量子点免疫层析检测技术方兴未艾
免疫层析技术是一种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉、可真正实现现场检测的检测方法。具有很多气相色谱、高效液相色谱、气质联用色谱、液质联用色谱、毛细管电泳等仪器检测方法以及其他传统方法无法企及的优点。在检测领域中处于特殊重要的地位，同时也是传统检测和仪器检测的良好补充。尤其在经济高速发展，生活水平提高的今天，人类重大疾病，环境污染，食品安全等问题日益受到极大的关注，让免疫层析检测技术更具有巨大的潜力和蓬勃的生命力。
目前，免疫层析产品主要为胶体金免疫层析试纸条，其最早应用于医学检验，在早孕检测中的应用取得了极大的成功，随后在各个领域迅速渗透漫延，其在毒品检测、环境检测、以及食品安全检测领域得到了迅速的发展，但是又出现新的问题，在很多方面，尤其是食品安全检测领域，有些农兽药残留限度极度苛刻，甚至要求0.1 ng/ml的检测限度，同时食品类物质如肉类、禽类、果蔬、谷物等成分复杂，前处理难度也很大，造成胶体金免疫层析检测灵敏度无法胜任。除了进一步提高前处理方法以外，寻求高灵敏度的免疫层析方法也显得尤为重要。
量子点是近20 年来发展起来的半导体纳米晶材料，因为它的优良特性，受到了很大的关注，并且已经显示出一定的潜力，近几年来从细胞标记等应用已逐渐开始向多个领域的检测与诊断方向渗透。
一、量子点特性
量子点(简称QDs,又称半导体纳米粒子)是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～V族元素组成的，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，其中研究较多的主要是CdX(x=S、Se、Te)，直径约为2nm-6nm。量子点由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规材料所不具备的光吸收特性，使其应用领域越来越广泛，特别是其在免疫生物学和临床检验学等研究中的潜在的应用价值，已引起了广大科学工作者的极大关注，发光量子点作为荧光试剂探针标记生物大分子，正是近年来迅速发展的纳米材料在生物分析领域的重要应用之一。与普通的荧光染料相比较，量子点具有以下特点：
(1) 有机染料荧光分子激光谱带较窄，每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发，而且产生的荧光峰较宽，不对称，有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难，很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽，可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发，并产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱，从而避免了相邻探测通道的串扰。
(2) 量子点具有“调色”功能，不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。
(3)量子点的荧光强度强，稳定性好，抗漂白能力强，Chan和Nie通过实验证明ZnS包覆的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍和稳定100-200倍，可以经受多次激发，且标记后对生物大分子的生理活性影响很小，因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。
(4)生物相容性好，尤其是经过各种化学修饰之后，可以进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，可进行生物活体标记和检测，而传统的有机荧光染料一般毒性较大，生物相容性差。
(5)荧光寿命长，典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒(ns)，这与很多样本的自发荧光衰减的时间相当。而量子点的荧光寿命可持续长达数十纳秒(20ns-50ns)，这使得当光激发数纳秒以后，大多数的自发荧光背景已经衰减，而量子点荧光仍然存在，此时即可获得无背景干扰的荧光信号。
图1. 量子点
二、量子点的合成方法
目前合成量子点的方法主要有两种，一种是在有机体系中合成，即用金属有机化合物在具有较强配位能力的有机溶剂中制备；另一种是在水溶液中直接合成。1.有机相合成法
量子点最早采用胶体化学方法在有机体系中制备的方法，将金属和有机化合物混合在有配位性质的有机溶剂中，在一定的温度条件下就能生长出纳米晶体。这类方法制备的量子点分散性、稳定性都较好，不容易聚沉，表面修饰容易。早期合成的量子点往往存在量子点粒径分布较广、荧光产率偏低等缺点。1993年，Bawendi及其同事用二甲基镉和硒的三辛基膦（TOP）配合物作为前驱体，将其依次注入剧烈搅拌的三辛基氧化膦（TOPO）溶液中，合成了高荧光产率的CdSe 量子点，这种方法合成的量子点结晶性好、尺寸单分散、量子产率约为10%。这种方法较以前来说是一种突破，但当量子点制成水溶性时，其荧光产率会大大下
图2. 1996年，Hines
成功合成了ZnS包覆的CdSe量子点
降。后来人们发现，当把ZnS或CdS包覆在CdSe纳米晶体表面后，荧光产率会大大提高。1996年，Hines等就用二甲基锌和六甲基二硅硫烷作为量子点壳层前驱体制备了CdSe/ZnS核壳式量子点，其量子荧光产率在室温可达50%。但上述合成方法均采用(CH3)2Cd作为原料，而(CH3)2Cd的毒性很大，具有易燃、昂贵、室温下不稳定等特性；且当(CH3)2Cd注入热的TOPO后，可能产生金属沉淀，这些缺点限制了上述方法的推广使用。2001年Peng等对以前的方法进行了改进，用毒性低安全友好的CdO代替原来有机相法中的剧毒原料二甲基镉，在温和的条件下制备了CdS包覆的CdSe量子点，并且其荧光量子产率可以达到50%以上。虽然有机相法合成的量子点有尺寸单分散，荧光量子产率高等优点，但是因为油性量子点与生物环境不相容，并且制备方法不环保。如果要用在生物分析领域需要将油相量子点转相为水溶性量子点。油相量子点经过水溶性基团饰转移到水相中后，其量子产率会降低，因而在生物分析
领域的应用甚少。
2. 水相合成法
目前，多利用水溶性巯基试剂作为稳定
剂直接在水相中合成量子点。巯基试剂对量
子点的稳定性及功能化起重要的作用，选择
带有适当官能团的巯基化合物作为稳定剂，
对于控制量子点的表面电荷与表面特性极
其重要，尤其当需要水溶性量子点做荧光标
记时，稳定剂的选择就更为重要了。1994年，
