重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶和玻璃酸钠滴眼液对睑板腺异常相关干眼的效果对比分析

重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶和玻璃酸钠滴眼液对睑板腺异常相关干眼的效果对比分析

【摘要】目的：将重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶和玻璃酸钠滴眼液对睑板腺异常相关干眼的治疗效果进行对比分析，从而得出治疗的最佳方案。方法：本文采取的方法是将2013年4月至2014年9月期间来医院进行治疗的睑板腺异常相关干眼患者75例（75只眼）进行随机分组，第一组为采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶进行治疗的组（即观察组），第二组为采用玻璃酸钠滴眼液进行治疗的组（即对照组）。在患者治疗过程中将两组患者的治疗前后（治疗后采取20和40天）效果进行临床症状评分，此外，将泪膜破裂的时间、泪液分泌试验、角膜荧光染色进行评分，还有将睑板腺进行评分，然后将这些评分进行比较分析，最终统计治疗总的效果。结果：两组患者在治疗后40天的临床症状评分、泪膜破裂的时间以及角膜荧光染色的评分都明显高于治疗前和治疗后20天的评分（P=0.067）；且观察组的临床症状评分、泪膜破裂的时间以及角膜荧光染色的评分都高于对照组（P=0.045）。结论：采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶和玻璃酸钠滴眼液进行治疗都可以改善患者的临床症状，延长泪膜破裂的时间，修复角膜的损伤，但采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶的治疗效果明显优于采用玻璃酸钠滴眼液的治疗效果。总体而言，两者对睑板腺功能障碍的治疗效果都不太明显，需要配合其他药物进行治疗。

【关键词】重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶；玻璃酸钠滴眼液；睑板腺异常；干眼

干眼症是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和（或）眼表组织病变特征的多种疾病的总称。又称角结膜干燥症。常见之症状包括眼睛干涩、容易疲倦、眼痒、有异物感、痛灼热感、分泌物黏稠、怕风、畏光、对外界刺激很敏感；有时眼睛太干，基本泪液不足，反而刺激反射性泪液分泌，而造成常常流泪；较严重者眼睛会红肿、充血、角质化、角膜上皮破皮而有丝状物黏附，这种损伤日久则可造成角结膜病变，并会影响视力。临床上可以分为两种类型，即蒸发过强型和泪液分泌不足型[1]。睑板腺功能障碍（meibomain gland dysfunction，MGD），在油性皮肤及年老者中十

分常见，是蒸发过强型干眼症的主要原因。它可以被广义的分为阻塞型和非阻塞型。症状包括眼红、眼部烧灼感、异物感、干燥感，刺激感、痒、视疲劳、视力波动、流泪等。睑缘常增厚，可伴有红斑、过度角化等[2-3]。目前，睑板腺异常相关干眼的临床治疗主要包括（1）眼睑的物理清洁，注意眼睑卫生；（2）口服抗生素；（3）局部药物的应用；（4）热敷和按摩，等。药物主要包括重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶和玻璃酸钠滴眼液等[4-5]。

1 材料与方法

1.1 材料

本文选取2013年4月至2014年9月在医院进行治疗的确诊为睑板腺异常相关干眼的患者75例（75只眼），这些患者都符合睑板腺功能障碍的诊断标准，试验选取过程中排除了眼部感染患者、眼球突出患者以及全身有炎症的患者[6]。这些患者中男性患者有45人（45只眼），女性患者有30人（30只眼），年龄在22至60之间，平均（41±6.5）岁；患病确诊时间为25天至4个月；临床都表现为眼红、眼部烧灼感、异物感、干燥感，刺激感、痒、视疲劳、视力波动、流泪，且伴随有睑缘增厚，有红斑、过度角化等症状，临床症状评分为（每一项目1至3分，总分30分）11至18分，平均（14.52±4.67），泪膜破裂时间小于9秒，平均（3.42±1.43），泪液分泌试验平均（6.23±2.16）毫米，角膜荧光素染色评分平均（3.75±2.14），睑板腺评分平均（4.04±1.76）。采用随机分组的方法将75名患者随机分为两组，第一组为采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶进行治疗的组37例（即观察组），第二组为采用玻璃酸钠滴眼液进行治疗的组38例（即对照组），且两组患者的资料经过统计学比较得出，差异无统计学意义，即P=0.06，所以具有可比性。

1.2 方法

设为观察组的的患者采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶进行治疗（上海生工生物股份有限公司，规格为每支21000IU/5g，国药准字S2*******），将此药物涂抹于患者的眼部，每天涂抹4次。设为对照组的患者采用玻璃酸钠滴眼液进行治疗（规格为每支5mL：5g，进口药品注册证号H20130583），每次滴1滴药液，每日5至6次。两组患者在治疗过程中都同时给予热敷和按摩等物理治疗手段。眼睑清洁、热敷：用毛巾浸入高于体温但别太烫的水，闭眼敷于眼睛

上，每次10分钟左右，早上最好能做一次，因为夜里睑板腺分泌最旺盛，潴留的分泌物最多，热敷可以帮助潴留的分泌物排出，如果有时间一天可以多做几次，效果很好；睑板腺按摩：由医务人员按摩。沿睑板腺排出方向按摩，将那些通过热敷仍不能排出的分泌物推出。如果自觉有效，可以每星期做一次，一个月为一个疗程。

