白喉病原学检测方法
病原学操作细则
1 目的
从病人咽部假膜或鼻咽部采集标本分离病原体。
2 适用范围
本操作细则适用于白喉杆菌的分离。
3 职责
检测人员：负责按照本操作细则对白喉杆菌的培养。
复核人员：负责对白喉杆菌菌的培养操作是否规范及细菌生长状态进行复核。
科室负责人：负责对科室综合管理。
4 方法原理
白喉杆菌在适应的培养基能良好生长。
4.1 白喉杆菌的分离培养和鉴定
从病人咽部假膜或鼻咽部采集标本分离病原体。
4.2 标本的采集
4.2.1 病人
以无菌棉拭子或无菌棉拭子吸附新鲜配制的亚碲酸钾、甘油盐水保存液从疑似患者咽喉假膜边缘蘸取标本或同时采取鼻咽拭子，放入灭菌试管内同时送检。
4.2.2 带菌者或疑似病人
由于未见到明显的假膜，故应采集鼻咽部或扁桃体粘膜上的分泌物送检。
4.3 鼻咽拭子接种吕氏血清斜面或亚碲酸钾培养基等作细菌培养观察鉴定
4.3.1 菌型
革兰氏阳性细长杆菌呈棒状，排列不规则，常呈人字形、栅栏状。庞氏染色可见异染颗粒。
4.3.2 培养及生化特性
白喉杆菌在血平板上形成灰白色、圆形光滑菌落，有溶血环。在亚碲酸钾血平板上，菌落呈中心黑色或灰黑色，边缘带灰色。在尿素卵黄双糖培养基上，经37℃12～48h培养后可做初步鉴定。白喉杆菌发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖，产酸不产气，不发酵乳糖、甘露醇，一般不分解蔗糖。不产生吲哚，能还原硝酸盐，酶阳性，氧化酶阴性，不液化明胶，不分解尿素。重型白喉杆菌能分解淀粉、糖原和糊精，迟缓分解蔗糖。依据形态、培养、生化特性可将白喉杆菌分为轻、中、重三型。
4.2 毒力试验
白喉是由白喉杆菌引起的急性传染病，其致病因素为外毒素。抗原性强，毒性剧烈。白喉杆菌不是所有菌株都有毒力，只有那些携带β－棒状杆菌噬菌体的菌株才能产生外毒素。毒力试验可测定白喉杆菌产生外毒素的能力，常用的方法有两种。
4.2.1 艾立克(Elek)氏平板毒力试验
将Elek培养基加热熔化，冷却至50℃左右，加入正常无菌(兔或牛)血清2mL，混匀后用无菌镊子取预先制好的白喉抗毒素(每毫升含5000～10000u)，干燥滤纸条贴于平板中央表面，臵37C 孵箱内约0.5h，烘干表面水分，时间不宜过长，以免影响结果。
将试验菌株划线接种于平板上成一直线，使其与抗毒素滤纸成直角相交。同一平板可同时接种4～5个标本。同时要用已知有毒菌株作阳性对照。于37℃培养48～72h，如发育良好即可观察结果。阳性者于距纸条稍远处沿接种线开始有絮状沉淀弧出现。若干72h仍未出现沉淀弧者可作阴性报告。
4.2.2 豚鼠皮内接种毒力试验
将待试菌株接种吕氏血清斜面，于37℃培养16～18h，加肉汤1mL，刮下菌苔，使成悬液，吸取此菌液0.5mL，加入3.5mL肉汤中，混匀后即可应用。同时要用已知有毒菌株作对照。
选体重250g左右豚鼠两只，一只在试验前24h腹腔注射白喉抗毒素1000u，作为对照动物；另一只不注射抗毒素，作为试验动物。接种前先将动物腹部向上，固定在架上。以温水洗净腹部后剃毛。剃毛后再用无菌生理盐水擦洗一次待干，用1mL注射器吸取菌液，准确注射0.1mL于皮内，可同时接种6～8株菌。注射后4h，给试验动物注射抗毒素4000u，以免因毒株毒力太强而致死。
注射后经24、48、72h，各观察皮内反应一次。对照动物无论接种有毒或无毒菌株，均应无局部反应；试验动物在注射有毒株的部位，于24h呈红肿，48h在红肿部位边缘有化脓性病变，72h 可见硬块，出现灰黑色坏死斑，无毒的菌株则无病变。动物毒力试验也可应用家兔及小鸡作试验动物。
4.3 白喉毒素试验(锡克氏试验)
白喉毒素试验可用于测定机体对白喉的易感性及判断白喉预防接种后是否产生免疫力。4.3.1 方法
在两前臂掌侧上1/3处，左臂皮内注射白喉毒索液0.1mL，右臂皮内注射对照液0.1mL。4.3.2 反应的观察与判断
阴性反应：两臂注射处无任何反应为阴性反应。两臂注射处稍有红色硬块，颜色较浅，界线不清，红色消退快，不留痕迹，在24～36h最为显著，48～72h基本消退，为假阳性。阴性和假阳性反应表示对白喉有免疫力，但感染量大时仍可得病。
阳性反应：注射对照液处呈阳性反应或假阴性反应(48～72h基本消退)，而注射试验液处呈现红色团块，界线分明，直径达1cm以上，通常于注射后24～48h开始出现，72～96h最明显，7d 以后逐渐消退，遗留一个褐色斑，数周至数月后可以退净。阳性反应表示对白喉无免疫力。
4.4 血清学诊断方法
4.4.1 间接血凝法测定白喉抗体
⑴原理
间接血凝法是利用红血球作为载体，并经过一定处理后，使蛋白质抗原吸附于红血球表面，此种血球称为致敏血球。然后用致敏血球来测定相应的微量抗体。当特异抗体存在时，发生抗原
抗体结合，血球就出现凝集，为阳性反应。
⑵材料
A、白类致敏血球：敏感度均不能低于0.003906IU/ml
B、标准抗毒素：用前需进行56℃30分钟灭活，用于测定致敏血球效价
C、96孔U型血凝板
D、25ul加样器及25ul的多孔移液器。
⑶待检血清处理
A、经56℃30min灭活。
B、醛化血球吸收。吸收方法：待检血清1份加50％醛化血球2份，放37℃1～2h，离心沉淀，吸取上清即为1∶2稀释的血清样品。
⑷待检血清滴定
先在血凝板中每孔加入0.5％兔血清生理盐水一滴(0.025mL)，再将待检血清用微量滴管滴入第一孔中(0.025mL)，使与0.5％兔血清生理盐水混合，注意不要发生气泡，混匀血清后，每孔均取0.025mL，加入到第二孔中。混匀后自第二孔中吸出0.025mL到第三孔中，如此类推，最后一孔取出0.025mL弃掉。或用0.025mL的稀释棒自第2孔开始作系列稀释。用微量滴管吸取0.025mL0.5％致敏血球加到每个孔中，加时滴管勿碰到孔壁，以免沾有抗血清。然后摇匀，放37℃2h取出，放2～10℃冰箱内次日晨判读结果，以“＋＋”为凝集试验终点。每份待检血清可做三个稀释度抗血清加鞣酸血球的对照，稀释方法如前所述(即1∶2，1∶4，1∶8)，以排除血清中非特异凝集。
⑷结果计算
待检血清单位＝待检血清终点稀释度×标准血清终点稀释度所含单位数。例如标准白喉抗毒素(10 IU/mL)终点稀释度为1∶2048，含有0.004 8 IU/mL，而待检血清终点稀释度为1∶8，于是其单位为0.038 IU/mL。
⑹结果判定标准
