LexA酵母双杂交系统简介
一、LexA酵母双杂交系统的设计原理
报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成
1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库
2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）
3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株
4. 对照质粒：
质粒用途
pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照
pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照
pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒
5. 引物：
pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
三、酵母双杂交实验的基本流程
1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。
2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。
3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。
4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。
转化质粒选择培养基克隆生长情况说明
(含有Gal/Raf)
pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝阳性对照
pLexA SD/-His，-Ura 白阴性对照
PlexA-X SD/-His，-Ura 白没有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura 蓝具有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生长酵母细胞毒性
4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。β能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少
4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。
5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。
转化质粒 SD固体培养基 LacZ表型
对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝
对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝
＋pB42AD-T
实验 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测
＋pB42AD-文库
5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。
-半乳糖苷酶无表达。β5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但
5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。
5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。
6. 阳性克隆的筛选
6-1. 随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coli KC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。
6-2. 如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。
7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆
7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10％-20％左右的频率随机丢失。
C孵育2-3天。?7-2. 将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，30
7-3. 再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。
7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。
8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆
如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。
质粒1
(in YM4271) 质粒2
(in EGY48) LacZ表型 Leu表型
pLexA pB42AD 白不能生长
pLexA-靶DNA pB42AD 白不能生长
pLexA pB42AD-文库白不能生长
pLexA-靶DNA pB42AD-文库蓝真阳性
pLexA-Lam pB42AD-文库白不能生长
9. 阳性克隆的进一步筛选和确证
9-1. 扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。
9-2. 将上述DNA电转化E.coli KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定。
9-3. 用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。
9-4. 扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究
10-1. 用不同的双杂交系统验证
10-1-1. 将载体pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。
10-1-2. 选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。
10-1-3. 将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。
-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。β10-1-4. 去除或突变特定结合位点，定量检测
10-2. 用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。
10-3. 用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。
10-4. 进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系
构建于AD载体的cDNA文库的扩增
1. 自-80℃冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻。
2. 用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释。
lμl加入90μ3. 取稀释菌液各10 90mm)；37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr，计数平板上
单克隆菌落数。φLB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板(
4. 确定待扩增的cDNA文库滴度(cfu/ml)=克隆数×108(1:106稀释)或克隆数×1010(1:108稀释)。