1.3 指标观察

在患者治疗过程中将两组患者的治疗前后（治疗后采取20和40天）效果进行临床症状评分，此外，将泪膜破裂的时间、泪液分泌试验、角膜荧光染色进行评分，还有将睑板腺进行评分，然后将这些评分进行比较分析，最终统计治疗总的效果。无效的标准：患者的症状在临床上未见缓解，泪膜破裂的时间小于半分钟，检查眼睑后可以看见有异常分泌物；好转的标准：患者的症状在临床上有缓解迹象，泪膜破裂的时间恢复正常，检查眼睑后未看见有异常分泌物；痊愈的标准：患者的症状在临床上完全消失，且泪膜破裂的时间回复正常，同样检查眼睑后未看见有异常分泌物。本文以痊愈和好转合起来共同算为总的效果有效。

1.4 统计学分析

将收集到的数据采用软件SPSS16.0进行处理分析，结果显示采用平均数±标准差（即X±s）显示，比较采用t检验；计数的资料采用百分比显示，用X2检验。其中P小于0.05表示差异显著，且有统计学意义。

2 结果

表1 两组患者指标比较分析（X±s）

组别治疗时间症状评分泪膜破裂时间泪液分泌试

验角膜荧光素染

色

睑板腺评分

（分）

观察组（n=37

）治疗前13.54±4.45 3.26±1.34 6.04±2.13 3.64±2.15 3.86±1.89 治疗后20天8.58±3.12* 4.35±1.36 6.31±1.78 2.35±1.25* 3.75±1.75 治疗后40天 5.65±4.06*△□ 5.46±1.39*△□ 6.35±2.04 1.78±1.56*△□ 3.78±1.69

对照组（n=38

）治疗前13.35±4.36 3.68±1.18 6.04±2.05 3.69±2.26 3.97±1.85 治疗后20天9.41±4.65* 3.86±1.11 6.23±1.98 3.24±2.04* 3.85±1.89 治疗后40天7.59±4.62*△ 4.67±1.13*△ 6.33±1.89 3.23±2.14*△ 3.84±1.74

注：与本组治疗前相比，*P小于0.05；与本组治疗后20天相比，△P小于0.05；与对照组治疗后40天相比，□P小于0.05

表2 两组患者临床治疗效果比较分析[ 例（％）] 组别无效好转痊愈总有效

观察组（n=37）6（16.22）15（40.54）16（43.24）31（83.78）* 对照组（n=38）13（34.21）11（28.95）14（36.84）25（65.79）注：与对照组相比，X2=5.453，*P小于0.05

3 讨论

睑板腺功能障碍导致的干眼病患者大约占各类干眼病患者的68％，在油性皮肤及年老者中十分常见，是蒸发过强型干眼症的主要原因。[7]它可以被广义的分为阻塞型和非阻塞型。症状包括眼红、眼部烧灼感、异物感、干燥感，刺激感、痒、视疲劳、视力波动、流泪等。睑缘常增厚，可伴有红斑、过度角化等。人类由睑板腺分泌的睑脂构成了泪膜的脂质层，而其脂质层位于泪膜的最表面，这层脂质的主要功能是防止眼部水分的迅速蒸发，并且使得泪膜能够均匀分布，这种作用在很大程度上增加了泪膜的稳定性[8]。除此之外，这层脂质还具有维持眼睛表面的光学表面，以及阻止微生物对眼睛表面的侵染的作用，这些功能与作用都可以起到保护眼睛表面的作用[9]。

睑板腺阻塞是睑板腺功能旺盛等造成分泌物排泄不出从而形成的堵塞.会形成睑板腺囊肿，这会直接导致睑板腺分泌的脂质量大幅度减少，进而造成眼部水分的迅速蒸发、增加泪膜的渗透压，最终造成泪膜稳定性的降低[10]；这种阻塞还会使得睑板腺內睑的脂质层增多，进一步导致睑板腺阻塞，最终使眼睛表面及其内部腺体中各类微生物的侵染速度加快，从而造成眼部的不适，加重干眼的症状表现[11]。

玻璃酸钠滴眼液是人工合成的具有高分子的滴眼液，玻璃酸钠可以与纤维连接蛋白结合，通过此作用可以促进上皮细胞的连接和伸展。同时，玻璃酸钠可以促进角膜创伤治愈作用，以及促进角膜上皮伸展作用。此外，由于玻璃酸钠分子内部有许多水分子，因此其具有优异的保水性，可以促进泪膜的稳定，最终减轻角膜干燥的症状[12]。重组牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对来源于中胚层

和外胚层的组织具有促进修复和再生的作用，其对碱烧伤后角膜上皮的再生、角膜基质层和内皮层的修复均有促进作用。重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶的主要成分是寡糖以及氨基酸等，此物质主要治疗各种原因引起的角膜上皮损伤和点状角膜病变：复发性浅层点状角膜病变和轻中度干眼症、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良、地图状（或营养性）单疱性角膜溃疡和大泡性角膜炎等[13]。本文经试验所得数据显示，观察组的总有效果显著地高于对照组（P=0.045），这种显著的差异表示重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶可以显著缓解患者的眼部不适的症状，并且可以延长泪膜破裂的时间以及修复角膜上皮的损伤。