A、凝集的红血球均匀地铺在孔底形成一薄层为“＋＋＋＋”；
B、凝集的红血球基本同a)，只是在此薄层的底部有一很弱红圈为“＋＋＋”；
C、凝集的红血球在孔底形成的薄层，同时中间可见一松散的红圈为“＋＋”；
D、凝集的红血球在孔底形成一圆圈，周围可见少量的红血球比对照圆圈稍大为“＋”；
E、血球在孔底形成紧密的圆圈成圆点为“－”。影响血凝试验的准确性与敏感度因素很多，如用具的清洁，材料的标准化，操作的细致等。
4.4 酶联免疫吸附试验检测白喉毒素抗体
4.4.1 原理
利用包被在固相载体上白喉类毒素捕捉待检血清中相应抗毒素抗体，再用酶标记的抗人IgG 抗体去掉反应(抗原－抗体－酶标记抗抗体)，利用底物使酶显色而测知是否存在抗体。
4.4.2 材料
⑴抗原：精制白喉类毒素1110Lf/mL。
⑵结合物：羊抗人IgG酶标记抗体。
⑶载体：1cm×4cm聚苯乙烯塑料管平底带盖。
⑷底物：邻苯二胺。
⑸参考血清
多份间接血凝法阳性高效价血清混合为阳性参考血清，多份阴性血清混合为阴性参考血清。
⑹被检血清：白喉暴发流行区的病人和健康者。
⑺测定仪：721型分光光度计。
4.4.3 方法及步骤
⑴包被抗原量及被检血清最适稀释倍数的确定
用阳性及阴性参考血清与抗原作方阵式滴定，确定本试验包被抗原浓度为20μg/mL，被检血清最适起始稀释度为1∶40。
⑵参考血清标准曲线绘制
阳性及阴性参考血清均从1∶40开始至10240二倍法稀释，反应结果用721型分光光度计测光密度OD值，γ＝492nm。本试验取三次测定结果的均值，以血清稀释度为横坐标，相对应的OD值为纵坐标，画曲线；然后用相关回归法确定OD值与血清稀释倍数相对应的标准曲线。阳性血清最高OD值为0.6，最低为0.1。因阳性和阴性血清呈明显差别的界限OD值为0.3处，故确定OD值大于等于0.3为阳性，其所对应的血清稀释度为1∶2560，即为一个单位。每份被检血清稀释度为1∶40，效价从标准曲线查出。经测算，两系数的P值皆小于0.01。
⑶抗原包被
每管加已稀释好的抗原1.0mL，放4℃过夜，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液(P.B.S)－吐温20洗涤三次，两次之间静止3min。
⑷加被检血清1.0mL，臵室温2h，再洗涤三次，方法同前。
⑸加结合物(1∶8000)1.0mL，室温2h，洗涤同前。
⑹加底物液(0.04％)1.0mL，室温下30min，加2mol/L硫酸0.015mL，如终止反应立即测OD 值。
4.1 光度分析法[5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 4.1.1试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc －HAc 缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取1.020 g β-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L 标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取0.5g 茚三酮溶于100ml 蒸馏水中，得到5g/L 的茚三酮水溶液。 4.1.2标准曲线的确定 分别准确移取0.30ml 、0.40ml 、0.50ml 、0.60ml 、0.70ml 、0.80ml 、0.90ml 、1.00ml 标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml 再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 4.1.3样品的测定 稀释待测液于0.24mg/ml —0.73mg/ml,调pH 值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 4.1.4 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml —0.73mg/ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1： 0.20.30.40.50.60.70.80.9 1.0 1.1 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 吸光度加入标液体积(ml) B 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热10min ，β-氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH=6.00 4.1.5样品的测定分析 将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的
食物中氨基酸的测定方法 测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。 一、氨基酸自动分析仪法 1.原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。 2.适用范围 GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。 本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定 3.仪器和设备 3.1真空泵 3.2恒温干燥箱 3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。用去离子水冲洗干净并烘干。 3.4真空干燥器（温度可调节） 3.5氨基酸自动分析仪。 4.试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 4.1浓盐酸：优级纯 4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。 4.3苯酚：需重蒸馏。 4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L 4.5缓冲液： 4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2 4.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。 4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 4.6茚三酮溶液 4.6.1 pH 5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.2。 4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1）50ml
