整体水平和组织水平研究方法
活体成像技术
活体成像技术，即可见光成像技术，是在小动物活体内细胞和分子水平上进行生物学行为研究的一项技术，是近年来发展最快的生命科学和药物学的研究方法，是最直接观察细胞和分子在体内行为的一项新兴技术。
多模式活体成像是当今可见光成像的最新技术潮流，不仅由荧光、生物发光和同位素三种成像方法构成完整的功能成像体系，还有X光成像提供结构成像，二者相叠加，实现特异性信号的精确定位，真正体现活体成像技术的两大技术优势—空间上的分布和时间上的变化。
对于生命科学和药物学等研究而言，了解横向空间上的分布和纵向时间上的变化尤其重要。要了解所研究对象的特性，就必须掌握其进入体内后在各脏器和组织的分布情况，就必须进行精确的定位，现阶段这一点必须借助X光成像系统来实现。同时，还必须掌握所研究的对象在时间上的变化，即代谢情况。这一点，包括两种含义，即要了解同一器官不同时间量上的变化，也要了解不同时间点不同脏器内分布的变化，同样离不开精确的定位。
1.肿瘤方面的应用（应用的成像技术：X光、荧光、发光）
例一：使用荷有4T1luc肿瘤细胞的小鼠模型；肿瘤细胞稳定表达生物素酶，通过生物发光技术显示肿瘤位置；用CY5.5近红外荧光染料标记VEGF(血管内皮生长因子)的单链抗体，静脉注射后，采用荧光成像技术显示抗体体内分布和代谢信息。活体成像表明，这种抗体可以特异性结合到肿瘤细胞上，成为一种新的肿瘤标示物。
Marina V Backer1, Zoya Levashova, NATURE MEDICINE 2007, 13（4）：504-509
例二：前列腺癌的生物发光成像：深层的前列腺癌成像，辅以肾造影剂显示的膀胱显影，进行精确的肿瘤定位。
例三：肺癌的生物发光成像：深层脏器的生物发光成像。
B, time course for the in vivo imaging of primary
tumor and tumor metastasis (arrows) in xenografts of PC-3 and DU145
transfected with DsRed
2、药学研究的应用（使用X光、同位素和荧光三种模块）
例一：CCPM是一种新型的荧光染料，可以用作肿瘤细胞的特异性标示；DTPA 则为常见原料药。采用乳腺瘤裸鼠模型，通过尾静脉注射In111标记的DTPA-CCPM分子，利用放射性同位素成像和近红外荧光成像技术，在不同时间点进行活体成像，观察染料分子在体内的分布与代谢情况。结果显示，这种染料分子可以特异性靶向到肿瘤细胞，并表现出良好的半衰期，展现了很好的药用前景，为肿瘤治疗研究提供新工具。
Zhi Yang, Chun Li, Biomacromolecules 2007，8（11）：3422-3428
例二：使用同位素In111标记特异性靶向小鼠肿瘤细胞的药物分子，口腔给药后，在不同时间点进行活体成像，可以看到，随时间推移，药物分子逐步靶向肿瘤，最后非特异结合的药物代谢出体外，特异性结合在肿瘤细胞上的药物清晰展示肿瘤所在位置和大小。
3、纳米材料研究的应用（使用白光、荧光蛋白和荧光标记三种技术）
使用裸鼠动物模型，皮下接种稳转GFP和RFP的肿瘤细胞。所用纳米材料，共标记三种分子，一是CY5.5近红外荧光染料，二是抑制GFP表达的siRNA，三是协助靶向的一种跨膜多肽MPAP。静脉注射后48小时成像，结果显示，纳米材料已富集到肿瘤部位，GFP表达水平显著下降，但RFP表达未受影响。此实验揭示一种纳米材料可以承担多重生物反应作用，不仅可以进行活体成像，还可以携带药物进行肿瘤治疗。
Zdravka Medarova, Wellington Pham, NATURE MEDICINE 2007，13（3）：372-377
不同水平检测举例
1.整体和组织水平
2.组织细胞水平
DIABETES, VOL. 54, JUNE 2005
3.细胞水平
其他功能：
体外分析功能：
主要用于活体实验后的分子水平的验证实验，包括多色荧光成像、化学发光成像、同位素成像、白光成像等。
文献列表
1.LINE-1 Activity in Facultative Heterochromatin Formation during X
Chromosome Inactivation.Cell 141(6) pp. 956 - 969
2.Distinct Factors Control Histone Variant H
3.3 Localization at Specific
Genomic Regions.Cell 140(5) pp. 678 - 691
3.Meiotic Chromosome Homology Search Involves Modifications of the
Nuclear Envelope Protein Matefin/SUN-1.Cell 139(5) pp. 920 - 933
4.Cytoskeletal Forces Span the Nuclear Envelope to Coordinate Meiotic
Chromosome Pairing and Synapsis.Cell 139(5) pp. 907 - 919
5.Mitochondrial Dysfunction Leads to Nuclear Genome Instability via an
Iron-Sulfur Cluster Defect .Cell 137(7) pp. 1247 - 1258
6.Centromere-Specific Assembly of CENP-A Nucleosomes Is Mediated by
HJURP.Cell 137(3) pp. 472 - 484
7.DEX-1 and DYF-7 Establish Sensory Dendrite Length by Anchoring
Dendritic Tips during Cell Migration.Cell 137(2) pp. 344 - 355
8.RAP1 Is Essential for Silencing Telomeric Variant Surface Glycoprotein
Genes in Trypanosoma brucei.Cell 137(1) pp. 99-109
9.Epigenetic Reprogramming and Small RNA Silencing of Transposable
Elements in Pollen .Cell 136(3) pp. 461-472
10.Dbf4-Dependent Cdc7 Kinase Links DNA Replication to the
Segregation of Homologous Chromosomes in Meiosis. Cell 135(4) pp.
662 - 678
11.ACF7 Regulates Cytoskeletal-Focal Adhesion Dynamics and Migration
and Has A TPase Activity.Cell 135(1) pp. 137 - 148
12.In Vivo Imaging of oskar mRNA Transport Reveals the Mechanism of
Posterior Localization.Cell 134(5) pp. 843 – 853
13.Final Stages of Cytokinesis and Midbody Ring Formation Are
Controlled by BRUCE.Cell 132(5) pp. 832 - 845
14.Regulation of a Late Phase of T Cell Polarity and Effector Functions by
Crtam. Cell 132(5) pp. 846 - 859
15.Phosphorylation of the Axial Element Protein Hop1 by Mec1/T el1
Ensures Meiotic Interhomolog Recombination. Cell 132(5) pp. 758 - 770 16.Neuroepithelial Stem Cell Proliferation Requires LIS1 for Precise
Spindle Orientation and Symmetric Division. Cell 132(3) pp. 474 - 486 17.The T elomere Bouquet Controls the Meiotic Spindle. Cell 130(1) pp. 113
- 126
18.New Histone Incorporation Marks Sites of UV Repair in Human Cells.
