RNA的剪接机制
酶母tRNA的剪接
RNA的剪接就是要把断裂基因的转录本中的内含子除去。酵母细胞核中400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。这些基因均只有一个内含子，位于与反密码子的3'侧相隔一个核苷酸之处，长度为14至46bp。不同氨基酸的tRNA基因中的内含子不相同，因此，剪接酶类看来并不能识别任何共同顺序。所有内含子中均有一段与tRNA的反密码子互补的序列，因而使反密码臂的构象发生了改变，即反密码子被配对而使反密码臂伸长了很多。在前体中仅反密码臂受到影响，tRNA分子的其他部分仍保持其正常结构。
酵母tRNAphe中的内含子能与其反密码子碱基配对，从而改变了反密码臂的结构。此剪切过程可分为两个阶段。第一步是磷酸二酯键的断裂，这不需要ATP。这一步由一种内切核酸酶所催化。第二
ATP P 步是连接反应，需要ATP的存在，由RNA连接酶所催化。在无AT 时，产生的两个tRNA半分子不能连接起来。这两个半分子具有独特
ATP P 的末端:其5'端有OH基，而3'有一个2'，3'-环磷酸基。当加入AT 时，即发生第二步反应:两个tRNA半分子先发生碱基配对，形成成熟tRNA分子的构象，然后由RNA连接酶形成磷酸二酯键而将两个半分子共价连接起来。2'，3'-环磷酸基的存在并不限于酵母，在植物和哺乳动物的tRNA剪接反应中也有环状基团的产生。在人的HeL
HeLa a 细胞中，RNA连接酶能将带有2'，3'-环磷酸基的RNA和另一带有
5'-OH基的RNA直接连接起来。酵母tRNA前体也可以在爪蟾的卵母细胞核提取液中正确地被剪接。这表示剪接反应没有种属特异性。爪蟾具有能识别酵母tRNA的内含子的酶类。
自身剪接反应
以前一直认为只有蛋白质有酶活性。这个概念在生物化学界已根
RNA A 深蒂固。然而近期发现RNA也可有酶活性。这种有酶活性的RN
有人称之为ribozyme。
一种四膜虫Tetrahumenathermophila的两个主要rRNAs的基因和其他真核生物相类似(见前文)，被转录在同一个初级转录本中。此转录本称为35S前体RNA，较小的rRNA的序列在5'侧，较大的rRNA(26S)序列则在3'侧。在编码26SrRNA序列存在一个单一的，短的(约400bp)内含子。如将这个35S前体RNA在体外温育，可以发生自动剪接作用:内含子从前体中被切出，先呈线性RNA片段，后来又环化为环状RNA。这个反应仅需要加入一种一价阳离子，一种二价阳离子，和一种鸟嘌呤核苷酸(G)。其他碱基均不能代替G.但并不一定需要GTP;GDP;GMP和鸟苷都可以应用。这表示此反应并不需要能量供应。此外，此鸟嘌呤核苷酸必须有一个游离的3'-OH基。这个G要连接到内含子的5'端上(通过通常的磷酸二酯键)。当线性的内含子成为环状时，其3'端可连接在距离5'端15个核苷酸之处，从而将原来5'端和15个碱基的节段(包括G在内)排除出去。这种反应基本上是一种磷酸酯转移反应。外显子A的3'-OH基可直接和外显
子B的5'端相连接。亦即一个磷酸酯可以直接被转移到另一个上去，不需要经过中间步骤(如水解作用之类)，因此磷酸酯键的能量被保存着。这解释了为什么此反应不需要水解ATP或GTP来供应能量。同时，两次磷酸酯转移反应似乎是紧密相连的，因为始终没有找到过游离的外显子(A或B)。而线性内含子的环化则可以被看作是第三个磷酸酯转移反应。在体外系统中进行剪接时，并不需要蛋白质的存在。RNA有能力自行剪接，故称为自身催化作用(auto catalysis)。
T.Cech和S.Altman各自独立地发现RNA具有催化作用。从而
Nobel l 改变了生物催化剂的传统概念。为此他们共同获得了1989年Nobe 化学奖。1978年Altman从纯化的RNA酶P中分离出一种多肽和一种RNA(M1RNA)。最初的实验结果表明，蛋白质和M1RNA单独都没有酶活性，但二者混合在一起又可恢复活性。其它生物材料的实验结果表明M1RNA是RNA酶P活性所必须的。1983年Altoman证
