蛋白质工程及其应用示例
摘要：在论述蛋白质工程的基本概念和由来的基础之上, 介绍了蛋白质工程的主要内容，并着重阐述了蛋白质工程在工业用酶、食品行业和生物制药三个方面中的应用和前景。
关键词：蛋白质工程；简介；发展与应用；
1.蛋白质工程的概念和由来
蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础的学科，其主要通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。
蛋白质工程最早始于1975年美国C. A. Hutehison使用了J. Lederberg 1960年推荐的寡脱氧核糖核普酸作为体外诱变剂，经他重新确定此诱变剂的顺序，成功地实现了定位突变试验，培育出了具有各类生物学特性的突变株[1]。而蛋白质工程的命名是1981年由美国的K.Ulemer确定的[2]。继后，许多大学及著名的实验室以及经营生物工程高技术产业的公司大量投资竞相研究与开发。
2.蛋白质工程的基本途径
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸（基因）
3.蛋白质工程的基本原理
基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的基因更换宿主得以异体表达，从而创造生物新类型，但这只能合成自然界固有的蛋白质。蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新的蛋白质分子。
4.蛋白质工程的研究内容
4.1 蛋白质结构分析 --- 基础
蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有的生物功能的必需手段。晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展，但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质(几毫克~几十毫克)，制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析。对子哪些很微量的蛋白质来说，是比较困难的。另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。核磁共振技术可以分析液态下的。肤链结构，这种方法绕过了结晶、X一射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。
现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。从某种意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力与研究意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力与研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发具有高度专一性的药用蛋白质。
4.2 蛋白质结构、功能的设计和预测 --- 基础的应用与验证
根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肤链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在的两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。目前，正加紧这方面的工作。虽然尚在起步阶段，但在可预见的将来，建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。
4.3 蛋白质的创造和改造 --- 最终目标
蛋白质的改造，从简单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方法。物理、化学法: 对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质链官能团，分割肤链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法: 使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖昔酶、酚酶、酸酶等去除或连接不同化学基团，
利用转酞胺酶使蛋白质发生胶连等等。以上方法只能对相同或相似的基团或化学键发生作用. 缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用。采用基因重组技术或人工合成D N A，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肚键连接而成的肤构成的。氨基酸序列就是蛋白质的一级结构，它决定着蛋白质的空间结构和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白质的基因的DNA序列决定的，改变DNA序列就可以改变蛋白质的氨基酸序列，实现蛋白质的可调控生物合成。在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标D N A 明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究。
4.3.1 定位突变
蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的一个或两个就可以改变氨基酸。通常是改变某个位置的氨基酸，研究蛋白质结构、稳定性和催化特性。噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后，通过复制以双链形式存在。将待研究的基因插入载体M 13，制得单链模板，人工合成一段寡核昔酸(其中含一个或几个非配对碱基)作为引物，合成相应的互补链，用连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子的胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。
4.3.2 盒式突变
1 98 5 年wels提出的一种基因修饰技术—盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链D N
A 片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因[3]。
4.3.3 PCR技术
DNA聚合酶链式反应是应用最广泛的基因扩增技术。以研究基因为模板，用人工合成的寡核昔酸(含有一个或几个非互补的碱基)为引物，直接进行基因扩
增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效[4]。
4.3.4 高突变率技术