Cell 127(3) pp. 481 - 493
19.DEP-Domain-Mediated Regulation of GPCR Signaling Responses.Cell
126(6) pp. 1079 - 1093
20.Spatiotemporal Feedback between Actomyosin and Focal-Adhesion
Systems Optimizes Rapid Cell Migration. Cell 125(7) pp. 1361 - 1374 21.ACF7 Regulates Cytoskeletal-Focal Adhesion Dynamics and Migration
and Has A TPase Activity. Cell 135(1) pp. 137 - 148
22.In Vivo Imaging of oskar mRNA Transport Reveals the Mechanism of
Posterior Localization. Cell 134(5) pp. 843 - 853
23.Final Stages of Cytokinesis and Midbody Ring Formation Are
Controlled by BRUCE. Cell`132(5) pp. 832 - 845
24.Regulation of a Late Phase of T Cell Polarity and Effector Functions by
Crtam. Cell 132(5) pp. 846 - 859
25.Phosphorylation of the Axial Element Protein Hop1 by Mec1/T el1
Ensures Meiotic Interhomolog Recombination. Cell 132(5) pp. 758 - 770 26.Neuroepithelial Stem Cell Proliferation Requires LIS1 for Precise
Spindle Orientation and Symmetric Division. Cell 132(3) pp. 474 - 486 27.Quiescent haematopoietic stem cells are activated by IFN-γ in response
to chronic infection Nature 465, 793-797
28.An RNA polymerase II- and AGO4-associated protein acts in
RNA-directed DNA methylation Nature 465, 106-109
29.Identification of sister chromatids by DNA template strand sequences
Nature 463, 93-97
30.Microscopy: Ever-increasing resolution Nature 462, 675-678
31.Uptake through glycoprotein 2 of FimH+ bacteria by M cells initiates
mucosal immune response Nature 462, 226-230
32.Developmental and species-divergent globin switching are driven by
BCL11A Nature 460, 1093-1097
33.A spatial gradient coordinates cell size and mitotic entry in fission yeast
Nature 459, 857-860
34.Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a
chromatin-binding PHD finger Nature 459, 847-851
35.Kinetochore geometry defined by cohesion within the centromere
Nature 458, 852-858
36.53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing
chromatin mobility Nature 456, 524-528
37.Misfolded proteins partition between two distinct quality control
compartments Nature 454, 1088-1095
38.CDK targets Sae2 to control DNA-end resection and homologous
recombination Nature 455, 689-692
39.Heterochromatin links to centromeric protection by recruiting
shugoshin Nature 455, 251-255
40.A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding
Nature 454, 728-734
41.Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint
recovery Nature 455, 119-123
42.Single-stranded DNA-binding protein hSSB1 is critical for genomic
stability Nature 453, 677-681
43.Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu
Nature 451, 425-430
44.Poly(ADP-ribose)-binding zinc finger motifs in DNA repair/checkpoint
proteins Nature 451, 81-85
45.Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse
and patients with CMT4. Nature 448, 68-72
46.Role of Formins in Actin Assembly: Nucleation and Barbed-End
Association.Science 297: 612-615
47.Systematic Analysis of Human Protein Complexes Identifies
Chromosome Segregation Proteins. Science 328: 593-599
48.Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function
Determination. Science 289: 1760-1763
49.Requirement for Coronin 1 in T Lymphocyte Trafficking and Cellular
Homeostasis. Science 313: 839-842
细胞分子水平的研究手段-------活细胞成像
当前活细胞成像对成像系统的要求：
?发生在细胞或者亚细胞水平的过程，参与者往往是形态上非常微小的结构
（往往小于5um）和分子，标记上的荧光分子和荧光蛋白数量有限，因此信号强度很低，需要成像系统有很高的分辨率和灵敏度；
?细胞间或者细胞内的相互作用，以及细胞内快速的生理生化过程（如钙离
子的释放、囊泡的运输），往往发生在数十毫秒间，需要成像系统很快的成像速度，以提高时间分辨率；
?长时间的活细胞观察，如何降低光照给细胞带来的光损伤，以及长期激发
荧光分子造成的光淬灭，保证合适的信号强度和健康的细胞状态，需要精确的控制光强，并将额外的光损伤降低到最低限度；
?在长时间活细胞观察中，保证细胞正常的生理状态至关重要，需要在观察
的同时维持合适的温度、pH等重要的环境条件；
目前世界上主流的现代分子影响平台包括三大部分：
1.以共聚焦显微镜为主的常规显微设备。
2.以活细胞工作站为主的活细胞成像设备。
3.图像处理和分析设备。
以往的生物学研究的往往是经过处理的固定样品，仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件下的状态。而活细胞观察，对处于正常生理状况下的细胞进行全程扫描和记录，获得其连续、全面、动态过程由于其显示的正常细胞动态的活动过程，很容易发现和确定细胞间相互作用和信号传导的过程，以及在活细胞水平上的生物分子间的相互作用，不仅可以解决长期以来悬而未解的问题，更为未来的研究提出新的问题，指出新的方向。
主要应用领域：
1）细胞迁移与细胞骨架；
2）细胞分裂与细胞周期；
3）细胞信号转导；
4）组织分化与发育；
5）囊泡和蛋白运输；
6）微生物研究
7）生理学和神经科学；
8）钙离子信号研究；
9）蛋白质与DNA的相互作用；
10）宿主与病原体相互作用；
11）癌症研究；
12）药理研究；
13）生物物理研究。
共享学科：生物学，微生物学，医学，农学，动物科学等
细胞水平：
A.细胞分裂
Molecular Biology of the Cell Vol. 14, January 2003
有丝分裂
T ime-lapse images of meiosis were collected for 10 min at 2-min intervals in moa1D rec12D cells. Note that
the upper cell is undergoing nondisjunction of tethered cnt1, whereas the lower cell is undergoing disjunction of tethered dh1L, with cnt2–tdT omato marked in different chromosomes is undergoing disjunction in either cells.