食物中氨基酸的测定方法 测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。 一、氨基酸自动分析仪法 1.原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。 2.适用范围 GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。 本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定 3.仪器和设备 3.1真空泵 3.2恒温干燥箱 3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。用去离子水冲洗干净并烘干。 3.4真空干燥器（温度可调节） 3.5氨基酸自动分析仪。 4.试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 4.1浓盐酸：优级纯 4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。 4.3苯酚：需重蒸馏。 4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L 4.5缓冲液： 4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2
4.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。 4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 4.6茚三酮溶液 4.6.1 pH 5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.2。 4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1）50ml加入4g 水合茚三酮（C9H4O3.H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O6.2H2O）搅拌至完全溶解。 4.7高纯氮气：纯度99.99%。 4.8 冷冻剂：市售食盐与冰按1：3混合 5.操作步骤 5.1样品处理：样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。 5.2称样：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在10～20mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。将称好的样品防于水解管中。 5.3水解：在水解管内加6mol/L盐酸10～15ml（视样品蛋白质含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。 打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50ml 容量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1ml于5ml容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用1～2ml水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mlpH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。 5.4测定：准确吸取0.200ml混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释到5ml，此标准稀释浓度为5.00nmol/50μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标
新增附录 附录XX 氨基酸分析法 氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。 根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，具体水解方法由各品种项下规定。蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。 本法包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一种茚三酮柱后衍生法。不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。 由于本法衍生过程中衍生溶液量较少，且容易挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采用内标法进行测定，内标的确定由各品种项下规定。在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理，使其转化为稳定地产物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生测定，具体方法由各品种项下规定。在测定过程中，可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类，对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。 第一法 PITC柱前衍生氨基酸分析法 本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～1.25μmol/ml。 试剂（1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。（2）流动相B 乙腈－水（8：2）。 对照品溶液按各品种项下规定的方法制备。 供试品溶液按各品种项下规定的方法制备。 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm，5μm）；流速为每分钟 1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下：
