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细胞融合技术及进展

细胞融合技术及进展
细胞融合技术及进展

细胞融合技术及进展

摘要:细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。本文综述了关于细胞融合的基本理论并重点综述了细胞融合的基本方法及最新进展。

关键字:细胞融合生物技术方法综述

前言

细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。

细胞融合使细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限,扩大了遗传物质的重组范围。但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现,直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂,投资少,有利于广泛开展研究和推广,有着重大的实践意义,正得到科学界的日益重视。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。

1关于细胞融合的基本理论及概念

所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下,两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization) 。如取材为体细胞则称体细胞杂交(somatic hybridization)。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞,由此形成的杂交细胞,其特性会有

很大的变化。

由于对植物细胞和微生物细胞进行细胞融合时,必须除去细胞壁,而剩余的部分称为原生质体(protoplast),所以植物和微生物细胞的细胞融合实际上就是原生质体融合。原生质体融合(protop last fusion)亦称细胞融合(cell fusion),是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞,使一个细胞的遗传物质包括细胞核DNA 和核外基因都进入另一个细胞。

细胞融合大体分三个阶段进行。第一阶段是制出细胞融合体。首先要用氧把细胞分散开,再把细胞壁溶解掉,这时的细胞就成了原生质体。原生质体用聚乙烯乙二醇(PEG)处理后,再把PEG洗掉,形成原生质体的结合。第二阶段是融合子的鉴定。利用利于融合子生存的培养基删选出已经融合的杂种细胞。第三阶段是培养融合细胞阶段。融合细胞在细菌培养基或是不含有细菌的液体培养基中进行培养,结合细胞反复分裂后,形成细胞团,把细胞团移植于含有植物激素的培养基里长出茎、叶,再把它们移植于土壤之中或嫁接于植物体上,继续生长形成新植物。

细胞融合技术大体上可分为化学诱导融合、生物诱导融合和物理诱导融合三类。

2细胞融合技术的常用方法

2.1化学诱导融合

2.1.1 PEG诱导细胞融合法

1974 年发现的高效融合剂聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合,融合率可达30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物,存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合,导致细胞脱水而发生质膜结构的变化,从而引起细胞融合。为了发挥PEG 促进细胞融合的效力,必须采用较高的浓度(40%~50%,分子量为6000),但PEG 在高浓度下,细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此,选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。影响原生质体融合的因素很多。特别是环境中的阳离子存在,融合时的pH 也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲钙、镁离子有助于融合。如有钙离子存在时,可得到较高的融合率。但在缺乏钙离子时,若pH 较低,融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电

荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用,使原生质体带电,彼此易于附着发生凝集所致。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点,在细胞融合领域取得了可喜的成绩,大量的研究仍采用此法。虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道,但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。

2.2 物理诱导融合

2.2.1细胞电融合技术

细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的,以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段,和细胞电注射构成一对互补技术。在短时间强电场的作用下,细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb leb reakdown),瞬时失去其高电阻和低通透特性,然后在数分钟后恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时,即可诱导他们的膜相互融合,从而导致细胞融合。细胞融合分为两步:第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell contact) ;第二步,接受区膜结构受扰动而紊乱,然后恢复并融合。根据其诱导细胞接触的性质,分为特异性和非特异性两大类。非特异性细胞电融合法是指在进行细胞电融合时,无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本间的细胞杂交融合。主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的,是非特异性细胞聚集。非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚集电融合法。细胞融合所必需的两个步骤为:①细胞间接触;②接触区的膜结构受到瞬间扰动而导致融合。只要其中的任意一步有特异性,就能形成特异性的细胞融合。

与使用PEG的化学法相比,电融合诱导法是一种非常高效的细胞融合方法。电融合技术的优点在于:融合频率高,是PEG的100倍;操作简便、快速;对细胞无毒;可在镜下观察融合过程。故这种方法得以在短期内被广泛采用,成为细胞融合的主要技术手段。该方法的缺点是必须购置专用的细胞电融合设备。

2.2.2 激光诱导法

激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动),可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。

即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触,然后对接触处进行脉冲激光束处理,使质膜发生光击穿,产生微米级的微孔。这样,由于质膜上微孔的可逆性,细胞开始变形融合,最终成为一个细胞。使用此技术时,使细胞接触的方法可用①光俘虏法;②用低浓度的融合剂PEG (5% )使细胞聚法。目前,最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触,即光镊(potical tweezers)利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间,在光斑直径与光波波长尺度相比拟时,指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力,该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处,从而实现对细胞的操作。