亚细胞结构：
分子水平：
1）单个分子a.分子的运动
b.分子的分布
GE超高分辨活细胞成像系统 利用活细胞成像工作站进行细胞和基因的功能研究，是生物医学研究的最新趋势。固定细胞观察仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件下的状态。活细胞观察，对处于正常生理状况下的细胞进行全程扫描和记录，获得其连续、全面、动态过程由于其显示的正常细胞动态的活动过程，很容易发现和确定细胞间相互作用和信号传导的过程，以及在活细胞水平上的生物分子间的相互作用，不仅可以解决长期以来悬而未解的问题，更为未来的研究提出新的问题，指出新的方向。 一、活细胞成像系统原理 目前主流的活细胞成像系统从原理上可以分为两大类： 基于宽场反卷积技术 基于共聚焦技术 两种技术作为目前最流行的活细胞成像技术，均可以实现在维持细胞存活的情况下，快速获取单一焦平面的信号，在具体性能上则各有擅长。 宽场反卷积技术 对光线进行反卷积运算是光学成像领域的成熟技术，最早由美国国家航空航天局开发并成为观察微弱天体信号的标准技术。去卷积和共聚焦技术是光学显微镜领域获得单一焦平面光线的两大主流技术(J.M.Murray, live cell imaging, 2010)。通过将非焦平面的光线还原至焦平面上，大大提高了样品信号的强度以及图像的信噪比。由于去卷积技术设计到大量的后期运算，因此在高性能计算机发明以前，一直受制于运算能力，没有得到大规模的推广。随着近年来计算机性能的大幅提升和价格的下降，去卷积技术逐渐成为光学显微镜的主流技术。一个点光源经过显微镜的光路，由于镜片对光线的衍射和散射，最终呈现在观察者面前的是一个模糊的点，所以点光源变成模糊的点的过程即为卷积。反卷积就是把模糊的点还原成点光源的过程。 以API 公司的DeltaVision系统为例，其反卷积过程经历以下几步： 1)首先通过无数的计算和实验，得到点光源经过显微镜物镜后变模糊的规律，建立模型。 2)选择完美的物镜，保证样品信号经过物镜后变模糊的规律符合步骤一中得到的模型。 3)将通过显微镜光路的所有的光信号进行收集，因为点光源经过显微镜光路后会变成一个空 间中的倒圆锥形，所以在收集信号的时候需要很准确的记录信号的Z 轴信息。 4)对收集到的所有光信号按照步骤一中的模型进行还原，最终将模糊的点还原成清晰的点， 客观反映它在空间的位置和强度。 目前去卷积技术越来越广泛地应用于生物学图像的研究中。 共聚焦技术 共聚焦显微镜它采用点光源(point lightsource) 照射标本,在焦平面上形成了一个轮廓分明 的小的光点(light spot ) ,该点被照射后发出的荧光被物镜收集,并沿原照射光路回送到探测器。探测器前方有一个针孔(pinhole) ,几何尺寸可调。这样,来自焦平面的光,可以会聚在探 测针孔范围之内,而其它来自焦平面上方或下方的散射光,都被挡在探测针孔之外而不能成象。 光束扫描器又分为单光束、多光束或狭缝扫描器几种。其中单光束扫描获得的图像质量最好, 狭缝扫描器虽然产生图像的速率很高(可达实时水平) ,但其图像信噪比低于单光束扫描,这是 因为从狭缝长轴来的漫射光不能被有效遮挡。多光束扫描如碟片式共聚焦是由电动马达驱动
活体动物光学成像系统在活体荧光成像中的应用 第一部分技术原理 一、技术简介 随着活体动物光学成像技术在国内外的普及和应用，越来越多的科研人员希望能通过该技术来观察活体动物体内肿瘤细胞的生长以及对药物治疗的反应，希望能观察到荧光标记的多肽、抗体、小分子药物在体内的分布和代谢情况。NightOWL ⅡLB 983 NC320活体动物光学成像系统正是为满足这样的应用需求而设计的。该系统通过荧光光路的特殊设计，实现了对激发光的能量控制和调节，提高了活体荧光成像的稳定性和灵敏度，并且该系统操作简单、费用低廉、不涉及放射性，是不错的进行活体荧光成像的仪器。与传统技术相比，活体荧光成像技术不需要杀死动物，可以对同一个动物进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果的影响。更重要的是，该技术可以得到直观的成像图片，了解标记物在动物体内的分布和代谢情况，避免了传统的体外实验方法的诸多缺点，特别是在药物制剂学、药物临床前研究中有不可估量的应用前景。 NightOWL ⅡLB 983 NC320活体荧光体内成像技术的基本原理是激发光源通过特殊的光路设计使其能量稳定、强度合适的激发光使荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的散射光，该散射光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器cooling slow scaning CCD以光子数量化检测到光强度，同时反应出标记物的数量。 二、标记原理 活体荧光成像技术有三种标记方法：荧光蛋白标记、荧光染料标记和量子点标记。荧光蛋白适用于标记肿瘤细胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等。量子点标记作为一种新的标记方法，是有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可
活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶基因（Luciferase）标记细胞或DNA，而荧光技术则采用绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等荧光报告基因和FITC、Cy5、Cy7等荧光素及量子点(quantumdot，QD)进行标记。
2. 生物发光成像 活体生物荧光成像技术是指在小的哺乳动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，将部分化学能转变为可见光能释放。然后在体外利用敏感的CCD设备形成图像。荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子，成为某种基因的报告基因，通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。 生物荧光实质是一种化学荧光，萤火虫荧光素酶在氧化其特有底物荧光素的过程中可以释放波长广泛的可见光光子，其平均波长为560 nm(460—630 nm)，这其中包括重要的波长超过600 nm的红光成分。在哺乳动物体内血红蛋白是吸收可见光的主要成分，能吸收中蓝绿光波段的大部分可见光；水和脂质主要吸收红外线，但其均对波长为590—800 nm的红光至近红外线吸收能力较差，因此波长超过600 nm的红光虽然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳动物组织被高灵敏的CCD检测到。 生物发光成像的优点可以非侵入性，实时连续动态监测体内的各种生物学过程，从而可以减少实验动物数量，及降低个体间差异的影响；由于背景噪声低，所以具有较高的敏感性；不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察；此外还有无放射性等其他优点。 