第一节模板和酶
概述
1、转录的概念——生物体以DNA为模板，以NTP为原料，在RNA聚合酶的催化下，合成RNA的过程，称为转录。即把DNA的碱基序列抄录成RNA的碱基序列。转录是基因表达的核心步骤。
2、转录的产物
转录的产物包括：mRNA; tRNA; rRNA等。mRNA把遗传信息从染色体内贮存的状态转送至胞质，作为蛋白质合成的直接模板， tRNA;rRNA不用作翻译的模板，但参与蛋白质的生物合成。
，比较如下：
3、转录与复制的异同
转录与复制都是酶促的核苷酸聚合过程，有许多相似之处，也有许多不同的地方。
相同：①模板：DNA；②原料：三磷酸核苷酸；③遵守碱基配对规律；④模板阅读方向：3′→5′；新链合成方向：5′→3′；⑤酶：依赖DNA的聚合酶；⑥产物：
多核苷酸链
不同：复制转录
模板 DNA双链 DNA模板链
原料 dNTP NTP
配对A→T，G→C A→U，T→A，G→C
酶 DDDP 、解螺旋酶、引物酶 DDRP
拓扑酶、连接酶
产物子代DNA（半保留） RNA（mRNA、tRNA、rRNA等）
引物 + —
第一节模板和酶
转录需要的原料是转录模板和聚合酶。转录时，DNA双链中一股单链用作模板链（template strand )，按碱基配对规律指引核苷酸的聚合，催化聚合的酶是依赖DNA的RNA 聚合酶（DNA dependent RNA polymerase, RNA-pol。）转录是有选择性的，能转录出RNA 的DNA区段，称为结构基因。
一、转录模板
即为DNA的一股链。
1、模板链
定义：转录时，DNA双链中能作为模板转录生成RNA的那一股链，称为模板链，也称有意义链或Waston链。
2、编码链
定义：与模板链相对的另一股单链称编码链，也称反义链或Crick链。
模板链既与编码链互补，又与mRNA互补，可见mRNA的碱基序列除用U代替T外，与编码链是一致的。如下图：
3、不对称转录——在转录过程中DNA双链中仅有一股链的某个区段可作为模板指导RNA 合成；不同的基因其转录时的模板链可能不同，转录的这种选择性，称为不对称转录。这是转录的特点。
不对称转录的含义：
1、DNA分子上一股可转录，另一股不转录。
2、模板链并非永远在同一单链上。
[图示]
4、结构基因
定义：DNA分子中能转录出 mRNA，然后指导蛋白质合成的部分称之。有的基因可能转录出rRNA、tRNA，也属结构基因。换句话说，凡是能转录出RNA的DNA区段，均称为结构基因。其余部分则不是。
二、RNA聚合酶（转录酶 transcriptase, RNA-pol)
（一）原核生物的RNA聚合酶
RNA聚合酶也称转录酶（transcriptase) ，全称依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP)。目前研究
比较透彻的是E.coli的RNA聚合酶。其它原核生物的RNA聚合酶在结构、组成、功能上都与E.coli的RNA聚合酶相似。
组成：全酶由5个亚基组成：即α2ββ′б，其中б亚基易脱落。既辩认转录起始点，又有催化聚合功能，参与转录起始。
核心酶由α2ββ′亚基组成，具有催化聚合功能，不能辩认起始点，但参与转录的延长。
各亚基的功能：
α亚基——决定哪些基因被转录
β亚基——与转录全过程有关 (催化）
β′亚基——结合DNA模板（开链）
б亚基——辩认起始点。
原核生物的σ、β亚基
1、原核生物的σ亚基已发现多种，典型者为σ70
2、参与热休克（应激 heat shock)应答反应必需的σ32因子：辨认与典型的-35和-10序列完全不同的启动子序列，以控制一套热休克基因的表达。
3、原核生物的RNA聚合酶，都受利福平或利福霉素的抑制，它专一性地结合RNA聚合酶的β亚基，在转录开始后才加入利福平，仍能发挥其抑制转录的作用，这就说明β亚基是在转录全过程都起作用的。
（二）真核生物的RNA聚合酶
已发现三种RNA聚合酶分别称为RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，专一性地转录不同的基因，生成不同的产物。鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶的特异性抑制剂，但敏感性不同。由于hnRNA为mRNA前体，而mRNA在各种RNA中寿命最短，最不稳定，需经常合成，故酶II被认为是最重要的酶。
三、模板与酶的辩认结合
转录开始时需要模板与酶的辨认，有特别的辨认“信号”。
操纵子（operon）：原核生物的转录单位定义。
启动子：
为DNA链上一段能被RNA聚合酶识别、结合并启动转录的区域，又称转录起始区。
特点：启动区长约40~ 60bp;富含A，T；位于结构基因上游（3′端）。
结构：启动区多为40~60bp的片段，包括三个部分
1、识别区（辨别区）：与起始点的辨认有关，由全酶б因子辨认，位于-35bp左右，多具有5′-TTGACA-的序列。又称—35区。
2、结合区：为RNA聚合酶紧密结合区，结合后使DNA解链，位于-10bp左右，具有5′-TA TAA TPu的序列，称为Pribnow-box。或称—10区。
3、转录起始位点：由全酶催化两个核苷酸生成第一个磷酸二酯键。
[真核细胞的启动区在—30区，又称TA TAbox或Hogness box。]
[图示]
第二节转录过程
转录也跟复制一样，分起始、延长、终止三个阶段。首先看原核生物的转录。
一、原核生物的转录过程
（一）原核生物的转录起始
1、转录的起始就是生成一个转录起始复合物
由RNA-pol(α2、β、β’σ)-DNA-pppGpN-OH 3 组成。
RNA聚合酶全酶辨认、结合到模板的启动区，靠σ因子辨认转录起点，使DNA解开成单链，形成复制叉，需诸多因子和酶的辅助。转录复合物即为RNA聚合酶的核心酶、DNA模板和转录产物RNA三者结合在一起的复合体。
2、解开DNA双链，形成“转录空泡”。
解链的范围不大（10—20bp）——形成转录空泡。
[图示]
3、起动复合物形成，转录开始：
不需引物，RNA聚合酶在起始部位催化两个核苷酸形成磷酸二酯键。第一个核苷酸常为GTP，GTP与随后的NTP生成PPPGPN′-OH，仍保留三磷酸鸟苷状态。因此常把[RNA聚合酶全酶-DNA-pppGpN′-OH]称为转录的起始复合物。
4、б因子从全酶脱落，可重复利用。
（二）、转录的延长
1、核心酶沿着模板滑动，催化四种NTP按碱基配对原则生成长核苷酸链，方向5′→3′。核心酶经过后，DNA双链复合为双螺旋，RNA链与模板分离。
2、因同一DNA上可多位点同时转录；又因DNA—DNA较DNA—RNA结构稳定，故RNA 易被排斥分离，在电镜下，同一DNA模板上，长短不一的RNA链散开成羽毛状图形（见图）。
3、对于较长的mRNA，可一边转录、一边与核糖体结合而开始“翻译”过程。
[图示]
三）、转录终止
转录的生成链到一定阶段，遇到“转录终止点”，停顿，酶—模板分离，RNA脱落，转录终止。转录终止方式：
1、依赖Rho (ρ)因子的转录终止
ρ因子帮助RNA聚合酶辩认终点并停止转录。
ρ因子与RNA结合（主要与PolyC亲和力最大）→RNA-DNA杂化双链的短链变性→利于转录产物从转录复合物中释放。ρ因子有A TP酶与解链酶活性。
2、非依赖Rho因子的转录终止
RNA产物形成特殊结构来终止转录。在近转录终止区，转录产物常出现多个“UUUU…..”结构，在此结构之前，转录产物形成“发夹样”或“柄鼓泡”样结构，这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。
其机理为：
1）、改变酶构象，使酶-模板结合方式变化，酶不能向下游移动，转录终止。
2）、RNA分子形成“发夹样”结构，DNA又要回复双链结构，使DNA-RNA杂化短链不稳定，使转录复合物（酶-DNA-RNA）解体。
二、真核生物的转录过程
（一）转录起始
1、转录起始的上游区段
真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。
[图示]
顺式作用元件：DNA分子上的具有的可影响转录的各种组分。
2、转录因子
转录因子：能直接、间接辨认和结合RNA聚合酶的蛋白质，称转录因子。
反式作用因子：能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，也称反式作用因子。
3、转录起始复合物
4、拼版理论
一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。
（二）转录延长
真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。
（三）转录终止
真核生物转录终止和转录后修饰密切相关。
1．真核生物DNA上有转录终止的信号，称为转录终止的修饰点。
已知真核生物DNA读码框架的3′端均含富含A T的序列（如AA TAAA或A TTAAA等）；相隔0-30bp后又出现TTTT顺序（通常是3-5个T）；该结构可能与转录终止及3′端加polyA 有关。
2．转录越过转录修饰点后的RNA在修饰点被切断，随即“加尾”、“戴帽”。余下RNA继续转录，但产物很快被酶水解。和转录后修饰密切相关。
第三节（真核生物）转录后的修饰