tRNA A 明，在较高浓度的Mg2+存在下，单独的M1RNA就可以催化tRN 前体的成熟，而单独的蛋白质则没有这种能力。这样，RNA即可看作是个酶。事实上，M1RNA的酶活性并不比RNA酶P的粗制品的活性低。原来认为蛋白质赋予酶的活性，RNA只起某种辅助作用(例
如帮助蛋白质与其底物结合)，但现在发现这两种功能已经倒转。Cec
Cech h 给具有催化活性的RNA定名为ribozyme。
很长时间以来，人们就试图自己设计和生产酶分子，但因蛋白质分子结构上的复杂性，迄今为止，尚无成功的例子。近年来随着ribozyme的发现，人工酶(新概念下的酶，它的构件分子是核苷酸)的设计又产生了新的希望。澳大利亚的科学家就设计了九个ribozyme分子，它们都具备内切酶的活性，且切割位点有高度特异性。同时，ribozyme的活性随pH、温度、及阳离子浓度的变化而变化，显示出典型的酶特性。由于ribozyme的作用位点高度特异，故可以用来切割特定的基因转录产物(RNA)。有人将这种切割作用叫做抗基因活性。因为切割的结果破坏了RNA，也就是抑制了基因的表达。这种特性为我们进行基因和病毒的治疗提供了一个可行的途径。
某些线粒体中的内含子也是自身剪接的内含子。一些常见的真菌，如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)，酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的线粒体内含子都能进行自身剪接，像四膜虫中进行的磷酸酯转移反应一样。
能够编码蛋白质的内含子
某些真菌线粒体中的内含子有很不寻常的结构，这些内含子有编码顺序，这些顺序的翻译对于该顺序所在的内含子的剪接是必须的。编码细胞色素b的box基因在仅剪去内含子1时，会产生RNA成熟
酶的mRNA。当内含子2亦被剪去时，才是细胞色素b的编码顺序的开端。线粒体中的box基因是编码细胞色素b(cytb)的。box基因中的外显子1有417bp，编码cytb的N端139个密码子。内含子1有765bp，不编码。外显子2非常短，仅有5个密码子。其后是一个很长的内含子2。内含子2的特点是其开头840bp是一个开放读框(ORF)，有280个密码子，其最后一个密码子为终止密码子。当将内含子1剪去后，翻译即从外显子1起始，通读过外显子2而进入内含子2的ORF，产生一个有423个氨基酸残基的蛋白质(其中144个是cytb的N端氨基酸，279个则由内含子2编码，称为RNA成熟酶(maturase)。RNA成熟酶是特异地用来剪去内含子2的。这样，这个酶促反应便成为一个非常敏感的负反馈径路。去除内含子2后，外显子1和2即与外显子3相连接，因而破坏了编码成熟酶的顺序。细胞核中的剪接连接点
剪接连接点(splicing junctions)是指在切断和重接位点处的两旁的顺序。在内含子左侧的连接点称为供体(donor)，在内含子右侧的称为受体(acceptor)。在细胞核的结构基因(即编码多肽的基因)中的所有内含子在外显子-内含子连接处均有GT．..AG的共同顺序。较详细的共同顺序如下，供体位点受体位点：
...Py10CAG↓↓...外显子
外显子...AG
...AG↓↓GTAAGT...内含子...Py10CAG
箭头表示切断的键。这些还是较短的共同顺序，存在于几乎所有的真核生物中。