然而生物发光也有自身的不足之处：例如波长依赖性的组织穿透能力，光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性也不尽相同，其中血红蛋白是吸收光子的主要物质；由于是在体外检测体内发出的信号，因而受到体内发光源位置及深度影响；另外还需要外源性提供各种荧光素酶的底物，且底物在体内的分布与药动力学也会影响信号的产生；由于荧光素酶催化的生化反应需要氧气、镁离子及ATP等物质的参与，受到体内环境状态的影响。 二、小动物活体成像 1. 制作动物模型 可根据实验需要通过尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种已标记的细胞或组织。在建模时应认真考虑实验目的和选择荧光标记，如标记荧光波长短，则穿透效率不高，建模时不宜接种深部脏器和观察体内转移，但可以观察皮下瘤和解剖后脏器直接成像。深部脏器和体内转移的观察大多选用荧光素酶标记。 2. 活体成像 小鼠经过常规麻醉（气麻、针麻皆可）后放入成像暗箱平台，软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯（明场）拍摄第一次背景图。下一步，自动关闭照明灯，在没有外界光源的条件下（暗场）拍摄由小鼠体内发出的特异光子。明场与暗场的背景图叠加后可以直观的显示动物体内特异光子的部位和强度，完成成像操作。值得注意的是荧光成像应选择合适的激发和发射滤片，生物发光则需要成像前体内注射底物激发发光。 3. 数据处理
为活细胞研究设计光学显微系统时，首要考虑的是检测器的敏感度（对信号乃至噪音的检测），图像获取的速度，以及在此基础上标本的可行性。对于固定细胞的成像，曝光时间及光强度相对来说都很高，这时可能会造成光漂白；然而对于活细胞成像，上述光的影响必须去除。几乎在所有情况下，活细胞显微镜都会在尽可能高的图像质量与尽可能好的细胞活性之间取得一个平衡。对于此类实验，时间及空间上的分辨率需要设定在能满足实验要求的水平上，而不是给予过度的光照或设定过多采样时间点。 基本上,一个理想的活细胞成像系统必需有足够的敏感度，来满足在弱荧光条件下仍能得到高图片质量；同时，系统也必需足够快，以记录整个动态过程。另外，这个系统还需要有足够高的分辨率以捕捉样品细节，并且能够准确的实时测量每个微小的光强变化。然而不幸的是，要改善上述的任意一条都需建立在牺牲其它性能的基础上。因此现在还不能够设计出一个可以满足所有要求的活细胞成像体系。研究人员现在只能在尽量减低不重要的信息的遗失的同时，尽可能的获得最优的重要参数。这样，显微镜的配置最终取决于成像的要求，对于样品在实验期间活性的要求，进行标记的难度水平，以及仪器的可用性等实际因素。 如图一（Figure 1）所示为一台倒置研究级显微镜，它配有四个相机接口，并可满足对培养的组织的研究。在四个接口上分别配有四个不同的相机，每一个都用来获取不同的图像。在大多数情况下，这种显微镜的分光设计是100％进入相机或以80：20的比例同时分配给相机和目镜。在弱光成像时，研究人员必需确保将最敏感的相机接在100％分光口上。在图一中，彩色CCD（Full color CCD）接在显微镜的底部（a），它从物镜接受的光信号不经过棱镜或反光镜的反射。这样的相机通常用来进行多色荧光或明场拍摄。显微镜右侧连接高效的电子倍增电荷偶联设备（Electron Multiplying Charge Coupled Device，EMCCD）（b），它通常用来检测极弱的荧光信号。接在显微镜左侧的相机（c）配有一个高量子效应的感应器，可以感应700－1000nm 波长范围内的光，所以这个相机可以用来进行微分干涉相称（differential interference contrast，DIC）观察方法下厚标本的红外线照明成像。最后，对于高分辨率的单色荧光成像，如全内反射荧光或其它荧光技术，图一中的显微镜在前部（d）
小动物活体成像技术 关键词：动物成像分子影像学光学成像2010-04-20 00:00来源：互联网点击次数：5089 1、背景和原理 1999年，美国哈佛大学Weissleder等人提出了分子影像学（molecular imaging）的概念——应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。 传统成像大多依赖于肉眼可见的身体、生理和代谢过程在疾病状态下的变化，而不是了解疾病的特异性分子事件。分子成像则是利用特异性分子探针追踪靶目标并成像。这种从非特异性成像到特异性成像的变化，为疾病生物学、疾病早期检测、定性、评估和治疗带来了重大的影响。 分子成像技术使活体动物体内成像成为可能，它的出现，归功于分子生物学和细胞生物学的发展、转基因动物模型的使用、新的成像药物的运用、高特异性的探针、小动物成像设备的发展等诸多因素。目前，分子成像技术可用于研究观测特异性细胞、基因和分子的表达或互作过程，同时检测多种分子事件，追踪靶细胞，药物和基因治疗最优化，从分子和细胞水平对药物疗效进行成像，从分子病理水平评估疾病发展过程，对同一个动物或病人进行时间、环境、发展和治疗影响跟踪。 2、分子成像的优点 分子成像和传统的体外成像或细胞培养相比有着显著优点。首先，分子成像能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用。第二，由于可以对同一个研究个体进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果的可影响，又不需要杀死模式动物，节省了大笔科研费用。第三，尤其在药物开发方面，分子成像更是具有划时代的意义。根据目前的统计结果，由于进入临床研究的药物中大部分因为安全问题而终止，导致了在临床研究中大量的资金浪费，而分子成像技术的问世，为解决这一难题提供了广阔的空间，将使药物在临床前研究中通过利用分子成像的方法，获得更详细的分子或基因述水平的数据，这是用传统的方法无法了解的领域，所以分子成像将对新药研究的模式带来革命性变革。其次，在转基因动物、动物基因打靶或制药研究过程中，分子成像能对动物的性状进行跟踪检测，对表型进行直接观测和（定量）分析； 3、分类 分子成像技术主要分为光学成像、核素成像、磁共振成像和超声成像、CT成像五大类。 (1) 光学成像 活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。
转化医学着眼于将生物医学基础研究和解决临床问题结合起来，将基础研究的成果转化为疾病预防、诊断、治疗及预后评估的新手段，已经逐步成为了医学界关注的热点之一。细胞水平的研究，是转化医学研究的重要方向，而一些创新性技术手段在细胞研究领域的应用，正加速转化医学研究在细胞水平的进展。活细胞成像和超高分辨率成像技术，作为细胞水平研究的重要手段，也为转化医学的发展注入了新的活力。通过活细胞成像技术，对细胞内的蛋白的表达、细胞器的运动等动态过程进行长期动态观察，可为疾病诊断、新药开发提供更多的线索。以下就对几个典型的活细胞成像应用于转化医学中的实例进行介绍： 自噬在黑色素瘤治疗中的研究 细胞内的基本上所有的细胞器都通过自噬途径得到降解。一些重要的疾病如阿兹海默综合征、动脉粥样硬化都伴随着自噬途径的缺陷，因此一些自噬途径的重要调控因子已经成为最近医学研究和药物开发的热点。 化合物polyinosine-polycytidylic acid可以诱导黑色素瘤细
