的原理和方法； ２、掌握抽滤和热过滤操作的方法。 二、基本原理 固体有机物在溶剂中的溶解度一般是随温度的升高而增大。若把固体溶解在热的溶剂中达到饱和,冷却时由于溶解度降低,溶液变成过饱和而析出结晶.利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，可以使被提纯物质从饱和溶液中析出，而让杂质全部或大部分仍留在溶液中(或被过滤除去），从而达到提纯目的。 重结晶的一般过程:使待重结晶物质在较高的温度(接近溶剂沸点）下溶于合适的溶剂里；趁热过滤以除去不溶物质和有色杂质（可加活性炭煮沸脱色)；将滤液冷却，使晶体从过饱和溶液里析出，而可溶性杂质仍留在溶液里,然后进行减压过滤，把晶体从母液中分离出来;洗涤晶体以除去附着的母液；干燥结晶. 三、实验装置 热过滤装置减压过滤装置干燥装置 回流装置 四、实验仪器、器材及药品 １、仪器、器材: 250ml三角烧瓶球形冷凝管保温漏斗短颈玻璃漏斗 200mｌ烧杯表面皿玻璃棒布氏漏斗 吸滤瓶酒精灯电热套乳胶管 滤纸剪刀台秤药勺 2、药品: 乙酰苯胺水活性炭 五、实验步骤 称取 3。0ｇ粗乙酰苯胺加到２50ｍL三角烧瓶中,加入100mＬ水,安装回流冷凝管，加热至沸,保持沸腾2—3min,取下稍冷,加入０．2g活性炭，再加热５-１０ｍｉn，用热漏斗趁热过滤,
滤液用干净的200mＬ烧杯接收，静止自然冷却,乙酰苯胺充分结晶后进行冷的减压过滤(抽滤），压实滤饼。彻底抽干水分,干燥,称重。 六、注意事项 1．可在补加2０％的水时，一同加入活性炭。 2。热过滤时保温漏斗中的水一定要尽可能热,动作要快。 3。减压过滤滤纸事先要润湿，铺好滤纸后不能减压太大。在倒入滤液之前滤纸要紧贴漏斗底部,防止滤纸被压穿. ４。如果滤液已经冷却到室温，长时间静止仍然没有结晶出现,可以用玻璃棒搅拌之。 七、思考题 1。重结晶包括哪几个步骤？每一步的目的是什么? 答:（１）溶剂的选择 目的：以保证在高温时被提纯的物质在溶剂中的溶解度较大,而在低温时则很小。 (２）样品的溶解 目的:将粗产物用所选溶剂加热溶解制成饱和或近饱和溶液。【为了避免趁热过滤的困难,一般可比需要量多加1５～20%的溶剂】 (3）活性炭脱色 目的：活性炭脱色,趁热过滤除去不溶性杂质及活性炭。【活性炭的用量应视有色杂质的多少而定，一般为干燥粗品的１～5%】 （4)滤液的冷却 目的：冷却过滤液使结晶慢慢析出，而杂质留在母液中.【将热滤液静置使其慢慢冷却至析出晶体，然后可再用冷水冷至室温，这样所得的晶体纯度高。】 （5）抽滤晶体 目的：使晶体与母液分离,过滤时尽量抽干。 （6）洗涤晶体 目的:以除去晶体表面的母液。【母液中含有可溶性杂质】 (7）晶体的干燥 目的：以除去晶体表面的溶剂。【晶体干燥时,可根据晶体的性质选择合适的方法进行干燥。】 (8）熔点的测定 目的：确定重结晶所得产品是否合乎要求.若不合格，应进行第二次重结晶。 2。怎样选择重结晶的溶剂？ 答：(１)需查阅文献、化学手册;（2)需要采用实验的方法。 若杂质溶解度很大，可以留在溶液中，若杂质溶解度很小,可以留在残渣中。要求被提纯的物质在选择的溶剂中的溶解度随温度变化大,溶剂沸点不宜太高或太低，如果没有适合的单一溶剂时，可以选用混合溶剂。混合溶剂一般由两种能以任何比例互溶的溶剂组成，其中一种易溶解被提纯物质，另一种则难溶解。 3。重结晶的溶剂应符合什么条件? 答:在重结晶时选择合适的溶剂是非常重要的。否则,达不到纯化的目的,作为适宜的溶剂,要符合以下条件: (1）与被提纯的有机化合物不起化学反应; (2）在高温时被提纯的物质在溶剂中的溶解度较大,而在低温时则很小;
12.GST蛋白的表达和纯化 12.1 GST蛋白的表达 （1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。 （5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。 （6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。 （7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。 （8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。转移至5ml离心管。 （9) 超声破壁 破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。 破壁参数：Frequency:100～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。 加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。 （10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。 12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry （1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。 （2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。 （3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。反复5次。 （4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。 12.3 GST融合蛋白的纯化 （1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。 （2) 3krpm离心5min，弃上清。该Sepahrose上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做） （3) 在管中加入离心后的 1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应