五、导尿管拔管指针评估： 1、是否每日评估留置尿管的必要性：是□否□ 2、导尿管拔管指针评估表： 评估内容评价 结论 评估 日期 评估内容 评价 结论 评估 日期 可自主排尿导 管 阻 塞 导 管 脱 出 密 闭 系 统 破 坏 尿 路 感 染 征 兆 拔 除 尿 管 更 换 尿 管 继 续 留 置 拔管 日期 可 自 主 排 尿 尿 管 阻 塞 尿 管 脱 出 密 闭 系 统 破 坏 尿 路 感 染 征 兆 拔 除 尿 管 更 换 尿 管 继 续 留 尿 拔管 日期 留置 尿管 天数 留置 尿管 天数评估人签字：评估人签字： 评估内容 评价 结论 评估 日期 评估内容 评价 结论 评估 日期 可自主排尿导 管 阻 塞 导 管 脱 出 密 闭 系 统 破 坏 尿 路 感 染 征 兆 拔 除 尿 管 更 换 尿 管 继 续 留 置 拔管 日期 可 自 主 排 尿 导 管 阻 塞 导 管 脱 出 密 闭 系 统 破 坏 尿 路 感 染 征 兆 拔 除 尿 管 更 换 尿 管 继 续 留 置 拔管 日期 留置 尿管 天数 留置 尿管 天数评估人签字：评估人签字： 评估内容 评价 结论 评估 日期 评估内容 评价 结论 评估 日期 可自主排尿导 管 阻 塞 导 管 脱 出 密 闭 系 统 破 坏 尿 路 感 染 征 兆 拔 除 尿 管 更 换 尿 管 继 续 留 置 拔管 日期 可 自 主 排 尿 尿 管 阻 塞 尿 管 脱 出 密 闭 系 统 破 坏 尿 路 感 染 征 兆 拔 除 尿 管 更 换 尿 管 继 续 留 尿 拔管 日期 留置 尿管 天数 留置 尿管 天数评估人签字：评估人签字： 评估内容 评价 结论 评估 日期 评估内容 评价 结论 评估 日期 可自主排尿导 管 阻 塞 导 管 脱 出 密 闭 系 统 破 坏 尿 路 感 染 征 兆 拔 除 尿 管 更 换 尿 管 继 续 留 置 拔管 日期可 自 主 排 尿 导 管 阻 塞 导 管 脱 出 密 闭 系 统 破 坏 尿 路 感 染 征 兆 拔 除 尿 管 更 换 尿 管 继 续 留 置 拔管 日期 留置 尿管 天数 留置 尿管 天数评估人签字：评估人签字：
光度分析法[5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 的NaAc －HAc 缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取 g β-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=缓冲溶液中，得到C = g/L 标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取茚三酮溶于100ml 蒸馏水中，得到5g/L 的茚三酮水溶液。 标准曲线的确定 分别准确移取、、、、、、、标准液于8个比色管中，用pH=的缓冲溶液稀释到再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 样品的测定 稀释待测液于ml —ml,调pH 值到，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在ml —ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1： 吸光度加入标液体积(ml) 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热10min ，β-氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH= 样品的测定分析 将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=
临床病原学检测与标本的正确留取 痰液标本采集与运送 ?痰液由气管、支气管和肺泡所分泌 ?正常情况下分泌物甚少，呼吸道粘膜受刺激时，分泌物增多，但多为清晰、 水样，无临床意义。 ?病理情况下痰量增多，呈不透明并有性状改变 采集目的 一般可用于普通细菌、分枝杆菌、真菌和军团菌的涂片或培养检测，经气管穿刺吸引物可用于厌氧菌的检测。 一般原则 1采集标本的最佳时机应在使用抗菌药物之前。 2宜采集清晨第二口痰液。 3对于普通细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续2～3天。不建议24小时内多次采样送检，除非痰液外观性状出现改变。 4怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检。 采集方法 1、自然咳痰与雾化倒痰法：无痰或痰量极少者可用3%～5%氯化钠溶液5ml雾化吸入约5min后留取痰液。如有可能，应在护理人员直视下留取清晨第二口痰。嘱咐患者留取前摘去牙托，清洁口腔，如刷牙后反复用生理盐水漱口；深吸气后用力自气管深部咳出痰液，置无菌容器内。应尽可能防止唾液及鼻咽部分泌物混入样品，不应用纸巾包裹痰液。 2、支气管镜法：鼻或口腔插入支气管镜。常用采集方法有经支气管镜吸引、支 气管肺泡灌洗、防污染毛刷采样或防污染支气管肺泡灌洗等。 3、经人工气道吸引法：进行手卫生后将一次性吸痰管末端拆开，连接吸引器， 调节吸引器置适宜负压（成人：40.0～53.3kpa;小儿：＜40.0kpa）。将一次性吸痰管外包装取出，戴手套持吸痰管试吸生理盐水，检查管道是否通畅。折叠一次性吸痰管末端，插入口腔或鼻腔或人工气道至适宜深度，放开吸痰管末端，轻柔、灵活、迅速地左右旋转上提吸痰管吸痰。见吸痰管内有痰液吸出，即折叠一次性吸痰管退出，将一次性吸痰管与吸引器分离（使用人工呼吸机者，一次吸痰时间不超过15s，高浓度氧气1～2min）。将痰液注入无菌容器（试管）内，如痰液粘稠可用一次性针筒向吸痰管末端注入少量生理盐水，将痰液冲入无菌容器（试管）内。 标本运送 ?痰以深咳排出后，应装于有密封瓶盖的无菌塑料容器中，以免感染自己或他 人。 ?标本应及时送检，室温≤3h。 ?若不能及时处理，可选择运送培养基运送和保存标本，但不应≥48h。 ?痰标本要求 白细胞（WBC）≥25/LPF。 ?鳞状上皮细胞（SEC）＜10/LPF。 ?如不符合上述指标，通知临床重新采样。