胞内的自噬途径激活。在加入polyinosine-polycytidylic acid后，细胞内很短时间内就可以看到自噬体标记蛋白LC3在细胞内出现，并伴随着细胞的凋亡。（Targeted activation of innate immunity for therapeutic induction of autophagy and apoptosis in melanoma cells. Cancer Cell, 16, 103-114.） 特异性结核杆菌抗生素的研发 结合杆菌是造成肺结核的主要病原菌，开发低毒高特异性的抗生素是目前结核病防治的重要方向。 在对结核杆菌的繁殖进行连续观察检测的同时，在灌流培养基中中加入不同的化合物，从而监测不同化合物对结核杆菌的抑制作用，最终可以得到对结核杆菌有显著抑制作用的化合物并可进入下游的临床试验。（Simple model for testing drugs against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 54, 4150-4158.）
Science：活细胞代谢成像新方法 0 25细胞S-腺苷甲硫氨酸成像图，随着每个时间点蛋氨酸（右下）的增加，荧光强度也增高 通过基因工程技术使得细胞表达一种经修饰（改造）过的RNA，又称Spinach，研究人员能对活细胞中的小分子代谢物进行成像，并观察它们随时间变化是如何改变的。每个细胞新陈代谢都会产生代谢产物。假如能得知产物生成效率的话，就能辨识如癌症状态下细胞代谢的异常或确定药物能否将细胞的代谢状况恢复到正常状态。 康奈尔大学威尔医学院的研究人员说发表在3月9日的《科学》杂志上的相关论文详细描述了这种先进的技术方法，这一技术将有可能彻底颠覆以往对代谢组学的认识，提供数千种细胞内代谢产物的动态变化的化学指纹图谱。 威尔康乃尔医学院药理学副教授Samie R. Jaffrey博士说：“动态观察到代谢产物的变化将为我们提供新的和强大的武器，方便我们了解代谢在疾病状态下是如何改变的，并帮助我们找到可以将它们恢复到正常水平的方法”。Jaffrey博士领导威尔康乃尔的其他三名研究人员共同完成了这项研究。他说：“细胞的代谢水平调控着细胞诸多功能，也正因为如此，代谢水平的变化可以是细胞内在特定的时间内发生什么变
化的写照”。 例如生物学家都知道，肿瘤细胞存在代谢异常，这些细胞对葡萄糖能源的利用存在异常并产生独特的代谢产物如乳酸，从而有不一样的新陈代谢过程。Jaffrey博士说：“能够看到这些代谢异常的话，就可以了解癌症的发生发展。但是到现在为止，测量活细胞中代谢产物一直非常困难。 Jaffrey博士和他的团队展开的科学研究表明：可以用特定的RNA序列来检测细胞中代谢产物的水平。这些RNAs是基于能在细胞发出绿色光的Spinach RNA设计的。Jaffrey博士研究小组修改Spinach的RNAs，使得它们一旦遇到它们专属绑定的代谢物时就关闭，造成Spinach荧光开启。他们设计出了RNA序列以追踪细胞中五个不同代谢产物包括二磷酸腺苷、细胞能量分子ATP和参与调节基因活性的甲基化过程的SAM（S-腺苷蛋氨酸）水平的变化。他说：“在此之前，一直没有人能够实时观察到细胞中代谢产物水平是如何变化的”。 Jaffrey博士说：“在活细胞中运用RNA传感器，研究人员能够测量单个细胞中的目标代谢产物水平随着时间的变化而 发生的改变，你可以看到这些代谢物如何响应信号刺激或遗传变化进而发生动态变化的。你可以筛选出能使得这些基因异常发生正常化的药物，我们的一个主要目标是确定药物是否能使细胞的新陈代谢正常化。
cy染料小动物活体成像操作流程 2017/4/13 吲哚花菁绿(ICG，indocyanine green)是经过FDA认证的菁染料，出于安全考虑，后期应用于活体（人、动物、细胞）的染料在结构上都和ICG有相似或相近之处。cy系列染料是Amersham公司（目前为GE公司）最初开发的染料体系，它的桥环由苯并吲哚变为吲哚环，并在吲哚的苯环上对称地引入硫酸根基团，水溶性得到很大改善，分子量降低后对大分子的亲和力有所增加。cy系列菁染料多带有羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS ester)、异硫氰酸酯(NCS)等活性基团，可与蛋白质、多肽、DNA或其他生物分子中的羟基、氨基或巯基以化学键的方式键合，表征生物分子的特性，形成具有生物功能的标记衍生物，广泛被用于抗体、多肽、小分子等多种荧光探针的合成中，可以说是目前使用最为广泛的一类近红外染料。cy染料应选择GE、李记生物等公司产品，化工企业提供的cy染料产品，一般不作为活体成像使用。 一、Cy染料在活体成像的应用领域 1. 标记特异性抗体 在CY菁染料标记蛋白的研究中，除了牛血清白蛋白以外最先开始涉及的功能性物质是抗体。从起初与IgG结合，用荧光光纤免疫传感器(FFOI，fluorescent fiber-optic immunosensor)考察抗原抗体反应，到现在连接特异性的单克隆抗体片段，对动物全身进行免疫荧光显影，分析片段在体内的分布代谢情况。分析cy-抗体复合物在不同时间不同器官中的荧光强度变化，可对抗体的靶向性、清除率等有更直观的评价。不过，染料抗体衍生物在降低背景噪音和非特异性吸附方面还有待进一步完善。 2. 标记特异性多肽(Conjugating to peptides) 在肿瘤诊断和治疗中，与菁染料衍生物结合的多肽主要有两种：其一是针对肿瘤表面过量表达的受体；另一种则针对肿瘤相关酶类。前者的报道很多，如生长激素抑制素、表皮生长因子，甚至一些特殊设计过的短肽，都可以被用来靶向结合肿瘤，现在更趋向于一些只有十几个氨基酸的环肽，因为它分子量小易于接近肿瘤部位，且呈环状构形不易被分解。Cy系列染料均能利用自身携带的活性基团直接与环肽结合，部分此类探针检测发现，在近红外光学显影和放射显影在浅表的分辨率相似，但在深层组织中前者的信噪比更高。针对酶类研究一般是设计酶特异性荧光探针，这种与Cy系列染料结合的检测技术除了在体内定位时有显著优势外，亦可作为体外检测手段与一些常用技术结合，辅助确定组织中该酶的存在。
荧光共振能量转移(FRET)影像系统
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荧光共振能量转移(FRET)影像系统
一、研究目的
随着生命科学研究的不断深入, 光学显微镜使我们理解了细胞结构和有关功能。 但是分子 生物学研究已经显示了分子事件，例如信号传导和基因翻译，需要蛋白质的装配成特殊的大 分子复合体等。对各种生命现象发生的机制,特别是对细胞内蛋白质间相互作用的研究变得尤 为重要。 传统的生物物理或生物化学方法例如亲和色谱法或免疫沉淀反应法和近来的酵母双杂 交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等方法等，都需要破碎细胞或对细胞造成损伤，无 法做到在活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。 而基于强度的影像技术FRET方法，使得研究活细胞内的这些相互作用变得容易了，荧光 共振能量转移( FRET)是用于对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法。根 据所基于的荧光显微镜配置不同而有不同的应用侧重，可在多细胞，单细胞，细胞膜，细胞 器等不同层次对生物大分子间的相互作用距离，动力学特性等进行研究。
