RNA剪接
RNA剪接（RNA splicing）是指从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。通过不同方式的RNA剪接，－种基因可在不同的发育分化阶段、不同的生理病理条件或不同的细胞、组织中合成不同的蛋白质。果蝇的性别就是通过不同的剪接途径完成的。在Science这篇文章中Li等人发现了一个Archaeglobus fulgidus的RNA剪接内切酶（RNA splicing endonuclease），为了解所谓的“生物分子”（即有机分子，包括蛋白质，核苷酸等）结构提出了新的观点见解。这项研究主要是利用了X射线结晶方法（X-ray crystallography）解析生物分子的三维结构，而对于生物分子的形状以及相关的化学性质的了解是科学家们探索生物分子维持细胞生命活动机理的基础。
而在另一篇文章中，Li和来自PTC Therapeutics（一家生物制药公司）的技术人员讨论了有关内含子结构剪接的相关发现：通过对真核tRNA剪接内切酶的分析，发现了一个以前从未发现的对于其催化作用有影响的活性位点。
这些发现可以帮助科学家们了解细胞中分子识别以及相互作用的基本化学与物理机理，FSU的Timothy Logan教授认为这项工作是为理解生物分子功能提供了重要信息，而且也为许多健康问题提出了新的治疗方案。
Related fig: Hypothetical model of the cation-πsandwich of the eukaryotic tRNA-splicing endonuclease. (版权归原作者所有)
A structural model of the pre-tRNA Archeuka bound to AF endonuclease (ribbon models) with the corresponding yeast endonuclease subunits re presented in colored shapes, and the splice sites indicated by arrow s.
深入阅读：
1 C. R. Trotta, S. V. Paushkin, M. Patel et al., Nature 441 (709 1), 375 (2006).
2S. Xue, K. Calvin, and H. Li, Science 312 (5775), 906 (2006).
Lab: PTC Therapeutics, 100 Corporate Court, South Plainfield, New Jersey 07080, USA.
Lab:
Department of Chemistry and Biochemistry, Institute of Molecular Biophysics, Florida State University, Tallahassee, FL 32306, USA.
可变剪接：有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接(或选择性剪接，alternative splicing) 。可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，是导致人类基因和蛋白质数量较大差异的重要原因。 基本内容 大多数真核基因转录产生的mRNA前体是按一种方式剪接产生出一种成熟mRNA分子，因而只翻译成一种蛋白质。但有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接(或选择性剪接, alternative splicing)。由于RNA的可变剪接不牵涉到遗传信息的永久性改变．所以是真核基因表达调控中一种比较灵活的方式。可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制, 是导致人类基因和蛋白质数量较大差异的重要原因。 可变剪接形式的识别 真核细胞核内前体mRNA加工通过5’加帽、剪接(移除内含子)、3’末端切割加尾．从而形成成熟的mRNA．成熟的mRNA和hnRNP及其他蛋白质形成复合体输出核外再经过选择性降解参与翻译。这些步骤并不是简单的线性顺序．而是在转录物延伸期和转录同时发生的。从而形成一个大型的“生产链。 一般认为，可变剪接有5种基本形式：①内含子保留；②可变的5’端；③可变的3’端； ④外显子盒；⑤互斥外显子(一组外显子中只选其一)。