V omeyer提出用巯基为稳定剂合成CdS。这
是首次提出用巯基为稳定剂合成量子点。
1996年Rogach等用水相法成功合成了巯基
乙醇和巯基甘油包覆的CdTe量子点，并得
到了较高发光效率。1998年Gao等用巯基
乙酸（TGA）作稳定剂，制备出水溶性CdTe
量子点。后来Zheng等首先采用水热法在温
和条件下合成了水溶性CdTe量子点，大大
缩短了水相法制备CdTe量子点的时间，其
荧光量子产率也超过了30%。目前水热法已
经成为直接用做生物荧光探针的量子点的
主要合成方法。水相合成量子点CdTe的典
型方法是首先将镉盐和巯基稳定剂配成溶
液，调节到适当的pH值，倒入三颈烧瓶中。
碲氢化钠前驱液的制备是通过硼氢化钠还原碲粉反应而得到的，然后将碲氢化钠倒入配好的镉盐和巯基稳定剂的溶液中，形
图3. 1998年Gao等用TGA作稳定
成CdTe单体，不断的加热，CdTe逐渐长大，通过控制加热时间，可得到不同粒径的量子点。水相合成量子点，不仅解决了量子点的水溶性问题，而且采用带羧基、氨基等的巯基稳定剂对其表面进行修饰，使得量子点能与生物分子上的氨基直接偶联，因而可以直接用于生物医学检测。随着水溶性量子点的性能不断提高，良好的生物相容性的水溶性量子点有望成为新一代生物荧光探针。
三、量子点在免疫层析技术中的应用
量子点免疫层析技术利用量子点荧光探针做为标记物，不仅充分体现了免疫层析技术的简便，快速，特异性强的优点，而且展示了量子点的高灵敏度，以及它的荧光特性，显示出巨大的发展潜力和广阔的应用前景。目前深圳市金准生物医学工程有限公司开发的量子点免疫荧光层析定量测试平台----干式荧光免疫分析仪（KF-Q001-A）是国内首创。在此平台上研发的降钙素原（PCT）定量测定试剂盒——量子点（QD）免疫荧光层析法也是国内唯一一家成功实现产业化并取得注册证号(粤械注准20152400386)的量子点诊断试剂。随着发展和应用趋势，越来越多的生物诊断试剂公司加入了量子点这个新兴行业。与此同时，量子点免疫分析技术也在不断地发展与改进，就其发展趋势来看，主要有以下几个方面：1. 优化量子点荧光探针的制备，得到荧光强度高的QDs，检测信号会随着QDs 的荧光增强而大大提高。单独的量子点颗粒容易受到杂质和晶格缺陷的影响，荧光量子产率很低，目前广泛应用的是以QDs为核心，用另一种半导体材料包覆形成核壳结构后，如CdTe/ZnS，可将量子产率提高到约50％甚至更高，并在消光系数上有数倍的增加，因而有很强的荧光发射,可大大提高检测灵敏度，有利于信号的检测。
2. 实现定量检测。至今已有部分实验室或公司研制出QDs荧光定量的仪器，从而可以定量检测出待测物的浓度，这将使量子点免疫层析技术得到更广泛的应用，打破了传统的胶体金免疫层析技术不能定量的限制。
3. 量子点的多色检测。QDs其中一个优点就是具有可精确调谐的发射波长。可以通过调整粒子尺寸来得到不同发射的荧光QDs，无需改变粒子的组成和表面性质。使得量子点可以用于多种组分的多色标记，实现多组份的同时检测。这将比传统的胶体金免疫层析技术的多元检测体现出更大的优势，减少了不同抗体间的交叉反应，特异性更强，相互间不会产生干扰。
总而言之，对免疫层析分析技术的要求是多方面的，在满足检测快速而简便的条件下，应尽可能提高检测的特异度和灵敏度，减少假阴性和假阳性，这对于用于自检的免疫层析产品是尤为重要的。适合于基层社区检测的快速免疫层析技术正受到越来越多的关注，可以预见，随着量子点免疫层析技术的不断研究和发展，必将为医学临床诊断试剂的研究提供商品化和自动化的新途径，促进我国医学事业的健康快速和持续发展。
量子点免疫层析检测技术方兴未艾 免疫层析技术是一种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉、可真正实现现场检测的检测方法。具有很多气相色谱、高效液相色谱、气质联用色谱、液质联用色谱、毛细管电泳等仪器检测方法以及其他传统方法无法企及的优点。在检测领域中处于特殊重要的地位，同时也是传统检测和仪器检测的良好补充。尤其在经济高速发展，生活水平提高的今天，人类重大疾病，环境污染，食品安全等问题日益受到极大的关注，让免疫层析检测技术更具有巨大的潜力和蓬勃的生命力。 目前，免疫层析产品主要为胶体金免疫层析试纸条，其最早应用于医学检验，在早孕检测中的应用取得了极大的成功，随后在各个领域迅速渗透漫延，其在毒品检测、环境检测、以及食品安全检测领域得到了迅速的发展，但是又出现新的问题，在很多方面，尤其是食品安全检测领域，有些农兽药残留限度极度苛刻，甚至要求0.1 ng/ml的检测限度，同时食品类物质如肉类、禽类、果蔬、谷物等成分复杂，前处理难度也很大，造成胶体金免疫层析检测灵敏度无法胜任。除了进一步提高前处理方法以外，寻求高灵敏度的免疫层析方法也显得尤为重要。 量子点是近20 年来发展起来的半导体纳米晶材料，因为它的优良特性，受到了很大的关注，并且已经显示出一定的潜力，近几年来从细胞标记等应用已逐渐开始向多个领域的检测与诊断方向渗透。 一、量子点特性 量子点(简称QDs,又称半导体纳米粒子)是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～V族元素组成的，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，其中研究较多的主要是CdX(x=S、Se、Te)，直径约为2nm-6nm。量子点由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规材料所不具备的光吸收特性，使其应用领域越来越广泛，特别是其在免疫生物学和临床检验学等研究中的潜在的应用价值，已引起了广大科学工作者的极大关注，发光量子点作为荧光试剂探针标记生物大分子，正是近年来迅速发展的纳米材料在生物分析领域的重要应用之一。与普通的荧光染料相比较，量子点具有以下特点： (1) 有机染料荧光分子激光谱带较窄，每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发，而且产生的荧光峰较宽，不对称，有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难，很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽，可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发，并产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱，从而避免了相邻探测通道的串扰。 (2) 量子点具有“调色”功能，不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。 (3)量子点的荧光强度强，稳定性好，抗漂白能力强，Chan和Nie通过实验证明ZnS包覆的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍和稳定100-200倍，可以经受多次激发，且标记后对生物大分子的生理活性影响很小，因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。