二、FRET的原理和实现方法
FRET的原理和发生的基本条件：
1. 2. 3. 4. 发色团之间的距离在10A到100A 。 供体D的荧光光谱和受体A的吸收光谱足够多的重叠。 供体D的量子产率和受体A的吸收系数足够大。 D和A的跃迁偶极矩有最佳的相对取向，或者两者之一有一定的快速旋转的自由度。
FRET的实现方法：
1) 稳态方法（基于供体、受体的三通道计算校准） 供体荧光的减弱－主要的方法 受体荧光的增强 激发光谱和吸收光谱的比较 2) 3) 光漂白方法 （Pb-FRET） 时间分辨方法（TR-FRET） 供体荧光的衰减 受体荧光的增长
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Bruker In-Vivo Xtreme小动物活体成像系统标准操作规程 【目的】通过制定本操作规程，规范小动物活体成像系统使用。 【准备】 1、实验试剂（药物、染料、麻醉剂、水、脱毛膏等）； 2、实验对象（小鼠、大鼠、黑鼠、裸鼠等）； 3、如需要气体麻醉则要进行氧气准备，将麻醉剂倒入麻醉机中，并检查麻醉机 检查窗中液位位于“min”和“Max”之间；气体麻醉前根据室内温度情况酌情打开动物空气加热器。 【开机】 主机部分： 1、打开X-Ray光源，将开关钥匙打到“ON”的位置； 2、打开主机，将主机右后方的电源开关打到“ON”的位置。接着打开电脑，等待网线图标出现一个黄色三角叹号后，将MI软件打开。 注意：仪器开机以后，需要大约20分钟的预冷时间。 附属部分： 1、如需要进行气体麻醉，则需要打开麻醉机，并对实验对象进行预麻醉； 2、如果需要进行三维旋转拍摄，则需准备动物旋转系统（MARS），动物旋转系 统的准备需要在不开拍摄软件和MARS控制器按钮打到manual的情况下，先按要求将旋转器安装到暗箱中，然后将按钮打到auto，完成之后即可打开MI软件 【拍照】 1、将实验对象摆放到托盘中，拍照部位朝下，如拍摄腹部影像，需将实验对象 腹部朝下，并将四肢伸展开，然后将托盘放入暗箱拍摄位置，放置是托盘缺口朝右侧摆放； 2、双击桌面MI图标，打开MI软件，单击“Capture”按钮，打开拍摄参数设置界面； 1）：拍摄界面顶部显示仪器型号。MI软件提供同时拍摄两张图像的功能，即第一张图像是Foreground，主图像，第二张图像是Background，背景图像。 点击Foreground和Background按钮进行切换，对两张图像的拍摄程序分别进行编辑。 2）：左边第一部分File里可以执行和创建、编辑修改一个Protocol，同时，Protocol还可以通过点击软件顶部的工具栏中Protocol按钮打开。 3）：第二部分是选择拍摄模式，共有5种，分别为Fluorescence荧光，Luminescence化学发光，Radioisotopix同位素，X-Ray X光，Reflectance反射光，另外可以Custom定制程序。 点击Setting的下拉菜单，可以选择我们已经设定好的拍摄程序，或者选择Default Session默认设置，和Current Session来新建一个拍摄程序。每个拍摄模式都有一个默认设置，具体拍摄条件如下（In Vivo Xtreme ENG，42页）：
激光全息细胞成像及分析系统应用 细胞活力 激光全息细胞成像及分析系统可以实时监测细胞死亡过程，以及通过图像进行记录。全息技术再不需要荧光标记的情况下可以得到细胞形态学数据。Khmaladze A. et al(2012和Pavillion N. et al(2012使用DHM 研究细胞死亡过程，观察到死亡过程中细胞体积显著减小。Kuhn et al(2013使用DHM 研究活/死细胞特点时得到实验结果和和基于荧光标记方法结果相一致。他们使用PI 和Hoechst 标记细胞。染料法鉴定细胞死活是目前常见的鉴定方法，其中台盼蓝染色方法最常见。台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。鼠成纤维细胞L929接种在μ-slide(Ibidi,Germany 上，肿瘤药物依托泊苷etoposide(100μM处理细胞，使用激光全息细胞分析系统(M3 分析细胞的死亡，并与台盼蓝染色法进行比较。图1中左图为台盼蓝染色结果，右图为全息结果，细胞越白，细胞越厚。死细胞是圆的，薄的。两种方法得到的结果是 一样的。
图1
图2细胞厚度VS 细胞体积，死亡细胞集中在绿色区域 细胞凋亡 细胞死亡起码有两种方式，即细胞坏死(necrosis）与细胞凋亡(apoptosis。细胞坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核 变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的炎症反应。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。在这两种过程中，细胞体积都会减少，形态学都会发生变化。 前列腺癌细胞DU145和小鼠成纤维细胞L929分别接种在IBIDI-micro slides (IBIDI）上，接种24h 后，50μM依托泊苷(etoposide 处理细胞，HoloMonitor M3分析细胞死亡过程。
细胞迁移/侵袭实验分析 ——LumaScope活细胞成像系统 细胞迁移实验是普遍应用于评价损伤修复、贴壁肿瘤细胞转移或血管再生等的典型实验。传统方法是应用无菌枪头（Tip）在细胞培养容器上划痕来实现。但是此种方法无法实现在不同孔中划出同样大小的划痕。Oris TM迁移/侵袭试剂盒能够提供更加精确的方法，在培养容器中生成一个圆形区域。这种方法同样适用于观察不同方向的细胞迁移。LumaScope活细胞成像系统具备传统显微镜的功能，可应用于细胞或组织培养实验室的日常细胞观察。如细胞状态实时检测、远程传送和监控、细胞计数、形态观察、染色观察等。LumaScope可放置于培养箱中实现细胞的长时间的连续成像和定点监测。这种应用大大提高了实验过程检测的便捷性和结果的准确性。 本文将描述如何结合LumaScope与Oris TM迁移/侵袭试剂盒来实现细胞迁移/侵袭实验。实验结果可通过Image J软件来进行分析，最终得到细胞迁移的数量和速度数据。 细胞迁移分析： Day 1：am 9:00插入Stoppers，接种细胞； pm 4:00（根据细胞贴附状况），拔除stoppers，PBS洗一遍后加入新鲜培养液。Day 2：根据要观察的时间点设置LumaScope成像参数进行成像，并进行量化分析。 细胞侵袭分析： Day 1：am 9:00包被薄层BME（用无血清培养液制备），插入stoppers，接种细胞； pm 4:00 （根据细胞状况），拔除stoppers，包被厚层BME（含血清生长因子），再在第二层gel上面加上一层无血清培养液 Day 2：根据要观察的时间点设置LumaScope成像参数进行成像，并进行量化。