激光微束融合法与病毒法、PEG法、电融合法相比较,可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时、定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌,无毒性。但它只能逐一处理细胞,不能像其他方法一样同时处理大量细胞。而且由于其所需设备昂贵复杂,操作技术难度大,很难推广应用。在微生物原生质体融合中应用激光微束技,融合效率较低且丧失了高度选择性的优点有赖后续步骤检出融合子激光诱导融合技术仍处在发展初期,还有待进一步完善。

2.3生物诱导融合

仙台病毒(HvJ)诱导法

1962年日本的冈田善雄(Okada)偶然发现了由日本血凝性病毒(HVJ)或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础。细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重。1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合方面做了大量的工作,并进一步利用这种灭活病毒来诱导不同种动物细胞间的融合。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新的台阶。

但是,利用灭活的病毒诱导细胞融合,存在着许多问题,如病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。

目前,这种方法主要适用于动物细胞融合,用于实验室研究。

3.细胞融合技术的最新进展

3.1空间细胞融合技术

植物细胞融合过程中由于地面上地球重力的存在,有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大,异源细胞融合得率十分有限。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中,在地面上由于无法排除地球重力的影响,要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。空间站微重力环境没有重力沉降、热对流和静水压等特点,不仅是研究重力生物学问题的理想场所,而且也为那些在地面因重力限制而难以发展的生物技术提供了新的机遇。20世纪80年代以来,德国细胞电融合技术发明家Zimmermann等人在空间材料科学的启发下,试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。大量的飞行实验结果表明,在微重力条件下酵母细胞杂种得率有很大的增加。融合得率增加显然是由于没有重力沉降影响的缘故,杂种细胞活力增加可能是细胞排列时间缩短引起的。最近的飞行试验结果表明在微重力条件下,哺乳动物细胞融合得率增加10倍,有活力的杂种细胞数比地面对照增加2倍。植物有无液泡原生质体的电融合得率,在微重力条件下比地面增加10-15倍。在取得这些成功实验的基础上,进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性已经开始。

3.2离子束细胞融合技术

雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体,20世纪80 年代中期,中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在,建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系。在离子束与生物体相互作用中,粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀,引起细胞膜透性和跨膜电场的改变,据此原理,发展了离子束诱导细胞融合技术。由于用于辐照的离子束的参数除了能量可调外,离子种类、电荷、质量皆可调,因此,离子束的可操纵性高,可以用微束对细胞进行超微加工,有目的地切割染色体用于基因工程和细胞工程,通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。此项研究一旦成功,将改变传统的一对一细胞融合的弊端,减少供体细胞导入的

染色体范围,使融合更具目的性,大大减少筛选的工作量,将是细胞融合研究的一大进步。

3.3非对称细胞融合技术

即利用某种外界因素(常为γ射线,即γ融合,gamma-fusion) 辐照某一细胞原生质体,选择性地破坏其细胞核。并用碘乙酰胺碱性蕊香红6 G处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体,选择性地使其细胞质失活。然后融合来自这两个原生质体品系的细胞,从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合,或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内,实现有限基因的转移,从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。

实践表明非对称细胞融合技术通过γ射线和X射线等照射,为实现供体亲本少数基因的转移,创造种间、属间杂种提供了可能性。值得注意的是,此方法特别适用于细胞质雄性不育基因的转移,通过辐照胞质不育的原生质体,破坏其染色体,与其具有优良性状品种的原生质体融合,从而获得实用的新的胞质不育系。这些都是常规育种所做不到的。

3.4基于微流控芯片的细胞融合技术

随着微机电系统(MEMS)技术和微加工技术的发展。微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟,加之微通道网络可以整合到生物芯片之上,这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台,利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。目前,基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域。利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控,比如转移、定位、变形等,也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞,细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现.此外由于在微通道内的腔体容积很小,所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量,同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。

3.5高通量细胞融合芯片

高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在微米范围内(10~40m)产生的高强度、高梯度辐射电场,使得细胞在特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力,精确处理和刺激预定的目标细胞,从而使目标细胞按照预先设计的方向

(可以是任何预先设计好的方向)以预定的速度(可以是不同种的细胞以不同的速度定向)移动,从而按照设计要求准确地、大批量地得到目标细胞配型,集成微电极阵列的微流控系统,可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移.由于在微通道内微电极间距可以做得很小,因此获得同样强度的辐射电场强度只需施加较低电压的交变电场和脉冲即可,不用加载昂贵的高电压发生装置。