总体而言，采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶和玻璃酸钠滴眼液进行治疗都可以改善患者的临床症状，延长泪膜破裂的时间，修复角膜的损伤，但采用重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶的治疗效果明显优于采用玻璃酸钠滴眼液的治疗效果。两者对睑板腺功能障碍的治疗效果都不太明显，需要配合其他药物进行治疗。

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老化皮肤成纤维细胞的分析研究进展

老化皮肤成纤维细胞的研究进展 丛敬1，2，指导：吴景东1 <1 辽宁中医药大学，沈阳110032；2 沈阳医学院，沈阳110034 ） 【摘要】延缓皮肤老化，永葆青春是人类从未放弃的梦想。成纤维细胞作为真皮中主要细胞成分，已广泛应用于皮肤老化模型的建立和研究中。较系统的介绍了成纤维细胞的组织学结构与功能，其在细胞和分子水平影响皮肤老化的机制，对深入研究皮肤老化的机制、预防和治疗具有重要意义。 【关键词】成纤维细胞；皮肤老化；机制；中药研究 成纤维细胞是皮肤真皮中最主要的细胞成分，在合成分泌纤维和细胞外基质中扮演着重要的角色，在组织创伤修复中发挥着重要的作用。随着年龄的增长，皮肤老化突显，可以表现为皮肤干燥粗糙，皱纹增多、加深，皮肤松弛，弹性下降等。这些临床表现都与成纤维细胞数量减少，合成功能下降或异常有关。因此，在皮肤老化的研究中，人们越来越关注成纤维细胞的结构和功能的改变及其对皮肤老化产生的影响。 1 成纤维细胞的组织学结构与功能 光镜下观察[1]，成纤维细胞胞体较大，常呈多突起的扁平星状。细胞核较大，扁卵圆形，着色浅，核仁明显。细胞质较丰富，呈弱嗜碱性。胞质内有较多的核糖核酸，碱性磷酸酶的活性很强。电镜下，细胞表面有一些微绒毛和粗短的突起，胞质内富于粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。 成纤维细胞的超微结构表明，细胞合成蛋白质功能旺盛。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白，弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋白等基质成分[1]。在婴儿和青年人皮肤中，Ⅰ型胶原蛋白的含量约占70％，Ⅲ型胶原蛋白占30％。在衰老过程中，成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白增加，Ⅰ型胶原蛋白减少。成纤维细胞受损，还可以产生大量异常弹性蛋白，导致皮肤弹性下降，皱纹增多，且难以平复。 2 成纤维细胞致皮肤老化的作用机理 皮肤老化包括自然老化和外源性老化两种形式，其发生、发展的机制十分复杂。成纤维细胞在致皮肤老化的过程中发挥着十分重要的作用。 2.1基因调控异常 紫外线照射可导致成纤维细胞急性DNA 光损伤和突变，形成环丁烷嘧啶二聚体和6- 4 嘧啶- 嘧啶酮光产物，光老化的成纤维细胞对其修复能力下降，表达参与细胞核外切修复的蛋白及其mRNA水平亦下降[2-3]。而光老化成纤维细胞DNA修复能力的下降是由于修复合成相关因子表达下降导致核苷酸切除修复后期功能障碍造成的[4]。 人类线粒体DNA

眼药水的六大常见问题

关于眼药水的六大常见问题

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关于眼药水的六大常见问题？ １、通常在何时点眼药水? 一般点完眼药水后最好闭眼几分钟,利于吸收。在早起后,午睡前和晚上睡觉之前点眼药水效果比较好。其它时间点眼药水要注意选择时间较充裕的时候,不要一点完,马上就去做别的事情。2、每次点几滴眼药水? 眼药水一次1~2滴就够了,多滴不仅吸收不了,而且还可能产生不良反应。一滴眼药水约３0微升,而结膜囊内可贮存的容量平常只有7微升,多点眼药水后,结膜囊的容量最多也只能增加至30微升，多余的眼药水不是从眼角溢出,就是沿鼻泪管流向鼻腔。对于那些没有毒副作用和刺激作用的眼药水来说，多点几滴只是造成了浪费。 ３、选择眼药水的依据 虽然很多眼药可以自己选择,但是在购买眼药水之前最好请眼科医生检查一下,到底是什么病,再根据医生的建议去买。如果一定要选择的话，必须要仔细看说明书，如果使用过程中有什么不适马上看医生。 4、有些眼药不能乱点 很多人点眼药水都是听别人介绍,特别是当自己的症状与别人“一样”时，其实这样做是很危险的。有几种眼药水需要特别注意,首先是阿托品眼液，阿托品眼液是用于治疗急性虹膜睫状体炎的，主要症状是眼睛发红，疼痛、视力下降。阿托品可以扩散