4种国产金免疫层析试验试剂检测HBsAg应用评价 发表时间：2015-10-19T16:29:14.250Z 来源：《医药前沿》2015年第23期供稿作者：陈华根宋强刘小花 [导读] 成都市新都区人民医院成都新都作为判断乙肝病毒感染和诊断乙型肝炎的病毒标志物，HBsAg是感染性疾病标志物检测中应用最为广泛的项目。 陈华根宋强刘小花 （成都市新都区人民医院成都新都 610500） 【摘要】对4种国产金免疫层析试验（GICA）试剂进行干扰和灵敏度试验，评价试剂临床应用价值。 【关键词】金免疫层析试验；乙肝病毒表面抗原；检测；评价 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）23-0333-02 我国是乙肝病毒感染大国，HBsAg一般人群携带率9.09%[1]。作为判断乙肝病毒感染和诊断乙型肝炎的病毒标志物，HBsAg是感染性疾病标志物检测中应用最为广泛的项目。传统的凝集试验已逐渐弃去，基本采用各种免疫标记技术检测。GICA自20世纪80年代运用于临床以来，已大量用于HBsAg检测。我们选用具有国家药品监督管理局批准文号的4个厂家的GICA试剂，进行干扰和灵敏度试验，评价其临床应用价值。 1.材料和方法 1.1 试剂和仪器 GICA试剂，北京蓝十字生物药业有限公司产品；北京万泰生物药业有限公司产品；广州万孚生物技术有限公司产品；厦门英科新创公司产品。酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂采用厦门英科新创公司产品。洗板机系热电Well wash plus，酶标仪系芬兰Wellscan MK3。 1.2 样本 定值血清，分别为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和>10000ng/ml，购于北京康彻斯坦公司，ELISA法基线测定1ng/ml、2ng/ml和5ng/ml的S/CO均值分别为3.4、7.3和13.1；溶血样本，抽全血3ml，自然收缩后3000转/min，离心15分钟，取血清利用ELISA法平行检测HBsAg，S/CO均值为20.4,然后将盛血试管放入-20℃冰箱冷冻过夜保存,解冻后3000转/min离心15分钟，是为溶血样本；黄疸血样本,TB 122? mol/L,ELISA法平行测定HBsAg,S/CO均值为18.3；脂血样本，TG 11.5mmol/L,ELISA法平行测定HBsAg,S/CO均值为15.8。1.3 方法 严格控制实验条件，室温18℃-25℃，湿度40%～60%，光线充足。严格按照试剂说明书要求操作，各类样本平行测定5次。检测线和质控线同时出现红色为阳性。 2.结果 灵敏度试验，4种GICA试剂检测1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和>10000ng/ml定值血清，15秒～25秒内都能出现质控带。2ng/ml血清20秒～25秒内出现检测带，至30分都呈极浅红色，时序上检测带出现在质控带之后；5ng/ml血清15秒～20秒出现检测带，时序上与质控带基本同步出现，至30分检测带呈浅红色；>10000ng/ml血清10秒～15秒出现检测带，时序上早于质控带，至30分检测带呈红色，颜色明显深于质控带；1ng/ml血清至30分都未见检测带呈色。 干扰试验，4种GICA试剂检测溶血样本、黄疸血样本和脂血样本，都能在25秒内出现红色的检测带和质控带。 3.讨论 HBsAg是由乙肝病毒S基因编码含226个氨基酸的乙肝病毒外膜蛋白，常与Dane颗粒并存，因此，把HBsAg作为乙肝病毒感染和诊断乙型肝炎的指标[2]。检测HBsAg的标记免疫方法有多种，如放射免疫、酶免疫、金标免疫及发光免疫。临床运用最广泛的是酶免疫测定（ELISA），国产批批检合格ELISA试剂检测HBsAg，检测下限可低于0.5ng/ml，接近或达到进口试剂水平[3]。ELISA环节影响因素多，从样本的采集和保存、试剂温度平衡、加样、温育、洗涤、显色比色到结果判读都需要严格控制、正规操作，且需要冰箱、加样器、温育箱、洗板机和酶标仪等设备。溶血、脂血、黄疸血等样本都会对检测结果造成影响，也有报道高浓度HBsAg值因hook效应致阴性检出[4-5]。GICA自首次用来检测HCG以来，也大量用于感染性疾病标志物检测。因其具有简便快速，室温存放，无需设备，影响因素少，安全等特点，尤其适合床旁检验。 本次用GICA试剂检测各种样本HBsAg实验表明，溶血、脂血及黄疸血等外源性标本影响因素对检测结果无影响。各种试剂对HBsAg浓度1ng/ml（S/CO均值3.4）都无法检出，对于HBsAg浓度2ng/ml（S/CO均值7.3）检测带呈色极弱,因此GICA试剂检测HBsAg的检测下限应在2ng/ml左右,而与一些试剂盒本身标明检测灵敏度1ng/ml有出入,检测HBsAg浓度>10000ng/ml样本,检测带呈色早而深,通常血中高浓度HBsAg应无hook效应影响。临床实践中，常有不少低浓度HBsAg阳性者，如应用GICA检测HBsAg，势必造成漏检，因此，GICA不宜用于临床HBsAg检测。血站系统应用GICA检测义务献血者HBsAg有一定实际意义，因系初筛，可以检测出大部分HBsAg阳性者，从而降低劳动强度，减少耗材消耗，对于低浓度HBsAg血源，通过复检程序，则可用ELISA法和分子生物学技术检测排除。 【参考文献】 [1]中华医学会肝脏病学分会、感染病学分会修订.慢性乙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志，2005，13（12）：881-891. [2]刘冰,陈华根.正确认识和应用乙肝病毒血清标志物[J].四川省卫生管理干部学院学报,2007,26(4):296-298. [3]李金明.临床酶免疫测定技术[M].第2版.北京：人民军医出版社，2008:192. [4]陈远林，秦立新，张仁生.ELISA一步法HBeAg阳性HBsAg阴性标本分析[J].临床检验杂志，2004，22（1）：45. [5]李永祥，顾光大，李和群.ELISA法检测HBsAg的“前带效应”[J].江西医学检验，2004，22（6）：585，581.