光度分析法 [5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 的NaAc －HAc 缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取 g β-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=缓冲溶液中，得到C = g/L 标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取茚三酮溶于100ml 蒸馏水中，得到5g/L 的茚三酮水溶液。 标准曲线的确定 分别准确移取、、、、、、、标准液于8个比色管中，用pH=的缓冲溶液稀释到再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 样品的测定 稀释待测液于ml —ml,调pH 值到，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在ml —ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1： 吸光度 加入标液体积(ml) 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热10min ，β-氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH= 样品的测定分析 将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=的缓冲液稀释到5ml 再加入1ml 茚三酮水溶液，在沸水中加热10min,测得如下数据如表3： 表3 样品的测定 待测液序号 待测液所对应的反应时间 吸光度A 1 10h 2 20h 3 22h
白喉病原学检测方法 病原学操作细则 1 目的 从病人咽部假膜或鼻咽部采集标本分离病原体。 2 适用范围 本操作细则适用于白喉杆菌的分离。 3 职责 检测人员：负责按照本操作细则对白喉杆菌的培养。 复核人员：负责对白喉杆菌菌的培养操作是否规范及细菌生长状态进行复核。 科室负责人：负责对科室综合管理。 4 方法原理 白喉杆菌在适应的培养基能良好生长。 4.1 白喉杆菌的分离培养和鉴定 从病人咽部假膜或鼻咽部采集标本分离病原体。 4.2 标本的采集 4.2.1 病人 以无菌棉拭子或无菌棉拭子吸附新鲜配制的亚碲酸钾、甘油盐水保存液从疑似患者咽喉假膜边缘蘸取标本或同时采取鼻咽拭子，放入灭菌试管内同时送检。 4.2.2 带菌者或疑似病人 由于未见到明显的假膜，故应采集鼻咽部或扁桃体粘膜上的分泌物送检。 4.3 鼻咽拭子接种吕氏血清斜面或亚碲酸钾培养基等作细菌培养观察鉴定 4.3.1 菌型 革兰氏阳性细长杆菌呈棒状，排列不规则，常呈人字形、栅栏状。庞氏染色可见异染颗粒。 4.3.2 培养及生化特性 白喉杆菌在血平板上形成灰白色、圆形光滑菌落，有溶血环。在亚碲酸钾血平板上，菌落呈中心黑色或灰黑色，边缘带灰色。在尿素卵黄双糖培养基上，经37℃12～48h培养后可做初步鉴定。白喉杆菌发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖，产酸不产气，不发酵乳糖、甘露醇，一般不分解蔗糖。不产生吲哚，能还原硝酸盐，酶阳性，氧化酶阴性，不液化明胶，不分解尿素。重型白喉杆菌能分解淀粉、糖原和糊精，迟缓分解蔗糖。依据形态、培养、生化特性可将白喉杆菌分为轻、中、重三型。 4.2 毒力试验 白喉是由白喉杆菌引起的急性传染病，其致病因素为外毒素。抗原性强，毒性剧烈。白喉杆菌不是所有菌株都有毒力，只有那些携带β－棒状杆菌噬菌体的菌株才能产生外毒素。毒力试验可测定白喉杆菌产生外毒素的能力，常用的方法有两种。 4.2.1 艾立克(Elek)氏平板毒力试验
临床病原学检测与标本的正确留取
4.不应从集尿袋中采集尿液。 5.尿液中不应加防腐剂或消毒剂。 6.若尿液培养前患者曾使用抗菌药物，应反复多次送检。 7.多次采集或24h尿不应用于尿液培养。 8.除非进行流行病学调查，不应对长期留置导尿管患者常规进行尿液培 养。 9.培养结果应结合临床表现、菌落计数以及微生物种类等，进行综合判断。 手术部位感染标本采集及运送 一般原则 ■在抗菌药物使用前，且仅在有临床感染症状或伤口恶化或长期不能愈合时采集标本。 ■皮肤或粘膜表面的清洁：1、闭合伤口和穿刺物标本：消毒方法同血培养标本的皮肤消毒；2、开放伤口：无菌生理盐水充分冲洗伤口部位。不可以用消毒剂。 3、采集新鲜的感染组织，避免采集浅表的组织碎屑。 4、若可以采集穿刺物或活检标本，应避免拭子标本。 ■容器：含有少量生理盐水的带螺纹口的无菌塑料容器。 ■采集方法： 封闭性脓肿：1注射器穿刺抽取浓度。2若无法抽到脓液，应先皮下注射少量无菌生理盐水，再次穿刺抽吸脓液；若脓液过多，应先切开引流，在基底部或脓肿壁采集标本。脓液的量以大于1ml为宜。3排除注射器内部及针头的气体用无菌橡皮塞封闭针头送检；或直接打入血培养瓶中。疑为厌氧菌，应迅速将脓液打入厌氧血培养瓶中。 组织和活标本：1、采集足够大的组织，体积以1mm3为宜，避免在坏死区域采集。 2、将小块的组织放在运输培养基内；较大的放在无菌容器中，并加入少量无菌生理盐水。 3、开放伤口：（1）无菌生理盐水彻底冲洗浅表部位，去除表面的渗出物和碎屑。（2）用拭子深入伤口的基底部或伤口-正常组织边缘采集两个标本，分别用于培养和革兰氏染色。 标本的标识：填写患者信息、标本类型（深部组织、表浅组织、脓肿和穿刺物等）、标本的来源（腹腔、腿和上臂等），记录标本采集的日期和时间及是否在使用抗菌药物前采集，选择检查项目（需氧培养或厌氧培养） 标本的送检：为了更好的分离病原菌，标本应在采集后的30min内送到实验