也有分为7种形式的，加上可变的起始或末端外显子，而这两种形式更有可能是可变启动子、可变polyA位点造成的。可进行专门分析。 可变剪接的意义和作用 可变剪接被认为是导致蛋白质功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码多个不同转录产物和蛋白产物。 可变剪接也是产生基因组规模与生物复杂性之间的矛盾根源之一。 已有实验研究表明，可变剪接在产生受体多样性、控制调节生长发育等方面起决定性作用。尤其表现在神经系统和免疫系统，这与该类系统的功能多样性和反应敏感性是密切相关的。许多遗传疾病都与剪接繁盛异常紧密相关据估计。导致疾病的变异中约15%会影响pre—mRNA的剪接。
可变剪接与蛋白质组多样性及其调节机制 武春晓 2001级博士生专业：免疫学导师：马大龙教授 前言 可变剪接是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制。剪接过程受多种顺式作用序列和反式作用因子相互作用调节。包括SR和hnRNP 家族蛋白在内的多种剪接因子参与这一调节过程。转录机器（machine）也参与可变剪接的调节。本文将讨论:一.可变剪接与蛋白质组多样性二. 可变剪接的调节机制。. 第一部分可变剪接与蛋白质组多样性5 据预测，人类基因组可能有约35,000个基因，果蝇约14,000个，而简单的模式生物线虫约19,000个基因。生物的复杂性与其基因组基因数量似乎存在明显差异。原因在蛋白质组。基因重排，RNA编辑，和可变剪接等机制可以从一个基因产生多种蛋白，从而使蛋白质组中蛋白质的数量超过基因组中基因的数量。其中，从影响的基因数量和生物种类范围来看，可变剪接是扩大蛋白质多样性的最重要的机制1－4。 一、可变剪接的频率。5,6 1. 5%。从1977年Walter Gilbert提出可变剪接概念，1980年Baltimore在小鼠IgM基因发现第一个可变剪接产生膜型、分泌型IgM，至2001年，用经典分子生物学实验的方法研究，一共仅发现了数百种有可变剪接的基因。并推测在高级真核细胞生物约5％的基因有可变剪接。 2. 35%－60%。高通量的基因组测序和EST测序，使得生物信息学的方法研究可变剪接成为可能。EST来源于完全加工的mRNA, 它们提供了一个广泛的mRNA多样性的样品库。这种多样性可以用计算机分析。最近两年，多个研究小组通过不同的生物信息学的方法，从整个人基因组的水平进行分析，结果一致显示约35%－60%的人基因有可变剪接形式。而且，由于对大多数基因来说，每个基因只测了很少几EST甚至没有EST；EST不是全长的mRNA，多位于mRNA的5’和3’端；EST来源于有限的组织和发育阶段；很有可能存在有更多的可变剪接而在现在的EST库中没有显示。因此实际可变剪接的频率可能比预测的更高。这还有待于建立新的高通量的分子生物学方法，如生物芯片的方法，以进一步实验验证。 二、单个基因可变剪接产生的多样性5。 一个基因可以通过如下几种方式产生多个转录体，如不同的转录起始位点，可变剪接，选择不同的加尾信号位点，RNA编辑等。可变剪接包括3种类型：1.内含子的保留；2.可变外显子的保留或切除；3. 3’和5’剪接位点的转移（shift）导致外显子的增长或缩短。可变剪接对蛋白质结构的影响也是多样性的，如多肽链中一个到数百个氨基酸的增加或减少；某功能域的有无；如果可变剪接使读码框架改变，则可能无法有效翻译，mRNA被监视系统降解。
RNA剪接 RNA剪接（RNA splicing）是指从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。通过不同方式的RNA剪接，－种基因可在不同的发育分化阶段、不同的生理病理条件或不同的细胞、组织中合成不同的蛋白质。果蝇的性别就是通过不同的剪接途径完成的。在Science这篇文章中Li等人发现了一个Archaeglobus fulgidus的RNA剪接内切酶（RNA splicing endonuclease），为了解所谓的“生物分子”（即有机分子，包括蛋白质，核苷酸等）结构提出了新的观点见解。这项研究主要是利用了X射线结晶方法（X-ray crystallography）解析生物分子的三维结构，而对于生物分子的形状以及相关的化学性质的了解是科学家们探索生物分子维持细胞生命活动机理的基础。 而在另一篇文章中，Li和来自PTC Therapeutics（一家生物制药公司）的技术人员讨论了有关内含子结构剪接的相关发现：通过对真核tRNA剪接内切酶的分析，发现了一个以前从未发现的对于其催化作用有影响的活性位点。 这些发现可以帮助科学家们了解细胞中分子识别以及相互作用的基本化学与物理机理，FSU的Timothy Logan教授认为这项工作是为理解生物分子功能提供了重要信息，而且也为许多健康问题提出了新的治疗方案。 Related fig: Hypothetical model of the cation-πsandwich of the eukaryotic tRNA-splicing endonuclease. (版权归原作者所有)