无论原核或真核生物，初级转录产物都经过一定程度的修饰和加工才具有生物学功能。真核生物转录后加工修饰更复杂，故主要介绍真核生物。
一、mRNA的转录后加工
（一）首尾修饰
1、5′端带帽：即GPPPmG。其功能：一种翻译起始因子可和帽子结构结合，故与翻译过程有关。
2、3′端接尾；即PolyA，一般为100~200bp。
其功能：维持mRNA作为翻译模板活性，增加mRNA稳定性。
（二）内部剪接
1、断裂基因（Split gene）、外显子（exon）和内含子（intron）
1）、断裂基因——真核生物的结构基因常由若干个编码区及非编码区间隔连续镶嵌而成，称之。
2）、外显子——基因中（包括hnRNA）能编码AA的片段。
3）、内含子——基因中（包括hnRNA）非编码AA的片段。
原核生物结构基因是连续的编码序列，无断裂基因。
2、mRNA的剪接：即剪去内含子，拼接外显子断裂基因经转录形成hnRNA，hnRNA剪去内含子，拼接外显子，成为成熟的mRNA
3、内含子分类：据剪接方式不同分为四大类；
第一、第二类主要是线粒体、叶绿体内分别转录初级rRNA和mRNA的基因，这两类内含子剪接多属于自身剪接，RNA自身具酶活性。第三类是形成套索状结构后剪接，由核小核糖核酸蛋白（SnRNP）完成。第四类是tRNA基因及其初级转录产物的内含子，剪接过程需酶及A TP。
4、内含子功能：看法不一
1）、利于物种进化选择。细菌无内含子，其体积小，复制速度快；真核生物有内含子，外显子可移动，使生物在环境变化时合成功能上有差异而结构只有微小差异的蛋白质。
2）、在基因表达中起调控功能。因从中断基因线性表达意义上说，内含子分为三类：翻译前剪接内含子、翻译绕过式内含子、翻译后删除内含子。
二、tRNA的转录后加工tRNA为DDRPIII的转录产物
1、剪接：去除插入的碱基。
2、生成各种稀有碱基：即除A、C、G、U以外的碱基，如DHU、ψ、I等。
1）、甲基化：A→Am,G→Gm
2）、还原反应：U→DHU
3）、核苷内转位反应：尿嘧啶核苷→假尿苷ψ（C5—C1′）
4）、脱NH3：A→I
3、3′端加入CCA-OH未端，完成氨基酸臂的组成。
三、rRNA的转录后加工
rRNA的基因（rDNA）属丰富基因族的DNA序列，有高度重复序列，这些序列可被不能转录为mRNA的间隔区分隔组成。
rRNA的加工：rRNA在胞核内经转录形成45S-rRNA，后者经加工剪接形成18S-rRNA和经拼接形成5.8s及28s-rRNA。三种rRNA一起和核糖体蛋白构成核糖体，进入胞质。
四、核酶发现的意义
（一）、对研究生命起源和进化有重大意义：核酶大多在古老生物中发现，或许是现代生物物种内存在的“活化石”。
（二）、人工核酶：可用人工合成的核酶连接于病原体（如RNA病毒）、有害基因（如癌细胞基因）的RNA或DNA并使其破坏。
第一节基因表达调控基本概念
一、基因表达的概念及意义
1、基因表达的概念
一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因，称为基因组。不同生物基因组所含基因多少不同。在某一特定时期，基因组中只有一部分基因处于表达状态。
在个体不同生长时期、不同生活环境下，某种功能的基因产物在细胞中的数量会随
时间、环境而变化。基因表达就是基因转录及翻译的过程(图)。在一定调节机制控
制下，大多数基因经历基因激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的
蛋白质分子。但并非所有基因表达过程都产生蛋白质。rRNA、tRNA编码基因转
录合成RNA的过程也属于基因表达。
2、基因表达调控的生物学意义
适应环境、维持生长和增殖生物体赖于生存的外环境是在不断变化的。在生命
体中的所有活细胞都必须对外环境变化作出适当反应，调节代谢，以使生物体能更
好地适应变化着的外环境，维持生命。这种适应调节的能力总是与某种或某些蛋白
质分子的功能有关，即与相关基因表达有关。生物体调节基因表达，适应环境是普
遍存在的。原核生物、单细胞生物调节基因的表达就是为适应环境、维持生长和细
胞分裂。高等生物也普遍存在适应性表达方式。如经常饮酒者体内醇氧化酶活性高
即与相应基因表达水平升高有关。
维持个体发育与分化在多细胞个体生长、发育的不同阶段，细胞中的蛋白质分
子种类和含量差异很大；即使在同一生长发育阶段，不同组织器官内蛋白质分子分
布也存在很大差异，这些差异是调节细胞表型的关键。高等哺乳类动物各种组织、
器官的发育、分化都是由一些特定基因控制的。当某种基因缺陷或表达异常时，则
会出现相应组织或器官的发育异常。
二、基因表达的规律
病毒、细菌，乃至高等哺乳类动物及人，基因表达表现为严格的规律性，即时间、空间特异性。基因表达的时间、空间特异性由特异基因的启动子（序列）和/或增
强子与调节蛋白相互作用决定。
时间特异性
噬菌体、病毒或细菌侵入宿主后，呈现一定的感染阶段。随感染阶段发展、生长
环境变化，有些基因开启，有些基因关闭。按功能需要，某一特定基因的表达严格
按特定的时间顺序发生，这就是基因表达的时间特异性。在多细胞生物从受精卵
到组织、器官形成的各个不同发育阶段，相应基因严格按一定时间顺序开启或关闭，
表现为与分化、发育阶段一致的时间性。因此，多细胞生物基因表达的时间特异性
又称阶段特异性。
空间特异性
在多细胞生物个体某一发育、生长阶段，同一基因产物在不同的组织器官表达多
少是不一样的；在同一生长阶段，不同的基因表达产物在不同的组织、器官分布也
不完全相同。在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，
这就是基因表达的空间特异性。基因表达伴随时间或阶段顺序所表现出的这种空间
分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，因此基因表达的空间特异性又称
细胞特异性或组织特异性。
二、三、基因表达的方式
不同种类的生物遗传背景不同，同种生物不同个体生活环境不完全相同，不同的基因功能和性质也不相同。因此，不同的基因其表达方式或调节类型存在很大差异。
组成性表达
某些基因产物对生命全过程都是必需的或必不可少的，这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因。例如，三羧酸循环是一中枢性代谢途径，催化该途径各阶段反应的酶编码基因就属这类基因。管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。这类基因表达被视为基本的、或组成性基因表达。这类基因表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其它机制调节。事实上，组成性基因表达水平并非真的"一成不变"，所谓"不变"是相对的。
诱导和阻遏
与管家基因不同，另有一些基因表达极易受环境变化影响。随外环境信号变化，这类基因表达水平可呈现升高或降低的现象。在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因是可诱导的。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程称为诱导。例如有DNA损伤时，修复酶基因就会在细菌内被诱导激活，使修复酶反应性地增加。相反，如果基因对环境信号应答时被抑制，这种基因是可阻遏的。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏。例如，当培养基中色氨酸供应充分时，在细菌内与色氨酸合成有关的酶编码基因表达就会被抑制。可诱导或可阻遏基因除受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响外，尚受其它机制调节；一般，这类基因的调控序列含有特异刺激的反应元件。
诱导和阻遏是同一事物的两种表现形式，在生物界普遍存在，也是生物体适应环境的基本途径。
第二节基因表达调控基本原理
一、原核基因表达调控
1、原核基因表达调控特点
原核特异基因的表达也受多级水平调控(见第一节)，但其表达开、关调控关键机制主要发生在转录起始。概括原核基因转录调节有以下特点:
σ因子决定RNA聚合酶识别特异性原核生物细胞仅含有一种RNA聚合酶，核心酶参与转录延长，全酶司转录起始。在转录起始阶段，σ亚基（又称σ因子）识别特异启动序列；不同的σ因子决定特异编码基因的转录激活，也决定不同RNA（mRNA、rRNA 和tRNA）基因的转录。
操纵子（元）模型的普遍性除个别基因外，原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位──操纵子（元），如乳糖（lac）操纵子、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操纵子（元）等。操纵子（元）机制在原核基因调控中具有较普遍的意义。一个操纵子（元）只含一个启动序列及数个可转录的编码基因(通常为2~6个，有的多达20个以上)。在同一启动序列控制下，操纵子（元）可转录出多顺反子mRNA。原核基因的协调表达就是通过调控单个启动基因的活性来完成的。
阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性在很多原核操纵子（元）系统，特异的阻遏蛋白是控制原核启动序列活性的重要因素。当阻遏蛋白与操纵序列结合或解聚时，就会发生特异基因的阻遏或去阻遏。原核基因调控普遍涉及特异阻遏蛋白参与的开、关调节机制。 2、乳糖操纵子（元）调节机制
乳糖操纵子（元）的结构 E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P 及一个调节基因I（图）。
I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
阻遏蛋白的负性调节在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I 序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P 序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
CAP的正性调节分解(代谢)物基因激活蛋白CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在lac启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；当有葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此lac操纵子表达下降。由此可见，对lac操纵子（元）来说CAP是正性调节因素，lac阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节lac操纵子的表达。
协调调节 lac阻遏蛋白负性调节与CAP正性调节两种机制协调合作：当Lac阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；但是如果没有CAP存在来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解聚仍几无转录活性。可见，两种机制相辅相成、互相协调、相互制约。由于野生型lac启动序列作用很弱，所以CAP是必不可少的。 lac操纵子（元）的负性调节能很好地解释：单纯乳糖存在时，细菌是如何利用乳糖作碳源的。然而，细菌生长环境是复杂的，倘若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖才是最节能的。这时，葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制lac操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。葡萄糖对lac操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏（catabolic repression）。lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需缺乏葡萄糖。
3.其它转录调节机制
原核基因通过操纵子（元）机制调节是主要的，此外尚有其它特异调节机制，如转录衰减、基因重组、SOS反应等。
4．基因转录激活调节的基本要素
包括：特异DNA序列的作用
调节蛋白质的作用
DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质的相互作用
RNA聚合酶的活性
（1）特异DNA序列的作用——在转录起点上游某些区域的DNA序列，能决定转录的起始、加强RNA聚合酶与启动序列的结合，从而调节转录的活性。被发现的特异DNA序列有：
TA TAA T序列（原核生物在-10区域，又称Pribnow box 或Pribnow盒）
TTGACA序列（原核生物在-35区域）
TA TA盒（真核生物在-25~-35区域）
CAA T盒（真核生物在-30~-110区域）
顺式作用元件——在结构基因两侧近距离的某些具有调节作用的DNA序列称顺式作用元件(cis-acting element)。包括启动子、增强子、沉默子等。
（2）调节蛋白质的作用：特异因
阻遏蛋白
激活蛋白如：CAP
原核生物基因调节蛋白如：转录因子
反式作用因子——位于真核细胞核内特异性地与顺式作用元件结合，从而调节基因转录活性的一类蛋白质称为反式作用因子(trans-acting factor)。
顺式作用蛋白——如DNA的表达蛋白能调节自身DNA分子上的基因转录活性，称为顺式作用蛋白
（3）DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质的相互作用
DNA-蛋白质相互作用(DNA-protein interaction)
——反式作用因子与顺式作用元件之间的特异识别与结合。
特点：非共价键结合
实质：多肽链中的侧链与DNA中的碱基作用
蛋白质-蛋白质的相互作用(protein-protein interaction)——形成二聚体或多聚体后结合DNA，调节基因的转录。
（4）RNA聚合酶的活性
启动子（或启动序列）影响其活性
调节蛋白质的作用影响其活性
二、真核基因表达调控
1、真核基因组结构特点
真核基因组结构庞大哺乳类动物基因组DNA由约3 × 109 bp（碱基对）的核苷酸组成。其中表达的基因约占全部基因组的6%。
单顺反子与原核不同，真核基因转录产物为单顺反子，即一个编码基因转录生成一个mRNA分子、经翻译生成一条多肽链。有很多真核蛋白质由几条不同的多肽链组成，因此存在多个基因协调表达的问题。
重复序列在原核、真核DNA中都有重复出现的核苷酸序列，但在真核更普遍。重复序列长短不一，重复频率也不尽相同。根据重复频率可将重复序列区分为高度重复序列（106次）、中度重复序列（103~104次）及单考贝序列。
基因不连续性真核结构基因两侧存在有不被转录的非编码序列，往往是基因表达的调控区。在编码基因内部尚有一些不为蛋白质编码的间隔序列，称内含子；编码序列称外显子，因此真核基因是不连续的。
2、真核基因表达调控特点
同原核一样，转录起始仍是真核基因表达调控的最基本环节，而且某些机制是一样的。但在下述方面与原核存在明显差别。
活性染色体结构变化当基因被激活时，可观察到染色体相应区域发生某些结构和性质变化，如活化基因对核酸酶极度敏感；当基因活化时，转录区DNA有拓扑结构变化； DNA碱基修饰（如甲基化）变化及组蛋白变化。
正性调节占主导真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有实质性的亲和力，必需依赖一种或多种激活蛋白的作用。尽管已发现某些基因含有负性顺式作用元件存在；很多真核调节因子既可作为激活蛋白又可作为阻遏蛋白发挥调节作用，但负性调节元件并不普遍存在。较大真核基因组广泛存在正性调节机制。在正性调节中，大多数基因不结合调节蛋白，所以是没有活性的；只要细胞表达一组激活蛋白时，相关靶基因即可被激活。
转录与翻译分隔进行真核细胞有细胞核及胞浆等区间分布，转录与翻译在不同细胞部位进行。
转录后修饰、加工真核基因转录后剪接及修饰等过程比原核复杂。
真核基因转录激活调节
顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”（trans）。顺式作用元件是同一DNA 分子中具有转录调节功能的特异DNA序列。
按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动子、增强子及沉默子。①启动子──是原核操纵子中启动序列的同义语。真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，每一组件含7~20 bp的DNA序列。启动子包括至少一个转录起始点以及一个以上的机能组件。在这些机能组件中最具典型意义的就是TA TA盒，它的共有序列是TA TAAAA。TA TA盒通常位于转录起始点上游-25 ~ -30 bp，控制转录起始的准确性及频率。TA TA盒是基本转录因子TFIID结合位点。除TA TA盒外，GC盒（GGGCGG）和CAA T盒（GCCAA T）也是很多基因常见的，它们通常位于转录起始点上游-30 ~ -110 bp区域。
此外，还发现很多其它类型的机能组件。由TA TA盒及转录起始点即可构成最简单的启动子。②增强子──就是远离转录起始点（1 ~ 30 kb）、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关。增强子也是由若干机能组件组成，有些机能组件既可在增强子、也可在启动子中出现。这些机能组件是特异转录因子结合DNA的核心序列。从机能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。有时，对结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。通常描述的、具有独立的转录活性和决定基因时间、空间特异性表达能力的启动子就是这类定义的启动子。在酵母基因，有一种类似高等真核增强子样作用的序列，称为上游激活序列（UASs），其在转录激活中的作用类似。③沉默子──某些基因含有的一种负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。