从大量的野生型背景中筛选出突变型是一项耗时、费力的工作。有两种新的突变方法具有较高的突变率，(1)硫代负链法: 核昔酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物( a -( S )-d c T P ) 对某些内切酶有耐性，在有引物和( a -(S )-d c T P ) 存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核昔酸外切酶l 从3`~ 5` 扩大缺口并超过负链上错配的核昔酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因；(2)UMP正链法: 大肠肝菌突变株RZ10 32中缺少脉嗜咤糖昔酸和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脉嗜咤( U )替代胸腺嗜咤( T )掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠肝菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制[3]。
4.3.5 蛋白质融合
将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起。经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性。现在研究的较多的所谓“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等，就是采用的这种方法。
5.蛋白质工程的应用示例
5.1在工业用酶中的应用
5.1.1脂肪酶
脂肪酶能催化酯的水解和合成，广泛用于洗涤剂的生产，油脂工业，有机合成，皮革及造纸工业。Beer等人[5]根据酶的X-射线结构建立一模型，并通过定点突变搞清楚了Rhizopus oryzea脂肪酶的催化机制。Okkels等人[6]通过定点突变使Candida Antarctica A脂肪酶的比活力提高了4倍。Yamaguchi等人[7]将Cys 二硫键引入Humicola lanuginsa 脂肪酶中，突变体的热稳定性提高了12℃，酶的最适温度提高了10℃。Patka 等人[8]发现Candida Antarctica B 脂肪酶的M72L突变体抗过氧辛酸氧化作用能力比野生型强。Kampen 等人[9]研究了Staphylococcus
hyicus脂肪酶的突变体对底物专一性的影响，发现把356位的Ser用Val来替换，其磷脂酶活性降低了12倍。Egmond 等人[10]研究了Fusarium solani pisi 角质酶对阴离子的亲和性。发现过N172K突变，酶表面带有更多的正电荷，同野生型角质酶相比，突变体稳定性更差。在17和196位引入负电荷残基，则酶对阴离子表面剂活性剂十二烷基磺酸锂的稳定性提高。Pseudomonas glumae脂肪酶的154和150位的氨基酸残基用Pro替代，在P1位引入Arg 残基，酶的抗蛋白稳定性得到了提高。
5.1.2纤维素酶
纤维素酶现在已广泛地应用于医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域，其应用前景十分广阔。大多数工业用的纤维素酶都是葡萄糖苷内切酶，含有一个催化区和一个纤维素连接区。没有纤维素连接区则酶对于纤维素的活性很低。现在研究的重点是了解酶的吸附和活性之间的关系。有人对纤维素酶和蛋白酶进行了对照研究，发现纤维素酶的活性与吸附的强弱关系更大[11]。Koivula 等人[12]对Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶催化区域169 位的氨基酸残基Try 进行了研究，发现其能协助葡萄糖环转换成更容易反应的构形。Hakamada 等人[13]用定点突变的方法将细菌碱性纤维素酶的Glu137、Asn179和Asp194 突变为Lys，其热稳定性得到了提高。Zhang 等人[14]专门研究了T.fusca 纤维素酶Ce16A表面残基对底物专一性的影响，发觉突变体R237A 对羧甲基纤维素的活力提高了。后来他[15]又研究了靠近活性位点残基对催化活性、底物专一性、配基连接亲和性的影响，4个残基（His159、Arg237、Lys259、Glu263）的7个突变体对羧甲基纤维素的活性都有所提高，其中K259H 突变体的活性提高的最为显著。
5.1.3淀粉酶
淀粉酶的使用范围极广，种类繁多，根据不同的需要可以选择不同种类的酶。α-淀粉酶主要用来生产麦芽糖糊精，葡萄糖淀粉酶催化糊精可得到葡萄糖，用β-淀粉酶可以得到麦芽糖，用葡萄糖异构酶可以将葡萄糖转化为果糖。而一般的淀粉酶催化都是在高温条件下进行的。应用蛋白质工程可提高酶的热稳定性。有人得到B. Licheniformmis α-淀粉酶的双突变体A209V/H133T，酶在90℃的
半衰期延长了9 倍。Mitchinson等人用定点突变和高通量筛选的方法得到了一个突变体，其最适pH 值提高了0.5～1.0。Gloria等人[16]用Phe 或Tyr来替换B.stearothermophilus α-淀粉酶289 位的Ala，其具有了催化醇化反应的能力。Sierks 等人[17]报道了通过改变葡萄糖淀粉酶活性位点的三个氨基酸残基，其作用于1，4-糖苷键相对于1，6-糖苷键的K cat/Km 比值提高了300倍。
5.2在食品工业中的应用
5.2.1葡萄糖异构酶的蛋白质工程
1992年，Mrabet等人构建了密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶的突变酶K253R，其酶活是野生型的120％，在60.lmol／L葡萄糖底物存在下。它的热失活半衰期比野生型酶提高了5倍[18]。T Jibeurgh等人构建的密苏里游动放线菌葡萄糖异杓酶的突变酶E185Q明显改变了酶的最适PH值，而且，与野生酶在Mn2+作用时的活性相比。E185Q要高出两倍[19]。另外，美国Amgen公司曾对大脑杆菌葡萄糖异构酶进行了盒式突变，筛选到两个活性大于野生型的突变酶[20]。
葡萄糖异构酶的蛋白质工程是国家“863”计划资助项目，中国科学技术大学生命科学学院在这方面做了大量的研究工作，构建了多种性能改善的突变酶[21-25]，如朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Glyl38)为目标氨基酸后，用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行体外定点诱变，以脯氨酸(Pr01 38)替代Glyl38，含突变体的重组质粒在太肠杆菌中表达，结果突变型葡萄糖异构酶比野生型的热失活半衰期延长一倍；最适反应温度提高10～12℃；酶比活相同[26]。
5.2.2细菌素的蛋白质工程[27-32]
细菌素是很有潜力的天然食品防腐剂，而细菌素生化和分子水平上的深入研究为细菌素蛋白质工程开辟了新前景。研究表明，即使在三维构象未知的情况下，某些小分子蛋白(如Lantibiotics)或疏水肽的蛋白质工程也是可行的。由于它们的氨基酸残基数目较少，使得定点突变和随机突变简单易行，对其进行一、二级结构水平上的预测及相关小肽的比较分析亦可获得许多重要的结构信息，有望建立特异性突变方法创造出“嵌台”细菌素。另外，因其分子量较小，适合于肚二维核磁共振技术研究其二级、三级空间结构及在不同溶剂中的溶液构象。
应用蛋自质工程改造细菌素通常有两类方法，一类是着眼于对细菌素结构与
功能关系的深人理解，旨在创造出新的细菌素；另一类是改进现有的细菌素特性以适合于工业生产与应用。未来的细菌素蛋白质工程将主要从以下几方面着手：提高细菌素产量；改进细菌素溶解性能及在靶位系中的扩散性；提高细菌素的稳定性；拓宽细菌素的抑菌谱；提高细菌素抑菌比活力及研究细菌素的免疫等。在确定出要改造的氨基酸残基后，还需有合适的系统使突变的细菌素高效表达。
5.3在生物制药中的应用