瞳孔,缓解炎症,防止虹膜和晶状体粘连。因为其散瞳作用很强，作用时间长，将瞳孔散大后,一般需要三周左右的时间才能完全恢复。在此期间,很难用药物使它缩小。有的患者就曾经因为“眼红”症状,错用阿托品,导致双目失明。眼药水并非“必备品”眼药水原则上是能不用就不用。 5、用眼药水要适度 为保持药物的无菌性和延长药物的有效期,其中一般都加入防腐剂保质。虽说微量防腐剂对眼睛损伤并不大，但多次使用眼药水，长期过度接触防腐剂，可能会对眼睛产生伤害,导致正常泪膜受到破坏,角膜上皮细胞出现损伤。因此，原则上来说，眼药水能不用就不用，若必须使用，一天不应超过4次。 ６、眼药水混用要慎重 买眼药水时看着这种眼药水的功能是这样，那种眼药水功能是那样，两者功能互补好像正好能解决自己的眼睛问题,于是眼药水使用时将两者混用,滴完一种五分钟后滴另一种。对于这种方法,有些眼药水可以混用，但是有些是不能混用的，有些眼药水混用后会降低疗效，有些甚至会产生毒性,因此如果想混用眼药水,要去询问一下医生的意见,不要想当然行事。 经常滴眼药水的危害 危害一：患上干眼症

成纤维细胞的最新用途

成纤维细胞的最新用途 一、自体成纤维细胞除皱整形技术的研究应用进展 1、培养的成纤维细胞去皱技术在整形外科上的应用 2005年Anon道在2002年ChelseWestminster医院用Isoagen治疗85％烧伤病人取得了被称为“接近奇迹”的效果。病人康复后说：“瘢痕的皮肤整个不再正常，但治疗后很多的活力回到了她脸上，朋友们见到她认为又回到了她自己，我不能想象有可能用任何其他的方法。” 2、作用原理： 注射培养的自体成纤维细胞制剂能促进软组织的强化作用和促进组织的再生用于除皱和软组织的缺陷，胶原蛋白的氨基酸组成和结构，具有组织细胞的支持功能，是构成皮肤的支架。胶原分子在成纤维细胞内合成并分泌到细胞外，在细胞内先合成多肽链，继之，3条前α链集聚，生成前胶原，即胶原分子的前体。前胶原分子分泌到细胞外间隙内以后受到限制性蛋白水解作用，消除分子的伸展肽而软化为胶原。在细胞外间隙内消除伸展肽后，胶原分子自发地排到成纤维。胶原交联后，纤维获得了所需的张力强度。注射培养的自体成纤维细胞制剂增加了皮肤成纤维细胞，促进胶原分子的合成、交联，使皮肤恢复弹性，皱纹消失。 二、成纤维细胞成骨作用的研究 1、成纤维细胞在骨折愈合中的成骨作用 成纤维细胞在骨缺损等特殊环境下同成骨细胞一起参与成骨过程。Chai

Parrasad]等通过电镜发现成纤维细胞分泌合成胶原纤丝,并在胶原纤丝内沉积钙盐结晶,在纵形排列的胶原纤丝内可以看到64 OA的周期带。软骨细胞合成分泌的是Ⅱ型胶原;而成纤维细胞及成骨细胞合成分泌的是Ⅰ型胶原,两种细胞合成分泌的Ⅰ型胶原,无论在形态上,还是在生化结构上是完全一样的。成纤维细胞形成基质小泡,并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成毛球状钙球,钙球合并融合成为骨组织。金大地在骨缺损修复的超微结构中发现了不同发育阶段的成纤维细胞的成骨现象。 2、作用原理： 在骨折愈合实验及成纤维细胞体外培养实验研究中均已被证实。成纤维细胞在骨折修复中不仅对早期形成的纤维骨痂起到固定作用;在以后阶段中,纤维骨痂中的成纤维细胞两种途径演变为骨组织,成为两种相互联系的细胞。体外培养成纤维细胞证实,成纤维细胞不仅能分泌胶原、软多糖等基质成份,在细胞胞浆内及培养液中, ALP活性检测均为阳性,且能分泌大量骨小结节。成纤维细胞的固有发生性只有在特殊环境特殊需要的条件下才能表现出来;一些成骨因子在成纤维细胞骨化过程中起到诱导作用。这就提示我们在骨诱导因子的作用下,成纤维细胞不仅参与骨折愈合,在病理状态下,这种具有游走性的成纤维细胞可能发生局部浸润及成为组织病理性钙化和骨化的原因之一。