反式作用因子除少数顺式作用蛋白，大多数转录调节因子以反式作用调节基因转录。
这些调节蛋白又称转录调节因子，简称转录因子（TF）。按功能特性可将其分为两类：①基本转录因子──是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种RNA转录的类别。有人将其视为RNA聚合酶的组成成分或亚基，故称基本转录因子。对三种RNA聚合酶来说，除个别基本转录因子成分是通用的，如TFIID；而大多数成分是不同RNA聚合酶所特有的。例如TFIID、TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF及TFIIH 为RNA聚合酶II催化所有mRNA转录所必需。②特异转录因子──为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达，故称特异转录因子。多数特异转录调节蛋白属DNA结合蛋白，具有DNA结合域、转录激活域，此外还具有介导蛋白质-蛋白质相互作用的界面，如锌指蛋白(zinc finger)、螺旋- 转角-螺旋蛋白（HTH）、螺旋-环-螺旋蛋白(HLH)及碱性亮氨酸拉链（bZIP）等.
此类特异因子有的起转录激活作用，有的起转录抑制作用。前者称转录激活因子，后者称转录抑制因子。转录激活因子通常是一些增强子结合蛋白；多数转录抑制因子是沉默子结合蛋白，但也有抑制因子以不依赖DNA的方式起作用，而是通过蛋白质-蛋白质相互作用、"中和"转录激活因子或TFIID，降低它们在细胞内的有效浓度，抑制基因转录。因为在不同的组织或细胞中各种特异转录因子分布不同，所以基因表达状态、方式不同。
mRNA转录激活及其调节真核基因mRNA转录激活就是“转录起始复合物”形成的过程，转录激活调节就是对转录起始复合物形成的调节。真核RNA聚合酶II不能单独识
别、结合启动子，而是先由基本转录因子TFIID组成成分TBP识别TA TA盒或启动元件（Inr），并有TAF参与结合，形成TFIID─启动子复合物；继而在TFIIA~F等参与下，RNA聚合酶II与TFIID、TFIIB聚合，形成一个功能性的前起始复合物PIC。在几种基本转录因子中，TFIID是唯一具有位点特异的DNA结合能力的因子，在上述有序的组装过程起关键性指导作用。这样形成的前起始复合物尚不稳定，也不能有效起动mRNA 转录。在迂回折叠的DNA构象中，结合了增强子的转录激活因子与前起始复合物中的TFIID接近，或通过特异的中介因子──TBP相关因子（TAF）与TFIID联系，形成稳定的转录起始复合物。
此时，RNA聚合酶II才能真正起mRNA转录。TBP相关因子也是细胞特异的，与转录激活因子共同决定组织特异性转录。
真核基因转录激活调节是复杂的、多样的。不同的DNA元件组合可产生多种类型的转录调节方式；多种转录因子又可结合相同或不同的DNA元件。结合DNA前，特异转录因子常需通过蛋白质-蛋白质相互作用形成二聚体复合物。组成二聚体的单体不同，所形成的二聚体结合DNA的能力不同，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。这样，基因调节元件不同，存在于细胞内的因子种类、性质及浓度不同，所发生的DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用类型不同，产生协同、竞争或拮抗，调节基因的转录激活方式。
原核生物和真核生物中基因的转录、翻译和后修饰 摘要:原核生物和真核生物中基因的转录、翻译和后修饰，是各种功能蛋白质生物合成的一系列程序。本文通过介绍了原核生物和真核生物中基因的转录、翻译和后修饰的机制、原理、过程，从而了解真核生物和原核生物的基因表达和功能蛋白质合成上的差异。 关键词: 原核生物真核生物基因转录翻译后修饰 0引言： 21世纪，基因水平上的研究受到人们广泛的关注。原核生物和真核生物中基因的转录、翻译和后修饰是基础研究，人们也只有在此基础不断扩散深入研究其它基因水平问题。本文只简单介绍了一些关于基因转录、翻译和后修饰的一部分相关研究成果。 1 原核生物和真核生物中基因的转录： 基因转录是在由RNA聚合酶和辅助因子组成的转录复合物的催化下，从双链DNA分子中拷贝生物信息生成一条RNA链的过程。转录中，一个基因会被读取被复制为mRNA，就是说一特定的DNA片断作为模板，以DNA依赖的RNA合成酶作为催化剂的合成前体mRNA的过程。转录产物主要有三类RNA，即信使RNA （mRNA）、核糖体RNA（rRNA）和转移RNA（tRNA）。在基因转录过程中，RNA聚合酶起着非常重要的作用。RNA聚合酶可以催化所有四种核苷- 5′-三磷酸（ATP、GTP、UTP和CTP）聚合成与模板DNA互补的RNA。此反应需要Mg2+,反应中释放焦磷酸。[1]该酶在转录的各个过程中发挥了不同的作用。 1．1 基因转录的启动 RNA聚合酶正确识别DNA模板上的启动子并形成由酶、DNA和核苷三磷酸构成的三元起始复合物，转录便开始进行。启动子是DNA分子上可与RNA聚合酶特异结合，而使转录开始的一段DNA序列而本身不被转录。DNA模板上的启动区域常含有TATAATG顺序，称P盒。复合物中的核苷三磷酸一般为GTP,少数为ATP,因而原始转录产物的5′端通常为三磷酸鸟苷(pppG)或腺苷三磷酸(pppA)。真核DNA上的转录启动区域也有类似原核DNA的启动区结构，和在-30bp（即在酶和DNA结合点的上游30核苷酸处）附近也含有TATA结构，称TATA盒。[3]第一个核苷三磷酸与第二个核苷三磷酸缩合生成3′-5′磷酸二酯键后,则启动阶段结束，进入延伸阶段。 1．2 基因转录的延伸 σ亚基脱离酶分子，留下的核心酶与 DNA的结合变松，因而较容易继续往前移动。核心酶无模板专一性，能转录模板上的任何顺序，包括在转录后加工时待切除的居间顺序。脱离核心酶的σ亚基还可与另外的核心酶结合，参与另一
SECTION 5 转录和转录水平的调控 重点： 转录的反应体系，原核生物RNA聚合酶和真核生物中的RNA聚合酶的特点，RNA的转录过程大体可分为起始、延长、终止三个阶段。真核RNA的转录后加工，包括各种RNA前体的加工过程。基因表达调控的基本概念、特点、基本原理。乳糖操纵子的结构、负性调控、正性调控、协调调节、转录衰减、SOS 反应。 难点： 转录模板的不对称性极其命名，原核生物及真核生物的转录起始，真核生物的转录终止，mRNA前体的剪接机制（套索的形成及剪接），第Ⅰ、Ⅱ类和第Ⅳ类内含子的剪接过程，四膜虫rRNA前体的加工，核酶的作用机理。真核基因及基因表达调控的特点、顺式作用元件和反式作用因子的概念、种类和特点. 以及它们在转录激活中的作用。 一．模板和酶： 要点 1．模板 RNA的转录合成需要DNA做模板，DNA双链中只有一股链起模板作用，指导RNA合成的一股DNA链称为模板链（template strand），与之相对的另一股链为编码链（coding strand），不对称转录有两方面含义:一是DNA链上只有部分的区段作为转录模板(有意义链或模板链),二是模板链并非自始至终位于同一股DNA单链上。 2．RNA聚合酶 转录需要RNA聚合酶。原核生物的RNA聚合酶由多个亚基组成:α2ββ'称为核心酶,转录延长只需核心酶即可。α2ββ'σ称为全酶,转录起始前需要σ亚基辨认起始点,所以全酶是转录起始必需的。真核生物RNA聚合酶有RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种,分别转录45s-rRNA; mRNA(其前体是hnRNA);以及5s-rRNA、snRNA和tRNA。 3.模板与酶的辨认结合 转录模板上有被RNA聚合酶辨认和结合的位点。在转录起始之前被RNA聚合酶结合的DNA部位称为启动子。典型的原核生物启动子序列是-35区的TTGACA序列和-10区的Pribnow盒即TATAAT序列。真核生物的转录上游调控序列统称为顺式作用元件,主要有TATA盒、、CG盒、上游活化序列(酵母细胞)、增强子等等。和顺式作用元件结合的蛋白质都有调控转录的作用,统称为反式作用因子。反式作用因子已发现数百种,能够归类的称为转录因子(TF),相应于RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ的是TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ。TFⅡ又有A、B、C、D、E、F多种及其亚类。 基本概念： 1.不对称转录: 两重含义,一是指双链DNA只有一股单链用作转录模板(模板链);二是对不同基因同一单链上某些区段作为模板链而另一些区段作为编码链，即模板链并非永远在同一单链上。 2.编码链: DNA双链上不用作转录模板的那一段单链,因其碱基序列除由T代 替U而外,其他与转录产物mRNA序列相同而得名。