目前蛋白质工程通过在分子水平上进行设计以及DNA重组对自然界的蛋白质进行突变重新合成，在生物药物的开发中应用非常广泛[33]。蛋白质工程技术对药物合成做针对性的改造能够对药物的稳定性、活性、生物利用度以及半衰期做进一步的优化。在生物药物的研究开发领域中具有重要的应用价值[34]。现主要对定点突变工程技术和体外定向转化技术在药物开发中的应用情况做相应的综述。
5.3.1定点突变工程技术
定点突变是根据生物医药的结构和功能进行针对性的改造，包括活性基团、DNA序列以及特定的核苷酸片段，做特定的插入或者删除，从而改变生物大分子的氨基酸序列，对药物的性状进行改变，在生物药物的编码序列以及一级结构中起着很好的修饰作用[35]。其与自然因素、化学因素诱导的突变相比特异性更强，同时可重复性强。通过改变相应的核苷酸序列对生物医药的功能和性质起作用，进而得到具有高活性的改良生物药物。
纳豆激酶是一种由纳豆枯草杆菌生产的具有溶解纤维蛋白活性的酶，在心血管药物的开发中具有较高的价值。纳豆激酶在实际应用中其稳定性较差，并且极为容易被氧化，对其进行定点突变，在序列中引入丝氨酸和丙氨酸，并改变其相应的催化残基以及附近的苏氨酸位点，成功让其在大肠杆菌中高表达，并且抗氧化测试显示抗氧化能力明显增强[36]。另外还可通过催化抗体从而对免疫球蛋白的活性进行调节，结合相应的突变技术将其催化酶活性进行提高，从而促进相应的酶解反应。采用PCR法进行定点突变也可改变核苷酸序列，结合包涵体对蛋白进行特异性的变性和复性处理能够纯化蛋白质的同时提高其生物活性[37]。
5.3.2体外定向进化技术
定点突变技术主要针对天然蛋白的少数位点突变，蛋白质的高级结构没有显著变化，同时蛋白质的功能只是部分发生变化。但是对蛋白质的结构和功能做少部分改变并不能满足人们对蛋白质功能的认知。因此在蛋白质的结构和功能改造中进行体外分子定向转化有很好的应用价值[38]。蛋白质工程技术中体外定向转化也称作分子进化，通过体外的PCR、DNA技术对蛋白质工程涉及药物进行高通量筛选后对活性较高的药物进行筛选，从而得到自然界没有的品质优良的药物。其与定点突变不同的是在药物结构和功能方面不需要已知信息，因此也称作非理性设计。
对于容易错误的PCR进行体外扩增时结合适当条件，使得碱基出现误配等突变，是一种简单、快速的随机突变，因此需要结合其他技术进行筛选。通常在一轮定向筛选和选择后很难得到满意结果，因此需要对连续突变进行筛选。一次次在错误中筛选出相应的有益突变基因，从而在随机诱变中得到有益累积突变[39]。例如1，3-丙二醇在医药领域中可作为聚酯、聚醚以及聚氨酯的合成单体，在合成过程中相比于采用1，3-丙二醇氧化还原酶，同工酶的活性更高，同工酶是通过突变筛选得到的突变体氧化还原酶，其在很多其他醛类的反应中也有较强的催化活性。另外结合抗原决定簇的化学基团以及环氧化物中间体等对药物的结构进行调节能够提升其生物活性。
DNA改组是对一些同源但有部分差异的基因序列打碎呈小片段后进行随机重组，在此过程中利用重叠碱基进行随机配对后形成重组全长核酸序列，并且结合自然界的模拟对DNA进行重组筛选。DNA重组技术在酶和蛋白药物的改良和优化中运用较为广泛，其对酶的活性、稳定性以及特异性都有很好的筛选[40]。例如丙酮酸的工业和医药运用中采用乳酸氧化酶对D，L-乳酸进行氧化制得。为提高其热稳定性对乳酸氧化酶基因进行改组，得到其突变体，其半衰期和热稳定性都得到很大的提高。
6.结语
蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就, 它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代, 为蛋白质和酶在工业、农业, 特别是在医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符
合人类需要的蛋白质的新时期。
蛋白质本身的多样性为其多种应用创造了条件, 而随着蛋白质工程的发展, 在不久的将来又会有一大批人工创造的新蛋白质家族出现。总之, 蛋白质工程对于探索者确是一块沃土, 在付出必要的劳动之后, 一定会结出丰硕的果。
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蛋白质工程的现状发展及展望 摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化 20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脱氢酶变成9- 18 : 0- ACP脱氢酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacillus stear other mophilus分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] 2.非理性进化 非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于
例1将某工程项目划分为A、B、C、D四个施工过程， 各施工过程的流水节拍均为4天，其中，施工过程A与B之间有 2天平行搭接时间，C与D之间有2天技术间歇时间，试组织流 水施工并绘制流水施工水平指示图表。 [ 解] 由已知条件：t1 = t 2 = t3 = t 4 = t = 4天，本工程宜组织全等节拍流水施工。 （1）取施工段：m = n = 4段 （2）确定流水步距K = t = 4天 （3）计算工期：T = （m + n －1）K + ∑ Z －∑C= （4 + 4 －1）×4 + 2 －2 = 28 （天）（4）绘制流水施工水平指示图表，见图所示 例2某地基基础工程由四个分项工程，划分成4个施工段，流水节拍均为1天，基础施工后需间歇2天才能回填, 试组织全等节拍流水。 （1）确定流水步距k：由等节拍专业流水的特点知：k = t = 1 （2）计算工期T： T＝（m + n－1）k＋∑Zj,j+1 ＋∑Gj,j+1 －∑Cj,j+1 ＝（4＋4－1）×1＋ 2＋0 －0＝9（d） （3）绘制进度计划表
例3某混合结构房屋有三个主要施工过程，其流水节拍为：砌墙4d；构造柱及圈梁施工6d；安板及板 缝处理2d。试组织流水作业。 （1）计算流水步距k：k＝各施工过程节拍的最大公约数。 k =2d 。 （2）计算各施工过程需配备的队组数bj ：bj = tj / k b砌＝4 / 2 = 2 （个队组）b混＝6 / 2＝3 （个队组）；b安＝2 / 2 ＝1（个队组） （3）确定每层施工段数m： 1）不分施工层时：m = ∑bj =N ； 2）分施工层时：m = ∑bj + Z2/k + ∑Z1/k ； 【例2】中，不分施工层，m = ∑bj＝2+3+1=6（段） （4）计算工期T： T＝（m j +∑bj－1）k＋∑Z1－∑Cj,j+1 【例2】中，T =（2×6＋6－1）×2＋0－0＝34 （d） （5）绘制进度表：（例见前表） 例4某两层楼房的主体工程由A、B、C三个施工过程组成。它在平面上设有两道伸缩缝（伸缩缝将该建 筑在平面上划分为3等分）。 各施工过程在各个施工段上的流水节拍依次为：4天、2天、2天。 施工过程B、C之间至少应有2天技术间隙。 试划分施工段，编制工期最短的流水施工方案，并绘制流水施工水平指示图表 解： 1）取K=2天 2)b1 = 2组,b2= 1组,b3 = 1组 3)N =∑bi=2+1+1= 4组 4)施工段Mmin = N+ZB,C/K = 4+ 2 / 2 = 5段 取M=6段(在平面上设有两道伸缩缝) 5）工期: T=（m×j + N—1）K + ZB,C =（6×2 + 4—1）×2 + 2 = 32天 6）绘图