粗盐提纯实验操作步骤文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]
实验：除去硫酸铜粉末中的沙子 一、实验目的 1.掌握、过滤、蒸发等实验的操作技能． 2.理解过滤法分离混合物的化学原理． 3.体会过滤的原理在生活生产等社会实际中的应用． 二、实验仪器和药品 药品：CuSO 4，蒸馏水 器材：托盘天平(含砝码)，量筒，烧杯，玻璃棒，药匙，漏斗，滤纸，铁架台（带铁圈），蒸发皿，酒精灯，坩埚钳，胶头滴管，若干一样的小纸片，滤纸 三、实验原理 四、粗盐中含有泥沙等不溶性杂质，以及可溶性杂质如：CuSO4等．不溶性杂质可以用溶解、过滤的方法除去，然后蒸发水分得到较纯净的精盐． 五、实验操作步骤 1.溶解 2.用托盘天平称取2克CuSO 4 混合物（精确到0.1克）．用量筒量取5毫升水倒入烧杯里．用药匙取一匙粗盐加入水中，观察发生的现象．用玻璃棒搅拌，并观察发生的现象（玻璃棒的搅拌对粗盐的溶解起什么作用）．接着再加入粗盐，边加边用玻璃棒搅拌，一直加到粗盐不再溶解时为止．观察溶液是否浑浊． 3.2.过滤 4.按照化学实验基本操作所述方法进行过滤．仔细观察滤纸上的剩余物及滤液的颜色．滤液仍浑浊时，应该再过滤一次．如果经两次过滤滤液仍浑浊，则应检查实验装置并分析原因，例如，滤纸破损，过滤时漏斗里的液面高于滤纸边缘，仪器不干净等．找出原因后，要重新操作．
注意：一贴二低三靠 ①“一贴”是指滤纸折叠角度要与漏斗内壁口径吻合，使湿润的滤纸紧贴漏斗内壁而无气泡，因为如果有气泡会影响过滤速度． ②“二低”是指滤纸的边缘要稍低于漏斗的边缘，二是在整个过滤过程中还要始终注意到滤液的液面要低于滤纸的边缘。这样可以防止杂质未经过滤而直接流到烧杯中，这样未经过滤的液体与滤液混在一起，而使滤液浑浊，没有达到过滤的目的。 ③“三靠”一是指待过滤的液体倒入漏斗中时，盛有待过滤液体的烧杯的烧杯嘴要靠在倾斜的玻璃棒上（玻璃棒引流），防止液体飞溅和带过滤液体冲破滤纸；二是指玻璃棒下端要轻靠在三层滤纸处以防碰破滤纸（三层滤纸一边比一层滤纸那边厚，三层滤纸那边不易被弄破）；三是指漏斗的颈部要紧靠接收滤液的接受器的内壁，以防液体溅出。 3.蒸发 把得到的澄清滤液倒入蒸发皿．把蒸发皿放在铁架台的铁圈上，用酒精灯加热（图16）．同时用玻璃棒不断搅拌滤液．等到蒸发皿中出现较多量固体时，停止加热．利用蒸发皿的余热使滤液蒸干．
P u l l D o w n实验流程 1. 混合两种预测相互作用的蛋白。（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂 IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。） 2. 加入1 mL Binding Buffer。 Binding Buffer：50 mM （.） 100 mM NaCl % Triton-X 100 35 mM β-Me（巯基乙醇） 3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。 4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。 5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。 6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。 7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。 8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的 Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。 电泳样品顺序： Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B 此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。 用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下： （input，蛋白量为后两者的1/10） Marker，Protein-B-HIS ， GST+ Protein-B-HIS， Protein-A-GST+ Protein-B-HIS Marker，Protein-A-GST ， HIS+ Protein-A-GST， Protein-B-HIS+ Protein-B-GST 9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。