5. 按照>150mm)，共100块；37℃倒置培养过夜。φ2-4×104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp 平板(
6. 在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000ml LB/Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr。
7. 留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-80℃。
8. 其余培养菌液离心8000xg×10min，4℃收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。
LB液体培养基，121℃，15lb/in2灭菌15min
A. bacto-Tryptone 10.0g
B. bacto-Yeast Extract 5.0g
C. NaCl 10.0g
D. ddH2O → 1000 ml
* LB固体培养平板为含有1.5%琼脂(Agar)LB培养基。
** LB/Amp培养基为含有Amp g/ml的LB培养基。μ50-100
构建于AD载体的cDNA文库的纯化
1. 质粒DNA提取缓冲液
名称缓冲液配方
g/ml RNaseμP1 悬浮缓冲液 50mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA；100 A
P2 裂解缓冲液 200mM NaOH；1% SDS
P3 中和缓冲液 3.0M Kac(pH5.5)
QBT 平衡缓冲液 750mM NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙醇；0.15% Triton X-100
QC 洗涤缓冲液 1.0 M NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙醇
QF 洗脱缓冲液 1.25 M NaCl；50mM Tris-HCl(pH8.5)；15%异丙醇
2. 培养菌液离心6000xg×10min，4℃，每500ml培养物(下同)的沉淀重悬于50ml P1缓冲液。
3. 加入50ml P2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵育5min。
4. 加入4℃预冷的50ml P3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min(其间再倒置混匀4-6次)。
5. 将上述混合液再倒置混匀，离心12000xg×30min，4℃，保留上清。
6. 上清再离心12000xg×15min，4℃，留上清。
7. 将上清液上样于经35ml QBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱。
8. 以100ml QC缓冲液洗涤层析柱2次。
9. 以35ml QF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA。
10. 以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。
11. 以7ml 70%乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。
12. 将沉淀的质粒DNA溶于5ml TE(pH8.0)缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5倍体
积无水乙醇；1/10体积3.0M NaAc(pH5.2)，于-20℃静置过夜。
13. 离心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤，超净台风干。
l)，保存于-20℃。μg/管(用于1次转化反应，约40μ14. 干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200
构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞
1. 将酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Difco Nitrogen 0.67g
B. 葡萄糖 2.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
D. 20×His 5.0ml
E. 20×Leu 5.0ml
F. 20×Trp 5.0ml
G. ddH2O → 100.0ml
2. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(约50ml)，30℃恒温，250rpm 振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Polypepton 6.0g
B. bacto-Yeast Extract 3.0g
C. 葡萄糖 6.0g
D. ddH2O → 300 ml
3. 室温离心5000xg×5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
4. 准备下列试剂
2×转化反应10×TE10×LiAc 50% PEG ddH2O
lμl / 120μl 15μA. 1×TE/LiAc 0.15ml 15
l /μl 960μl 120μB. PEG/LiAc 1.20ml 120
lμl / / 900μC. 1×TE 1.00ml 100
5. 分装待转化的质粒DNA，振荡混匀。
lμg) 3-5μA. pLexA-X(0.1
B. 10mg/ml lμSperm DNA*(0.1mg) 10
* 新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。μ6. 每管加入100
lμ7. 各加入600 PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
lμ8. 各加入70 DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
9. 室温离心13000xg×10sec，尽量弃上清；以0.3ml 1×TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His 固体培养板，30℃倒置培养3-5天。
SD/-Ura，-His固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
A. Difco Nitrogen 1.34g
B. 葡萄糖 4.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 20.0ml
D. 20×Leu 10.0ml
E. 20×Trp 10.0ml
F. Agar 4.00g
G. ddH2O 90-100mm)φ→ 200.0ml 铺8-10块平板(
附表1. 不同规模转化酵母感受态细胞
Small Scale* Large Scale Library Scale
转化反应 20 1 1
(1) SD液体培养基扩增酵母菌 100ml 100ml 300ml
(2) YPD液体培养基扩增酵母菌 300mla 300mla 1000mla
(3) TE或ddH2O洗涤酵母细胞 15mlc 25-50mlb 500mla
(4) 准备A. 1×TE/LiAc缓冲液 1.5mld 1.0mld 8.0mlc
B. PEG/LiAc缓冲液 12.0mlc 6.0mlc 100.0mlb
C. 1×TE缓冲液 6.0mlc 10.0mlc 10.0mlc
(5) 分装A. DNA-BD vector gd×20 / 0.2-1.0mgcμ 0.1
gd 0.1-0.5mgμg×20 10-50μB. AD vector 0.1
C. l 2.0mlμl×20 200μSperm DNA(10mg/ml) 10
1×TE/LiAc重悬感受态细胞 1.5mlc 1.0mlc 8.0mlb