mRNA可变剪接的调控 有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接(或选择性剪接，alternative splicing) 。可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，是导致真核生物基因和蛋白质数量较大差异的重要原因。 真核细胞核内前体mRNA加工通过5’加帽、剪接(移除内含子)、3’末端切割加尾．从而形成成熟的mRNA．成熟的mRNA和hnRNP 及其他蛋白质形成复合体输出核外再经过选择性降解参与翻译。这些步骤并不是简单的线性顺序．而是在转录物延伸期和转录同时发生的。从而形成一个大型的“生产链。 一般认为，可变剪接有5种基本形式：①内含子保留；②可变的5’端；③可变的3’端；④外显子盒；⑤互斥外显子(一组外显子中只选其一)。也有分为7种形式的，加上可变的起始或末端外显子，而这两种形式更有可能是可变启动子、可变polyA位点造成的。可进行专门分析。 mRNA前体中内含子的剪切和外显子的拼接主要由剪接复合体加工完成，后者是一类大分子蛋白复合物，主要由5个小核糖核蛋白（U1，U2，U4，U5，U6）剪接位点约300多种蛋白分子组成。目前认为剪接位点的正确识别并被精确剪接主要依赖于mRNA前体上的顺式原件和剪接因子之间的相互作用。除此之外，一些组织或发育阶段特异性的剪接因子对剪接位点的选择也很重要。
剪接的发生必然涉及到蛋白-蛋白（剪接复合体、剪接因子）、蛋白-RNA(剪接因子与顺式原件)以及RNA-RNA(U snRNP与顺式原件)的相互作用，而信号转导对剪接调控也会涉及这些相互作用。 参考文献 1.细胞信号转导和可变剪接调控王稳、杭兴宜等医学分子生物学杂志2009.6（5） 2.mRNA可变剪接调控—维基百科
RNA剪接因子hnRNP的结构与功能研究进展 动物遗传育种刘小艳 2005414 摘要RNA剪接是一个多步骤、形成多种中间状态复合物的复杂过程，尽管在已经发现的一百多种pre-mRNA剪接相关因子中，仅研究了约8%相关蛋白质的空间结构，已充分显示对剪接相关因子三维晶体结构以及溶液结构的测定与研究，在理解RNA剪接的复杂机理以及生物学特性中具有不可替代的重要意义． 关键词RNA剪接，hnRNA结合蛋白，剪接体，晶体结构，溶液结构 原核生物中mRNA的转录与翻译几乎是同步发生的，而真核生物，转炉是发生在细胞核内，翻译则在核外进行。真核生物RNA尤其mRNA分子的寿命较长，在5’和3’两个末端都要受到修饰。而RNA剪接(RNA splicing)是tRNA、rRNA，特别是mRNA加工与成熟的重要生物学过程，也是蛋白质分子多样性产生的关键机制之一。RNA剪接需要多种因子参与，包括杂性核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)，结合蛋白hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)，小型核RNA (small nuclear RNA，snRNA)，结合蛋白snRNP(small nuclear ribonucleoprotein)等。在真核细胞内，RNA原初转录物的分子很大，通过剪接产生成熟的mRNA分子。hnRNP与hnRNA结合形成核酸蛋白质复合物hnRNPP(hnRNP particles)可穿梭于细胞核与胞质之间，具有转运和剪接RNA的作用。另一方面，snRNP与细胞核内snRNA (分子质量为100-200 nt 的小RNA)紧密结合，而构成核内小核酸蛋白质复合物snRNPP(snRNP particles)，参与RNA剪接、多聚腺苷化以及转录拷贝3’端的成熟。 最近，Reed等通过蛋白质组学方法证明，与pre-mRNA剪接相关的蛋白质因子大约有145种，它们参与RNA剪接过程中的不同环节[1]。托普霉素亲和层析［2］(tobramycin affinity-selection) 以及麦芽糖亲和层析［3] (maltose-binding affinity)等方法能识别和分离70种以上的相关剪接蛋白质。