1.蛋白质分子的构型与构象 构型：是分子中原子的特定空间排布。当构型相互转变时，必须有共价键的断裂和重新形成。基本构型有L-型和D型两种。这种构型无法通过单键的旋转相互转换。 构象:是组成分子的原子或基团围绕单键旋转而成的不同空间排布，构象的转换不要求有共价键的断裂和重新形成,在化学上难以区分和分离。 2.内核假设原理所谓内核是指蛋白质在大自然的进化中形成的保守内部区域。这样的区域一般由氢键连接而成的二级结构单元组成。内核假设原理就是所有蛋白质的折叠形式主要决定于其内核中残基的相互作用和组织形式。遵循这样的内核原理意味着蛋白质工程无法创造出超越天然蛋白质所具有二级结构的新蛋白质二级结构。 3. van't Hoff焓平衡常数与焓/熵的关系式为：－RT lnK = △H - T△S。取对数可以变为： lnK = －△H/RT + △S/R。进一步推导可以变为：d（lnK）/d（1/T）= －△H/R。基于此，以lnK对1/T可以得到一条曲线。在这条曲线上任何一点的斜率就是△H/R，其中的△H称为van't Hoff焓。通过解析van't Hoff焓随温度变化的曲线特点，可以用于测定蛋白质体系构象平衡的转变，主要是两态转变模型的分析。也就是通过这样的曲线分析，可以预测蛋白质天然构象退在折叠时的容易程度。 4. 盒式突变法也称为片断取代法（DNA fragment replacement）。这一方法的要点是利用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点，用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取代目标基因上的一段DNA序列。 5、熔球态在折叠途径中第一个可以观测到的中间体是柔性无序的为折叠多肽链卷折成局部有组织的球状体，称为熔球体melton globule。熔球体具有天然态的大多数二级结构，但不如天然结构致密，蛋白质内部的密堆积相互作用尚未形成，环肽区和表面结构多数处于未折叠状态，侧链可以活动。非折叠态卷折成熔球体包含了蛋白质折叠的主要奥秘—疏水侧链的包埋。 6. 反向折叠设计在蛋白质工程中，全新蛋白质设计是以弥补天然蛋白质结构和功能在应用方面的不足为目的，根据人类所希望的结构和功能，采取工程手段，来人工设计新的氨基酸序列，这样的设计研究称为反向折叠研究。在全新蛋白质设计的反向折叠研究中，需要采取的基本策略是通过设计新的氨基酸序列,来加强或者减弱蛋白质的某些相互作用力，使设计的序列能最终具有所希望的结构和功能。 7. 功能基团的特异性修饰 蛋白质中，不仅末端氨基酸具有氨基和羧基，很多链中氨基酸侧链也具有羟基、巯基、氨基和羧基等能进行特征性化学反应的功能基团。利用这些功能基团的化学反应性可以进行蛋白质功能基团的特异性修饰。 8. 基因突变技术 在基因水平上设计并使某特定基因发生变异，对该基因所编码的蛋白质进行改造，在突变基因表达后、用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 9. 融合蛋白质 重组DNA技术允许在体外产生不同基因和基因片段之间的融合，并且通过基因融合产生的蛋白质叫做融合蛋白质。
蛋白质工程及其应用研究进展 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功
流水施工习题 一、单项选择题 1、在时间坐标中用横的线段表示各施工过程的开始、结束及延续时间，同时反映各施工过程相互关系的指示图表称为（B）。 A斜道图B横道图C网络图D施工平面图 2、组织施工几种方式中，施工工期最短，一次性投入的资源量最集中的方式是（B）。 A流水施工B平行施工C依次施工D搭接施工 3、采用（A）组织方式，施工现场的组织管理简单，日资源用量少，工期长。 A依次施工B平行施工C流水施工D搭接施工 4、建设工程组织流水施工时，其特点之一是（ C ）。 A. 同一时间段只能有一个专业队投入流水施工 B. 由一个专业队在各施工段上依次施工 C. 各专业队按施工顺序应连续、均衡地组织施工 D. 施工现场的组织管理简单，工期最短 5、"（C）数值大小，可以反映流水速度快慢、资源供应量大小。 A. 流水步距 B. 组织间歇 C. 流水节拍 D. 平行搭接时间 6、下列流水参数中属于空间参数的是（D）。
A流水节拍B流水步距C施工过程数D流水段数 7、在组织流水施工时，用以表达流水施工在施工工艺上开展顺序及其特征的参数，称为( A)。 A工艺参数B空间参数C时间参数D组织参数 & (A) —般指的是在组织拟建工程流水施工时，其整个建造过程可分解 的几个施工步骤。 A工艺参数B空间参数C时间参数D组织参数 9、确定某一施工过程所需安排的施工班组人数时，考虑“最小工作面”是为了( D)。 A 确定最低限度人数 B 确定最高限度人数 C 确定最可能人数 D 确定最合理 人数 10、"相邻两个施工班组投入施工的时间间隔称为( B)。 A流水节拍B流水步距C施工过程数D流水段数 11、"( A)是指从事某个专业的施工班组在某一施工段上完成任务所需的时间。 A流水节拍B流水步距C施工过程数D流水段数 12、"当各施工过程的持续时间保持不变时，则增加施工段数，工期将 ( B)。 A 不变 B 变长 C 缩短 D 无法确定 13、"同一施工过程的流水节拍相等，不同施工过程的流水节拍不尽相等，但它们之间有整数倍关系，则一般可采用的流水组织方式为( A)。 A有节奏流水B等节奏流水C无节奏流水D非节奏流水 1
《蛋白质工程》课程教学大纲 赵艮贵 课程名称：蛋白质工程 课程类型: 专业基础课 总学时：讲课学时：36 学分：2 适用对象: 生物技术专业 先修课程：生物化学，细胞生物学，分子生物学，基因工程 一、课程性质、目的和任务 蛋白质工程是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，也与基因组学、蛋白质组学、生物信息学等的发展密切相关，是融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。由于蛋白质工程学科的边缘性，所以本课程在介绍蛋白质基本内容的同时，兼顾学科发展动向，旨在使学生了解现代蛋白质工程理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。 二、教学基本要求 通过本课程的学习，使学生掌握蛋白质工程的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在蛋白质工程上的应用及典型研究实例，熟悉从事蛋白质工程的重要方法和途径。努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，为未来的学习和工作奠定坚实的理论和实践基础。
重点内容包括蛋白质分子基础、分子设计、折叠、理化性质、结构解析与预测以及蛋白组学、生物信息学在蛋白质工程中的应用、蛋白质的分离纯化鉴定技术和现代生物技术在蛋白质工程中的应用。难点蛋白的分子设计和结构解析。 五、实践环节 独立开课六、参考性教学时间安排 4 蛋白质分子设计 4 蛋白质的修饰和表达2 蛋白质的物理化学性质3 蛋白质结构解析 3 生物信息学在蛋白质工程中的应用 4 蛋白质的分离纯化与鉴定4 现代生物学技术在蛋白质工程中的应用4 蛋白质组学 蛋白质工程的应用3 七、考核方式 期末笔试 八、推荐教材和教学参考书 教材： 《蛋白质工程》（第二版），汪世华主编，科学出版社，2008. 普通高等教育十一五规划教材