从上述共同顺序可见供体和受体位点之间并无互补现象，所以不可能想像这两个位点会通过碱基配对而结合一起，以便于内含子的切除。正确的剪接并依赖于天然前体RNA分子的完整性。一个外源基因如果存在于病毒顺序中，仍能很好地被剪接。另外，前体RNA亦能在不同的组织，或甚至不同物种的细胞中被正确地剪接。这都表示剪接作用是很保守的。一个真正基因中一个外显子可以和另一个基因的外显子连接起来。例如，将SV40(猴病毒40)的早期转录单位的第一外显子和小鼠β珠蛋白的第三外显子相连，这样形成的杂交内含子仍能正确地被剪接。即SV40的内含子的供体位点(1I)可以剪接到小鼠β珠蛋白的内含子的受体位点(r2)上。
套索的产生
HeLa细胞的核提取液能够剪接纯化的RNA前体，这表示剪接作用并不与转录作用相关连。RNA的修饰也和剪接无关，例如珠蛋白RNAs即使缺少poly(A)尾链，也没有加帽，仍能正常地被剪接。剪接过程可分为两个阶段，与上文所述自身剪接不需能量不同，核内剪接需要用ATP。
在第一阶段中，内含子左端(供体位点)处被切断，形成两个分离的RNA分子，即左外显子和右内含子-外显子。左外显子此时为-线性分子，但右内含子-外显子则不然:内含子左端(5'端)以5'-2'键与在内含子右端上游约30碱基处的CTGAC序列(共同序列)中的A相连接，于是形成一个"套索"(lariat)"。在第二阶段，在受体位点处被切断而将此套索状的内含子剪去;同时分离的右外显子即与左外显子相连接。套索然后被"脱支(debranch)"而形成一线性内含子。在这种剪接机构中，有三个很短的共同顺序，即供体和受体位点处于一个和套索分支处的一个序列。用酵母做的实验证明:分支处的共同顺序如果发生突变或缺失将使剪接不能进行。这个共同顺序常称为TACTAAC盒。它和左侧的供体位点共同顺序互补，但研究证明两者并不发生碱基配对。在高等真核生物中此分支靶顺序的保守性较小。
snRNAs的作用
真核细胞有细胞核和细胞浆中都含有许多
小RNA，它们约有100到300个碱基，每个细
胞中可含有105-106个这种RNA分子。它们是
由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ所合成的，其中某些像
mRNA一样可被加帽。在细胞核中的小RNA称
为snRNA，而在细胞浆中的称为scRNA。但在天然状态下它们均与蛋白质相结合，故分别称为snRNP和scRNP。某些snRNPs和剪接
作用有密切关系。有些snRNPs分别和供体及受体剪接位点以及分支顺序相互补。snRNAs中最受注意的一个是U1，它普遍存在于哺乳动物、鸟类和昆虫细胞中。人U1snRNP中除RNA外还8个蛋白质分子。人U1snRNA的可能二级结构如图。其5'端的11个核苷酸是单链的，并有一段和内含子左侧的供体序列互补。在供体位点处的互补序列通常为4-6bp。在体外，完整的U1snRNP粒子能和左侧共同顺序结合，但纯化的U1snRNA却不能。U1snRNA参与剪接的证据是抗U1snRNP的抗体可以在体外抑制剪接作用;而且如果从系统中将U1snRNP除去，剪接即不能进行。事实上，除去U1sn RNA5'端的几个核苷酸即可抑制体外剪接作用。
U5snRNA A能识别右侧(受体位点)共同顺序;而U2snRNA，有可能U5snRN
U2snRNA A
U2snRNP P的抗体可以和U2snRN 则具有与分支位点互补的顺序。抗U2snRN
及包括分支位点在内的内含子所形成的复合体发生免疫沉淀。U1和U2可能参与剪接反应的起始阶段，因为U1和U2的灭活将阻止左侧连接点的切断和套索的形成。另外两个snRNAsns(U4和U6)可能亦参与剪接作用，但它们的功能尚不详。一般认为，脊椎动物细胞有6种不同的snRNAs，称为U1、U2、U3、U4、U5和U6。最小的是U6，有约100核苷酸长。最大的是U3，也不过215核苷酸长。它们和蛋白质结合成snRNPs。系统性红斑狼疮(SLE)患者和某些风湿病患者的血清中常可检出对snRNPs中某些蛋白质的自身抗抗体。
核内不均一RNA