l×20 1.0ml 8.0mlμ酵母感受态细胞 100
(7) PEG/LiAc缓冲液0.6ml×20 6.0ml 60.0ml
l 7.0mlμl×20 700μ DMSO 70
(9) 室温离心后弃上清13000xg×10sec2000xg×5min2000xg×5min
(10) 1×TE重悬感受态细胞0.3ml×20 6.0ml 10.0ml
150mm×50φ150mm×30φ90mm×20φ铺固体选择培养基平板
注: * 即为“构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞”
** 在不同容积的无菌离心管中进行，a: 300或500ml；b: 50ml；c: 15ml；d: 1.5ml
文库cDNA转化含有DNA-BD载体的酵母感受态细胞
1. 以生长于SD/-Ura，-His固体培养板上的含有构建于DNA-BD载体的目的DNA及报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为宿主菌，制备酵母感受态细胞。
2. 将酵母宿主菌接种于5.0ml SD/-Ura，-His液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura，-His液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。
SD/-Ura，-His液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Difco Nitrogen 0.67g
B. 葡萄糖 2.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
D. 20×Leu 5.0ml
E. 20×Trp 5.0ml
F. ddH2O → 100.0ml
3. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(约50ml)，30℃恒温，250rpm 振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Polypepton 6.0g
B. bacto-Yeast Extract 3.0g
C. 葡萄糖 6.0g
D. ddH2O → 300 ml
4. 室温离心5000xg×5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
5. 准备下列试剂
1×转化反应10×TE10×LiAc 50% PEG ddH2O
lμl / 800μl 100μA. 1×TE/LiAc 1.0ml 100
l 4.8ml /μl 600μB. PEG/LiAc 6.0ml 600
C. 1×TE 10.0ml 1.0ml / / 9.0ml
6. 取1.0ml用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入下列成份，振荡混匀。
lμg) 40μA. pB42AD-Library(50-100
B. 10mg/ml lμHerring DNA*(2.0mg) 200
* 新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
7. 加入6.0ml PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
lμ8. 加入700 DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
9. 室温离心2000xg×5min，尽量弃上清。
10. 以6.0ml 100mm，每稀释度各×2)，30℃倒置培养3-5天，确定转化效率在2×106cfu以上有效。φl稀释不同倍数，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板(μ1×TE重悬沉淀细胞，取10
150mm×30)，30℃倒置培养3-5天。φl涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板(μ11. 按每板200
SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
A. Difco Nitrogen 13.40g
B. 葡萄糖 40.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 200.0ml
D. 20×Leu 100.0ml
E. Agar 40.00g
F. ddH2O 150mm)φ→ 2000.0ml 铺30块平板(
12. 在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上各加5ml TE(pH7.0)缓冲液，将菌落刮下。
13. 离心弃上清，加入10-20ml TE缓冲液重悬沉淀菌，加入等体积的无菌65%甘油-MgSO4缓冲液，混匀，分装1.0ml/管，保存于4℃1周或-80℃1年以上。
65%甘油-MgSO4缓冲液: 65%甘油；100mM MgSO4；25mM Tris-HCl(pH8.0)
A. 甘油 65.00ml
B. MgSO4?7H2O 2.465g
C. 2.0 M Tris-HCl(pH8.0) 1.25ml
D. ddH2O → 100.00ml
酵母双杂合系统阳性克隆的筛选
1. 经过选择培养基筛选的含有DNA-BD载体、文库DNA及报告基因的酵母感受态细胞，用无菌TE稀释至1:104、1:106和1:108等不同浓度。
90mm)，30℃倒置培养3-5天，计数平板上单克隆菌落数。φl，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板(μ2. 取上述稀释菌液各100
3. 确定待进一步鉴定的酵母菌滴度(cfu/ml)=克隆数×105(1:104稀释)、克隆数×107(1:106稀释)或克隆数×109(1:108稀释)。
4. 按照以前实验确定的文库转化效率的5-10倍的总量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养板，30℃倒置培养3-5天。
5. 挑取显蓝色的菌落，再接种于SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基，以进一步确证。
SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基
A. SD/Gal/Raf 3.79g
B. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
C. Agar 2.00g
D. ddH2O → 85.0ml
灭菌(115℃，10lb/in2)15min ，冷却至50℃，加入下列成份后铺板
E. 10×BU 10.0ml
F. 20mg/ml X-gal 0.4ml 90-100mm)φ铺5-6块平板(
10×BU缓冲液，121℃，15lb/in2灭菌15min
A. Na2HPO4?12H2O 9.30g
B. NaH2PO4?2H2O 3.90g
C. ddH2O → 100.0ml
20mg/ml X-Gal
A. X-Gal 40mg
B. DMF 2ml
酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定
-酵母质粒DNA的提取
1. 挑取经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落，接种于5.0-10.0ml SD/-Trp液体培养基，30℃恒温，250rpm振荡培养20hr。
SD/-Trp液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Difco Nitrogen 0.67g
B. 葡萄糖 2.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
D. 20×His 5.0ml