仪器一：小动物活体光学成像系统 (一)具体参数要求 1、系统性能 *具备高灵敏度的生物发光二维成像功能； *具备高性能的荧光二维成像功能； *具备荧光分子断层成像技术，能够实现真实三维断层扫描，获取真实三维信息； 具备基于切伦科夫辐射原理的放射性同位素成像功能； *具备高品质滤光片及光谱分离算法，可实现自发荧光扣除及多探针成像； 实验中能够实现生物发光及荧光成像模式的联合使用，并能将影像融合叠加； 具备国际公认的光学信号定量方法； 2、应用领域 广泛应用于癌症、干细胞、感染、炎症、免疫疾病、神经疾病、心血管疾病、代谢疾病、基因治疗等多种疾病分子机理及相关药物研发的临床前研究。 3、主要技术参数 3.1仪器硬件部分 3.1.1二维成像部分 *采用背照射、背部薄化科学一级CCD； *CCD采用电制冷方式，工作温度达到绝对-90℃，温度可视化； *CCD 量子效率大于85%（500-700nm）； *最小检测光子数可达100光子/秒/弧度/平方厘米； 采用定焦镜头，最大光圈可达f/0.95，可自动聚焦； 成像视野范围可调，最大视野能够满足至少3只小鼠同时成像； 动物载物台温度可控（20-40℃），且即时温度可通过软件显示； *生物发光灵敏度达到可检测小鼠皮下少于100个生物发光细胞（需提供证明文献）； 荧光光源采用高效金属卤素灯，功率不低于150瓦； *激发光滤片标配数量不少于19个，发射光滤片标配数量不少于7个； *所有滤片均为高品质滤光片，透光率可达95%，滤片表面采用多层硬性涂料防护，防止因长期照射导致的滤片退化或损伤，使用寿命长； 具备高品质成像暗箱，避免仪器背景信号的过多产生； 仪器出厂前经过国际标准的NIST光学校准； 仪器具备定时自检功能，可自动去除仪器本身产生的背景信号。 3.1.2三维成像部分 具备反射照明方式，以获取小动物体表轮廓结构； *具备透射照明方式，并通过底部多点透射扫描，获取三维重建所需的断层信息； *具备荧光分子断层成像技术，能够实现小动物体内任意深度的信号探测； *透射激发光源为长寿命固态激光器，能满足体内有效激发深度>2cm；
IncuCyte：非标记的、长时间动态活细胞成像分析仪 典奥生物 目前，大部分的细胞检测方法采用的仍然是传统的终点法——仅仅给出最终结果，而且往往需要标记细胞和破坏细胞。这种方法无法得到细胞在生长时的真正状态，也无法对细胞的生长过程做出动态的监测和分析。美国Essen公司开发了一款非标记的、长时间动态活细胞成像分析仪——IncuCyte，用一种非侵入式的方法，记录细胞的实时生长状态。 IncuCyte是一套用于长时间动态，非伤害式的活细胞成像分析平台。IncuCyte分为信号采集机和控制机两部分，信号采集机可放置于培养箱中，中间放置多种规格尺寸的板、皿、瓶及载玻片，在其下方有显微照相设备，通过显微拍照，对培养细胞进行连续的监测，并通过连接电脑和网络进行远程控制、数据读取与分析。系统可自动集中每个时间点的图像并自动生成动态录像（live video）。用户除了可以得到各种格式的图像或动态录像外，还可以得到由系统软件自动依据饱和度和计数分析生成的基于图像应用的图表，以显示细胞的变化及趋势。IncuCyte FLR可采集相差图像和荧光图像，可显示GFP，YFP和荧光素等；IncuCyte EX可以与自动化的平板和液体处理系统整合。它们都进行了光学组件的优化，成像清晰，无传统的光晕问题。 图１：培养箱中的IncuCyte IncuCyte的优势：１）培养的细胞用相位差显微镜或荧光显微镜直接监测，为非破坏性的监测，细胞不用染色便可以观察监测，影像效果好；２）监测过程中细胞无需离开培养箱，不用担心培养条件的改变对细胞的影响；３）真正的长时间的动态活细胞成像，可达数天或数月，且没有传统显微系统的光晕问题，可以在384微孔板内监测细胞形态；４）图像处理软件自动依据饱和度和计数分析，量化细胞增殖；５）自动输出细胞生长曲线和细胞生长录像；６）通量大，可同时监测6块标准规格的细胞培养板/皿/瓶，细胞在384微孔板内实验，可以减少宝贵的药品消耗；７）支持超过200种的标准培养容器，无需特殊的培养容器，节约后期实验成本；８）可远程监控，进行数据读取和分析，无需反复出入细胞房，避免了潜在的污染隐患及人工出入观测之麻烦。
TILL 活细胞实时成像显微系统 TILL Photonics是一家从事活细胞实时成像显微系统产品的生产厂商。TILL Photonics 总部位于德国慕尼黑, 其创始人Rainer Uhl 博士发明了世界上第一台单色光镜显微镜光源（polychrome Ⅰ），并一直致力于多种先进的显微技术产品的研发和改进。 TILL Photonics 最早从事专业的显微镜光源生产，为著名显微镜生产商Zeiss 和Leica 配置显微镜光源。随着公司的发展和技术的革新，TILL有了自己的显微镜产品，并发展成为拥有多项专利和先进的显微成像技术的高科技企业。 TILL 活细胞实时成像显微成像系统 高分辨率荧光成像系统不仅仅意味着一台荧光显微镜。先进的显微成像技术需要一系列的配套仪器：高敏感度相机，高速切换的光源，甚至需要不同激光光源和其他设备。 德国TILL“All for One”数码显微成像系统iMIC system，是市面上最快速，精准的科学控制平台，拥有模块化的设计和微秒级实时控制ICU控制中心，实现荧光成像、拍摄及数据传输的同步获得，成为真正的实时成像显微系统。 独家开发的应用软件能完美控制荧光成像和光源切换，使其两者能够完美配合。 I MIC系统具有高度灵活性，特有 的Polytrope装置，可根据客户要要量身定制显微镜的配置，允许每个组件的升级，可同时满足FRET，FRAP，TIRF，SI等多种显微成像实验的需要。
基于iMIC可实现的技术 荧光显微镜技术：高分辨率, 精确到分子级别的显微镜。 两种荧光光源可供选配：Polychrome V 连续波长光源、Oligochrome快速切换的光源。 FRET：荧光共振能量转移技术是用于对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法。TILL 显微镜系统通过添加Dichrotome 这一组件实现特殊光路模式，并配有双CCD相机来实现同时对两种荧光染料成像的显微成像技术。
JuLI 高级细胞成像仪活细胞荧光成像仪活细胞观测仪 Nanoentek JuLI FL fluorescence live cell movie analyzer Nanoentek JuLI Smart fluorescent cell analyzer digitalbio Nanoentek 仪器特点： ·将细胞计数和细胞分析两种功能集于一身； ·通过荧光和亮光两种方式进行细胞成像； ·50,000小时寿命的蓝光LED ； ·一键获取图像功能； ·LCD 触摸屏 ·连续储存的细胞图像可转化成影像资料； ·通过新式分析软件可对荧光细胞进行全面分析，使得出芽增殖分析，活细胞计数等数据更加可靠； ·通过无线保真技术可轻易将图像、影像等资料传输至PC 。 仪器用途： ·活细胞成像； ·细胞迁移测定； ·优化细胞分析； ·细胞培养质量控制； ·出芽增殖检测； ·GFP 转染细胞定量； ·通过台盼蓝检测存活细胞； 活细胞成像 活细胞实时动态影像技术 操作使用非常简单：