编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转录的。但是核浆中的RNA 却并不像mRNA 。核浆RNA 要大得多，很不稳定，并且其顺序的复杂性也要大得多。由于它的大小很不一致，故称核内不均一RNA(hnRNA)。已经证明mRNA 确实是从hnRNA 生成的。细胞浆内的mRNA 平均只有1800-2000个碱基。而哺乳动物的hnRNA 平均有8000-10000个碱基，其范围很广泛，从2000-14000碱基均有，所以一般要比mRNA 大4-5倍。如果以5倍计算，由于正常哺乳动物细胞中测得mRNA 仅占hnRNA 量的5%，则相当于有25%的hnRNA 可转变为mRNA 。这意味着有3/4的hnRNA 即在核内降解。hnRNA 被切除内含子后即成为mRNA ，并进入细胞浆内。但在切除内含子之前，hnRNA 可先加帽和加poly(A)尾链。有一种称为poly(A)
聚合酶的酶可以用ATP 为底物，以加上poly(A)尾链，这是hnRN hnRNA
A 转变为成熟的mRNA 所必须的。在哺乳动物细胞中，仅约30%的
hnRN hnRNA A 被多聚腺苷酸化，而mRN mRNA
A 中却约70%是有poly(A)尾链的。可能多聚腺苷酸化是hnRNA 分子要被加工的信号。hnRNA 的尾端要被切去一段，然后才加上poly(A)。因为RNA 聚合酶在转录时即已通过了相当于加上poly(A)的位点，故hnRNA 尾端的多余部分要由内切核酸酶切去，才能加上poly(A)。
RNA剪接 RNA剪接（RNA splicing）是指从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。通过不同方式的RNA剪接，－种基因可在不同的发育分化阶段、不同的生理病理条件或不同的细胞、组织中合成不同的蛋白质。果蝇的性别就是通过不同的剪接途径完成的。在Science这篇文章中Li等人发现了一个Archaeglobus fulgidus的RNA剪接内切酶（RNA splicing endonuclease），为了解所谓的“生物分子”（即有机分子，包括蛋白质，核苷酸等）结构提出了新的观点见解。这项研究主要是利用了X射线结晶方法（X-ray crystallography）解析生物分子的三维结构，而对于生物分子的形状以及相关的化学性质的了解是科学家们探索生物分子维持细胞生命活动机理的基础。 而在另一篇文章中，Li和来自PTC Therapeutics（一家生物制药公司）的技术人员讨论了有关内含子结构剪接的相关发现：通过对真核tRNA剪接内切酶的分析，发现了一个以前从未发现的对于其催化作用有影响的活性位点。 这些发现可以帮助科学家们了解细胞中分子识别以及相互作用的基本化学与物理机理，FSU的Timothy Logan教授认为这项工作是为理解生物分子功能提供了重要信息，而且也为许多健康问题提出了新的治疗方案。 Related fig: Hypothetical model of the cation-πsandwich of the eukaryotic tRNA-splicing endonuclease. (版权归原作者所有)
RNA剪接因子hnRNP的结构与功能研究进展 动物遗传育种刘小艳 2005414 摘要RNA剪接是一个多步骤、形成多种中间状态复合物的复杂过程，尽管在已经发现的一百多种pre-mRNA剪接相关因子中，仅研究了约8%相关蛋白质的空间结构，已充分显示对剪接相关因子三维晶体结构以及溶液结构的测定与研究，在理解RNA剪接的复杂机理以及生物学特性中具有不可替代的重要意义． 关键词RNA剪接，hnRNA结合蛋白，剪接体，晶体结构，溶液结构 原核生物中mRNA的转录与翻译几乎是同步发生的，而真核生物，转炉是发生在细胞核内，翻译则在核外进行。真核生物RNA尤其mRNA分子的寿命较长，在5’和3’两个末端都要受到修饰。