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910371125.8 (22)申请日 2019.05.06 (71)申请人 中生北控生物科技股份有限公司 地址 102200 北京市昌平区科技园区超前 路27号 (72)发明人 张勇 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 黄爽 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/533(2006.01) (54)发明名称 CRP和SAA联合检测试剂盒及其制备方法 (57)摘要 本发明提供一种CRP和SAA联合检测试剂盒 及其制备方法。所述试剂盒包含CRP和SAA联合检 测试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、分析 膜、吸收垫和底板，所述分析膜上设有2条检测线 (CRP、SAA检测线)和1条质控线，样品垫、结合垫、 分析膜和吸收垫依次搭接地粘贴在底板上且分 别部分重合；所述结合垫包被有CRP和SAA抗体标 记荧光微球。本发明采用荧光免疫层析法制备的 试剂盒，可以同时检测CRP和SAA，提高了临床检 测效率，具有高灵敏度、高特异性及快速检测的 优点，为感染性疾病、组织损伤坏死性疾病等疾 病的辅助诊断提供有效手段。权利要求书3页 说明书9页 附图1页CN 110133281 A 2019.08.16 C N 110133281 A
权 利 要 求 书1/3页CN 110133281 A 1.CRP和SAA联合检测试纸条，其特征在于，包括样品垫、结合垫、分析膜、吸收垫和底板，所述分析膜上设有2条检测线和1条质控线，所述样品垫、结合垫、分析膜和吸收垫依次搭接地粘贴在底板上且分别部分重合； 其中，2条检测线靠近结合垫一端，质控线靠近吸水垫一端； 2条检测线分别为CRP检测线、SAA检测线；所述CRP检测线包被有CRP检测抗体，所述SAA 检测线包被有SAA检测抗体； 所述结合垫包被有CRP抗体标记荧光微球和SAA抗体标记荧光微球； 所述检测线包被的抗体与所述结合垫包被的抗体分别具有不同的抗原结合位点。 2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜；和/或 所述结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜；和/或 所述分析膜为硝酸纤维素膜；和/或 所述底板的材质为PVC。 3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所用荧光微球是含有荧光物质的聚苯乙烯微球，所述荧光物质选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、TO、Cy3、Cy5、藻红蛋白、量子点中的至少一种； 所述荧光微球的粒径为20nm～600nm，发射波长为500nm～700nm，荧光微球的使用浓度为0.00001mg/ml～0.1mg/ml；所述荧光微球的表面修饰有官能团，所述官能团选自羧基、氨基或醛基中的至少一种。 4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述CRP检测抗体为Abgree公司生产的抗体801001，所述SAA检测抗体为Medix Biochemica公司生产的抗体2203；和/或所述CRP抗体标记荧光微球中使用的CRP抗体为Abgree公司生产的抗体801002，所述SAA抗体标记荧光微球中使用的SAA抗体为Medix Biochemica公司生产的抗体2201；和/或所述质控线包被有二抗，所述二抗选自羊抗鼠、羊抗兔、兔抗羊抗体中的至少一种。 5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述CRP抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使CRP抗体与荧光微球上的官能团连接；和/或 所述SAA抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使SAA抗体与荧光微球上的官能团连接。 6.根据权利要求1-5任一项所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条的长度为5～10cm，宽度为3～5mm。 7.CRP和SAA联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6任一项所述的试纸条，任选包含用于装载所述试纸条的卡壳。 8.CRP和SAA联合检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)微球活化：向1mg/ml荧光微球1～5ml中加入用50mM，pH6.1 MES溶解的0.1～10mg EDC和10mg NHS，活化10～60min，7000～15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用pH7.0～8.0的50mM PBS重悬，得到1mg/ml活化的荧光微球溶液； 其中，所述荧光微球采用权利要求3中所述的荧光微球； (2)CRP抗体的偶联：将0.2mg CRP标记抗体加入1mg/ml活化的荧光微球溶液2ml中，室温混匀2～4h，10000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含5mg BSA的50mM PBS溶液封闭60min，搅拌混匀，10000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.8含0.5％BSA的20mM Tris缓冲液 2
免疫层析试验
免疫层析试验 以双抗体夹心法测尿hCG 为例来介绍免疫层析试验的方法。 [目的] (1) 掌握免疫层析试验的原理。 (2) 熟悉双抗体夹心法测尿hCG 的方法、结果判定及应用。 [原理] 抗hCG 免疫金复合物干片粘贴在试剂条近下端G区(图1- 17)，抗hCG 单克隆抗体和小鼠IgG 抗体分别固化于NC 膜的测试区(T区) 和质控参照区(C 区)。当试纸条下端(A区) 浸入液体标本中，吸水材料即吸取液体，通过层析作用，液体向B 端移动，流经干片时，使抗hCG免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有hCG，可与抗hCG 免疫金复合物结合。此抗原体复合物流至T 区时即被固相抗hCG 单克隆抗体所获，形成金标抗体一抗原一抗体复合物，在T 区显现出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至C 区被固相抗小鼠IgG 捕获，呈现出红色质控线条。 [材料]
(1) “一步金”法早早孕妊娠诊断试纸条(有商品供应)。 (2) 孕妇尿液，待测尿液。 (3) 尿液收集杯等。 [方法] (1) 将试剂条及待测标本置室温一定时间以充分复温。 (2) 从原包装铝箔袋中取出试剂条，将试剂条按箭头方向插人尿液标本中。注意: 尿液液面 不能超过试剂条的标记线。 (3) 约5 S 后取出放于干净平整的台面上观察，3 min 时读取结果，10 min 后判 定无效。 在戏迟出死~条心线待技床样无h(G(阴临) [结果判断] 1.阴性试剂条上仅质控区出现条紫红色线，在测试区内无紫红色线出现(图1- 18a)。 2.阳性试剂条上出现两条紫红色线，一条位于测试区内，另一条位于质控区内(图1- 18b)。 3.弱阳性试剂条测试区的线条颜色明显浅于质控区内的紫红色线，表明可疑，2 d 后应重 新测试，以免漏诊(图1- 18c)。 4.无效试剂条上无任何线条出现，或仅出现测试区线条而质控区未出现，表明操作过程不正确或试剂条已变质失效。