由于RNA 剪接机制愈来愈受到国内外同行的关注，在最近几年中，部分pre-mRNA 剪接因子，尤其hnRNP的晶体及溶液结构获得了一些研究成果，为阐释RNA剪接的复杂机制提供了至关重要的信息。 1 hnRNP的结构与功能 hnRNP-A1 (又名解链蛋白1，unwending protein 1，A1)是真核细胞核hnRNPP 复合物中含量十分丰富的分子．A1能与pre-mRNA结合，形成hnRNPP 复合物，并通过对几种富含Ser／Arg剪接因子的拮抗，以球状(globa1)调节因子的方式参与RNA 交替剪接(alternative splicing)，表现为选择性地跨过某些外显子，实现5’端交替剪接。A1蛋白不断地穿梭在细胞核和胞质之间，能将polyA+ mRNA从细胞核运输到胞质，该过程的调节与其C端富含Gly结构域的结构相关［4]。了解hnRNP A1与RNA相互作用中空间结构方面的信息，将有助于揭示RNA穿过细胞核膜以及剪接过程中的分子细节。
mRNA前体的加工过程有哪些步骤 ?浏览：1881 ?| ?更新：2012-11-20 12:43 原核生物转录作用生成的mRNA属于多顺反子mRNA，即由操纵子机制控制生成的一条mRNA可编码几种不同的蛋白质。原核生物转录生成的初级转录本mRNA不需经过复杂的加工过程即可表现功能，惟一的加工过程是多顺反子mRNA在RnaseⅢ的催化下裂解为单个的顺反子。 真核生物转录生成的是单顺反子mRNA，其前体是非均一RNA(hnRNA)。hnRNA加工过程包括 方法/步骤 1.剪接 真核生物的基因是一种断裂基因，即其结构基因由若干编码序列和非编码序相间排列而成，其中为蛋白质编码的可转录序列称为外显子，不为蛋白质编码的可转录序列为内含子。转录合成的hnRNA需经过剪接、切掉内含子部分，然后再将外显子部分拼接起来。该过程有多种酶活性物质(包括snRNA)参与。
2.5′末端加“帽” 真核细胞成熟mRNA的5′末端均有一个特殊的结构，即m7Gpp-pmnNp，称为“帽”。帽的生成是在细胞核内进行的，但胞浆中也有酶体系，动物病毒mRNA 加帽过程就是在宿主细胞的胞浆内进行的。 3.3′末端加“尾” mRNA前体分子的3′末端有一段保守序列，由特异的核酸内切酶切去多余的核苷酸，然后在多聚A聚合酶的催化下，由ATP聚合生成多聚A尾。该反应在核内发生，在胞浆中也可继续进行。 4.碱基修饰 mRNA分子中有少量稀有碱基(如甲基化碱基)是在转录后经化学修饰(如甲基化)而形成的。 5.选择性加工 某些MRNA前体含有多个3‘剪切位点和多聚腺苷酸化位点，因此利用这些选择性位点可产生具有不同3'端非编码区或者具有不同编码能力的RNA产物。 通过可变剪接途径可以挑先最保留在MRNA中的外显子，结果单个基因可以合成多种不同的蛋白质。 6.RNA编辑 在合成并经RNA编辑加工之后，MRNA分子的序列可以发生改变。个别核苷酸可以被置换，添加或者删除。编辑过的MRNA翻译产生了较短脱脂基蛋白B48，由于基缺少一个结合受体的蛋白结构域，因此功能受限。还有好多
可变剪切与复杂疾病 摘要:大多数真核生物的基因都是断裂基因，断裂基因的转录产物需要通过剪接，去除插入部分（部分内含子），使编码区（外显子）连接起来成为连续序列。剪接是真核生物转录调控的一个重要环节，是一个非常复杂的过程，如果剪接发生异常，则会引起一些疾病。并且对剪接认识的加深，也为这类疾病的治疗提供了一些方法。 关键字：断裂基因，外显子，内含子，可变剪接，疾病。 1剪接概述 剪接是真核生物表达调控的一个重要过程，它涉及到很多的调控因子，并且发生在特定的调控位点。并不是所有的位点都可以发生剪接，而是只有在特定的剪接位点才会发生剪接，如果剪接发生在不正常的位点就会出现剪接异常。 1.1剪接位点的特点 内含子切割位点有2个特点（1）内含子的两个末端并不存在同源或互补。这就排除了存在二级结构的可能。（2）连接点具有很短的保守序列，称为边界顺序。其规律称为GT-AG法则（GT-AGrule)Chambon法则。并且我们称左边的剪接位点称供体（donor）位点，右边的剪接位点称受体（acceptor）位点。在不同的真核生物中，内含子的一致顺序有不少变化，动物中典型的剪接位置一致顺序组成为：5'AGGTAAGU--------------YNYURAY--Y10-20--YAG3'其中Y为U或C，N为任何核苷酸。但是需要注意的一点是仅仅GT-AG边界顺序并不能保证内含子的正确剪切，因为在内含子中有不少相同的GU-AG顺序。内含子中还有另一段识别剪接边界必不可少的序列称为分枝点，位于3‘-端剪接位的上游，具有特征性组成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶（U或C），R表示嘌呤（A或G），A是剪接时参与形成分枝的特别位点。紧接在分枝点的下游有一段多嘧啶序列，也是参与剪接事件蛋白接合的位置。 1.2剪接的类型 剪接是基因表达调控的一个重要环节，由于内含子具有多种多样的结构，剪接机制也是多种多样的。有些内含子可以催化自身剪接，而有些内含子需在剪接体作用下才能剪接。 根据剪接机制的不同，可把剪接分为以下几种类型:类型1自我剪接，类型Ⅱ