茚三酮显色法测定氨基酸的含量 一．原理： 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。 二．仪器： 721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。 三．药品： （1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液 （2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。用pH 检查校正。 （3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。 （5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。 茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。 还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。 乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。 四、操作步骤 1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 1 2 3 4 5
病原学检测每日一练(2014.7.3) 一、单项选择题（每小题均有1个正确答案，请从每小题的备选答案中选出你认为正确的答案，在答题卡相应位置上用2B铅笔填涂相应答案代码。每小题所有答案选择正确的得分；不答、错答、漏答均不得分。答案写在试题卷上无效。） 1、上肢出血应用止血带时不应捆扎在( ) A.上臂上1/3 B.上臂中上1/3 C.上臂中1/3 D.上臂中下1/3 E.上臂下1/3 2、男性，25岁，因车祸造成多发性损伤，急救时发现有窒息，腹部内脏脱出，股骨开放性骨折，病人血压低，脉微速。首先要处理的情况是( ) A.窒息 B.腹部外伤 C.股骨开放性骨折 D.休克 E.脉搏微弱 3、9%氯化钠溶液 B.5%葡萄糖生理盐水 C.5%碳酸氢钠溶液 D.平衡盐溶液 E.低低分子右旋糖酐 4、下列不属于物理性损伤的是 A.高温 B.低温 C.毒气 D.电流 E.激光 5、男性，34岁，头面部发生爆炸伤，急需行清创缝合术，清创过程中以下哪项有错( ) A.去除异物及坏死组织 B.伤后6—8小时内清创 C.若伤口污染重清创后可延期缝合 D.若受伤超过12小时，不宜清创缝合 E.伤后12小时内，经彻底清创可Ⅰ期缝 6、浅部软组织挫伤，何时可改用热敷( ) A.6小时 B.12小时 C.18 小时 D.24 小时 E.32小时 7、下列哪项不属于机械性损伤( ) A.切割伤 B.擦伤
C.挫伤 D.刺伤 E.放射线 8、成人躯干占体表面积的比例( ) A.20% B.22% C.23% D.25% E.27% 9、伤口边缘不整齐，周围组织损伤广泛，出血少，应为( ) A.刺伤 B.割伤 C.擦伤 D.撕脱伤 E.裂伤 10、关于清创术哪项有错( ) A.一般在伤后6-8h内进行 B.清除污物，切除失活组织，彻底止血 C.对伤后12h以内伤口，经彻底清创，可一期缝合 D.对颜面部创伤口，超过24h，不考虑清创缝合 E.对污染重的伤口，清创后可延期缝合 11、毒蛇咬伤后为减慢毒素吸收应 A.立即取坐位或卧位 B.立即甩动肢体 C.立即跑步到医院 D.原地走动 E.患肢抬高 12、5：1 13、有关损伤的急救和转运，下列哪项是错误的( ) A.外露骨折断端应及时复位 B.开放性伤口用无菌纱布覆盖，缠上绷带 C.四肢动脉大出血时可上止血药 D.脊柱骨折的伤员必须卧板床 E.已明确无颅脑及腹部内脏损伤而剧痛的患者，可注射止痛剂 14、重度烧伤后补液，晶、胶液体的比例正确的是( ) A.一般为l：l B.一般为l： 15、9mmol/L. 应考虑为( ) A.创伤性休克 B.右下肢挫伤 C.挤压综合征 D.右下肢闭合性损伤 E.右下肢血栓形成 16、按急救顺序对机械性损伤患者最先采取的措施是( )
一采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸 1.氨基酸测定原理： 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 2.测定氨基酸所用仪器: 真空泵;恒温干燥箱;水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。用去离子水冲洗干净并烘干;真空干燥器(温度可调节);氨基酸自动分析仪。 3.测定氨基酸所用试剂及其配制方法: 3.1试剂：全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 浓盐酸(优级纯);苯酚(须重蒸馏); 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L; 不同pH值柠檬酸钠缓冲液；氢氧化锂(LiOH·H2O)；冰乙酸(优级纯)；二甲基亚砜(C2H6OS)；水合茚三酮(C9H4O3·H2O)；还原茚三酮(C18H10O6·2H2O);NaOH；高纯氮气（纯度99.99%）；冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。 3.2试剂配制方法： 3.2.1. 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。 3.2.2. pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 3.2.3. 茚三酮溶液 pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至5.2。 