高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合,比如:在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率.此外,二价阳离子(例如:钙离子)以及蛋白酶对细胞进行预处理,融合率也可大幅提高。

4.细胞融合技术的应用及发展前景

纵观细胞融合技术的发展历史,细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。融合剂走过了从活病毒,灭活病毒生物阶段到PEG化学物质阶段;新方法不断涌现,从生物学,化学方法,物理学方法过渡到各种方法的综合应用乃至应用空间技术。融合对象从动物,植物到微生物,从种内扩展到种间,从近缘扩展到远缘。伴随着细胞融合技术的每一次革新和改进,都会迅速在各个领域得到充分的应用,然后在实际应用中又不断发现新的问题,在解决实际问题中又促使细胞融合技术跃上一个又一个新的台阶,使其日臻完善。动物细胞融合、植物细胞融合、微生物细胞融合以及三者之间的细胞融合不断应用于基础理论研究和人类生产实际。如创造新物种、培育动物新品种、植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖、获得优良的微生物菌种以及药物单克隆抗体和疫苗等有用物质的生产。并且细胞融合技术和基因工程的汇合,使生物工程进入了崭新的发展阶段。

参考资料:

[1] 李志勇. 细胞工程[M]. 北京:科学出版社, 2003: 3-21.

[2] 罗立新. 细胞融合技术与应用[M].北京:化学工业出版社,2003:1-12.

[3] 霍乃蕊, 韩克光.细胞融合技术的发展及应用[J].激光生物学报,2006,15(2):209-213.

[4] 郭学民, 徐兴友.王同坤,等.植物细胞融合的研究进展(综述)[J]. 河北科技师范学院学报,2005,19(1):65-69.

[5] 王克明,细胞融合技术及其进展[J]. 浙江科技学院学报,2004,16(2):113-116.

[6] 孙剑秋, 周冬坡.微生物原生质体融合[ J ].生物学通报,2002, 37(7):9211.

[7] 张铭, 毛树坚.鱼类细胞电融合条件的研究[J ].杭州大学学报,1992,19(2):196-200.

[8] 罗雯,陈志勤.微生物原生质体融合技术及其在育种中的应用[J].西安联合大学学报,2003,6(4):5-6.

[9] 王蒂,细胞工程学[M].中国农业出版社,2000.306-307.

[10] 罗立新,潘力,郑穗平. 细胞工程[M ]. 广州:华南理工大学出版社, 2003: 5-19

细胞融合技术的应用与前景

细胞融合技术的应用与前景 人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象,首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞,紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合,随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新的 台阶。原生质体的大量制备较为困难,限制了植物细胞融合技术的发展,因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制,活性稳定,使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合,但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50~55)对细胞毒性很大,因此人们又找到了新的方法来替代PEG,这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史,该技术的不断改进首先表现在融合剂上,从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质,其次体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行,如将磁、超声、机械等和激光、电相结合,同时添加化学剂以便进一步提高融合率,细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单,便于量化研究,同时融合率又能得到不断提高的 方向发展。 1.细胞融合的意义 所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下,两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交口]。如取材为体细胞则称体细胞杂交,体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞,由此形成的杂交细胞,其特性会有很大的变化。细胞融合不受种属的局限,可实现种间生物体细胞的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒,极大地扩大了遗传物质的重组范围;细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂,投资少,有利于广泛开展研究和推广,有着重大的实践意义,正得到科学界的日益重视[2_引。经过长期反复研究和实践,细胞融合技术逐步发展和完善起来,已成为生物工程的基础技术之一。特别是近20年来,从理论和实践两个方面,有力地推动了生物科学各领域的发展。细胞融合方法得到了不断的更新,融合率也得到逐步的提高。 2.动物细胞融合技术 动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性,用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品,改良培育动物新品种,缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科,特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴,但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上,动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面,动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的用。动物体细

流式细胞术临床应用

流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析,PI可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N),而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期,S期和G2/ M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率,DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变,协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程,而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时,在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变,FCM可精确定量DNA含量的改变,作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志,能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价,有助于癌变的早期诊断。有资料证实,癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系,增生程度越重,癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重,DNA非整倍体出现率增高,这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可,DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据,FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大,敏感度高等优点,已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用,异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高,而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳的治疗方案,从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化,及时选用有效的药物,对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段,胞浆膜磷脂的不对称性丧失,导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层,从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的,也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的,而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的,而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此,Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色,凋亡细胞可被标记上Annexin-V,坏死和凋亡晚