碱性成纤维细胞生长因子

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）神经再生 1975年Gospodarowicz首先报道运用理化方法从牛的大脑和垂体中分离纯化出碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）。80年代，bFGF的氨基酸序列得到澄清。90年代，国内外相继运用基因工程方法成功获得重组bFGF，有力推动了关于bFGF的研究。系列研究证实，bFGF能刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层的细胞分化增殖，在胚胎发育、组织愈合中起重要作用。神经方面，关于bFGF的研究集中在中枢神经，发现其神经活性广泛，能保护神经元，促进突起增生，提示在周围神经再生方面的研究意义。现参考近年来bFGF与神经再生的相关文献作一综述。 一、内源性bFGF正常情况下的表达和神经损伤后的变化 (一)中枢神经：正常情况下，内源性bFGF以微量分布于脑、垂体和下丘脑等器官，已证实星形胶质细胞、垂体滤泡及部分神经细胞能分泌bFGF，在海马皮质、中脑、纹状体和小脑颗粒细胞均有其受体。神经损伤后，早期就能观察到内源性bFGF表达增多，是神经损伤后早期反应之一。 叶诸榕用原代培养的大鼠大脑星形胶质细胞作成机械损伤模型，观察发现bFGF在损伤后2小时开始表达，12小时达高峰，2天后开始回落，星形胶质细胞胞体肥大，突起粗大。崔建忠运用Northern杂交、组织学方法动态观察大鼠颅脑弥漫性损伤后bFGF的基因表达和组织学改变，结果发现轻度损伤后12小时，重度损伤后4小时，bFGF基因表达增加，均于第3天达到高峰。Grothe〔1〕研究脊髓神经节bFGF及其Ⅰ型受体（FGFR-1)的表达时发现，正常情况下，bFGF和FGFR-1的mRNA在脊神经节均有表达，原位杂交显示星形胶质细胞产生bFGF，而感觉神经元表达FGFR-1，提示旁分泌作用；坐骨神经损伤后，L4～6感觉神经元bFGF的表达在1天内即上调，7天达高峰，28天后恢复，FGFR-1的变化则不明显。 (二)周围神经：Grothe〔1〕和Meisinger〔2〕1997年报道了bFGF及其受体在周围神经的表达和损伤后变化的研究结果，而此前该领域未见报道。该研究发现，正常情况下，大鼠坐骨神经FGFR-1 mRNA表达高于bFGF mRNA。坐骨神经损伤后，FGFR-1和bFGF的mRNA 在损伤远、近端均于不同的时相点上调，并有时间依赖性；bFGF的表达具有自身正反馈特点，且不影响FGFR-1。这一实验说明，与在中枢神经一致，内源性bFGF表达增多同样是外周神经损伤后的早期反应。 神经损伤后bFGF表达上调的意义是什么?不少学者将bFGF运用于神经细胞培养和神经损伤模型，发现bFGF具有广泛的促神经再生作用，提示bFGF表达增多是神经损伤后的修复反应，且可能具有始动意义。 二、外源性bFGF促进神经再生 (一)中枢神经 (1)离体试验：端礼荣在原代培养的大鼠胚胎中脑神经细胞中加入bFGF，观察发现细胞微团集落形成率明显增加，不同剂量的bFGF表现量效关系，图像分析见神经细胞突起增多，连接丰富呈网状。Miyagawa运用bFGF于原代培养的海马神经元轴突损伤模型，观察发现实验组较对照组轴突增生、突起增多。Himmelseher〔3〕进一步研究了不同浓度的bFGF对如上模型的作用，结果未用bFGF的对照组神经元存活65%，运用不同剂量bFGF的试验组神经元变性均减少，10 mg／L组存活神经元达85%，神经突起亦增多、增长。 由上述试验可见，bFGF能促进培养的神经细胞增生，神经细胞损伤后运用bFGF，变性死亡减少，神经突起增生，说明bFGF在体外具有促进、保护神经细胞的作用。Malgrane 〔4〕研究大鼠背根神经节神经元对神经毒性药物的反应时发现：bFGF不但能刺激轴突再

以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞_杨俊林

·基础研究· 以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞* 杨俊林 刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴 奔 高 庭 潘 盛 邬玲仟梁德生夏家辉 （中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078） 摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。结论： HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号： R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009） 16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts as feeder cells* YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting, PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui （State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ） ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs. Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009） 16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298） 作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@https://www.doczj.com/doc/a43815665.html, 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@https://www.doczj.com/doc/a43815665.html, 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者 △通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@https://www.doczj.com/doc/a43815665.html, （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30） 前言 自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。 hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。目前大 多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的， MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病

重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶-说明书

重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶-说明书以下内容仅供参考，请以药品包装盒中的说明书为准。 重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶说明书 【说明书修订日期】 2006年12月07日 【警告】 运动员慎用 【特殊标记】 外 【药品名称】 重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶 【英文名称】 RecombinantBovine Basic Fibroblast Growth Factor Gel 【汉语拼音】 Chongzu NiuJianxingchengxianweixibao Shengzhangyinziningjiao 【成份】

本品主要成份为重组牛碱性成纤维细胞生长因子。系由含有高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后制成。 【性状】 应为无色透明凝胶。 【适应症】 促进创面愈合，用于烧伤创面(包括浅Ⅱ度、深Ⅱ度、肉芽创面)、慢性创面(包括体表慢性溃疡等)和新鲜创面(包括外伤、供皮区创面、手术伤等)。 【规格】 21000IU/5g/支 【用法用量】 将凝胶直接涂于清创后的伤患处，覆以适当大小的消毒敷料，适当包扎即可。推荐剂量每次约300IU/cm2，每日一次，或遵医嘱。 【不良反应】 未见不良反应。 【禁忌】