《蛋白质工程的应用》教案 教学目标 1、举例说出蛋白质工程崛起的缘由。 2、简述蛋白质工程的原理。 3、尝试运用逆向思维分析和解决问题。 教学重难点 (1)为什么要开展蛋白质工程的研究？ (2)蛋白质工程的原理。 课时数 本节教学建议用1课时。 教学过程 (1)采用“问题—探究—新问题—再探究”的教学模式。 本节内容是基因工程的延伸和发展。由于蛋白质工程刚刚起步，学习内容较少。如何学得充实，又让学生悟出些终身学习的道理，建议采用“问题—探究—新问题—再探究”的教学模式。 新课一开始，可以带领学生回忆原有知识：要想让一种生物的性状在另一种生物中表达，在种内可以用常规杂交育种的办法实现，但要使有生殖隔离的种间生物实现基因交流，就显得力不从心了。基因工程的诞生，为克服这一远缘杂交的障碍问题，带来了新的希望。于是取得了丰硕成果：大肠杆菌为人类生产出了胰岛素，牛的乳腺生物反应器为人类制造出了蛋白质类药物，烟草植物体内含有了某种药物蛋白……至此，人们也只是实现了世界上现有基因在转基因生物中的表达。但一个新问题出现了，生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中形成的，它的结构、性能不能完全满足人类生产和生活的需要。为了加深这一点的认识，可调动学生从书中找实例(干扰素例子、工业用酶的例子)加以佐证。于是要对现有蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们又开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。 (2)建议加强与已有知识的联系，用逆向思维的方法解决新问题。 学生在必修课中已学习过中心法则及蛋白质具有复杂的空间结构等知识。中心法则告诉我们遗传信息的流动方向如图1-4所示。 遗传信息的流动方向
第2章建筑工程流水施工试题答案 一、填空 1.建筑工程施工中常用的组织方式有三种：顺序施工、平行施工和流水施工。 2.流水施工的表示方法有三种：水平图表(横道图)、垂直图表(斜线图)和网络图。 3.根据组织流水施工的工程对象范围的大小，流水施工可以划分为分项工程流水施工、分部工程流水施工、单位工程流水施工、群体工程流水施工和分别流水。 4.流水施工的基本参数包括工艺参数、时间参数和空间参数。 5.工艺参数包括流水过程(数)和流水强度。 6.时间参数包括流水节拍、流水步距、间歇时间、搭接时间、流水工期。 $ 7.空间参数包括工作面(大小)、施工段(数)和施工层(数)。 8.根据流水施工的节奏特征，流水施工可划分为有节奏流水施工和无节奏流水施工。 9.有节奏流水施工又可分为等节拍流水施工、异节拍流水施工和成倍节拍流水施工。 10.流水施工的分类是组织流水施工的基础，其分类方法是按不同的流水特征来划分。 11.分部工程流水施工是组织流水施工的基本方法。 12.分别流水法是组织单位工程或群体工程流水施工的重要方法。 13.分项工程流水是组织流水施工的基本单元。 14.根据工艺性质不同，可以把施工过程分为制备类、运输类和砌筑安装类三类施工过程。! 15.砌筑安装类施工过程按其在工程项目生产中的作用划分，有主导施工过程和穿插施工过 程两类。 16.砌筑安装类施工过程按其工艺性质划分，有连续施工过程和间断施工过程。 17.砌筑安装类施工过程按其施工复杂程度划分，有简单施工过程和复杂施工过程。 18.流水强度分为机械施工流水强度和手工作业流水强度。 19.为了避免施工队转移时浪费工时，流水节拍在数值上最好为半个班的整数倍。 20.异节奏流水施工又可分为成倍节拍流水施工和不等节拍流水施工。 21.有层间关系的工程中组织流水施工时，施工段数（m）和施工过程数（n）的正确关系是m≥n。 22.组织流水施工时，一个施工班组在一个流水段上完成施工任务所需要的时间，称为流水节拍。 *
1.4 蛋白质工程的崛起 班级：____________ 姓名：_____________ 小组：_____________ 评价：____________ 【考纲要求】 1.举例说出蛋白质工程崛起的理由。 2.简述蛋白质工程的原理。（重难点） 3.尝试运用逆向思维分析和解决问题。 第一步：了解感知 阅读教材P26-28相关内容，将你认为重要的部分勾画出来，并完成下面内容： （一）蛋白质工程崛起的缘由 1．基因工程及不足 (1)实质：将一种生物的________转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的_________， 进而表现出____________。 (2)不足：在原则上只能生产自然界已存在的________。 2．天然蛋白质的不足 天然蛋白质的___________符合____________生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。（二）蛋白质工程的基本原理 1．概念:蛋白质工程是指以___________________________为基础，通过_______________________或__________________,对现有蛋白质__________或_____________________,以满足人类生产和生活的需要。 (1)基础：蛋白质分子的____________及其与____________的关系。 (2)手段：通过____________或____________，对现有蛋白质进行__________或制造一种新的蛋白质。 因为基因决定蛋白质，所以必须从基因入手。 (3)目的：获得满足人类生产和生活需求的_______________。2．原理：________________________。 3．流程： 天然蛋白质合成的过程是按照进行的；基因→表达（ 和）→形成→形成→行使生物功能；而蛋白质工程与之相反，它的基本途径是：从预期蛋白质功能出发→设计预期的____________→推测应有的________序列→找到相对应的__________序列(基因)。 4、蛋白质工程的成果 （1）延长干扰素体外保存时间 问题：干扰素在体外保存相当困难 措施：可将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，使其长时间保存。 （2）提高玉米中赖氨酸的含量 问题：玉米中含量较低，原因是当赖氨酸浓度达到一定量时，就会抑制赖氨酸合成过程中两个关键酶----天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性。 措施：将玉米中天冬氨酸激酶的第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶只中第104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可提高玉米中游离赖氨酸的含量。 （3）还有许多工业用酶也是在改变天然酶的特性后，才使之适应生产和使用需要的。 （三）蛋白质工程的进展和前景 蛋白质工程是在__________的基础上,延伸出来的第______代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域. 1．前景诱人：如用此技术制成的电子元件，具有______、______和效率高的特点；通过对胰岛素的改造，使其成为速效型药品。 2．难度很大：蛋白质工程是一项难度很大的工程，目前成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于，这种十分复杂.