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求 1）随机六聚体引物： 当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2）Oligo(dT)： 是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。 3）特异性引物： 最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 做Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求： ①Tm=55-65℃ ②GC=30-80% ③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。 ④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。 至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。 五、cDNA与引物质量检测 取0.2ml薄壁PCR管，编号。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul；加入正反向引物各0.5ul（引物浓度10uM），向管中加入混合的cDNA各1ul。各管补加水至20ul。 组份加量 2×PCRTaqMix10ul 10uMPrimer FW 0.5ul 10uMPrimer RV 0.5ul Template DNA 1ul
一．前期对一些重要试剂用量的评估（以mRNA 100ng为计算标准）1.如果原材料0.2g（约5株2周苗期的苗），分成两管，每管0.1g，则分别加TRIzol 2ml（共4ml），也就是说，每个生物样品作两次生物重复的话。每瓶TRIzol有100ml，所以可以做25个材料。 2.一个材料作二次生物重复，需要4根Zymo RNA纯化柱。一个标准Zymo Kit有100个反应柱子，也就是可以做25个材料。 3.RNA fragmentation完整Kit可以做100个样品。 4.mini/midi Kit可以做12个柱子反应。 二．前期准备工作 1.DEPC处理的Rnase free水； 2.RNA专用的75%乙醇、异丙醇、三氯甲烷和NaOAc； 3.220℃烘烤>6小时的研磨棒、器皿和药匙； 4.足够的液氮； 三．其它小知识 理论上，每100mg材料可以获得100-200ug total RNA，纯化后获得的mRNA的量约为total RNA量的1/100。 四．具体实验步骤 （一）TRIzol提取总RNA 1．先将研磨棒等用液氮预冷，然后加液氮粉碎叶片（组织），越细越好。 2．准备好TRIzol管，每50-100mg材料加入1mlTRIzol（材料体积应小于TRIzol体积的10%），振荡或用移液器打至无大颗粒（震荡2分钟可）。 3．悬液室温放置>5min(可30min放置)。再加入1/5V（起始体积）氯仿，剧烈振荡1-2分钟，室温放置5min。然后13000rpm 2-8℃离心30 min。 4．吸取无色上清（约有1/2的起始体积量），加入1/2 V（起始体积）异丙醇。室温放置10 min。然后13000rpm 2-8℃离心30 min。 5．弃上清液。沉淀物以75%乙醇洗涤（>1ml乙醇/1mlTRIzol）。然后13000rpm 2-8℃离心10min。 6．空转一次，吸去上清。 7．适当干燥5 min。加入经DEPC处理的Rnase free水100ul，冰浴1小时。 8．检测：2μl电泳检测，另取1μl稀释10倍后测OD值。 9．【用RNase free 的Dnase酶切。（一般100ug 的总RNA中加4%-5%V 的RNase inhibitor和10-20U的Dnase，然后37℃ 30 min）。】10．如果暂时不用，可以加1/10V的3M PH5.5的NaOAc和3V体积无水乙醇，-80℃放置2小时以上或overnight。然后12500rpm 2-8℃离心 15 min，重复step 5-7。
启动子 科技名词定义 中文名称：启动子 英文名称：promoter;P 定义1：DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；基因表达与调控（二级学科） 定义2：对遗传转录起发动作用的基因。 应用学科：水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科） 定义3：DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域。在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科） 定义4：决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列。 应用学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由核苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA 聚合酶polymerases) 的活动。这种酶指导着RNA复制。 目录 简介
1启动子区的基本结构转录单元 1转录起点 1启动子区 1-10位的TATA区和-35位的TTGACA区 展开 简介 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的 起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA聚合酶polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的RNA 复制本。一般分为广谱表达型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子等多种形式。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。这种变化常见于恶性肿瘤。真核细胞含有3类不同的RNA聚合酶，根据其对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同，分为RNA聚合酶Ⅰ（A）、RNA聚合酶Ⅱ（B）、RNA聚合酶Ⅲ（C），如下： 酶的种类[1] 存在功能对抑制物的敏感性 RNA聚合酶 Ⅰ 核仁合成rRNA前体不敏感RNA聚合酶 Ⅱ 核质合成mRNA前体及大多数snRNA 低浓度敏感 RNA聚合酶Ⅲ核质 合成5S rRNA前体、tRNA前体及其他的核和胞质小 RNA前体 高浓度敏感 [1]真核细胞还具有线粒体RNA聚合酶，存在于线粒体，能产生线粒体RNA；叶绿体RNA聚合酶，存在于叶绿体，能产生叶绿体RNA。 如RNA聚合酶Ⅱ识别Ⅱ类启动子，催化mRNA和大多数核内小RNA（snRNA）合成，它的启动子很复杂，主要包括4个部位：第一个部位为转录的起始部位其碱基大多为A；第二个部位是TATA框（TATA box），其共有序列为TATA（A/T）A（A/T），是富含AT的7个核苷酸。TATA框是类似于原核启动子的Pribnow框，位于-25；第三个部位为CAAT框（CAAT box），其共有序列为GGNCAATCT（其中N为C或T），位于-75附近；第四部分为增强子（enhancer），增加转录的速率
关于逆转录试剂的那些事 逆转录（reverse transcription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。是RNA病毒的复制形式，需逆转录酶的催化。艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。 逆转录与反转录严格意义上来说没有什么区别，但是逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程；反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，逆转录在体内，反转录在体外。 逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA 互补DNA(complementary DNA,cDNA)。逆转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有逆转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有逆转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。 逆转录酶 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为赖氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反转录酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。 BIOG Super Reverse Transcriptase是公司美国团队在西雅图的实验室研发出的一款具有卓越性能的逆转录酶。利用基因工程技术，我们成功地将BIOG Super的热稳定性大幅提高，即使在摄氏50多度时也有较好的逆转录表现，从而有效克服了RNA模板二级结构对逆转录反应的影响。与其它品牌的逆转录酶相比，BIOG Super与RNA模板具有更高的亲和力，更容易获得完整的cDNA片段，并可检测到低至1pg总RNA 中的目标片段，特别适合于总RNA量较少以及目标RNA拷贝数较低情况下的逆转录。 成分反应体系 组分2000单位10000单位 5×BIOG RT Buffer500ul500ul BIOG Super Reverse Transcriptase 10ul50ul RNase free ddH2O to20μl 5×BIOG RT Buffer4μl dNTP Mixture(10mM each)1μl Gene Specific Primers(2μM)1μl RNase inhibitor(40U/μl)1μl BIOG Super Reverse Transcriptase1μl 模板RNA100pg-5μg