免疫层析实验 1．原理 金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。本项技是将各种反应试剂分点固定在试纸条上，检测标本加在试纸条的一端，通过毛细血管作用使样品溶液在层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成的复合物被富集或固定在层析条上的特定区域（检测线），通过标记免疫技术显色。本项技术的特点是可进行单份标本检测且简便、快速、不需任何仪器设备，因此，发展非常迅速。 DICA也是GICA（goldimmunochromatography assay）GICA试剂为试纸条形式。在以塑料条上依次黏贴上以下几种组分，1--吸水纸，2--破璃纤维膜，抹上固定着干燥的金标抗体，3--硝酸纤维素膜，膜上包被着线条状抗体，4--吸水纸。 因为1，4都是吸水纸，由于吸水作用， 一，使样品液从1端向4端移动 二，当样品液达到2时，金标抗体被溶解，同时与标本中的抗原反应形成复合物 三，样品液继续移动至3 时，金标记的抗体复合物与膜上的抗体结合，呈现红色的线条 四，多余的金条抗体继续前移到4， 1 2 3 4 2.方法学类型 DICA多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。常见方法学类型有： 1)双抗体夹心法测抗原： 若图-2所示，G处为金标抗体(免疫金)，T处包被抗体，C处包被抗金标抗体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时，形成金标抗体-抗原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。 图-2免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原 2）竞争法测小分子抗原： 若图1-3所示,G处为金标抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗免疫金抗体，测试时待测标本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处时结合金标抗体，当混合物移至T 处时，因无足够游离的金标抗体与膜上标准抗原结合，T处无棕红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标抗体或金标抗体复合物流经C处，与该处的抗金标抗体结合出现棕红色的质控带，若标本中不含待测抗原，金标抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕
胶体金免疫层析测定试剂（盒）技术审评规范（征求意见稿） 发布时间：2016-02-03 本审评规范旨在指导注册申请人对胶体金免疫层析测定试剂（盒）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本审评规范是对胶体金免疫层析测定试剂（盒）的一般要求，申请人应依据具体产品的特性对注册申报资料的内容进行充实和细化，并依据产品特性确定其中的具体内容是否适用。 本审评规范是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本审评规范。 本审评规范是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本审评规范相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 胶体金免疫层析测定试剂（盒）用于体外定量测定临床样本中待测物的含量。 从方法学考虑，本文主要指采用胶体金免疫层析原理，利用胶体金免疫层析阅读仪，在医学实验室进行目标项目定量检验所使用的胶体金免疫层析定量测定试剂条/卡。本规范不适用于采用荧光标记或其他标记方法的免疫层析定量测定试剂（盒），但适用处可参照执行。 依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）、《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管[2013]242号）,本规范适用于管理类别为Ⅱ类的胶体金免疫层析定量测定试剂条/卡，分类代号为6840。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、临床意义、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合《体外诊断试剂注册管理办法》的相关要求和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。 （二）主要原材料研究资料（如需提供） 主要原材料（包括标记物、抗体及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验验证研究资料；质控品、校准品的原料选择、制备、定值过程及试验资料；校准品的溯源性文件，包括具体溯源链、实验方法、数据及统计分析等详细资料。 （三）主要生产工艺及反应体系的研究资料（如需提供） 1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示； 2.反应原理介绍； 3.确定反应所需物质用量（校准品、样本等）的研究资料； 4.确定反应最适条件研究； 5.其他：如基质效应等。 （四）分析性能评估资料 企业应提交在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、试验数据、统计方法等详细资料。申请人应按以下要求提供体外诊断试剂性能评估资料： 1.申请人名称； 2.性能评估方法、要求； 3.性能评估所使用试剂（包括校准品、质控品）的名称、批号、有效期； 4.应提供使用的仪器型号、序列号（SN）； 5.性能评估的时间、地点、检验人员； 6.性能评估的具体数据及分析判定； 7.性能评估审批人签字、审批时间。 对于本试剂盒，建议着重对以下分析性能进行研究： 1.准确度 对测量准确度的评价依次包括：与国家标准品（和/或国际标准品）的偏差分析、方法学比对等方法，企业可根据实际情况选择合理方法进行研究。 （1）与国家（国际）标准品的比对研究