第一步：打开蓝LED按钮第二步：将培养板放置在JuLI上第三步：观察结果/保存图像 GFP 转染细胞图像 白光：Hela细胞12小时内形状变化的时间动态影像 荧光：Hela细胞48小时内EGFP表达的时间动态影像
仪器参数： 电源：AC 100-240V, 50-60Hz CPU : AMD AU1250 放大率：10x和20x 滤光器：激发光、散射光、二向色滤光片 光源：白光/蓝光LED（488nm） 可选： 白光/绿光（532nm） 白光/红光（630nm） 相机：CMOS 1.3M像素（1280X1024） 显示器：7 ’ TFT-LCD （WVGA, 800×480）重量：<5Kg 尺寸：220×375×220 mm
小动物活体光学成像技术在神经疾病研究中的应用 PerkinElmer 小动物活体光学成像技术已在生命科学基础研究、临床前医学研究及药物研发等领域得到广泛应用。在众多应用领域中，神经疾病研究是活体光学成像技术的应用热点之一。在应用活体光学成像技术进行神经相关疾病研究中，常用的标记方法及应用领域包括：1、利用萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）或荧光蛋白作为报告基因，通过转基因技术体外转染神经肿瘤细胞、神经干细胞等细胞，进行神经肿瘤、神经发育及细胞治疗的相关研究；2、利用荧光素酶作为报告基因标记神经疾病相关基因构建转基因动物，进行神经疾病机理研究；3、利用功能性荧光探针监测神经疾病的发生发展。下面结合一些具体实例进行阐述： 一.神经肿瘤研究 与其它类型肿瘤研究类似，利用小动物活体光学成像技术可以长期监测神经肿瘤的发生发展及治疗效果。例如，利用荧光素酶基因标记肿瘤细胞，通过肿瘤发光情况的变化，观测肿瘤的生长及药物对于肿瘤的治疗效果，如下： 上图：应用 IVIS 系统长期观测原位接种的经生物发光标记的 U87-MG-luc2 神经胶质瘤的生长。 上图：应用 IVIS 系统观测血管生成抑制剂对 U87-MG-luc2 生长的移植。A.对照组；B.给药组
除了利用生物发光成像技术进行神经肿瘤研究，还可应用功能性荧光探针监测肿瘤，例如，通过应用荧光染料标记的DHE 探测神经胶质瘤中的活性氧自由基，从而监测肿瘤的发展情况。基于IVIS 系统的多模式成像功能，可以同时应用生物发光及荧光成像功能共同监测肿瘤，如下： 上图：左.应用荧光成像技术观测尾静脉注射 DHE 后观测D HE 对肿瘤的靶向；中.应用生物发光成像技术观测经荧光素酶基因标记的肿瘤；右.荧光与生物发光成像结果融合。 二.神经退行性疾病的研究 神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化，以导致功能障碍。常见的神经退行性疾病包括阿兹海默症、帕金森氏病、多发性硬化症、脊髓性肌萎缩症等。应用小动物活体成像技术进行上述疾病相关研究的主要方式为：1、通过构建生物发光标记的疾病动物模型，观测疾病特异性基因的表达，进而反映疾病的发生发展；2、应用功能性荧光探针观测疾病特异性标识物，进而反映疾病的发生发展。下面以阿兹海默症的研究为例进行阐述： 阿兹海默症（Alzheimer disease，AD），是一种中枢神经系统变性病。AD 的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β 淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和 tau 蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴随胶质细胞增生等。基于特殊的病理特征，研究者可以通过不同思路应用活体光学成像技术，对阿兹海默症进行观测。 如 Wattnoek 等人基于阿兹海默症的发生伴随胶质细胞增生的病理特征推测，伴随阿兹海默症的发生发展，胶质细胞中胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表达量也会增多。利用W estern Blot 及免疫组化等技术手段进行体外实验显示，随着β 淀粉样蛋白表达的增多，GFAP 的表达量也同时增多，两者在疾病发展过程中成
MetaMorph 活细胞成像分析系统 MM-LCI 在维持细胞长时间存活过程中，必须保证在观察过程中给细胞最小的刺激（光毒性、光漂白等）和获得尽可能清晰的细胞图像。MetaMorph活细胞系统结合多种先进技术，呵护细胞，清晰呈现。 在进行长时间的活细胞成像和观察中，需要保证活细胞生存所需最基本的温度、湿度、CO2等条件，以确保细胞正常生长代谢 MetaMorph活细胞成像系统，在保证细胞生长存活的同时，能够最大限度的降低细胞损害，并能获得清晰的细胞多维图像，满足活细胞各个方面观察和研究的需要。优化高效的工作流程能够清晰呈现细胞图像，并获得无偏移的分析结果。 ■精准、清晰 新的反卷积提供了实时的反卷积功能 ■充分保护活细胞 降低细胞光照射，为细胞提供保护，获得细胞最真实的影像■从宏观到细节 同时获得相同细胞的微观和宏观图像■从平面到立体 4D浏览，获知细胞的所有结构随时间发生的位移变化和转移过程，获得前所未有的深层细胞信息
获取准确清晰的细胞图像 ■精准、清晰 新的反卷积提供了实时的反卷积功能 ■充分保护活细胞 降低细胞光照射，为细胞提供保护，获得细胞最真实的影像 准确、清晰 充分保护细胞 ■灵活的光学系统 MetaMorph 活细胞系统能够配合Leica 、Nikon 、Olympus 、Zeiss 显微镜，结合各品牌显微镜的成像优势，获得无以伦比的成像效果。 ■3D 反卷积和实时反卷积 捕获的荧光图像通过强大的3D 反卷积和实时反卷积提高水平和Z 轴的分辨率，获得更高的信噪比和图像质量，并能恢复由于光学系统导致的信号损失。 ■高精度的载物台系统 采用高精度回馈电路XY 载物台系统，速度快，精度高，最小步进可达20nm ，适合活细胞连续观察过程中的精确定位，支持多孔板、玻片、培养皿等各种样品。 实时反卷积使用前后的图像对比 ■远红外自动对焦及防漂移系统 能够快速聚焦找到细胞，同时对细胞无光毒性和光漂白作用。采用远红外对焦系统能够减少激发光对细胞的照射和刺激，降低光的细胞毒性作用，使细胞更健康 ■长寿命LED 光源 固态光源为冷光源，无发热，能够最大程度的保护细胞不受伤害，寿命可达10000小时。能够在电脑控制下快速进行多色切换，进行快速多色成像，免维护设计。 ■环境控制系统 采用多维加热方式，侧壁、顶盖、底部和物镜均可加热，能够有效防止热量散失和样品温度变化；湿度可达饱和湿度；CO2的控制范围为1-20%，稳定性高，支持三气混合。 ■多点活细胞自动成像 支持多大6D 成像（XYZT ，多位点多波长），进行多位点活细胞观察，可在实验中任意添加观察点。 ■从宏观到微观 MetaMorph 活细胞成像系统能够对同一群/同一个细胞在一次实验中即进行宏观（低倍）观察，还能同时在微观（高倍）进行观察，大大提高实验的可比性和实验周期，只需一次实验，即可获得细胞不同层次下的表现 ■多组活细胞同时观察 进行活细胞实验通常需要花费大量时间，MetaMorph 活细胞系统支持各类多孔板进行平行多组活细胞观察，节省时间，平行对比。 从宏观到微观