（PVDF膜用之前，用甲醇泡2 min） 10. 做Western Blot 过程： 预杂交1 h 以上；杂交一抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min ；杂交二抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min。 11. 显影： 用1 mL 发光液A + 1 mL发光液B浸润PVDF膜，然后固定，显影液显影1 min（时间可以适当调整），水洗，定影1 min。 12. 扫描杂交胶片结果。
pull-down试验方法(自己总结) 12、GST蛋白的表达和纯化 12、1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得 种子液。（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600为0、1。（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。（5) 加入50μl100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液， 4℃5krpmx5min离心，弃上清。（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。转移至5ml离心管。（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl10mg/ml PMSF,80μl 蛋白酶抑制剂(100x)。破壁参数：Frequency:100～200w 60s，pause 20s run40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。加 100μl20%TritonX－100，冰上放置30min。（10) 将裂解液分入 1、5ml离心管中，4℃离心12krpm10min，取上清。（11)
吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮 3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表 达情况。 12、2 准备50%GST Sepharose4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose4B的slurry弹至混匀。（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。反复 5次。（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose4B备用。 12、3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl50%Glutathione Sepharose4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。（2) 3krpm离心5min，弃上清。该Sepahrose上即结合了GST融 合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可 以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）（3) 在管中加入离心后的 1、5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～ 60min。3krpm离心5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使Sepahrose上结合6～10ml 裂解液中的GST融合蛋白。（4)
安国市小营中学导学案 九年级学科化学设计人使用人使用日期 过滤浑浊天然水 实验目标： 1．了解过滤是使不溶性固体和液体分离的一种常用方法,了解过滤的适用范围和主要操作。 2.学习过滤操作步骤,分析过滤操作过程中应注意的问题,培养学生动手实验的能力。 重点：用过滤分离混合物的一般原理。 难点：过滤分离的操作方法及步骤。 实验过程： 引言：在生产生活中，人们所接触到的物质很多都是混合物，为了适应各种不同的需要，常常要把混合物里的几种物质分开，得到较纯净的物质，这叫做混合物的分离，过滤是最常用的混合物分离的方法。 讲授新课: 一、过滤 1.定义：过滤是把溶于液体的固态物质跟液体分离的一种方法。 2.原理：过滤时，液体穿过滤纸上的小孔，而固态物质留在滤纸上， 从而使固体和液体分离。 3.实验仪器:铁架台(带铁圈),烧杯,漏斗,玻璃棒. 演示实验:浑浊天然水的过滤.
4.实验装置图： 5.注意事项: 一贴：滤纸紧贴漏斗内壁; 二低：滤纸低于漏斗边缘(0.5cm)滤液低于滤纸边缘; 三靠：漏斗下端紧靠烧杯内壁;玻璃棒靠在三层滤纸处; 烧杯紧靠在玻棒上倾倒液体. 讨论: 滤液浑浊的原因?