茚三酮溶液：取150mL二甲基亚砜(C2H6OS)和乙酸锂溶液(3.6.1)50mL加入4g水合茚三酮(C9H4O3·H2O)和0.12g还原茚三酮(C18H10O6·2H2O)搅拌至完全溶解。 二.液相法测定氨基酸 柱前衍生法：参见文献（高效液相色谱柱-前衍生化法测定饲料中的含硫氨基酸 柱前衍生化反相高效液相色谱法测定板蓝根中的氨基酸 高效液相色谱法测定酶促反应液中的L-半胱氨酸含量） 1.仪器:Waters2695 HPLC; Waters2998 PDA检测器；电热恒温鼓风干燥箱 色谱柱：Phenomenex Luna C18 (250mm×4.6mm,5μm) 试剂：流动相A：0.1mol/L醋酸钠缓冲液（以醋酸调pH6.5）-乙腈（93:7） 流动相B：乙腈-水（4:1） 梯度洗脱 检测波长：254nm 2.试剂：衍生试剂：PITC(异硫氰酸苯酯)；浓盐酸；三乙胺；正己烷；苯酚；氨基酸标准品衍生化试剂的配制方法：1mol/L三乙胺-乙腈溶液：取三乙胺7mL加乙腈稀释至50Ml 0.01mol/L PITC-乙腈溶液：取PITC 60μL加乙腈稀释至50mL
＠＠［１］ Ｒüｄｅｎ Ｈ， Ｇａｓｔｍｅｉｅｒ Ｐ， Ｄａｓｃｈｎｅｒ ＦＤ， ｅｔ ａｌ． Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ａｎｄ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ－ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｒｍａｎｙ． Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ Ｓｔｕｄｙ （ＮＩＤＥＰ）． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， １９９７， ２５ ： １９９－２０２． ＠＠［２］刘又宁，陈民钧，赵铁梅，等．中国城市成人社区获得性肺炎 ６６５例病原学多中心调查．中华结核和呼吸杂志，２００６，３２： ３－８． ＠＠［３］ Ｌｉｕ Ｙ， Ｙｅ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００９，５３：２１６０－２１６２． ＠＠［４］中华医学会呼吸病学分会．社区获得性肺炎诊断和治疗指 南．中华结核和呼吸杂志，２００６，２９：６５１－６５５． ＠＠［５］汪复，朱德妹，胡付品，等．２００９年中国ＣＨＩＮＥＴ细菌耐药性 监测．中国感染与化疗杂志，２０１０，ｉ０： ３２５－３３４． ＠＠［６］王辉．下呼吸道标本的采集运送及处理中应注意的事项．中 华结核和呼吸杂志，２０１ １，３４：６５０－６５２． ＠＠［７］ Ｌｕｎａ ＣＭ， Ａｒｕｊ Ｐ， Ｎｉｅｄｅｒｍａｎ ＭＳ， ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｄｅｌａｙ ｔｏ ｉｎｉｔｉａｔｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ． Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ，２００６，２７ ： １５８－１６４． ＠＠［ ８ ］ Ｒｕｉｚ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ａ， Ｆａｌｇｕｅｒａ Ｍ， Ｎｏｇｕéｓ Ａ， ｅｔ ａｌ．Ｉｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｔｈｅ ｌｅａｄｉｎｇ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｅｔｉｏｌｏｇｙ？ Ａ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｌｕｎｇ ａｓｐｉｒａｔｅｓ ｉｎ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ－ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ． Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ， １９９９，１０６ ： ３８５－３９０． ２０１１－０７－０８ 肺部真菌感染病原学检测的方法及其临床意义施毅孙文逵 肺部真菌感染的患者临床表现多样，影像学特征不典 型，实验室病原学检查就成为诊断的重要依据，其中临床体 液标本涂片的显微镜检查（简称镜检）和真菌培养应用最为 广泛，该方法虽然在某些真菌感染的诊断中尚难以鉴别是定 植还是感染，但其结果作为“微生物学证据”，无疑对于侵袭性 真菌病的诊断和治疗均有重要的参考价值。目前，临床上对 不同体液标本镜检和培养结果的判断价值仍存争议，现结合 笔者的经验对这一问题进行探讨，以期为临床诊治提供参考。 １０． ３７６０／ｃｍａ． ｊ． ｉｓｓｎ． １００１－０９３９．２０１１．０９．００３ ２１０００２ 南京军区南京总医院呼吸科 万方数据
文献的氨基酸检测方法有高效液相色谱法(HPLCV'、气相色谱法(GC)离子交换柱法液相色谱 质谱法(LC-MS)毛细管电泳法(CE)然而，每一种方法都有各自的优点和缺点。微流控技术(又称“芯片实验室” )从采用之初到现在己经得到突飞猛进的发展对食品中的氨基酸进行分析具有以下困难:(1)氨基酸本身不发焚光，也没有电子活性基团，在自然状态下很难对氨基酸进行检测;(2)实际样品中的其它组分会对氨基酸的分离检测产生干 扰，因此对样品的处理方法与过程要求严格 ["]。 基于激光诱导劳光自身具有选择性高、灵敏度高的优点，微流控芯片电泳与激光诱导劳光检测联用己成为最流行的组合方式。选择合适的焚光试剂来衍生氨基酸成为激光诱导焚光检测的必要步骤。衍生过程可以分为柱前衍生和柱后衍生。后衍生的优点在于不受衍生时间的限 制，添加物不会对分离效率产生影响。目前对氨基酸的分析大多集中于基础研宄和感念验证 ， 只有少数课题组把微流控装置用于实际样品中氨基酸的分析 ["]。 