层析法概念 层析法(chromatography)的原理是利用混合物中各组分的物理性质之差(如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)而建立来的一种分离技术。 层析系统是由固定相(stationary phase) 和流动(Mobile Phase)相组成。固定相是固体物质或固定于固体物质上的成分。流动相是可以流动的物质，如水或各种溶剂。 层析过程：当待分离混合物随流动相通过固定相时，由于混合物各组分的理化性质的差异，与固定相相互作用弱的组分随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的速度快；与固定相相互作用强的组分向前移动的速度慢。从而实现混合物中各组分的分离。 免疫层析法概念 免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。 免疫层析技术是建立在层析技术和抗原一抗体特异性免疫反应基础上的一项新兴免疫检测技术。 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细管作用使待测物在层析条上移动。 待测物在T线处发生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。 分类 检测方法标记物质 TRFIA技术镧系稀土元素螯合物 上转换发光技术上转磷光材料（UCP） 荧光乳胶层析技术荧光胶乳颗粒 荧光微球免疫层析技术荧光微球 荧光QDS层析技术量子点 IMB层析技术免疫磁珠 新型胶体金技术纳米磁性微粒、核酸适配体
量子点免疫层析检测技术方兴未艾
量子点免疫层析检测技术方兴未艾 免疫层析技术是一种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉、可真正实现现场检测的检测方法。具有很多气相色谱、高效液相色谱、气质联用色谱、液质联用色谱、毛细管电泳等仪器检测方法以及其他传统方法无法企及的优点。在检测领域中处于特殊重要的地位，同时也是传统检测和仪器检测的良好补充。尤其在经济高速发展，生活水平提高的今天，人类重大疾病，环境污染，食品安全等问题日益受到极大的关注，让免疫层析检测技术更具有巨大的潜力和蓬勃的生命力。 目前，免疫层析产品主要为胶体金免疫层析试纸条，其最早应用于医学检验，在早孕检测中的应用取得了极大的成功，随后在各个领域迅速渗透漫延，其在毒品检测、环境检测、以及食品安全检测领域得到了迅速的发展，但是又出现新的问题，在很多方面，尤其是食品安全检测领域，有些农兽药残留限度极度苛刻，甚至要求0.1 ng/ml的检测限度，同时食品类物质如肉类、禽类、果蔬、谷物等成分复杂，前处理难度也很大，造成胶体金免疫层析检测灵敏度无法胜任。除了进一步提高前处理方法以外，寻求高灵敏度的免疫层析方法也显得尤为重要。 量子点是近 20 年来发展起来的半导体纳米晶材料，因为它的优良特性，受到了很大的关注，并且已经显示出一定的潜力，近几年来从细胞标记等应用已逐渐开始向多个领域的检测与诊断方向渗透。 一、量子点特性 量子点(简称QDs,又称半导体纳米粒子)是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～V族元素组成的，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，其中研究较多的主要是CdX(x=S、Se、Te)，直径约为2nm-6nm。量子点由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规材料所不具备的光吸收特性，使其应用领域越来越广泛，特别是其在免疫生物学和临床检验学等研究中的潜在的应用价值，已引起了广大科学工作者的极大关注，发光量子点作为荧光试剂探针标记生物大分子，正是近年来迅速发展的纳米材料在生物分析领域的重要应用之一。与普通的荧光染料相比较，量子点具有以下特点： (1) 有机染料荧光分子激光谱带较窄，每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发，而且产生的荧光峰较宽，不对称，有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难，很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽，可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发，并产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱，从而避免了相邻探测通道的串扰。 (2) 量子点具有“调色”功能，不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。
综一一述 免疫层析技术的发展及在P O C T中的应用 黄德智综述,蒲晓允?审校 (陆军军医大学新桥医院检验科,重庆４０００３７) 一一摘一要:免疫层析技术因其简单二方便二易操作二快速,价格相对低廉,已广泛应用于即时检测(P O C T).随着P O C T检测项目的增多和对已有项目检测定量二灵敏度二特异度等要求的提高,本文就免疫层析技术的最新发展及其应用,作以下综述. 关键词:免疫层析技术;一即时检测;一量子点 D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１９．０５．０２２中图法分类号:R４４６ 文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１９)０５Ｇ０５９４Ｇ０４文献标识码:A D e v e l o p m e n t o f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y a n d i t s a p p l i c a t i o n i nP O C T HU A N GD e z h i,P UX i a o y u n? (D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,X i n q i a oH o s p i t a l,A r m y M e d i c a l U n i v e r s i t y,C h o n g q i n g４０００３７,C h i n a) A b s t r a c t:I m m u n o c h r o m a t o g r a p h y h a sb e e nw i d e l y u s e d i nP O C Tb e c a u s eo f i t s s i m p l i c i t y,c o n v e n i e n c e, e a s y o p e r a t i o n,r a p i d i t y a n d r e l a t i v e l y l o w p r i c e．W i t h t h e i n c r e a s eo fP O C Tt e s t i n g i t e m s a n d t h e i n c r e a s eo f t h e r e q u i r e m e n t s f o r q u a n t i f i c a t i o n,s e n s i t i v i t y,a n d s p e c i f i c i t y o f e x i s t i n g p r o j e c t s,t h i s p a p e r r e v i e w s t h e l a t e s t d e v e l o p m e n t s a n d a p p l i c a t i o n s o f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y． K e y w o r d s:i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y;一P O C T;一q u a n t u md o t s １一免疫层析技术简介 一一免疫层析技术是在２０世纪６０年代在发达国家兴起并被用于检测血清蛋白的一种结合了免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法,利用胶体金二胶体碳二磁性纳米材料二稀土纳米材料二量子点等着色标记物,在层析时,标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色于硝酸纤维素膜上的检测线,以纤维膜上显色条带的有无二颜色深浅和反射光线来定性或定量,在即时检测(P O C T)中应用极为广泛.