可变剪接与疾病的生物信息学研究概况 王科俊1*，吕俊杰1，冯伟兴1，王 鑫2 （1.哈尔滨工程大学自动化学院，中国黑龙江哈尔滨150001；2.剑桥大学癌症分子研究中心英国剑桥） 摘要：可变剪接是真核基因转录后期的重要调控机制，它使得同一条蛋白质编码基因能够产生多种转录 体，极大的扩展了遗传信息的应用.研究发现，可变剪接与人类疾病有着密切的联系.错误的剪接会导致疾病，增加疾病的易感性与病变程度，甚至直接导致癌变.现对可变剪接调控机制与疾病的生物信息学研究进展进行综述. 关键词：可变剪接；疾病；癌症；生物信息学中图分类号：Q752 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2011）01-0086-09 The Application of Bioinformatics in the Research of Alternative Splicing and Disease WANG Ke -jun 1，L 譈Jun -jie 1*，FENG Wei -xing 1，WANG Xin 2 （1.College of Automation ，Harbin Engineering University ，Harbin 150001，Heilongjiang ，China ； 2.Cancer Research Center ，Cambridge University ，Cambridge ，England ） 收稿日期：2010-09-01；修回日期：2010-12-01 基金项目：国家自然科学基金资助项目（61071174）；国家863计划项目（2008AA01Z148） 作者简介：王科俊（1962-），男，黑龙江哈尔滨人，哈尔滨工程大学自动化学院教授，博士生导师，主要从事模式识别、多模态生物特 征识别、生物信息学研究，E -mail ：wangkejun@https://www.doczj.com/doc/5411376058.html, ；吕俊杰（1982-），女，黑龙江齐齐哈尔人，博士研究生，主要从事生物信息学研究. Abstract ：Alternative splicing is an important mechanism in regulating eukaryotic gene expression during post -transcriptional processing as it generates numerous transcripts from a single protein -coding gene ，which largely increases the use of genetic information.Researches showed that alternative splicing was highly relevant to human diseases.Wrong splicing patterns could cause disease ，contribute to disease severity and susceptibility ，and even cause cancer directly.Research progress of bioinformatics in alternative splicing regulation mechanism and disease was summarized. Key words ：alternative splicing ；disease ；cancer ；bioinformatics （Life Science Research ，2011，15（1）：086～094）1977年Walter Gilbert 在对Adenovirus hexon 基因的研究中发现并提出可变剪接现象［1］，同时，他表明一个基因的不同编码区可以拼接在一起被剪接下来，产生功能不同的信使核糖核酸，这是对可变剪接的最早描述.