启动子概述 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。启动子是一段位于结构基因5’-端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，并具有转录起始的特异性。基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物。启动子分三类：启动子Ⅰ、启动子Ⅱ、启动子Ⅲ.只有启动子Ⅱ指导mRNA的转录。真核生物启动子Ⅱ由两大部分组成：上游元件(upstream element)和启动子核心(core promoter)。上游元件与转录的效率有关；启动子核心包括3部分：TATA 盒、起始子(initinator)及下游元件(downstream element)。TATA盒为转录调控因子包括各种调节蛋白的结合区，与转录起始位点的精确选择及转录有关，起始子是转录起始所必须，下游元件作用尚不清楚。原核生物启动子区范围较小，包括TATAAT区(Pribnow区)及其上游的TTGACA区。 启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合位点的DNA序列，位于基因上游。启动子具有如下特征： 1序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的序列框，序列框中碱基的变化会导致转录启动活性的改变。 2方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件，有单向启动子和双向启动子两类。 3位置特性。启动子一般位于所启动转录基因的上游或基因内的前端。处于基因的下4种属特异性。原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启动 没有启动子，基因就不能转录。原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。启动子区域：（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5—10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T， 故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。（2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。 质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7,pMC1，PGK启动子等。一下介绍几个常见的启动子。 （1）U6启动子 U6是二型启动子，一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列。由Ⅲ类RNA聚合酶启动子U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果。这一类 启动子在腺病毒和慢病毒干扰载体的构建中应用很多。U6更多的是用在shRNA的启动，来达到敲低一个基因的作用。
反转录酶的新时代 之一具有高扩增活性，高热稳定性的反转录酶反转录酶，又称逆转录酶，是依赖RNA为模板的DNA聚合酶的统称。美国科学家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年发现了反转录酶，并因此获得了1975年的诺贝尔生理学医学奖。反转录酶的发现对遗传工程技术起来到了巨大的推动作用，是研究真核或者原核生物目的基因，构建cDNA文库等实验不可或缺的工具，与Taq酶等共同构成了现代生物技术的的基础工具酶。 目前已经商品化的反转酶主要有，AMV（avian myeloblastosis virus）和m-mlv （molomey murine leukemia virus）两种反转录酶。AMV来源于禽成髓细胞瘤病毒，最适反应温度在42℃，具有较强的反转录活性和RNase-H活性，RNase H 是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链，从而限制了cDNA的合成长度。与之对应的m-mlv该酶基因来源于莫洛尼氏小鼠白血病病毒，在具有较强的反转录活性的同时，却具有较低的RNase-H活性，所以它可以获得较长的cDNA 片段，因此目前m-mlv应用最广。像promega公司，takara公司等生产的都是这种酶。但是这并没有说明m-mlv就是完美的，由于的它的扩增能力有限，一般获得的cDNA片段长度不超过6KB，不足以满足构建cDNA片段，同时该酶的热稳定性较差，50℃时半衰期很短，无法通过提高反应温度克服RNA的二级结构，因此当遇到有复杂结构的RNA时，反转录酶就会从模板上掉下来，反转录失败。如何通过基因工程的方法提高m-mlv的反转录活性，降低RNase-H活性，提高酶的热稳定性，已成为生物公司的研发热点之一。 有着雄厚研发能力的北京百泰克生物技术有限公司，一直致力于优良性能的反转录酶的研发工作，在不懈的努力下终于在2011来临之际迎来了突破性进展。我们经过对m-mlv基因多次定点突变，使该酶的性质得到了质的飞跃！消除了该酶的RNase-H活性，增加了反转录酶与模板的结合能力，增强了酶的延伸活性，从而很到程度上提高了酶的扩增速度，最大可以获得超过15kb的cDNA片段，充分满足了构建cDNA文库的要求；不仅如此，我们研发的反转录酶耐热性显著增强，最适合反应温度50℃，在42℃-55℃范围内拥有最高活性的80%以上，最高反应温度可达60℃，因此可以轻松克服模板RNA的二级结构，顺利完成反
DNA 复制、基因控制蛋白质合成 注：mRNA 即信使RNA 呈单链，是以DNA 的一条链为模板转录出来的，它是翻译的模板；tRNA 呈“三叶草”型，是翻译时转运氨基酸的工具；rRNA 也呈单链，它与蛋白质组成核糖体的成分。 【例1】关于DNA 和RNA 的组成及结构的说法正确的是( ) A ．人体细胞中都有5种碱基和8种核苷酸 B ．硝化细菌的遗传物质由5种碱基构成 C ．蓝藻的线粒体中含有DNA 和RNA D ．DNA 彻底水解得到的产物中有脱氧核糖而没有核糖 解析：在人体成熟红细胞中不含 DNA 、RNA ，因而其内不含碱基和核苷酸；硝化细菌的遗传物质是DNA ，由4种碱基构成；蓝藻属原核生物，无线粒体。答案：D 【特别提醒】 （1）若核酸中出现碱基T 或五碳糖为脱氧核糖，则比为DNA 。 （2）若核酸中出现碱基U 或五碳糖为核糖，则比为RNA 。 （3）若A ≠T 、C ≠G ，则为单链DNA ；若A=T 、C=G ，则一般认为是双链DNA 。
【例2】在遗传信息的传递过程中，一般不可能发生的是( ) A．DNA复制、转录及翻译过程都遵循碱基互补配对原则 B．核基因转录形成的mRNA穿过核孔进入细胞质中进行翻译过程 C．RNA复制、转录都是以DNA一条链为模板，翻译则是以mRNA为模板 D．DNA复制、转录和翻译的原料依次是脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸 解析：DNA复制是以DNA的两条链为模板进行的，转录是以DNA的一条链为模板进行的；组成DNA、RNA、蛋白质的基本单位分别为脱氧核苷酸、核糖核苷酸和氨基酸，因此，复制、转录和翻译的原料依次是脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸。答案：C 【特别提醒】 （1）对细胞结构的生物而言，DNA复制发生于细胞分裂过程中，而转录和翻译则发生于细胞分裂、分化等过程。 （2）DNA中含有T而无U，而RNA中含有U而无T，因此可通过放射性同位素标记T或U，研究DNA 复制或转录过程。 （3）复制和转录发生在DNA存在的部位，如细胞核、叶绿体、线粒体、拟核、质粒等部位。 （4）转录出的RNA有3类，但携带遗传信息的只有mRNA。 （5）一个mRNA分子上可相继结合多个核糖体，同时合成多条相同的肽链。 （6）从核糖体上脱离下来的只是多肽链，多肽链还要在相应的细胞器(内质网、高尔基体)内加工，最后才形成具有一定空间结构的有活性的蛋白质。 【例3】有关蛋白质合成的叙述，正确的是(多选)( ) A．终止密码子不编码氨基酸 B．每种tRNA只转运一种氨基酸 C．tRNA的反密码子携带了氨基酸序列的遗传信息 D．核糖体可在mRNA上移动