芯片毛细管电泳 3.1 概述 芯片毛细管电泳 (chip-based capillary electrophoresis )是以电场为驱动力，借助于离子或分子在电迁移或分配行为上的差异，对复杂试样中的多种组分进行高速分离的分析技术。电泳分 析时，先在进样通道上施加电压，在电渗流的作用下，使试样从样品池经十字交叉口流向样品废液池 ;然后将电压切换到分离通道，储存在十字交叉口处的一段试样溶液在电渗流的推动下进入分离通道并进行分离，组分经过检测点时，记录电泳谱图。 3. 2 进样方式芯片毛细管电泳的进样方法对于芯片毛细管的发展至关重要 _。 3. 2. 1 简单进样芯片毛细管电泳中最为常见的进样方式为十字通道进样。该进样系统由垂直交叉的样品通道和分离通道组成，通过电压在两通道间的切换实现简单进样操作。通过在样品池和样品废液池之间施加一定的电压，使样品从样品池流向样品废液池的过程中，将十字交叉口处的一小段通道中充满样品 ;接着将电压切换到缓冲液池和缓冲液废液池之间，储存在十字交叉口处的试样溶液在电渗流的推动下进入分离通道，进行分离。 3. 2. 2 夹流进样在十字形通道上采用夹流进样。在充样阶段，除样品废液池接地外，样品池、缓冲液池和缓冲液废液池均施加一定的正电压，电势的分配应使样品池、缓冲液池、缓冲液废液池处的电势 V|、、V,均大于十字交叉口处电势V」而样品废液池处的电势 V,小于V|。由于缓冲液通道 和分离通道中的缓冲液也在电渗流的作用下经十字交叉口“挤”入样品通道，使得来自样品池的样品液流在十字交叉口处被挤压变细 ,夹在两层缓冲液的液流之间流入样品通道。在分离阶段，四个液池处的电势同时切换，最终使的V3大于Vi,Vi、V2小于V|,v.,更小于v.,。 3. 2. 3 门式进样 施加一定电压使缓冲液池的电势大于样品池的电势,样品废液池和缓冲废液池的电势均设零。 这时,缓冲液以较大的流量从缓冲液池出发流经十字交叉口时一部分向下流入分离通道,另一部分流向样品废液池 ;而样品从样品池经十字交叉口流向样品废液池。进样时,缓冲液池和样品废液池悬空 ,样品溶液在样品池和缓冲废液池之间的电场作用下,经十字交叉口向下流入分
发布日期20060803 栏目化药药物评价>>临床安全性和有效性评价 标题浅谈如何规范感染性疾病病原学检查 作者周宏峰杨进波 部门 正文内容 周宏峰杨进波 摘要：目前抗感染药物临床试验中存在病原学检查不规范、可信度低等问题， 不利于对抗感染药物的客观评价。本文就如何规范病原学检查进行了简要的 探讨，希望业内人士给予批评指正。 关键词：抗感染药物；病原学检查 抗感染药物不仅在我国各类药物使用中处于首位，而且其申报量也一直居于前列。病原学检查在感染性疾病的诊断与治疗中有着重要的意义，它不仅 是抗感染药物临床试验的一个重要环节，而且对审评也意义重大。规范、科 学的病原学检查结果，对药品评价起着重要的作用。目前药物临床试验中存 在着病原学培养率低、培养结果可信度差等问题。本文就如何规范病原学检 查进行了简要的探讨，希望业内人士给予批评指正。
一、标本的采集和运送：正确的采集、运送和处理标本在一定程度上比病原微生物的鉴定更为重要，是诊断感染性疾病的关键步骤。但这一点常为临床医师所忽视。 （一）临床标本有关信息的收集和记录：临床标本应伴有化验单，包括病人的姓名、住院号、病历号、负责医师、标本来源和部位、要求检查项目、初步诊断，以及标本采集的日期、时间、实验室收到标本的日期、时间等。（二）重要标本的采集方法： 1．采集标本前局部应做好准备工作，标本必须直接采自病变部位。 2．尽可能在合适时间采集标本。例如清晨的痰和尿液含菌量较多，故是采集的最佳时间。了解感染性疾病的自然过程，有助于决定采集何种标本及采集时间。必要的免疫学知识对解释血清学试验结果十分有用。 3．应尽量采集足量的标本送实验室，如成人的血培养标本每次宜采集10ml 以上。 4．使用合适器械及运送容器，所有标本都应使用无菌容器；棉拭子常与运送培养基配合应用，但棉拭子不宜做厌氧菌培养。任何厌氧菌培养标本应做到在厌氧环境下运送。 5．培养标本应尽可能在应用抗菌药物前采集，解释培养结果时也应考虑到抗菌药物应用史。 6．对送检标本有特殊要求时，应在化验单上清楚表明，或直接与实验室联系。（三）主要感染的标本的质量 1．血流感染对于疑有各类血性感染的病人应在给予抗生素治疗前多次（至
专利 中文 英语 查找前案 讨论此申请 查看PDF PDF 下载 公 CN103163226 A 开 号 发 布 申请 类 型 专 利 申 CN 201110417088 请 号 公 2013年6月19日开 日 申 请 2011年12月14日日 期 优 2011年12月14日先 权
日 公开号201110417088.3, CN 103163226 A, CN 103163226A, CN 201110417088, CN-A-103163226, CN103163226 A, CN103163226A, CN201110417088, CN201110417088.3 发 明 者 刘丽宏, 李鹏飞, 李丹, 张绪得, 陶蓓蓓 申 请 人 刘丽宏, 李鹏飞, 李丹 导 出 引 文 BiBTeX, EndNote, RefMan 被以下专利引用(4), 分类(2), 法律事件(3) 外部链接: 中国国家知识产权局, 欧洲专利数据库 (Espacenet) 30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备 CN 103163226 A 摘要 本发明提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒及其制备方法。复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇衍生化处理，吹干复溶后，采用C18键合相硅胶为固定相，以含七氟丁酸和甲酸的乙腈水为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测。本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到10ng/ml，各项方法学指标均可满足氨基酸临床检验、工业生产和科学研究等定量需要。 权利要求(8) 1.一种高灵敏30种氨基酸同时定量检测试剂盒，其特征在于由特定浓度的稳定同位素内标样本、质控样本、衍生化试剂、流动相调节液组成。