随后Sharp 和Roberts 发现高等生物基因的编码区被非编码区所分割，并提出分割的基因结构［2，3］.这一发现推翻了传统生物学关于“一种基因对应一种蛋白 质”的观点，接下来1981年，第一次在哺乳动物 编码荷尔蒙降血钙素的基因中发现可变剪接现象［4］，20世纪80年代初，在编码免疫球蛋白的基因中发现可变剪接［4，5］.此后，可变剪接被发现广泛存在于真核生物中［6］.大量关于可变剪接的实验性文章不断发表出来.很长一段时间，对可变剪接机制的研究多停留在对单个基因的可变剪接现象和机制的研究上，而缺少更为系统更为综 第15卷第1期生命科学研究 Vol．15No．12011年2月 Life Science Research Feb.2011 ·综述·
一、events of exon skipping 1. 结果一（跳过一个exon）： a)首先是psl文件（一共是21列,具体每一列的格式见说明1，主要利用了第10列转录本id，第14列染色体id，第19列转录本的每个exon的长度，第21列转录本的每个exon在染色体的起始位置）： 转录本NM_004749的psl结果如下（只有一行，多行显示只为方便）： 0 0 0 0 0 0 0 0 - NM_004749:45106223-45117842 0 0 0 chr7 0 45106223 45117842 11 327,115,112,246,145,111,158,172,324,461,76, 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0, 45106223,45107381,45107626,45107948,45108470,45109456,45110222,45110661,45111564,45114950,451177 66, 因为psl结果的位置信息是从0开始的，所以每个起始位置需要加上1，结合每个exon的大小，我们可以知道这个转录本每个exon的在染色体具体位置： exon1:45106224-45106550（45106224=45106223+1, 45106550=45106224+327-1） exon2:45107382-45107496 exon3:45107627-45107738 exon4:45107949-45108194 exon5:45108471-45108615 exon6:45109457-45109567 exon7:45110223-45110380 exon8:45110662-45110833 exon9:45111565-45111888 exon10:45114951-45115411 exon11:45117767-45117842 b)其次在junctions的结果里有： chr7 45109567 45110223 junction1 chr7 45109567 45110662 junction2 chr7 45110380 45110662 junction3 所以从junction1可以知道来exon6和exon7存在连接，从junction3可以知道exon7和exon8存在连接，从junction2可以知道来exon6和exon8存在连接（跳过了exon7），因此exon6（45109457-45109567）、exon7（45110223-45110380）、exon8（45110662-45110833）存在exon skipping，如下图： 在结果文中显示如下，9238为转录本NM_004749所对应的基因id（用基因id替换转录本id的原因见说明2）： gene chromsome strand constitutive exon inclusive exon constitutive exon （表头）
总结 随着多物种的基因组测序结果公布，人们发现蛋白质编码基因的数量并没有随着生物复杂性的增加而增加，进而发现了可变剪切的机制。可变剪切是指mRNA 前体中的外显子以不同的组合方式进行剪切和拼接，从而产生不同结构及功能的mRNA 和蛋白质。这种由同一基因产生不同结构的mRNA 和蛋白质称作可变剪切。目前已发现的可变剪切共有五种类型： 1.外显子跳读(图1A)即在进行序列剪切时会跳过一个外显子。 2.互斥外显子(图1B)即进行序列剪切时存在两个外显子，二者选一进行剪切。 3.内含子保留(图1C)即剪切时不剪切内含子。 4.可变5’供体(图1D)即剪切上游长度不定的外显子。 5.可变3’受体(图1E)即剪切下游长度不定的外显子。 图1 可变剪切类型 E D C B A