E. 20×Leu 5.0ml
F. 20×Ura 5.0ml
G. ddH2O → 100.0ml
2. 室温离心5000xg×1min，弃上清，收菌。
l酵母裂解液，振荡重悬沉淀酵母菌。μ3. 加入200
酵母裂解液: 2% Triton X-100；1% SDS；100mM NaCl；10mM Tris-HCl(pH8.0)；1mM EDTA
A. 10% Triton X-100 20.0ml
B. 10% SDS 10.0ml
C. NaCl 0.58g
D. Tris 0.12g
E. EDTANa2?2H2O 0.04g
F. 1.0M HCl调pH8.0
G. ddH2O → 100.0ml
4. 加入下列试剂，充分振荡5min；液氮冻存10min，室温复融；再充分振荡5min。
A. 经酸处理的玻璃珠(Sigma) 0.20g
B. 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 0.2ml
5. 室温离心12000xg×10 min，将上清转移至新的1.5ml 离心管中，加入下列试剂，于-70℃冻存30-60 min。
A. 3 M NaAc(1/10 lμV) 20
lμB. 无水乙醇(2.5V) 500
6. 离心12500xg×10 min，4℃，弃上清；70%乙醇洗涤沉淀，于37℃烘箱或超净台干燥DNA；将干燥的沉淀DNA重溶于l无菌ddH2O中，保存于-20℃。μ20-30
酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定
-酵母质粒DNA电转化大肠杆菌
1. 在冰浴条件下，取待转化DNA l感受态细胞中，混匀。μg)，加入100μl(5pg-0.5μ1.0
ΩF，200μ2. 将上述混合液加入间距0.1cm的样品杯中，电转化(1.8kV，25。
3. 迅速加入1ml新鲜的LB培养液，混匀，转入1.5ml 离心管中，37℃恒温，150rpm振荡孵育30-60min。
4. 将上述转化反应液涂布M9/DO(-Trp)固体培养板，37℃倒置培养至单菌落出现(16-22hr)。
5. 按常规方法扩增上述阳性转化菌，碱裂解法少量抽提质粒DNA，酶切筛选AD载体上含有插入片段的阳性克隆，保存其于25%甘油，待进一步验证。
M9/DO-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. 葡萄糖 1.2g
B. Agar 6.0g
C. 5×M9缓冲液 60 ml
D. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 30 ml
E. 20×His 15 ml
F. 20×Leu 15 ml
G. 20×Ura 15 ml
H. ddH2O 165 ml
冷却至50℃左右，加入下列成份，混匀铺板
I. 1.0M Thiamine-HCl(Vit.B1) 0.3 ml
J. 100mg/ml Amp 0.3 ml 90-100mm)φ铺10-15块平板(
大肠杆菌感受态细胞的制备(电转化)
1. 挑取LB固体培养基上生长的E.coli KC8单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃恒温，250rpm振荡培养过夜(约12-14hr)。
2. 将2.5 ml新鲜菌液接种于500ml SOB培养液中，37℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.5-0.6(约2.5-3hr)。
SOB液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. bacto-Tryptone 10.00g
B. bacto-Yeast Extract 2.50g
C. NaCl 0.25g
D. KCl 0.09g
E. MgCl2?6H2O 1.02g
F. ddH2O → 500.0ml
3. 将培养菌液收集于离心管中，冰水浴15-20min。
4. 离心6000xg×10min，4℃，弃尽上清；以5ml 预冷的无菌ddH2O重悬沉淀菌；再加入500ml预冷的无菌ddH2O洗涤细菌。
5. 重复上述步骤1次，以充分去除培养基中残余的盐离子成份。
6. 用40-50ml 预冷的无菌10% 甘油重悬沉淀细菌，转移至50ml 无菌离心管中；离心6000xg×10min，4℃，弃尽上清；重复此步骤1次。
7. 以等体积(约1.5-2.0ml) 预冷的无菌10% 甘油重悬上述沉淀的感受态细胞，分装0.5ml/管
(5-6次转化反应)，保存于-80℃备用。
酵母双杂合系统阳性克隆的确证
1. 以含有报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为转化宿主菌。
2. 将酵母宿主菌接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。
SD/-Ura液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Difco Nitrogen 0.67g
B. 葡萄糖 2.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
D. 20×His 5.0ml
E. 20×Leu 5.0ml
F. 20×Trp 5.0ml
G. ddH2O → 100.0ml
3. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(约50ml)，30℃恒温，250rpm 振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Polypepton 6.0g
B. bacto-Yeast Extract 3.0g
C. 葡萄糖 6.0g
D. ddH2O → 300 ml
4. 室温离心5000xg×5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
5. 准备下列试剂
20×转化反应10×TE10×LiAc 50% PEG ddH2O
l / 1.2mlμl 150μA. 1×TE/LiAc 1.5ml 150
B. PEG/LiAc 12.0ml 1.2ml 1.2ml 9.6ml /
C. 1×TE 10.0ml 1.0ml / / 9.0ml
6. 分装待转化的质粒DNA。
A. pLexA lμg) 3-5μor pLexA-X(0.1
lμg) 3-5μB. pB42AD-Y(0.1
C. 10mg/ml Sperm lμDNA*(0.1mg) 10
* 新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。μ7. 每管加入100
lμ8. 各加入600 PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
lμ9. 各加入70 DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
10. 室温离心13000xg×10sec，尽量弃上清；以0.3ml 1×TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板，30℃倒置培养3-5天。
SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
A. Difco Nitrogen 3.35g
B. 葡萄糖 10.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 50.0ml
D. 20×Leu 25.0ml
E. Agar 10.00g
F. ddH2O → 500.0ml 90-100mm)φ铺20-25块平板(
11. 挑取上述固体培养基上生长的含有目的DNA(X)的pLexA-X(+)或空载pLexA(-)单菌落，分别接种SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养板，30℃倒置培养3-5天。
SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基
A. SD/Gal/Raf 3.79g
B. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
C. Agar 2.00g
D. ddH2O → 85.0ml
灭菌(115℃，10lb/in2)15min ，冷却至50℃，加入下列成份后铺板
E. 10×BU 10.0ml
F. 20mg/ml X-gal 0.4ml 90-100mm)φ铺5-6块平板(
12. 选择含有pLexA-X显蓝色，而相应的不含有插入DNA的空载pLexA显白色的克隆，扩增其在E.coli KC8中的甘油菌，按常规抽提质粒DNA，进行序列分析。
10×DO(-His，-Trp，-Leu，-Ura)
为不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。
每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。
(1) L-Isoleucine L-异亮氨酸 300mg
(2) L-Valine L-缬氨酸 1500mg
(3) Adenine 腺嘌呤 200mg
(4) L-Arginine HCl L-精氨酸 200mg
(5) L-Lysine HCl L-赖氨酸盐酸盐 300mg
L-Methionine L-甲硫氨酸 200mg
(7) L-Phenylalanine L-苯丙氨酸 500mg
L-Threonine L-苏氨酸 2000mg
(9) L-Tyrosine L-酪氨酸 300mg
20×氨基酸储存液
每100ml溶液中分别含有下列成份，配制后保存于4℃。
20×His L-Histidine L-组氨酸 40mg
20×Trp L-Tryptophan L-色氨酸 40mg
20×Leu L-Leucine L-白氨酸 200mg
20×Ura Uracil 尿嘧啶 40mg
酵母转化缓冲液:
缓冲液体积缓冲液配制
10×TE 100ml Tris 1.21g；EDTANa2?2H2O 0.37g；ddH2O 80ml；盐酸调pH7.5；ddH2O定容
10×LiAc 100ml LiAc?2H2O 10.20g；ddH2O 50ml，冰醋酸调pH7.5；ddH2O定容
50% PEG 100ml PEG3350 50.0g；ddH2O定容
其它缓冲液:
缓冲液体积缓冲液配制
TE 1000ml Tris 1.21g；EDTANa2?2H2O 0.37g；ddH2O 800ml；盐酸调pH；ddH2O定容STE 1000ml NaCl 5.84g；Tris 1.21g；EDTANa2?2H2O 0.37g；ddH2O 800ml；盐酸调pH8.0；ddH2O定容
2.1.1酵母双杂交 2.1.1.1Gateway入门克隆 设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。 通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下： att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μL pDONR221 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL 将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。 进行BP反应时，需注意以下几项： (1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P 入门载体； (2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可 以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对 于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的； (3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物 最好不要超过250ng。 2.1.1.2诱饵载体构建 重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下： 入门载体(50-150 ng)1-7μL pDEST32 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。 （3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。 （4）95 ?C保温30 s，去除二级结构。 （5）72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C保温2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 （7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。 （9）在连接反应管中加入如下成分： pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μL annealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μL BSA（10 mg/mL）0.5 μL Nuclease-free H2O 10.5 μL T4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL 总体积15 μL 注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。 （10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
4月4日划线配培养基TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25mlYPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始8号8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5mlEP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O8.8ml
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始 8号 8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物
LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株 4. 对照质粒： 质粒用途 pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照 pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照 pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒 5. 引物： pLexA测序引物及pB42AD测序引物。 三、酵母双杂交实验的基本流程 1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。 2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。 3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。 4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。 转化质粒选择培养基克隆生长情况说明
酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料: PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187 pGBKT7 DNA-BD Vector (bait) pGADT7 AD Vector (prey) pGBKT7-53 Control Vector pGBKT7-Lam Control Vector pGADT7-T Control Vector pCL1 Control Vector 3' DNA-BD & AD Sequencing Primers Herring testes carrier DNA Yeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a- gal( Yeast Phenotypes –––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the –or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients. Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow. +His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.
酵母单杂分析 酵母单杂交技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的情况。 【实验目的】 了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。 【实验原理】 酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示，将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）上游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报告基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。
“Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System”提供了一个简单高效的构建cDNA文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用aureobasidin A 抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单杂交筛选是从酵母双杂交筛选发展而来，利用单杂交筛选可以对cDNA文库进行筛选直接获得与目的顺式作用元件相结合的蛋白质。 图2 用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选protein-DNA相互作用的原理 The Matchmaker Gold One-Hybrid Library Screening process主要包括以下步骤： 1 将已知序列（bait）克隆到pAbAi载体。 2 pBait-AbAi质粒转化Y1HGold酵母菌株，使其与酵母基因组发生重组，生成bait/reporter酵母菌株。 3 检测Y1HGold bait菌株AbAi r基因的本底表达水平。 4 合成cDNA并通过cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母进行细胞内同源重组筛选cDNA文库。 5 筛选结果的验证和分析。 【实验准备】 1 仪器设备 微量取液器（2.5 μL；20 μL；50 μL；100 μL；200 μL；1000 μL）、PCR仪、低温离心机、台式离心机、CHROMA SPIN TM+TE-400纯化柱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、酒精浴、无菌接种环、10 cm培养皿、15 cm培养皿等。
酵母双杂交系统的发展和应用 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY 载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。 基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
第一链cDNA合成 1.准备: 高质量的Poly A 或总RNA 2. 在微量离心管中混匀以下试剂： 1–2 μl RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA) 1.0 μl CDS III 或CDSIII/6 引物 1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl) 4.0 μl 总体积 注意: 对照实验时，请使用1μl *1μg+ 的对照RNA。CDSIII = Oligo-dT； 引物CDSIII/6 =随机引物 3. 72°C ，孵育2 min。 4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。 5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的 RNA样本中，轻拍混匀。 2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液 1.0 μl DTT (100 mM) 1.0 μl dNTP 混合物(10 mM ) 1.0 μl SMART MMLV 反转录酶 6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT (CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10 min。 7. 42°，孵育10 min。 注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。若用非热盖的PCR仪或水浴，请 在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。 8. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 hr。 9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。 10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。 11. 37°，孵育20 min。 12. 继续进行LD-PCR 扩增(Section VII.B)。 注意: –20°C下可保存3个月。 第一链反应最终体积为15μl ? 10 μl SMART III Oligo (10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG CCATTATGGCCGGG-3’) ? 10 μl CDS III 引物 (10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30VN-3’)*23个碱基 ? 10 μl CDS III/6 引物 (10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-NNNNNN-3’) 注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C ? 50 μl 5’ PCR 引物 (10 μM; 5’-TTCCACCC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25个碱基 ?50 μl 3’ PCR 引物 (10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCC TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)