而RNA剪接(RNA splicing)是tRNA、rRNA，特别是mRNA加工与成熟的重要生物学过程，也是蛋白质分子多样性产生的关键机制之一。RNA剪接需要多种因子参与，包括杂性核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)，结合蛋白hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)，小型核RNA (small nuclear RNA，snRNA)，结合蛋白snRNP(small nuclear ribonucleoprotein)等。在真核细胞内，RNA原初转录物的分子很大，通过剪接产生成熟的mRNA分子。hnRNP与hnRNA结合形成核酸蛋白质复合物hnRNPP(hnRNP particles)可穿梭于细胞核与胞质之间，具有转运和剪接RNA的作用。另一方面，snRNP与细胞核内snRNA (分子质量为100-200 nt 的小RNA)紧密结合，而构成核内小核酸蛋白质复合物snRNPP(snRNP particles)，参与RNA剪接、多聚腺苷化以及转录拷贝3’端的成熟。 最近，Reed等通过蛋白质组学方法证明，与pre-mRNA剪接相关的蛋白质因子大约有145种，它们参与RNA剪接过程中的不同环节[1]。托普霉素亲和层析［2］(tobramycin affinity-selection) 以及麦芽糖亲和层析［3] (maltose-binding affinity)等方法能识别和分离70种以上的相关剪接蛋白质。由于RNA 剪接机制愈来愈受到国内外同行的关注，在最近几年中，部分pre-mRNA 剪接因子，尤其hnRNP的晶体及溶液结构获得了一些研究成果，为阐释RNA剪接的复杂机制提供了至关重要的信息。 1 hnRNP的结构与功能 hnRNP-A1 (又名解链蛋白1，unwending protein 1，A1)是真核细胞核hnRNPP 复合物中含量十分丰富的分子．A1能与pre-mRNA结合，形成hnRNPP 复合物，并通过对几种富含Ser／Arg剪接因子的拮抗，以球状(globa1)调节因子的方式参与RNA 交替剪接(alternative splicing)，表现为选择性地跨过某些外显子，实现5’端交替剪接。A1蛋白不断地穿梭在细胞核和胞质之间，能将polyA+ mRNA从细胞核运输到胞质，该过程的调节与其C端富含Gly结构域的结构相关［4]。了解hnRNP A1与RNA相互作用中空间结构方面的信息，将有助于揭示RNA穿过细胞核膜以及剪接过程中的分子细节。
mRNA前体的加工过程有哪些步骤 ?浏览：1881 ?| ?更新：2012-11-20 12:43 原核生物转录作用生成的mRNA属于多顺反子mRNA，即由操纵子机制控制生成的一条mRNA可编码几种不同的蛋白质。原核生物转录生成的初级转录本mRNA不需经过复杂的加工过程即可表现功能，惟一的加工过程是多顺反子mRNA在RnaseⅢ的催化下裂解为单个的顺反子。 真核生物转录生成的是单顺反子mRNA，其前体是非均一RNA(hnRNA)。hnRNA加工过程包括 方法/步骤 1.剪接 真核生物的基因是一种断裂基因，即其结构基因由若干编码序列和非编码序相间排列而成，其中为蛋白质编码的可转录序列称为外显子，不为蛋白质编码的可转录序列为内含子。转录合成的hnRNA需经过剪接、切掉内含子部分，然后再将外显子部分拼接起来。该过程有多种酶活性物质(包括snRNA)参与。