原核生物基因的转录的 过程 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
原核生物基因的转录的过程 转录过程包括启动、延伸和终止。 启动RNA聚合酶正确识别DNA模板上的启动子并形成由酶、DNA 和核苷三磷酸(NTP)构成的三元起始复合物，转录即自此开始。DNA模板上的启动区域常含有TATAATG顺序，称普里布诺(Pribnow)盒或P盒。复合物中的核苷三磷酸一般为GTP,少数为ATP,因而原始转录产物的5′端通常为三磷酸鸟苷(pppG)或腺苷三磷酸(pppA)。真核DNA上的转录启动区域也有类似原核DNA的启动区结构，和在-30bp（即在酶和DNA结合点的上游30核苷酸处，常以—30表示，bp为碱基对的简写）附近也含有TATA结构，称霍格内斯(Hogness)盒或TATA盒。第一个核苷三磷酸与第二个核苷三磷酸缩合生成3′-5′磷酸二酯键后,则启动阶段结束，进入延伸阶段。 延伸σ亚基脱离酶分子，留下的核心酶与DNA的结合变松，因而较容易继续往前移动。核心酶无模板专一性，能转录模板上的任何顺序，包括在转录后加工时待切除的居间顺序。脱离核心酶的σ亚基还可与另外的核心酶结合，参与另一转录过程。随着转录不断延伸，DNA双链顺次地被打开,并接受新来的碱基配对，合成新的磷酸二酯键后，核心酶向前移去，已使用过的模板重新关闭起来，恢复原来的双链结构。一般合成的RNA链
对DNA模板具有高度的忠实性。RNA合成的速度，原核为25～50个核苷酸／秒，真核为45～100个核苷酸／秒。 终止转录的终止包括停止延伸及释放RNA聚合酶和合成的RNA。在原核生物基因或操纵子的末端通常有一段终止序列即终止子；RNA合成就在这里终止。原核细胞转录终止需要一种终止因子ρ（四个亚基构成的蛋白质）的帮助。真核生物DNA上也可能有转录终止的信号。已知真核DNA转录单元的3′端均含富有AT的序列〔如AATAA(A)或ATTAA(A)等〕，在相隔0～30bp之后又出现TTTT顺序（通常是3～5个T）,这些结构可能与转录终止或者与3′端添加多聚A顺序有关。
SMART 技术制备GS FLX 样品cDNA详细流程 第一天 一．RNA的提取 1.用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook)：1）在1.5 ml管中加入600ulRL T和6ul B-巯基乙醇 2）取10—30mg组织样品放入管中，用剪刀或电动匀浆机破碎，3—5min 3）12000rpm/3min,取上清移入新管 4）加入1倍体积70%乙醇，轻柔混匀（吸打），不能离心，并立即转入收集柱，10000rpm/30s,弃废液。(分两次移吸附柱，离心弃废液后，打开盖子让酒精挥发一下再操作) 5）加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液 6）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液 7）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新收集管，空转12000rpm/1min 8）将收集柱移入1.5mlRnase-free管中，加30—50ulRnase-free water,静置1min,10000rpm/1min..(由于下步用Dnase去除DNA,需用87.5ul RNA溶液，因此用45ul Rnase-free water洗两次) 9）定量，跑胶 2.用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除DNA 污染 1）反应体系：共100ul 87.5ul RNA 溶液
10ul buffer RDD 2.5ul Dnase I储存液（配制：干粉溶于550ul的Rnase-Free ddH20 中，分装，-20℃保存） 2）20—25℃孕育10min 3.用Qiagen Rnwasy Mini Kit 纯化 1）100ul除DNA后的RNA+350ulRL T,混匀 2）加入250ul无水乙醇，轻柔混匀，不能离心，并立即移入收集柱，10000rpm/30s，弃废液 3）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液 4）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新的收集管，空转1min 5) 换1.5ml管，加30—50ulRnase-free water，置1min,10000rpm/1min 6）定量，跑胶 第二天 二．反转录（SMART Kit,详见Manual） 1.做逆转录之前对RNA的处理： 浓缩RNA 1）在所提取的RNA里（大约为10ug），加无水乙醇（2倍体积），醋酸钠（3M. PH=15.2 0.1倍体积） 2）-70℃, 酝酿40min或过夜. 3）取出溶液，3000g/1min; 换个方向，12000rpm/5min
启动子：RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。 不同的启动子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶识别位点和结合位点。 （1）、-10序列在转录起点上游大约-10处，有一个6bp的保守序列TATAAT，称Pribnow框。此段序列出现在-4到-13bp之间，每个位点的保守性在45%-100%。 频度：T89 A89 T50 A65 A65 T100 据预测，Pribnow框中，一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。 目前认为，Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物，Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开，形成开放型起始结构，它是RNA聚合酶牢固的结合位点，是启动子的关键部位。 RNA聚合酶的结合，诱导富含AT的Pribnow框的双链解开，然后进一步扩大成17个核苷酸长度的泡状物，在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。 （2）、-35序列 只含-10序列的DNA不能转录，在-10序列上游还有一个保守序列，其中心约在-35位置，称为-35序列，此序列为RNA酶的识别区域。 各碱基出现频率如下：T85 T83 G81 A61 C69 A52 ，其中TTG十分保守。 -35序列的功能：它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。因此，-35序列对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。-35序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的启动子。 -35序列提供RNA聚合酶识别信号， -10序列有助于DNA局部双链解开，启动子结构的不对称性决定了转录的方向。 2.熟悉原核生物启动子的结构与功能、其中的－35区、－10区等的结构？ ①域中的基序并与之结合，启动转录的起始。一般将DNA上的转录位点定位+1来排序，其下游（右侧）为正值，其上游（左侧）为负值。原核生物不同基因的启动子虽然结构也有一定的差异，但明显具有共同的特点。◆结构典型，都含有识别（R），结合（B）和起始（I）三个位点；◆序列保守，如-35序列，-10序列结构都十分保守；◆位置和距离都比较恒定；◆直接和多聚酶相结合；◆常和操纵子相邻；◆都在其控制基因的5′端；◆决定转录的启动和方向。 ②-35序列又称为Sextama盒,其保守序列为TTGACA，与-10序列相隔16～19bp。其功能是：◆为RNA 聚合酶的识别位点。RNA 聚合酶的核心酶只能起到和模板结合和催化的功能，并不能识别-35序列，只有σ亚基才能识别-35序列，为转录选择模板链。◆-35序列和-10序列的距离是相当稳定的，过大或过小都会降低转录活性。这可能是因为RNA 聚合酶本身的大小和空间结构有关。 ③-10序列也称为Pribnow框盒,其保守序列为TATAAT，位于-10bp左右，其中3′端的“T”十分保守。A,T较丰富，易于解链。它和转录起始位点“I”一般相距5bp。其功能是：◆与RNA聚合酶紧密结合；◆形成开放启动复合体；◆使RNA聚合酶定向转录。 为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?显然启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序（consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。 转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5’末端的序列称为上游（upstream），而把其后而即3’未端的序列称为下游（downstream）。在描述碱基的位置时，一般用数字表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3……，上游方向依次为-1、-2、-3…