对本品过敏者禁用。 【注意事项】 1.本品为无菌包装，用后请立即盖上喷盖，操作过程中，尽量保持无污染。 2.勿将本品置于高温或冰冻环境中。 3.高浓度碘酒、酒精、双氧水、重金属等蛋白变性剂可能会影响本品活性，建议常规清创后用生理盐水冲洗后再使用本品。 【孕妇及哺乳期妇女用药】 孕妇及哺乳期妇女使用本品的疗效和安全性尚未确立，必须使用时请遵医嘱。 【儿童用药】 17岁以下儿童患者使用本品的疗效和安全性尚未确立，必须使用时请遵医嘱。 【老年用药】 60岁上老年患者使用本品的疗效和安全性尚未确立，必须使用时请遵医嘱。 【药物相互作用】

玻璃酸钠滴眼液

玻璃酸钠滴眼液 【药品名称】 通用名称：玻璃酸钠滴眼液 英文名称：Sodium Hyaluronate Eye Drops 【成份】 玻璃酸钠。 【适应症】 眼睛疲劳、眼干燥症、眼干燥综合症、斯-约二氏综合症等内因性疾患。手术后药物性、外伤、光线对眼造成的刺激及戴隐形眼镜等引起的外因性疾病。 【用法用量】 滴眼,一次1滴,一日5～6次,可根据症状适当增减。 【不良反应】 1.过敏症:有时可能会发生眼睑炎、眼睑皮肤炎等,出现上述症状应停药。 2.有时可能会出现瘙痒感、刺激感、充血、弥漫性表层角膜炎等角膜障碍,出现上述症状时应停药。 【禁忌】 尚不明确。 【注意事项】 1.对本品过敏者禁用; 2.本品不能作为治疗使用，青光眼或眼部有剧痛感者，禁用本品; 3.包装开启后应在一月内用完，每次使用后必须立即关闭容器。如出现浑浊，停止使用。【特殊人群用药】

儿童注意事项： 尚不明确。 妊娠与哺乳期注意事项： 尚不明确。 老人注意事项： 尚不明确。 【药物相互作用】 尚不明确。 【药理作用】 1.玻璃酸钠是一种线性多糖,广泛存在于脊椎动物的结缔组织基质中。玻璃酸钠能与纤维连结蛋白结合,加速上皮细胞的粘附和延展;由于玻璃酸钠分子能存留大量水分子而具有较好的保水作用。 2.家兔试验提示,局部应用玻璃酸钠可一定程度促进角膜上皮损伤的愈合。体外试验提示,玻璃酸钠能加速培养的家兔角膜片中结膜上皮细胞的延展,具有防止离体家兔结膜片干燥的作用。 【贮藏】 密闭保存。 【有效期】 24个月 【批准文号】 国药准字H20103633 【说明书修订日期】

核准日期：2010年10月19日修改日期：2011年04月07日【生产企业】 企业名称：齐鲁天和惠世制药有限公司 生产地址：济南市高新区中心区新泺大街317号

成纤维细胞的最新用途

成纤维细胞的成骨作用 成纤维细胞经诱导可以形成骨组织，由于成纤维细胞直接参与了骨折愈合过程中纤维性骨痂的形成，其自身又具备被诱导成骨的能力，在体外大量培养扩增成纤维细胞，并施以有效的诱导因素(如上皮细胞、TNG-α和BMP等)使其具备成骨效能，然后与合适的生物材料载体复合，同时使该复合体在体外或体内保持良好的成骨能力并进行一定程度的成骨，则有望获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损，这无疑将为骨缺损的修复治疗开辟一条新的有辉煌前景的道路。 成纤维细胞修复受损心脏 美国研究人员通过对成纤维细胞进行重新编程，使其直接变成心肌细胞来修复受损的心脏。该方法一旦在人体试验中获得成功，再生的心肌组织将可用以修复因自然衰老和心脏停搏导致的损伤，同时还可避免干细胞疗法的安全隐患。该研究发表在《细胞》杂志上。 重组人类成纤维细胞生长因子 重组人类成纤维细胞生长因子研究具有非常重要的理论和实用意义，它有助于阐明分子水平的免疫调节机理，有助于疾病的预防、诊断和治疗，特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已用于治疗肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等，并收到良好疗效，具有非常广阔的应用前景。 在炎症期，重组人类成纤维细胞生长因子对创伤细胞有明显的趋向活性，刺激成纤维细胞，血管内皮细胞等向创伤部位移动。当细胞迁移至损伤部位时，开始进入增殖和修复期，其中最关键的步骤之一是肉芽组织的形成，肉芽组织的本质是大量的毛细血管和丰富的成纤维细胞，重组人类成纤维细胞生长因子正是成纤维细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的高效促生长剂，能够强烈促进新生毛细血管的形成，显著增加肉芽组织毛细血管数量和血液流量，改善创面微循环，为组织修复提供所必须的氧及丰富的营养物质；同时重组人类成纤维细胞生长因子对损伤组织部位神经纤维的再生也有显著的促进作用，加速损伤组织功能的恢复；成纤维细胞也是合成胶原的主要细胞，而胶原是肉芽组织中细胞间质的主要成份，重组人类成纤维细胞生长因子通过调控胶原的不断合成、分泌、改构和更新，而不断改善修复组织的结构和强度。

一 人皮肤成纤维细胞培养

Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.doczj.com/doc/a43815665.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week.