安国市小营中学学案 达标测评 1.过滤操作的要点：“一贴”“二低”；“三靠；； 2.活学活用：如图所示。 （1）该图进行的是操作。 （2）在此操作中玻璃棒的作用是, 滤纸的边缘要液面（填“高于”或“低于”），这主要是因为。 （3）该操作用于净水，可除水中杂质，如需要进一步使水净化，则可继续进行(填“吸附”或“蒸馏”)。 （4）操作过程中，他发现过滤速度太慢，产生的原因可能是 （5）过滤后，滤液仍然浑浊，其原因有哪些？ （6）改进后过滤，得到了澄清透明的水，他兴奋地宣布：我终于制得了纯水！对此，你有无不同看法？，理由是。若要制取纯水，还需采用的净化方法是3.某化学科技小组在实验室中对一烧杯浑浊的河水进行了简单净化。请完成操作中的有关问题： （1）先向烧杯中加入适量明矾粉末，这是利用明矾溶于水后生成的胶状物对杂质的________，使杂质________来达到净水的目的。 （2）再进行过滤液体： ①过滤操作所必需的仪器：________。 A.烧杯 B.酒精灯 C.铁架台（带铁圈） D.试管 E.玻璃棒 F.漏斗 G.托盘天平 H.蒸发皿 ②玻璃棒的作用是________________________________，玻璃棒下端接触的部分是________层滤纸处。 ③若滤液仍然浑浊，你认为其原因可能是_____________ _____________。 （3）再用活性炭除去水中的异味，这是利用了活性炭的________作用。 （4）最后进行蒸馏： ①蒸馏时加入沸石的目的是________________________；加热烧瓶，注意不要使液体沸腾得太剧烈，以防________________________________________。 ②所得蒸馏水是_____（填“硬水”或“软水”），检验的简单方法是_________
分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解 GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。 GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间 新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。这两种实验的设计和实施都有所不同。
GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定A蛋白和B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如A蛋白融合GST标签，然后将GST-A和B以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，然后进行放射自显影（如果两个蛋白通过体外翻译并且S35标记的话），就可以看见GST-A和B分别对应的条带，表明GST-A和B因相互作用而被GST-A pull down，如果没有相互作用，就只有GST-A相对应的一条带。我们实验室就是这么做的，当然也有细菌表达GST-A蛋白，而B蛋白通过细胞裂解液中得到，电泳后直接western blot检测。 1、首先你的目的是“要检测这两种蛋白是否与寄主细胞之间存在相互作用”，也即是说要寻找这两种蛋白的相互作用蛋白---在寄主细胞表面，也就是说你要寻找的相互作用蛋白是膜蛋白，对吗？pulldown似乎不是达到你目的的最佳办法，因为你首先要提膜蛋白。而膜蛋白一般都疏水，量少，好像难以pulldown----缓冲液系统不适合。我想，你真正的目的是检测寄主细胞表面是否有你这两个蛋白的受体或配体，细胞ELISA应该可以胜任这个目的。其他方法你可以在查查看？ 2、如何保证你融合蛋白（细胞提取物）的尽可能大的活性，只有一条：快速、低温纯化。即，要保证你纯化过程尽量低温，时间尽量短，得到蛋白后立刻冻纯-70。当然，你还是有必要做下你蛋白活性到底丧失有多快。 3、如果你还是执意要做pulldown，最好还是直接买珠子，试剂盒太贵了，不划算。
教学设计方案1 教学重点：用过滤和结晶分离混合物的一般原理。 教学难点：利用结晶方法，分离几种可溶固体物质的混合物的原理。 教学过程： 引言：在生产生活中，人们所接触到的物质很多都是混合物，为了适应各种不同的需要，常常要把混合物里的几种物质分开，得到较纯净的物质，这叫做混合物的分离，过滤和结晶是最常用的混合物分离的方法。 （板书）第四节过滤和结晶 一、过滤 1．定义：过滤是把溶于液体的固态物质跟液体分离的一种方法。 2．原理：过滤时，液体穿过滤纸上的小孔，而固态物质留在滤纸上，从而使固体和液体分离。 3．操作方法： 例如：粗盐提纯（请学生设计实验步骤）展示粗盐，让学生看到粗盐上的沙子等不溶性固体物质，以利于学生思考。 （演示实验）粗盐提纯 归纳出： （1）步骤： ①在烧杯中溶解粗盐 ②过滤 （2）注意事项： 一贴：滤纸紧贴漏斗内壁 二低：滤纸低于漏斗边缘0.5cm 滤液低于滤纸边缘 三靠：漏斗下端紧靠烧杯内壁 玻璃棒靠在三层滤纸处