免疫层析试纸条由样品垫二结合垫二硝酸纤维素(N C)膜二检测线(T线)二质控线(C线)二吸水垫二聚氯乙烯(P V C)底板等部分组成,根据待检测物的大小和抗原抗体结合的方式,分为双抗体夹心法和竞争法[１Ｇ２].２一免疫层析技术发展及应用 一一免疫层析技术关键在于依靠标记抗体的免疫标记材料,而纳米材料由于优越的信号放大作用,能达到良好的灵敏度和特异度而备受青睐.下面主要从胶体碳二量子点二稀土纳米材料二上转换发光技术和超顺磁性纳米材料以及适配体等方面进行介绍.２．１一胶体碳一与胶体金相比,胶体碳的优点包括更高的颜色强度,即更高的灵敏度和标记效率,动力学检测范围更广,成本低廉,制作工艺简单,可大规模生产且更环保,但由于其标记和封闭时间长,并未体现出对胶体金的绝对优势,故其商业化程度较低[３Ｇ４].何卓等[３]利用碳纳米颗粒制作的胶体碳试纸条用于检测疟原虫,并可通过扫描检测带灰度值以定量.最近,Y U等[４]利用一种新的胶体碳材料氧化石墨烯作为标记物,成功制作出用于检测黄曲霉素B１的试纸条,肉眼最低检测限可达０．３n g/m L.材料学的进步能促进检测的进步,诸如碳量子点和石墨烯量子点等材料也是免疫层析研究中可以利用的标记材料.２．２一量子点一量子点被认为是免疫层析中最有前途的荧光半导体纳米材料,与一般荧光染料相比,量子点具有尺寸可调的荧光,发射光谱窄而对称,高量子产率,宽吸收光谱,荧光强度高,耐光漂白和稳定性好等优点[５Ｇ６].水溶性量子点表面富含羧基或氨基以用于连接蛋白质.表面是羧基的量子点被１Ｇ(３Ｇ二甲氨基丙基)Ｇ３Ｇ乙基碳二亚胺盐酸盐(E D C)和NＧ羟基琥珀酰亚胺(N H S)激活,并且这些激活的羧基和抗体的氨基相连接.这些特性使得量子点是一个可以达到高灵敏度和同时对多种检测物定量的免疫层析标记物[７].为了检测样本中不同的物质,有两种不同模式的检测方法.第一种模式是不同的T线去检测与之对应的分析物;第二种模式是一条T线去检测不同的分析物.例如,第一种模式,T A R A N O V A等[８]设计了一种 交通信号灯 式的竞争性免疫层析方法,他们 ４９５ 国际检验医学杂志２０１９年３月第４０卷第５期一I n t J L a bM e d,M a r c h２０１９,V o l．４０,N o．５ ?一通信作者,EＧm a i l:１５８０９３２０＠q q．c o m. 一一本文引用格式:黄德智,蒲晓允．免疫层析技术的发展及在P O C T中的应用[J]．国际检验医学杂志,２０１９,４０(５):５９４Ｇ５９７．
免疫层析法检测原理分类介绍 作者：佚名 文章来源：艾康生物技术（杭州）有限公司 点击数： 88 更新时间：2005-10-16 双抗体夹心 ·以 hCG 试剂为例 金标为鼠源性抗β-hCG 单克隆抗体与胶体金的复合物，测试线包被羊抗α-hCG 多克隆抗体，控制线包被羊抗鼠多克隆抗体。 妇女受孕的“指示剂” hCG 是一种肽，包含一条和FSH （促卵泡成熟激素），FLH 具有同源性的α链和一条高度特异的β链。当待测尿液或血清中含有一定量的hCG 时，样本通过层析作用到达金标位置hCG 的β链和单抗β-hCG 发生免疫反应，再层析到测试线位置，hCG 的α链和多抗 α-hCG 发生免疫反应，这样就把金标通过hCG 桥连到测试线上，达到一定量后，金标显色为肉眼可见的水平，多余的金标继续泳动到控制线位置，由于多抗鼠和鼠源性抗β-hCG 单抗发生免疫反应，从而桥连胶体金显色，这样就得到阳性结果。 当尿液或血清中不含 hCG 时，金标和测试线抗体不发生桥连，而控制线则显色，这样就得到了阴性结果。当测试线和控制线均不显色时，表示试剂盒无效。 该产品检验灵敏度25mIU/ml hCG 。 测HbsAg 的HbsAg 产品的检测原理是双抗体夹心。 竞争反应原理 ·以 MOP 为例（BSA 为牛血清白蛋白） 金标为鼠源性抗体Morphine 单抗和胶体金的复合物，T 线（为取得较强的免疫应答，故免疫 原采用Morphine-BSA 偶联物）包被Morphine-BSA 。C 线包被羊抗鼠抗体。
当待测尿液中含一定量以上的 Morphine时，样本到达金标位置，和单抗Morphine-BSA发生 免疫反应并完全饱和之，再层析到T线位置时，由于单抗Morphine-BSA lgG胶体金复合物已无空余的位点和测试线上的Morphine-BSA结合，故T线不显色，C线显色，这样得到的是阳性结果。 当待测尿液中不含 Morphine时，样本与金标不反应，再层析到T线位置时，固定在NC膜上 的Morphine-BSA会“捕捉”单抗 Morphine-BSA胶体金复合物，故T线显色，C线也显色，得到 阴性结果。当无C、T线时，表示试剂盒失效。 其它产品如 DPC、DTH、DME、DAM、DCO等依次类推。 应用proteinA金标的试剂盒检测原理 蛋白 A是金黄色葡萄球菌的一种胞壁蛋白，有与哺乳动物的lgG结合的特性，亲和力根据物种的差异而有区别。而人体中所有的抗体均是lgG因此能用来检测人体血液中的抗体用已知抗原测未知抗体。 ·以IHI为例说明 HIV试剂盒金标为protein A-金标复合物,T线包被HIV抗原。C线包被鸡抗protein A多克隆抗体。 当待测血清中含有HIV抗体时，该抗体先和protein A胶体金复合物免疫结合，到T线位置时，该抗体又和固定在NC膜上的HIV抗原免疫结合，从而桥连protein A胶体金，T线显色。到达C线位置时，固定在NC膜上的鸡抗protein A 多抗桥连protein A多抗桥连protein A胶体金，C线显色，得到阳性结果。 若待测血清中不含HIV抗体，则T线上的HIV抗原和protein A不发生免疫结合，T线不显色，
一、抓不住的胶体金 一个看似简单的胶体金的制备过程，其实有相当复杂的控制工艺，稍有偏差，就会导致生产出劣质、性能差及重现性极差的产品进而影响其商业用途。将这样的产品应用于快速检测中可能导致结果的低稳定性、低敏感性及低特异性。 在胶体金的制备过程中，需要把氯金酸还原成金原子。加入还原剂之后，溶液中金原子的含量上升并达到过饱和，并在核化过程中发生凝集作用，形成由11个金原子构成的中央的二十面体金核心。 最初形成的核数目决定了最终将有多少颗粒形成于溶液中，还原剂越多产生的晶核越多从而产生的金颗粒也越多。显而易见，在一个含既定数目氯化金的溶液中，形成的核化位点的数目越多，最终形成的每个金颗粒的尺寸就越小。因而微粒的大小可通过所加入的还原剂的量来精细调控。如果溶液中所有的核化位点都可以在瞬间同时发生，所形成的金颗粒大小都完全一致。要做到这一点（同步核化）是非常困难的，常会发生核化过程的不均一及多分散性胶体的产生，最终导致产品的重复性低下、交联物不稳定。 胶体金及交联物的生产制造表面看似简易，若掉以轻心则如果还原过程中核化作用及形成速度没有得到很好控制，粒子的形成就会不均一。这样的粒子在与蛋白的结合过程中将无法被均匀包被，也不能在溶液中均匀分布。仅仅5%形状不均一的粒子都会影响测试的结果，使其完全不具重现性，而这种不稳定性更容易造成错误的结果。更严重的是，粒子形状及尺寸的不均一会导致蛋白包被的不均一，这样会导致交联物长时间的积聚与凝集，储存于溶液中的交联物可能于几天甚至几个小时内就出现这样的变化。即使立即将交联物干燥于固相基质上也无法完全克服这个问题，在干燥过程中，由于粒子形状而未稳定结合的表面蛋白很容易分离，造成假阳性及高背景。 这也就是为什么胶体金标记的产品批间差较大（30%）的原因，因为每一批胶体金在制备过程存在天然的不可控性（氧化还原的过程），直接影响到每批胶体金的颗粒大小，颗粒分布比例，颗粒稳定性都不一样。直接影响到最终产品的灵敏度，重复性，带来较大的假阴性，假阳性。 二、摸不透的NC膜