蛋白质工程的研究进展及其农业医药应用展望 摘要：蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术，是生物 工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。随着社会和技术的不断发展，蛋白质工程技术在农业和医药方面的作用越来越突出，必将为社会的发展和许多重大社会问题的解决提供极大的支持。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；农业应用；医药应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1 概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。 2 蛋白质工程基本途径
流水施工典型例题 一、流水施工总结 二、典型例题： （一）固定节拍流水施工 1.特点： 在组织的流水范围内，所有施工过程的流水节拍都相等，并且都等于流水步距。即t1=t2＝
t3＝K 根据上例图推导流水施工工期的公式。 T＝（m＋n－1）K＋ΣZ－ΣC 2.练习： 已知某分部工程有3个施工过程，其流水节拍t1=t2=t3=2天，划分为3个施工段。 （1）若无工艺间歇，试计算流水施工工期并绘制流水施工横道图。 （2）若2、3之间工艺间歇2天，又如何 解：首先判断属于什么流水：固定节拍。 取k=t=2天，n＝3，m＝3， （1） T＝（m＋n－1）K＝（3＋3－1）×2＝10天 （2） T＝（m＋n－1）K＋ΣG＝（3＋3－1）×2＋2＝12（天） 流水施工横道图如下： （二）成倍节拍流水施工 1.特点： 同一施工过程在各个施工段上的流水节拍都相等，不同施工过程的流水节拍不完全相等，但成倍数关系。 成倍节拍流水施工的组织步骤： （1）求各施工过程流水节拍的最大公约数作为流水步距K （2）计算各施工过程所需工作班组数 bi＝ti/K （3）计算工作班组总数 n’＝Σ bi （4）计算流水施工工期
T＝（m＋n’－1）K+ΣZ－ΣC 2.练习： 某分部工程有3个施工过程，其流水节拍分别为t1=1天，t2=3天，t3=2天，划分为6个施工段。试组织流水施工，计算流水施工工期并绘制流水施工横道图。 解：首先判断属于什么流水：加快的成倍节拍流水。 t1=1天，t2=3天，t3=2天 （1）取K＝1天 （2）计算各施工过程所需工作班组数 b1＝t1/K＝1/1＝1（队），同样b2＝3，b3＝2 （3）计算工作班组总数 n’＝Σ bi＝b1＋b2＋b3＝6（队） （4）计算流水施工工期 T＝（m＋n’－1）K＝（6＋6－1）×1＝11（天） （三）无节奏流水施工 1.特点 （1）各施工过程在各施工段上的流水节拍不全相等； （2）相邻施工过程的流水步距不尽相等； （3）专业工作队数等于施工过程数； （4）各专业工作队能够在施工段上连续作业，但有的施工段之间可能有空闲时间。 2.练习：
蛋白质工程的崛起 班级： ____________ 姓名： _____________ 小组：_____________ 评价：____________ 【考纲要求】 1.举例说出蛋白质工程崛起的理由。 2.简述蛋白质工程的原理。（重难点） 3.尝试运用逆向思维分析和解决问题。 第一步：了解感知 阅读教材P26-28相关内容，将你认为重要的部分勾画出来，并完成下面内容：（一）蛋白质工程崛起的缘由 1．基因工程及不足 (1)实质：将一种生物的________转移到另一种生物体内，后者可以产生它 本不能产生的_________，进而表现出____________。 (2)不足：在原则上只能生产自然界已存在的________。2．天然蛋白质的不足 天然蛋白质的___________符合____________生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 （二）蛋白质工程的基本原理 1．概念:蛋白质工程是指以___________________________为基础，通过_______________________或__________________,对现有蛋白质__________或_____________________,以满足人类生产和生活的需要。 (1)基础：蛋白质分子的____________及其与____________的关系。 (2)手段：通过____________或____________，对现有蛋白质进行 __________或制造一种新的蛋白质。因为基因决定蛋白质，所以必须从基因入手。 (3)目的：获得满足人类生产和生活需求的_______________。 2．原理： ________________________。 3．流程：
蛋白质工程在其诞生以来就在人们生活的方方面面起到了很大的作用，它的应用主要是在在医药，食品加工，轻工业，农牧业等方面，为社会的发展进步提供了不容忽视的力量，这将预示着蛋白质工程将在以后的社会发展中有着良好的发展前景。 随着20世纪70年代初期DNA基因工程的诞生，蛋白质工程在它的冲击下应运而生。1983年，美国Genex 公司K.Ulmer 在《Science》上发表以《Protein Engineering.》为题的专论，第一次提出了蛋白质工程的概念，并建立了专门的研究实体，制定了相应研究开发计划，标志着蛋白质工程的正式诞生。在以后的二十多年里，蛋白质工程有了长足的发展且应用于医学，农业，轻工等各个领域，产生了较大的经济效益和社会效益。 一．蛋白质工程在医药中的的医用 基因工程为实现蛋白质工程已经提供了基因克隆、表达、突变以至活性测定等关键技术，而蛋白质分子的结构分析、结构设计和预测为蛋白质工程的实施提供了必要的结构模型和结构基础。蛋白质工程的实施实际上是一个由理论到实践、由实践到理论的周而复始的研究过程，对蛋白质的结构—功能关系的规律性认识是一个螺旋式上升的过程。