反转录PCR 科技名词定义 中文名称：反转录PCR 英文名称：reverse transcription PCR;RT-PCR 定义：扩增mRNA的一种实验技术。先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用 PCR方法加以扩增。 应用学科：遗传学（一级学科）；基因组学（二级学科） 以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录 一、反转录酶的选择 二、合成cDNA引物的选择 三、操作步骤 四、注意事项 RT-PCR反应原理 [1] 反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、
合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 编辑本段一、反转录酶的选择 1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 编辑本段二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA 具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于 Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 编辑本段三、操作步骤 1. 总RNA的提取。 2. cDNA第一链的合成（Reverse Transcription）：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以
了解启动子 目录 1. 基因的构成 (2) 2. 启动子（promoter） (3) 3. 终止子（termianator） (4)
1. 基因的构成 基因是由成千上万个核苷酸对组成。组成基因的核苷酸序列可以分为不同区段。在基因表达的过程中，不同区段所起的作用不同。在遗传学上通常将能编码蛋白质的基因称为结构基因。任何一个基因都包括非编码区和编码区。能够转录为相应信使RNA-mRNA，进而指导蛋白质合成(也就是能编码蛋白质）的区段叫做编码区,编码区中可分为内含子和外显子。不能转录为信使RNA、不能编码蛋白质的区段叫做非编码区。非编码区位于编码区前后，同属于一个基因，控制基因的表达和强弱。 非编码区虽然不能编码蛋白质，但对遗传信息的表达是不可缺少的，因为在它上面由调控遗传信息表达的核苷酸序列，该序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子、终止子属于非编码区。因为回文序列的特殊排列，大多都位于非编码区。
原核基因的编码区全部编码蛋白质，真核生物的基因是间断的、不连续的、断裂的基因。一个断裂基因能够含有若干段编码序列，可以编码蛋白质的序列称为外显子。在两个外显子之间被一段不编码的间隔序列隔开，这些间隔序列称为内含子。非编码区在每个断裂基因的第一个和最后一个外显子的外侧，有人称其为侧翼序列。在侧翼序列上有一系列调控序列。通常把基因转录起点前面即5’端的序列称为上游(upstream)，起点后面即3’端的序列称为下游(downstream)。并把起点的位置记为+1，下游的核苷酸依次记为+2，+3，……，上游方向依次记为-1，-2，-3，……。 2. 启动子（promoter） 位于编码区上游的非编码区中，含有丰富的转录因子结合位点（transcription factor binding sites, TFBS）。主要包含核心启动子区域（TSS附近-60bp到+40bp）和调控区域。核心启动子区域产生基础水平的转录，对于精确转录是必须的最小单元；调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对基因的表达水平做出相应的调节。 启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp（主要在transcript start site 上游1kb的范围内），有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。
TUREscript H M-MLV Reverse Transcriptase 使 用 说 明 书 包 装 量： 产品组成、储存、浓度： 储存：－20 ℃ 保存。浓度：200 units/μl 制品说明：本制品使用通过基因重组技术克隆表达的点突变型RNase H 活性缺失的M-MuLV 反转录酶 TUREscript Hˉ RTase 。野生型的M-MuLV 包含的RNase H 活性能够催化降解DNA/RNA 杂合体中的RNA ，因此在cDNA 第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA 杂合体中的模板RNA 。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H 活性缺失，与M-MuLV 相比，具有更强的延伸能力和稳定性，可用于较长的cDNA 合成以及高比例的全长cDNA 文库的构建等。 适用范围：第一链cDNA 合成。可用于低拷贝基因的检测。 特点：合成cDNA 片段长度最高可达12 kb 。 第一链cDNA 合成(以20 μl 反应体系为例) 1.加入
2. 轻轻混匀 如用Oligo(dT)18或基因特异引物(GSP)，42℃孵育50min。 如用Random Primer，25℃孵育10 min，42℃孵育50 min。 3.65℃加热15 min失活TUREscript Hˉ RTase。 RT-PCR 建议取1/10-1/5 体积(2-4 μl)的反转录产物作为PCR模板。 (以50 μl反应体系为例) PCR 循环 94℃ 2-5 min 94℃ 30 sec 50-60℃ 30 sec 30-40 cycles 72℃ 1-2 kb/min 72℃5-10 min 注意事项: 1.避免RNase污染。 2.为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。 3.如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构，可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混匀， 65℃变性5分钟，冰上冷却，短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。 NOT FOR HUMAN OR DRUG USE
1.最早应用于的表达系统的是Lac乳糖操纵子，由启动子lacP + 操纵基因lacO + 结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。 https://www.doczj.com/doc/8f11166722.html,cUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI 产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。 3.tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。 4.trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。 5.在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac 操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。 6.IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30℃下抑制转录，42℃开始发挥作用。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物的稳定。 7.以λ噬菌体转录启动子PL、PR 构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30℃下阻遏启动子转录，42℃下解除抑制开始转录。同样的，PL、PR表达载体需要以cI857(ts)作为表达菌株，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因溶源化到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cI基因的表达，从而解除强大的PL启动子的抑制。 8.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由