烧杯靠在玻棒上倾倒液体 （3）玻璃棒的作用 溶解——加速溶解 过滤——引流 让学生总结过滤作为分离物质的一种方法的适用范围。 过滤是用于分离不容性固体和可溶性固体的一种方法。 设问过渡：如果要分离硝酸钾和氯化钠固体能用过滤的方法吗？如果不能，想一想能用什么方法来分离它们？ 二结晶 1.定义：溶质以一定几何形状的晶体从溶液中析出的过程叫做结晶。 2.原理：几种可溶性固态物质的混合物，根据它们在同一种溶剂里的溶解度不同，用结晶的方法加以分离。 （讲述）常用的结晶方法主要有两种，对于溶解度受温度影响不大的固态溶质，一般用蒸发溶剂的方法得到晶体；对于溶解度受温度影响较大的固态溶质，一般可以用冷却的热饱和溶液的方法，使溶质结晶析出。 例如：硝酸钾中混有少量氯化钠，应怎样分离？ （演示实验）在烧杯中加入10g和NaCl混合物，注入15mL水，加热使混合物完全溶解，然后冷却，观察的析出，再进行过渡，晶体留在滤纸上，NaCl溶解在滤液中。 （讲述）我们已经知道，的溶解度受温度变化的影响较大（80℃时，的溶解度是169g，20℃时为31.6 g），因此较高温度下的饱和溶液降温时，部分从溶液里结晶析出。而NaCl的溶解度受温度变化的影响较小（80℃时，NaCl的溶解度是38.4g，20℃时为36g），降温时大部分NaCl仍溶解在溶液里。过滤时，晶体留在滤纸上，大部分NaCl仍留在滤液里（这种滤液叫做母液）。 小结： 作业：课本142页习题1、2、3 教学设计方案2 [教学方法] 实验讨论法。 [教学用具] 仪器：烧杯、漏斗、玻璃棒、试管、试管夹、铁架台、铁环、滤纸、酒精灯、药匙。
GST pull-down实验介绍 本帖引用网址：https://www.doczj.com/doc/811726786.html,/thread-30095-1-1.html GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋 白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过 SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。 GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase) GST pull down 和 Coimmunoprecipitation关系问题 啥叫GST pull down , Coimmunoprecipitation呢? 学过生物的地球人都知道. 这是研究蛋白质相互作用的两种方法. 简单通俗的打个比方, GST pull down 就像把一男一女放在孤岛上, 除非蜂马牛不相及, 同类男女之间该发生的一般都会发生. 这种关系是直接的, 西方的. Coimmunoprecipitation, (Co-IP) 则是, 众里寻他千百度, 那人却在灯火阑珊处. 研究一群男女间的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的. 两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起, 也可能不会互相吸引, 但是到了生物系统的大环境中, 在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系. 所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单. 有关Control和多方取证. 我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系. 这也是我们生理学家所关心的, 若是没有生理意义, 那还空谈什么关系. 尤其在蛋白实验里, 假阴性, 假阳性泛滥. 以为是真的东西, 实际是假的; 以为是假的东西, 实际上却是真的. 如何披沙捡金, 去伪存真? 就得靠缜密的阴性, 阳性对照组来帮助我们辨别. 要把蛋白和已知不相干的蛋白放在一起, 和已知相干的放在一起, 以此来检验实验手段是
实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离. 试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160） 实验操作程序： 材料及试剂 探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物 细胞蛋白裂解液，洗脱液： PBS及PBS+1%Triton-100 PBS (1L) NaCl：8g KCl：0.2g Na2HPO4： 1.44g KH2PO4：0.24g 加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！ PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃ （以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用） 1：原核融合蛋白A的获得 1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株 1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜 1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整）.6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N 1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀 1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分清凉 1.6：11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清，-80℃保存备用 2：真核融合蛋白B的获得 2.1：将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上，进行细胞转染xq 3：48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融 4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。 5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（PBS+Beads）作Offer。 6：同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分钟。
实验三 过滤综合实验 —— 恒压（板框）过滤实验 本实验设备由过滤板、过滤框、旋涡泵等组成，是一种小型的工业用板框过滤机。本套装置可进行设计型、研究型、综合型实验。由于设备接近工业生产状况，通过实验可培养学生的工程观念、实验研究能力、设计能力以及解决生产实际问题的能力。 一、实验任务 根据教学大纲要求和各实验小组的准备情况，从下列实验任务中选择其中1-2项实验。 1.测定恒压过滤参数K 和过滤介质参数qe 、θe ； 2．改变压力，测定滤饼压缩性指数S 和滤饼物料特性常数k ； 3.研究不同过滤压力对过滤机生产能力的影响； 4．研究在相同压力下，不同滤浆浓度对过滤机生产能力的影响。 二、实验基本原理 滤饼过滤是液体通过滤渣层（过滤介质与滤饼）的流动。无论是生产工艺还是工艺设计，过滤速率的计算都要有“过滤常数”作依据。由于滤渣厚度随着时间而增加，所以，恒压过滤速度随着时间而降低。不同物料形成的悬浮液，其过滤常数差别很大，即使是同一种物料，由于浓度不同，滤浆温度不同，其过滤常数也不尽相同，故要有可靠的实验数据作参考。 根据恒压过滤方程: ()()e e K q q θθ+=+2 (1) 式中: q ─ 单位过滤面积获得的滤液体积 [ m 3/m 2 ] e q ─ 单位过滤面积的虚拟滤液体积 [ m 3 /m 2 ] θ ─ 实际过滤时间 [ s ] e θ ─ 虚拟过滤时间 [ s ] K ─ 过滤常数 [ m 2 /s ] 将(1)式微分可得: e q K q K dq d 2 2+=θ （2） 当各数据点的时间间隔不大时， dq d θ 可以用增量之比 q ??θ 来代替，即： e q K q K q 22+=??θ （3） 上式为一直线方程。试验时，在恒压下过滤要测定的悬浮液，测出过滤时间θ及滤液累计量q 的数据，在直角坐标纸上标绘 q ??θ 对 q 的关系，所得直线斜率为 K 2，截距为 e q K 2 ，从而求出 K 和 e q 。
实验四重结晶及过滤 一．实验目的: 1.学习重结晶法提纯固态有机化合物的原理和方法; 2.掌握抽滤、热滤操作和滤纸的折叠方法；３．了解重结晶时溶剂的选择二．实验重点和难点： 1.学习重结晶法提纯固态有机化合物的原理和方法; 2．掌握抽滤、热滤操作和滤纸的折叠方法; 实验类型：基础性实验学时：4学时 三．实验装置和药品: 主要实验仪器:抽滤瓶布氏漏斗真空泵表面皿 滤纸玻棒 主要化学试剂:乙酰苯胺（粗品）活性碳 四．实验装置图:
图１. 重结晶热过滤装置图2．抽滤装置 五．实验原理： 重结晶是利用固体混合物中目标组分在某种溶剂中的溶解度不同,或在同一溶剂中不同温度时的溶解度不同,而使它们相互分离。即随温度变化有明显差异，在较高温度下溶解度大，降低温度时溶解度小,从而能实现分离提纯。 显然，如果:?①杂质B在该溶剂中的溶解度比目标物A大，则结晶次数和损失都可能减少; ②目标物A对该溶剂在较低温度下的溶解度更小些,则结晶次数和损失也可能减少； ③杂质B在混合物中的含量更少些，则结晶次数和损失也可能减少。?如果混合物中的A和B有相同的物质量和相近的溶解度时就不能用重结晶方法分离。只要二者在溶解度上有明显的差别，分离就是可能的。 固体有机物在溶剂中的溶解度一般随温度的升高而增大。把固体有机物溶解在热的溶剂中使之饱和，冷却时由于溶解度降低,有机物又重新析出晶体。——利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同,使被提纯物质从过饱和溶液中析出。让杂质全部或大部分留在溶液中，从而达到提纯的目的。 注意——重结晶只适宜杂质含量在5%以下的固体有机混合物的提纯。从反应粗产物直接重结晶是不适宜的,必须先采取其他方法初步提纯，然后再重结晶提纯。 六．实验內容及步骤： 称取２克粗乙酰苯胺于２50毫升烧杯中，加入6０毫升水（不要太多水)、加热使微沸（要垫石棉网)、若不能完全溶解，再分次加入少量水(每次10毫升左右）用玻棒搅拌,并使微沸2—３分钟,直到油状物质消失为止，若溶液有色,待其稍冷后（降低1０度左右)，加入约０．2克活性炭,重新加热至微沸并不断搅拌。 与此同时,准备过滤装置(本实验用减压抽滤）（最好热滤装置)和一扇形滤纸。将溶液趁热过滤,滤液用烧杯收集,滤毕,将烧杯放在冷水浴中冷却,使结晶完全析出。如果没有结晶析