蛋白质工程不但有着广泛的应用前景，而且在揭示蛋白质结构形成和功能表达的关系研究中也是一个不可替代的手段。 （一）蛋白质工程在医药中的应用 1抗体工程的应用 抗体工程的出发点是改善抗体的特异性、亲和性以及在受体细胞中的可生产性。当然也包括使其特性扩展，可同时作用于不同的抗原。对于很多应用而言，只改变亲和性是不够的。在一些应用中，特别小的抗体片段是必需的；鼠抗体必须改成人抗体；再者，增加抗体分子对蛋白酶的稳定性以及正确折叠都是重要的考虑。 下面以一个特异性结合实体瘤的单克隆鼠抗体为例。这种抗体对高度特异性肿瘤治疗而言是很理想的，它可以将免疫毒素带到瘤细胞中，从而杀死瘤细胞。由于完整的抗体分子太大，不能最大限度地扩散到瘤体中，以致不能完成治疗目的。为此，必须将抗体分子变小，抗体的最小片段Fv就成了最佳候选分子。然而Fv本身不稳定，这样抗体运载体Fy和所携带的毒素可能在到达目的地之前就分开。因而，首先要使其稳定化；然后抗体的亲和性要尽可能高，这是因为抗体对抗原(即瘤细胞)的结合越好，所携带的毒素错误地在身体内传布的危险性就越小，抗体更能达到其目的地。然而，如果病人的免疫系统将这个鼠源抗体识别为外源蛋白质，则几天之后由于HAMA反应产生的人抗鼠抗体就阻断了携带毒素的鼠抗体到达瘤细胞之路，使免疫治疗归于失败。为了解决这一问题，就要对抗体进行改造。近年来，用大肠杆菌系统有效地表达所需要的特定功能的抗体技术取得突破，向人们提供了具有全新性质的医用抗体片段。以上就是对鼠源抗体改造的路子。 如上所述，由于HAMA免疫反应直接从具有特异性结合活性的鼠源单抗在治疗中的作用就受到限制。由于绝大多数HAMA抗体是抗鼠源抗体的恒定区，使人们想到产生嵌合抗体可能解决上述问题，即将鼠单抗的恒定区换成人抗的恒定区。由于人抗体基因和鼠抗体基因都可以分别进行克隆，利用PCR技术很容易将鼠单抗可变区与人的恒定区重组到一起，所得到的嵌合抗体仍然能特异性地结合抗原，而HAMA反应被减少。由于这样的嵌合抗体的恒定区(或恒定结构域)来源于人，因而它对于激活人免疫系统的某些辅助功能更有效，则可有效地激活依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)，这就是某些像这样的人源化抗体已经用到临床实验的原因。
流水施工习题 班级: 学号: 姓名: 一、单项选择题 1.流水施工的施工过程和流水强度属于（） A、技术参数 B、时间参数 C、工艺参数 D、空间参数 2.由于某工程项目在第i施工段上的第2施工过程采用新技术施工,无标准定额可循,所以只能根据相关专家经验估算其流水节拍。已知对该施工过程进行估算得到的最短估算时间、最长估算时间、最可能估算时间分别为12d、22d、14d,则该施工过程的期望时间应为( ) A.15d B.16d C.18d D.14d 3.在流水施工中,造成专业队窝工是由于出现( ) A. M0=N B. M0＞N C、M0 ＜N D、M0≤N 4. 浇筑混凝土后需要保证一定的养护时间,这就可能产生流水施工的( )。 A.流水步距 B.流水节拍 C.技术间歇 D.组织间歇 5. 某工程有2个施工过程,技术上不准搭接,划分4个流水段,组织2个专业队进行等节奏流水施工,流水节拍为4天,则该工程的工期为( )天。 A.18 B.20 c.22 D.24 6. 流水节拍是指一个专业队( )。 A.整个工作的持续时间 B.在一个施工段上的持续时间 C.最短的持续工作时间 D.转入下一个施工段的间隔时间 7. 以下属于无节奏流水施工的主要特点的是( )。 A.各施工过程的施工段数不相等 B.施工段可能有间歇时间 C.专业工作队数不等于施工过程数 D.每个施工过程在各个施工段上的工程量相等 8. 某基础工程土方开挖总量为8 800m3，该工程拟分5个施工段组织固定节拍流水施工，两台挖掘机每台班产量定额均为80m3，其流水节拍应确定为( )天。 A. 55 B. 11 C. 8 D. 65 9. 利用横道图表示建设工程进度计划的优点是( )。 A.有利于动态控制 B.明确反映关键工作 C.明确反映工作机动时间 D.明确反映计算工期 10.下列组织流水施工的方式中,专业组数大于施工过程数的是( ). A.等节拍流水 B.异步距节拍流水 C.等步距异节拍流水 D.无节奏流水 二、多项选择题 1. 以下属于流水施工参数的时间参数的是（）。 A流水节拍 B.流水步距C工艺间歇D组织间歇 2. 流水施工作业中的主要参数有( )。 A、工艺参数 B.时间参数 C.流水参数 D.空间参数 E.技术参数 3.流水施工根据各施工过程时间参数的不同特点分类可分为( )。 A、等节拍流水 B.异节拍流水 C.无节拍流水 D.无节奏流水 4.本工程采用的流水施工方式是( ) A.等节拍流水 B.异节拍流水 C.无节拍流水 D.无节奏流水
《蛋白质工程》教学大纲 Protein Engineering 课程编码：27A11714 学分：1.5 课程类别：专业任选课 计划学时：24 其中讲课：24 实验或实践：0 适用专业：生物技术专业 推荐教材：刘贤锡著，《蛋白质工程原理与技术》，山东大学出版社，2002年。 参考书目：汪世华著，《普通高等教育"十一五"规划教材-蛋白质工程》，科学出版社，2008年。 课程的教学目的与任务 通过本课程的学习，掌握蛋白质工程的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及蛋白质工程的应用，熟悉从事蛋白质工程的重要方法和途径。形成科学的思维方式、培养学生科学思维能力和勇于探索、善于思考、分析问题的能力，激发学生对蛋白质工程的学习热情，为将来的学习和工作奠定坚实的理论和实践基础。 课程的基本要求 本课程的教学目的是使学生掌握蛋白质和蛋白质工程的概念，并在此基础上通过对蛋白质分子设计、蛋白质的热力学和动力学、蛋白质的修饰和表达、蛋白质的结构的学习，加深蛋白质的功能和应用的掌握,通过蛋白质组学的学习了解蛋白质工程的原理。同时兼顾学科发展动向，着重涉及当今蛋白质工程的应用。旨在使本科生了解现代蛋白质工程理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。 各章节授课内容、教学方法及学时分配建议（含课内实验） 第一章：绪论建议学时：2 [教学目的与要求] 了解蛋白质工程发展的历史及理论基础、基本研究内容与研究程序，掌握蛋白质结构与功能的关系，了解蛋白质工程的发展方向。 [教学重点与难点] 本部分教学重点也是难点为蛋白质结构与功能的关系。 [授课方法] 以课堂讲授为主，课堂讨论和课下自学为辅。 [授课内容] §1.1 蛋白质工程概论 蛋白质工程的理论基础 蛋白质工程的研究内容 蛋白质工程的基本程序 §1.2蛋白质工程的应用 研究蛋白质结构与功能的关系 改变蛋白质的特性 生产蛋白质和多肽类活性物质