双抗体夹心法原理 以HCG 为例（检测抗原） 此方法较常用，主要用于较大分子量的蛋白（抗原）的检测。要求两株抗体针对一个抗原的不同位点才可以。也有个别的检测项目（HIV）是双抗原夹心检测抗体的，原理类似。HCG 金标记αHCG 金-αHCG-HCG 金-αHCG-HCG -βHCG 金-αHCG -羊抗鼠IgG(Y3) 金-αHCG-HCG 羊抗鼠IgG （Y3） 显示红色显示红色 金标记αHCG 不显色显示红色 金-αHCG -羊抗鼠IgG 阴性反应 阳性反应 βHCG
以吗啡为例（检测抗原） 此方法主要用于小分子抗原（毒品、农药、肽链等）的检测。由于抗原分子量小不能直接固定于NC 膜上，常常用化学方法把小分子偶联到BSA 等大分子物质上再固定于NC 膜上。此结果与双抗原夹心法相反，阴性CT 两条都是红线，阳性只有C 线一条红线，T 线不显色。 金-吗啡抗体-吗啡吗啡-BSA 金标记吗啡抗体显示红色不显色金-吗啡抗体-吗啡羊抗鼠尿液(含 吗啡)显示红色 显示红色金标记吗啡抗体金-吗啡抗体-羊抗鼠 阴性尿液 抗体-吗阴性反应 阳性反应金标记吗啡抗体-吗啡-BSA
乙肝E 抗体为例 金标记e 抗体e 抗原e 抗体 金标记e 抗体-e 抗原-e 抗体金标记e 抗体-e 抗原-e 抗体-羊抗鼠 不显色显示红色 金标记e 抗体e 抗原金标记e 抗体-e 抗原 金标记e 抗体-e 抗原-e 抗体显示红色显示红色 金标记e 抗体-e 抗原 羊抗鼠 阳性反应 阴性反应
间接法原理检测抗体 此方法主要用于血清中抗体检测，纯化或者重组的抗原固定于NC 膜上，标记多为蛋白A(ProteinA 或叫SPA，与抗体Fc 端结合而与其它蛋白质不结合)或者鼠抗人（如检测为IgM，则标记为鼠抗人IgM）。此方法要求胶体金过量（待测样品往往含有大量多种抗体，所检测抗体所占份额很小），一般来说样品再加入前需要稀释或者加极少量后再加样品缓冲液。 一般斑点免疫渗滤法使用也是间接法。显示红色显示红色 金标记SPA 目的抗体杂抗体阳性反应抗原 杂抗体金标记SPA 抗原不显色显示红色 阴性反应
胶体金标记的全定量免疫层 析技术的原理 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理 从定性、半定量向全定量是即时检验（POCT）技术发展的一个趋势。全定量的POCT检测技术有多种原理。本文主要介绍胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理。 一、胶体金标记的全定量免疫层析POCT试剂装置结构示意图及作用 1、吸收垫：吸收多余液体。 2、 PVC底板：提供试剂封装外壳。 3、 C1、C2：标准质控区。羊抗鼠抗体结合于硝酸纤维膜上。 4、 T：检测区。鼠源性单克隆二抗。 5、硝酸纤维素膜：提供抗原抗体反应的固相载体。 6、胶体金垫：含胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。 7、样品吸收垫：吸收样品液体。 二、原理 该方法的免疫学原理是一个双抗体夹心法。 样品加入样品吸收垫，样品中的液体首先溶解胶体金垫中含有的胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。其次样品中待测抗原与胶体金颗粒标记的鼠源性单克隆抗体结合，形成抗原-抗体*胶体金复合物，并靠毛细作用向检测线移动。在硝酸纤维薄膜的检测线上固定有另一鼠源性单克隆二抗。当样品层析至检测线时，可以进一步形成抗体-抗原-抗体*胶体金双抗体夹心复合物，并在检测线上聚积显现出一条可见的显色反应。无显色反应则表示样品中无抗原存在。而胶体金的量反应了待测抗原的量。从加样垫中泳动过来的过量胶体金标记的单克隆抗体是鼠源性的，无论携带抗原与否，均可被固定于标准的羊抗鼠抗体所捕获，形成显色反应，这种显色反应，既代表了整个反应体系是正确的，同时C1、C2区的显色反应的深浅，与检测区中被测抗原的量呈对应关系。胶体金颗粒在特定波长下，对光的吸收和散射与胶体金颗粒的量相关，通过光电感应器检测胶体金颗粒对光的吸收和散射，从而获得待测抗原的量。 三、讨论 全定量是POCT的发展趋势，采用两点定标法是全定量的一个重要标志，只有两点定标才有可能实现真正的全定量。 2
胶体金免疫层析分析仪技术审评规范（2016 版） 本规范旨在指导和规范胶体金免疫层析分析仪产品的技术审评工作，帮助审评人员理解和掌握该类产品原理/机理、结构、性能、预期用途等内容，把握技术审评工作基本要求和尺度，对产品安全性、有效性作出系统评价。 本规范所确定的核心内容是在目前的科技认识水平和现有产品技术基础上形成的。因此，审评人员应注意其适宜性，密切关注适用标准及相关技术的最新进展，考虑产品的更新和变化。 本规范不作为法规强制执行，不包括行政审批要求。但是，审评人员需密切关注相关法规的变化，以确认申报产品是否符合法规要求。 一、适用范围本规范适用于在医学实验室通过测定胶体金试剂卡反应区条带的反射率对样品结果进行判读的仪器（以下简称胶体金分析仪）。该产品管理类别为II 类，产品类代号为6840-2 。 本规范不适用于采用荧光标记或其他标记方法进行快速免疫测定的仪器，但适用处可参照执行。 二、技术审查要点 （一）产品的名称要求 胶体金免疫层析分析仪 （二）产品的结构和组成 胶体金分析仪应由主机（如：控制主板，光电检测系统、机
械扫描控制电路、液晶显示器、外壳等）、随机软件、电源及信 息采集装置（如：二维条码扫描器，IC 芯片读取器）等部分组成。 （三）产品的基本参数基本参数应包含：主机尺寸、整机重量、工作波长范围、测试通道、接口类型、开机预热时间、功耗等。 注：多型号应在技术要求中注明差异性。 （四）产品的工作原理胶体金分析仪是对胶体金试剂卡检测结果进行判读的仪器。将待检测的试剂卡置入仪器内，通过传感器将检测试剂卡的反射率特征转为光电信号，通过校准曲线信息将光电信号转化为相应的浓度值，对待测物进行分析。胶体金分析仪依据光传感器不同可分为：CCD （电荷耦合器件），CMOS （互补金属氧化物半导体），光电二极管等三种类型。 （五）注册单元划分的原则和实例胶体金分析仪的注册单元原则上以技术结构、性能指标、预期用途为划分注册单元的依据。 1.不同的信号采集原理应考虑归入不同的注册单元，如 CCD 、CMOS 、光电二极管； 2.不同的电击防护类型应考虑归入不同的注册单元； 3.自动化程度不同的仪器应考虑归入不同的注册单元； 4.定性、半定量、定量可考虑归入同一注册单元。 （六）产品适用的相关标准企业应根据产品的自身特点引用相关的标准。目前与胶体金分析仪相关的常用国家标准、行业标准如下： GB/T 191-2008 包装储运图示标志； GB 4793.1-2007 测量、控制和实验室用电气设备的安全要