2.5′末端加“帽” 真核细胞成熟mRNA的5′末端均有一个特殊的结构，即m7Gpp-pmnNp，称为“帽”。帽的生成是在细胞核内进行的，但胞浆中也有酶体系，动物病毒mRNA 加帽过程就是在宿主细胞的胞浆内进行的。 3.3′末端加“尾” mRNA前体分子的3′末端有一段保守序列，由特异的核酸内切酶切去多余的核苷酸，然后在多聚A聚合酶的催化下，由ATP聚合生成多聚A尾。该反应在核内发生，在胞浆中也可继续进行。 4.碱基修饰 mRNA分子中有少量稀有碱基(如甲基化碱基)是在转录后经化学修饰(如甲基化)而形成的。 5.选择性加工 某些MRNA前体含有多个3‘剪切位点和多聚腺苷酸化位点，因此利用这些选择性位点可产生具有不同3'端非编码区或者具有不同编码能力的RNA产物。 通过可变剪接途径可以挑先最保留在MRNA中的外显子，结果单个基因可以合成多种不同的蛋白质。 6.RNA编辑 在合成并经RNA编辑加工之后，MRNA分子的序列可以发生改变。个别核苷酸可以被置换，添加或者删除。编辑过的MRNA翻译产生了较短脱脂基蛋白B48，由于基缺少一个结合受体的蛋白结构域，因此功能受限。还有好多
RNA的剪接机制 酶母tRNA的剪接 RNA的剪接就是要把断裂基因的转录本中的内含子除去。酵母细胞核中400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。这些基因均只有一个内含子，位于与反密码子的3'侧相隔一个核苷酸之处，长度为14至46bp。不同氨基酸的tRNA基因中的内含子不相同，因此，剪接酶类看来并不能识别任何共同顺序。所有内含子中均有一段与tRNA的反密码子互补的序列，因而使反密码臂的构象发生了改变，即反密码子被配对而使反密码臂伸长了很多。在前体中仅反密码臂受到影响，tRNA分子的其他部分仍保持其正常结构。 酵母tRNAphe中的内含子能与其反密码子碱基配对，从而改变了反密码臂的结构。此剪切过程可分为两个阶段。第一步是磷酸二酯键的断裂，这不需要ATP。这一步由一种内切核酸酶所催化。第二 ATP P 步是连接反应，需要ATP的存在，由RNA连接酶所催化。在无AT 时，产生的两个tRNA半分子不能连接起来。这两个半分子具有独特 ATP P 的末端:其5'端有OH基，而3'有一个2'，3'-环磷酸基。当加入AT 时，即发生第二步反应:两个tRNA半分子先发生碱基配对，形成成熟tRNA分子的构象，然后由RNA连接酶形成磷酸二酯键而将两个半分子共价连接起来。2'，3'-环磷酸基的存在并不限于酵母，在植物和哺乳动物的tRNA剪接反应中也有环状基团的产生。在人的HeL HeLa a 细胞中，RNA连接酶能将带有2'，3'-环磷酸基的RNA和另一带有
5'-OH基的RNA直接连接起来。酵母tRNA前体也可以在爪蟾的卵母细胞核提取液中正确地被剪接。这表示剪接反应没有种属特异性。爪蟾具有能识别酵母tRNA的内含子的酶类。 自身剪接反应 以前一直认为只有蛋白质有酶活性。这个概念在生物化学界已根 RNA A 深蒂固。然而近期发现RNA也可有酶活性。这种有酶活性的RN 有人称之为ribozyme。 一种四膜虫Tetrahumenathermophila的两个主要rRNAs的基因和其他真核生物相类似(见前文)，被转录在同一个初级转录本中。此转录本称为35S前体RNA，较小的rRNA的序列在5'侧，较大的rRNA(26S)序列则在3'侧。在编码26SrRNA序列存在一个单一的，短的(约400bp)内含子。如将这个35S前体RNA在体外温育，可以发生自动剪接作用:内含子从前体中被切出，先呈线性RNA片段，后来又环化为环状RNA。这个反应仅需要加入一种一价阳离子，一种二价阳离子，和一种鸟嘌呤核苷酸(G)。其他碱基均不能代替G.但并不一定需要GTP;GDP;GMP和鸟苷都可以应用。这表示此反应并不需要能量供应。此外，此鸟嘌呤核苷酸必须有一个游离的3'-OH基。这个G要连接到内含子的5'端上(通过通常的磷酸二酯键)。当线性的内含子成为环状时，其3'端可连接在距离5'端15个核苷酸之处，从而将原来5'端和15个碱基的节段(包括G在内)排除出去。这种反应基本上是一种磷酸酯转移反应。外显子A的3'-OH基可直接和外显