主题：GST-pulldown 概述： GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。 其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 目的： 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理： 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
步骤： １.Glutathione琼脂糖珠预处理； ２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜； ３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上； ４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液； ５.将细胞裂解液上清加入beads； ６.加上SDS上样缓冲液； ７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。 流程图：
普洛麦格公司GST pull-down 试剂盒手册-步骤部分翻译 第一部分：TNT? T7 Quick 转录/翻译反应制备捕获蛋白技术 1.V8871共4个试剂中取3个试剂，从-70℃保存环境中拿出解冻，RQ1 DNase第一次 使用后可放置在-20℃保存。→TNT? T7 Quick Master Mix 手温溶解或在冰上溶解，其他样品室温溶解或冰上放置。 2.按下表加样，获得捕获蛋白，30℃孵育60-90min。 Components Reaction Volume（不用35S蛋氨酸）TNT? T7 Quick Master Mix 40ul Methionine，1mM 1ul Plasmid DNA template（s）0.5ug/ml 2ul Nuclease-Free Water to 50ul 第二部分：GST融合蛋白固定到Magne GST TM颗粒上的相关技术 实验组：1ml GST-融合蛋白细菌培养物 对照组：1ml GST蛋白细菌培养物→→低表达蛋白需要加大样品量 当然，Magne GST TM颗粒本身也可以作为阴性对照。 ◆细菌裂解步骤 1.从1ml左右菌液中收获细菌→加入Magne GST TM细胞裂解液之前先冻融细菌可增加某 些菌种的裂解效果，如BL 21菌种，方法可选用：-20℃冷冻15-20min或干冰冷冻5-10min。 2.室温中，在每个菌液中加入Magne GST TM细胞裂解液200ul，吹打并重悬浮菌液。 3.加入RQ1无RNA酶DNA酶2ul。（可省略）→该步骤可增加GST-融合蛋白纯度并降 低蛋白粘度，若加入5ul可明显降低粘度，但是也可以省略该步骤。 4.25℃放置在平面摇床上，缓慢振荡，孵育20-30min。 ◆Magne GST TM颗粒平衡步骤 1. 上下颠倒Magne GST TM颗粒使其重悬浮成均匀液体。 2. 取1.5mlEP管，加入已充分重悬浮的Magne GST TM颗粒20ul →在诱捕捕获蛋白时 不要让Magne GST TM颗粒放置过久，会因沉淀而降低结合效率。 3. 将Magne GST TM颗粒放在磁力架上的试管处，一般几秒钟之间会发生磁性捕获。 4. 小心倾倒EP管，弃掉上清液。 5. 将Magne GST TM颗粒从磁力架上移开，加入Magne GST TM结合/洗涤缓冲液250ul， 用移液枪吹打数次使其重悬浮，或上下颠倒数次。 6. 重复3—5步骤2次，一共需要洗涤3次。
【实验技巧】lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术 lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术 RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。 1) lncRNA筛选： 通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因； 通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。 2) lncRNA确定： 通过5' RACE获取lncRNA 5'全长，3' RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。 3) 表达分析： 细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。 组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。 