贝复济

产品介绍 贝复济主要成分为重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rb-bFGF)。是一种多功能细胞生长因子，具有广泛的生物活性，能促进与创伤修复有关的所有细胞迅速增殖和分化，从而主动促进创面修复，全面提高愈合质量，是一种安全有效的创伤修复治疗新药。 贝复济也是国内唯一，国际上第一个正式批准上市使用bFGF 用于创伤修复的药物。 作用机理 贝复济的主要成分为重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rb-bFGF)，对来源于中胚层和外胚层的组织具有促进修复和再生的作用。它与损伤部位的靶细胞（包括角膜上皮细胞、角膜内皮细胞和基质细胞）表面的特异性结合，激发细胞主动修复功能，促进角膜细胞的分裂增殖、移行和分化，加速角膜损伤愈合及改善角膜

愈合质量。 产品特点源于基因工程技术的国家一类新药加快伤口愈合，缩短创面愈合时间减少及避免瘢痕的形成 增加创面的抗撕裂强度 安全有效、无毒副作用 应用 外伤、刀割切、冻伤、手术伤口及激光创面、医学美容术后创面。 各种原因引起的溃疡、伤口延期不愈，糖尿病溃疡、放射性溃疡、褥疮、瘘窦、宫颈糜烂、口腔溃疡等。 烧烫伤、包括浅Ⅱ度、深Ⅱ度、肉芽创面。 产品介绍 贝复济冻干粉主要成分为外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rb-bFGF)。是一种多功能细胞生长因子，具有广泛的生物活性，能促进与创伤修复有关的所有细胞迅速增殖和分化，从而主动促进创面修复，全面提高愈合质量，是一种安全有效的创伤修复治疗新药。 贝复济冻干粉采用新型专利无菌包装, 滴瓶设计, 使用方便。 产品特点滴瓶设计--使用方便 无菌现配--活性更强 直接作用于修复细胞, 加速创面修复高度安全、无毒副作用 应用普外科

鸡胚成纤维细胞的制作及培养

鸡胚成纤维细胞培养 1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。 7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的 胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10－15分钟。一般约12分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织 已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。 使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。 10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。 培养基为0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易 生霉菌，每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24－48小时可形成单层细胞。 传代 1. 倾倒培养瓶内旧培养液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。 5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

成纤维细胞生长因子及其与受体作用机制的研究进展

成纤维细胞生长因子及其与受体作用机制 的研究进展1 姜媛媛，任桂萍，王文飞，郝建权，李德山 东北农业大学生命科学学院生物制药教研室，哈尔滨（150030） E-mail：deshanli@https://www.doczj.com/doc/a43815665.html, 摘要：成纤维细胞生长因子(FGF)是一类多肽类物质，其中大多数成员可与肝素结合发挥作用。目前已知FGF至少包括23个因子，即FGF1～23。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，可以分泌到细胞外。FGF家族成员是一类生理功能较广泛的生长因子，功能包括促进细胞有丝分裂、趋化与血管生成、促进中胚层和神经外胚层细胞的存活与生长等。本文根据最近的研究成果对 FGF因子及其受体研究进展做一综述，并主要对FGF因子特征及其研究趋势进行了探讨。 关键词：FGF，FGF受体，肝素 中图分类号:Q74 引言： 成纤维细胞生长因子最早是从脑和垂体的提取液中发现的，该物质是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类活性物质，可以通过与细胞膜特异性受体结合对细胞生长进行调节。从70年代中期到目前已进行了大量广泛的研究，目前已知FGF至少包括23个因子，它们在一级氨基酸序列上有一定的同源性，并有类似的生物学功能，且广泛存在于体内多种组织中。FGF对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有十分明显的促细胞分裂增殖作用，并且在机体内的胚胎发育、细胞生长分化、创伤组织愈合及肿瘤发生发展中起着十分重要的作用。 1. 成纤维细胞生长因子（FGF）家族 成纤维生长因子（Fibroblast growth factor, FGF）又被称为肝素亲和生长因子(Heparin binding growth factor, HBGF)，是一类通过与细胞膜特异性受体结合发挥作用的多肽分子。现已知FGF家族至少包括23个成员，即FGF1～FGF23。FGF家族成员之间的氨基酸序列同源性约为25%～50%，其每个成员都有140个氨基酸的中轴，该中轴在不同的成员中有高度的同源性。结构分析表明，此中轴折叠成12条逆向平行的β链，它们又进一步形成圆柱状的结构。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，使得它们可通过内质网一高尔基复合体的经典(即自分泌和旁分泌)途径被分泌到细胞外，但其中也有部分FGF则因本身缺乏信号肽结构，不能向外分泌，只能在细胞受损时释放[1]。多数FGF（如FGF3～8、10、15、17～19、21～23）的N末端具有典型的信号肽序列。而FGF16和FGF20虽然没有明确的信号肽序列却也能高效地分泌到细胞外[12]。FGF1 和FGF2也缺乏信号肽序列和正常的分泌途径，却也能出现在胞外基质，推测两者可能来自受伤的细胞，或者通过与内质网-高尔基体通路不同的细胞脱颗粒机制释放至胞外的。此外，FGF 11～14没有典型的信号肽序列，因此认为这些FGF是在胞内发挥作用[13]。由于FGF家族成员之间的氨基酸序列有25％～50％的同源性，分子结构有一定的共性，故FGF不同分子之间的生物学效应既有相似性，又有各自的特点[1-3]。 FGF1(aFGF)和FGF2(bFGF)是最先被发现，也是迄今为止研究最充分的两个成员，因其1本课题得到黑龙江省科技厅重点攻关项目（编号：2006G0461-00）的资助。