蛋白质工程的研究的前景 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。 2 蛋白质工程基本途径 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸（基因） 3 蛋白质工程研究内容 3.1蛋白质结构分析 蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有生物功能的必需手段。晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展，但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克～几十毫克），制备出单晶
【例3】某分部工程由四个分项工程所组成，流水节拍均为２天，无技术、组织间歇时间。试组织流水施工并绘制流水施工水平图。 【解】由条件知： n=4,t1=t2=t3=t4=2, j=1,可组织全等节拍流水施工。 ①确定流水步距：K=t=2d ②确定施工段数： ? 【例4】某项目有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个施工过程，分两个施工层组织流水施工，流 水节拍均为一天；施工过程Ⅱ完成后需养护一天，下一个施工过程Ⅲ才能施工，且层间技术间歇为一天。试组织流水施工并绘制流水施工水平图。 ? 【解】由条件知： t=t1=t2=t3=t4=2d, j=2, n=4,可组织全等节拍流水施工。 ①确定流水步距：K=t=1（天） ②确定施工段数： T ＝（j ×m ＋n －1）K ＋∑Z 1－∑C 42 02042=++=+ + =∑K Z K Z n m i ③计算工期： =（1×4+4-1）×2=14（天） ④绘制流水施工水平图，如下图所示。
③计算工期： T ＝（j ×m ＋n －1）K ＋∑Z1－∑C =（2×6+4-1）×1+1-0=16（天） ④绘制流水施工水平图，如下图所示。 【例6】某工程由三个施工过程组成，各分项工程在各施工段上的流水节拍依次为：6天、4天和2天。试组织流水施工并绘制流水施工水平图。 根据条件，本工程可组织成倍节拍流水施工。 ⑴确定流水步距： {}（天）最大公约数2 2,4,6==K ⑵确定专业工作队数目： （个）ⅠⅠ32 6 === K t b （个）ⅡⅡ22 4 === K t b （个）ⅢⅢ12 2 === K t b （个）6 123=++==∑i b N ∴ ⑷确定计划工期： （天） 222)166()1(=?-+=?-+=K N m T ⑶确定施工段数，j=1，取： ) (6段==N m
蛋白质工程复习题一、名词解释 结构域： 基因突变： 融合蛋白： 蛋白的表达模式: 蛋白质的分子设计： 构型： 构象： α氨基酸： 原核表达： 蛋白质的二级结构： 蛋白质的三级结构： 蛋白质分子的四级结构： 蛋白质的分子设计： 分子伴侣： 启动子： 增强子： 乳糖操纵子： 二、单选题 1.下列不属于蛋白质结构测定的技术是（）
A X射线晶体衍射技术 B 核磁共振波谱技术 C 生物信息学预测蛋白质结构 D 缺失突变技术 2. 下列不属于蛋白质结晶技术的是（） A 悬滴法 B 坐滴法 C 微量扩散小室法 D 插入突变法 3. 增加蛋白质分子的热稳定性的常用方法是（） A 提高脯氨酸的含量 B 在蛋白质分子中引入二硫键 C 增加蛋白质分子的α螺旋 D 增加β折叠 4. 蛋白质工程的最终目的是( ) A 开发新产品 B 创造新理论 C 制造具有新性能的新蛋白质结构 D 研究蛋白质的氨基酸组成 5. 抗体属于（） A 基因 B 蛋白质 C DNA D RNA 6、不属于蛋白质空间结构的基本组件的是（） A α螺旋 B β层 C 环肽链 D 结构域 7、不属于强烈倾向于形成α螺旋的氨基酸（） A Ala B Glu C Pro D Met 8、蛋白质分子的完全从头设计属于（） A 小改 B 中改 C 大改 D 没改 9. 蛋白质工程的基本原理是（） A 中心法则 B 热力学第二定律 C 中心法则的逆推 D 模型对比 三、填空题
1. 维持蛋白质一级结构的作用力是（）和（）。 2.目的蛋白的表达模式检测的方法有（）和（） 3.蛋白质分子设计的目的是（）和（） 4．常用的蛋白表达系统有（）、（）和（）。 5. 蛋白质工程的基本原理是（） 6．常用的蛋白表达系统有（）、（）和（）。 四、简答题 1.简述蛋白质工程研究的基本途径。 2.欲使目的蛋白在大肠杆菌中表达，则表达载体的一般特点是什么？ 3、简述X射线晶体衍射技术测定蛋白质晶体结构的具体步骤。 4、简述目的蛋白原核表达的基本步骤。 5、简述蛋白质在生物体内的形成的过程. 6、蛋白质分子设计的步骤是什么？ 7. 一个蛋白质由300个氨基酸组成，请简述用搭桥PCR的方法在该蛋白的150个氨基酸处插入GAATCT这6 个碱基的基本步骤。 8、一个蛋白质分子由300个氨基酸编码，欲将第102个氨基酸（由TAC 编码）突变成GCT, 简述用搭桥PCR的方法完成突变的步骤。 9、怎样用PCR的方法将一个由300的氨基酸编码的蛋白质的200-250个氨基酸之间的序列删除。