单末端和双末端测序结果均可用于检测可变剪切事件，但二者的原理不尽相同。单末端测序是将测序得到的reads比对到参考基因组中，如果特定的外显子没有对比到参考基因组，则标记为在转录本中可能为选择性剪切事件。而双末端测序产生的是成对的reads，将成对的reads匹配到参考基因组上，然后对每对reads之间的实际距离与理论距离进行计算，推测转录本的结构。以下为几种较为常用的可变剪切识别工具，接下来将对以下几种不同可变剪切机制识别软件的功能特点进行简单的介绍： AStalavisa原理：与其它软件都是相同的标记代码不同，AStalavisa计数系统将每一个未映射成功的reads相对应的位置标记唯一的代码。首先将reads与转录本进行映射，并将未在重叠转录本覆盖的reads作为拼接结构进行检测，然后根据基因组坐标系，将剪切位点的变化生成AS代码描述相应的可变剪切事件。AStalavisa会将相同类型的可变剪切归类到相同的分类结构组中，无论使用多少转录本进行比对它都会过滤去除冗余的数据来确定唯一的可变剪切事件。AStalavisa功能主要集中于拼接结构的变化，而非外显子或内含子的属性选择，它克服了复杂剪切事件预测的难题。AStalavisa适用于所有物种的基因组或自定义基因的一部分。AStalavisa是一种预测方法而非固定的数据，所以预测准确度依赖于不同的注释文件，种特异性和编码活动制约性。 图2 AStalavisa示例结果
RNA的剪接机制 酶母tRNA的剪接 RNA的剪接就是要把断裂基因的转录本中的内含子除去。酵母细胞核中400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。这些基因均只有一个内含子，位于与反密码子的3'侧相隔一个核苷酸之处，长度为14至46bp。不同氨基酸的tRNA基因中的内含子不相同，因此，剪接酶类看来并不能识别任何共同顺序。所有内含子中均有一段与tRNA的反密码子互补的序列，因而使反密码臂的构象发生了改变，即反密码子被配对而使反密码臂伸长了很多。在前体中仅反密码臂受到影响，tRNA分子的其他部分仍保持其正常结构。 酵母tRNAphe中的内含子能与其反密码子碱基配对，从而改变了反密码臂的结构。此剪切过程可分为两个阶段。第一步是磷酸二酯键的断裂，这不需要ATP。这一步由一种内切核酸酶所催化。第二 ATP P 步是连接反应，需要ATP的存在，由RNA连接酶所催化。在无AT 时，产生的两个tRNA半分子不能连接起来。这两个半分子具有独特 ATP P 的末端:其5'端有OH基，而3'有一个2'，3'-环磷酸基。当加入AT 时，即发生第二步反应:两个tRNA半分子先发生碱基配对，形成成熟tRNA分子的构象，然后由RNA连接酶形成磷酸二酯键而将两个半分子共价连接起来。2'，3'-环磷酸基的存在并不限于酵母，在植物和哺乳动物的tRNA剪接反应中也有环状基团的产生。在人的HeL HeLa a 细胞中，RNA连接酶能将带有2'，3'-环磷酸基的RNA和另一带有
5'-OH基的RNA直接连接起来。酵母tRNA前体也可以在爪蟾的卵母细胞核提取液中正确地被剪接。这表示剪接反应没有种属特异性。爪蟾具有能识别酵母tRNA的内含子的酶类。 自身剪接反应 以前一直认为只有蛋白质有酶活性。这个概念在生物化学界已根 RNA A 深蒂固。然而近期发现RNA也可有酶活性。这种有酶活性的RN 有人称之为ribozyme。 一种四膜虫Tetrahumenathermophila的两个主要rRNAs的基因和其他真核生物相类似(见前文)，被转录在同一个初级转录本中。此转录本称为35S前体RNA，较小的rRNA的序列在5'侧，较大的rRNA(26S)序列则在3'侧。在编码26SrRNA序列存在一个单一的，短的(约400bp)内含子。如将这个35S前体RNA在体外温育，可以发生自动剪接作用:内含子从前体中被切出，先呈线性RNA片段，后来又环化为环状RNA。这个反应仅需要加入一种一价阳离子，一种二价阳离子，和一种鸟嘌呤核苷酸(G)。其他碱基均不能代替G.但并不一定需要GTP;GDP;GMP和鸟苷都可以应用。这表示此反应并不需要能量供应。此外，此鸟嘌呤核苷酸必须有一个游离的3'-OH基。这个G要连接到内含子的5'端上(通过通常的磷酸二酯键)。当线性的内含子成为环状时，其3'端可连接在距离5'端15个核苷酸之处，从而将原来5'端和15个碱基的节段(包括G在内)排除出去。这种反应基本上是一种磷酸酯转移反应。外显子A的3'-OH基可直接和外显