细胞原代培养细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤

人皮肤成纤维细胞的获取-

人皮肤成纤维细胞的获取 一、材料：手术过程中获取的老年人皮肤组织 二、所需试剂：DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，PBS缓冲液，青霉素，链霉素 三、方法： 1.提前准备好含有添加过青霉素和链霉素的PBS缓冲液的15ml离心管低温放置。 2.将得到的皮肤组织置于含有PBS（添加300U/ml青霉素和300μg/ml链霉素）的15ml 离心管中，并以冰盒存放拿至实验室立马进行实验。 3.在生物安全柜中将得到的皮肤组织于培养皿内用（含300U/ml青霉素和300μg/ml链霉 素）的PBS缓冲液反复漂洗3-5次。 4.用无菌手术刀片和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉和脂肪组织。或在PBS清洗前，用70% 酒精浸泡半分钟。 5.清理干净的皮肤组织转移至新培养皿内，用含抗生素的PBS反复清洗后，取出皮肤组织 转移到新的皿中。 6.用剪刀将皮肤剪成体积约1mm3大小的组织块。 7.将小组织块贴附于一新的培养皿底部，每平方厘米均匀接种10-15块组织。 8.5-10分钟后（以团块贴紧培养皿为准），加入少量含10%FBS的DMEM培养液，使组织 块刚刚接触培养液即可（不能浸没组织，防止组织块飘起来），置于CO2培养箱。 9.2-3h后沿培养皿边缘缓慢加入含10%FBS的DMEM培养液浸没组织块，随后将培养皿 轻轻放置于培养箱内，在移动过程中严禁剧烈晃动培养皿影响组织块的贴壁。 10.间隔2-3天观察组织块贴壁情况，并进行换液。 11.观察细胞爬出情况，当组织块周边细胞生长汇合率达90%以上时进行胰蛋白酶的消化传 代。剩余的组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，细胞达到融合后，再消化传代，然后剩余组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，反复上面的步骤。

2020药典三部,收载品种变化情况

本版药典（三部）新增品种名单 预防类 ?23价肺炎球菌多糖疫苗 ?无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗 ?黄热减毒活疫苗 ?冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞） ?S a b i n株脊髓灰质炎灭活疫苗（V e r o细胞） ?口服I型I I I型脊髓灰质炎减毒活疫苗（人二倍体细胞)治疗类 ?马破伤风免疫球蛋白F(a b')2 ?人凝血酶 ?人干扰素α2b阴道泡腾片 ?外用人粒细胞巨噬细胞刺激因子凝胶 ?康柏西普眼用注射液 ?精蛋白人胰岛素混合注射液（30R) ?精蛋白人胰岛素混合注射液（50R) ?甘精胰岛素 ?甘精胰岛素注射液 ?赖脯胰岛素 ?赖脯胰岛素注射液

?治疗用卡介苗 体外诊断类 ?人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫法） ?乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型核酸检测试剂盒 二部转三部品种 ?人胰岛素 ?人胰岛素注射液 ?精蛋白人胰岛素注射液 ?注射用人生长激素 本版药典（三部）采用生物制品通用名称与原通用名称对照

本版药典（三部）新增的生物制品通则/总论/通则和指导原则名单 一、新增的生物制品通则 ?生物制品通用名称命名原则 二、新增的总论 ?人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品总论 ?人用基因治疗制品总论 ?生物制品病毒安全性控制 ?螨变应原制品总论人用马免疫血清制品总论 三、新增的通则和指导原则 ?3128抗毒素/抗血清制品分子大小分布测定法

?3129单抗电荷变异体测定法 ?3130单抗N糖谱测定法 ?3208人血白蛋白铝残留量测定法（第二法） ?3303鼠源性病毒检査法（第二法） ?3307黄热减毒活疫苗猴体试验 ?3308禽源性病毒荧光定量P C R(Q-P C R)检查法 ?3407外源性D N A残留量测定法（第三法） ?3428人免疫球蛋白类制品I g A残留量测定法 ?3429免疫化学法 ?3503人用狂犬病疫苗效价测定法（第二法） ?3534S a b i n株脊髓灰质炎灭活疫苗效力试验 ?3535康柏西普生物学活性测定法 ?3601生物制品生产及检定用实验动物质量控制 ?3603重组胰蛋白酶 ?3650氢氧化铝佐剂 ?9401生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则?9402生物制品稳定性试验指导原则生物制品术语 本版药典（三部）未收载2015年版药典(三部）及增补本中的品种名单 治疗类 ?注射用重组链激酶