表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。 4) 功能研究： 功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体:原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。 功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响； 采用RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、 ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。 采用lncRNA芯片分析技术结合mRNA对lncRNA功能进行预测，研究lncRNA trans和cis作用机制。 采用配体指数级富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，设计一种RNA配体，与癌症相关的lincRNA结合达到抑制肿瘤细胞的生长和转移。
过滤器实验报告
化学实验报告 姓名：班级： 实验名称制作过滤器日期 【实验目的】 1、学会制作过滤器，并能掌握其规范的操作方法 2、了解过滤纸的作用 【实验用具】 试管架、烧杯、、滴管、、淘米水、、过滤架台、抹布 【实验步骤】 1、搭建过滤架台，配置30ml淘米水； 2、折好并用水粘在漏斗中； 3、将烧杯中的淘米水通过引流到另一个烧杯中。 【实验现象】 漏斗中的上有米粒杂质；过滤到烧杯中的水变了。 【实验结论】 能够过滤出米粒杂质，使淘米水变。 化学实验报告 姓名：班级： 实验名称制作过滤器日期 【实验目的】 3、学会制作过滤器，并能掌握其规范的操作方法 4、了解过滤纸的作用 【实验用具】 试管架、烧杯、、滴管、、淘米水、、过滤架台、抹布 【实验步骤】 4、搭建过滤架台，配置30ml淘米水； 5、折好并用水粘在漏斗中； 6、将烧杯中的淘米水通过引流到另一个烧杯中。 【实验现象】 漏斗中的上有米粒杂质；过滤到烧杯中的水变了。 【实验结论】 能够过滤出米粒杂质，使淘米水变。
化学实验报告 姓名：班级： 实验名称制作过滤器日期 【实验目的】 1、学会制作过滤器，并能掌握其规范的操作方法 2、了解过滤纸的作用 【实验用具】 试管架、烧杯、、滴管、、水、、泥巴、过滤架台、抹布 【实验步骤】 7、搭建过滤架台，配置30ml泥巴水； 8、折好并用水粘在漏斗中； 9、将烧杯中的泥巴水通过引流到另一个烧杯中。 【实验现象】 漏斗中的上有泥巴杂质；过滤到烧杯中的水变了。 【实验结论】 能够过滤出泥巴杂质，使泥巴水变。 化学实验报告 姓名：班级： 实验名称制作过滤器日期 【实验目的】 1、学会制作过滤器，并能掌握其规范的操作方法 2、了解过滤纸的作用 【实验用具】 试管架、烧杯、、滴管、、水、、泥巴、过滤架台、抹布 【实验步骤】 1、搭建过滤架台，配置30ml泥巴水； 2、折好并用水粘在漏斗中； 3、将烧杯中的泥巴水通过引流到另一个烧杯中。 【实验现象】 漏斗中的上有泥巴杂质；过滤到烧杯中的水变了。
蛋白相互作用Pull-Down实验 实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。 用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。
实验准备： 实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、 实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液 实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KCl SDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT 裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl、1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF）） 实验方法： 方法一： 1、预清除细胞裂解液： 将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。 离心机12,000g在4℃离心2min。 将上清转移至新的离心管中。 2、探测细胞裂解液 两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。 两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在4℃翻转混合孵育2h。 最大速度在4℃离心样品2min。 在新的微量离心管中收集上清。 用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心1ml。弃去上清。 重复洗三次。 加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何