原生质体细胞融合技术

食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术

原生质体细胞融合技术 摘要:细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG(聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等,并对它们的优缺进行简要的评述。 关键词:原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展 正文: 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术,把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞,这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质,具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前,通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段,而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备,原生质体融合,原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中,用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用

细胞融合技术的发展及应用

#专题综述# 细胞融合技术的发展及应用* 霍乃蕊a,韩克光b (山西农业大学a.食品科学与工程学院;b.动物科技学院,山西太谷030801) 摘要:细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段向操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。本文以细胞融合技术的发展历史为主线,对上述内容做了简要综述。 关键词:细胞融合技术;发展;应用 中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:100727146(2006)022******* C ell Fu si on T echn iqu e:its D eve l opm en t and App lica ti on s H U O N a i2ru i a,HA N Ke2guang b (Shanxi Agr i cu lt ura lUn i ve rs it y a.College of Food Sc i ence and Eng i neering; b.College ofAn i m a l Sc ience and Technol ogy,Ta i gu030801,Shanx,i Ch i na) Ab stra ct:C ell u l a r engi neer i ng i s o ne of t he f our techniques of biote chnolo gy,and as t he core of ce ll ular engi neering, the cell fusi on technique ha s acqu ired outstand i ng ach ieve m ents i n m any fields such as agr icu lt ure,m ed icine and envi2 ron m enta l protecti on.Its app licati on i s still i ncreasi ng i n nu m ber.The i m prove m ent of t he ce ll fusi on techn i que i nvol ves the fusi on agent,new m e t hods and the cells used i n fusi on.No w new cell fusi on m ethods are re sorti ng to the co m b i ned usage of phys i ca l and chem i ca lm ethods to deve l op a s i m p le and co nven i ent,easy quantificati on and a t t he sam e ti m e can i ncrease the fusi on rate.A ll these aspects were d i scussed i n th i s pape r centered aro und the h i story of the cell f usio n te ch2 n i que. K ey word s:ce ll fus i on techn i que;deve l op m ent;app licati on 细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合 第15卷第2期2006年4月 激光生物学报 ACTA LAS ER BI O LOGY SI NI CA Vo.l15No.2 Ap r.2006 *收稿日期:2005203210;修回日期:2005209222 基金项目:山西省科委攻关项目(04105523);山西省自然科学基金项目(20041094) 作者简介:霍乃蕊(1972)),女,博士,现为澳大利亚纽卡斯尔大学访问学者,主要从事生物工程方面研究. (电子信箱)sxndkgh@163.co m

动物的克隆----动物的细胞融合技术及其应用

第二章克隆技术 第三节动物的克隆----动物的细胞融合技术及其应用 【学习目标】 1.说出动物细胞融合技术的概念、原理及方法。 2.辨别细胞融合与细胞杂交。 3.简述单克隆抗体的制备过程。 【学习重难点】 1.重点:动物细胞融合技术的概念、原理及方法;辨别细胞融合与细胞杂交;单克隆抗体的制备过程。 2.难点:辨别细胞融合与细胞杂交;单克隆抗体的制备过程。 【课前导忆】 写下植物体细胞杂交(原生质体融合)的原理和诱导方法。 动物细胞克隆培养的方法和要求。 【课堂任务】 任务一: 请阅读p31,完成以下问题 细胞融合的概念: 细胞杂交的概念: 细胞融合的诱导方法: 选择下列材料,为制备针对肝癌细胞的单克隆抗体提供思路 原理: 动物细胞的融合物理: 诱导方法化学: 生物: 应用: 【课堂练习】 1、人绒毛膜促性腺激素(HCG)是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白,制备抗 HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图,请分析回 答: (1)制备单克隆抗体过程中要用到_________和__________技术。

(2)制备单克隆抗体过程中,给小鼠注射的HCG相当于________,使小鼠产生分泌相应 ________的淋巴细胞,此过程属于特异性免疫中的______________免疫。 (3)在细胞内DNA合成一般有两条途径,主途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成DNA,而氨基喋呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存 在的情况下,经酶催化作用合成DNA,而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。 ①.利用DNA合成途径不同的特点配制的HAT培养基含有多种成分,其中添加的_________ 成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。 ②.最终筛选获得的杂交瘤细胞的特点是___________________。 (4)此过程生产的单克隆抗体可以与______________特异性结合,从而诊断早孕。

细胞融合技术的发展过程

细胞融合技术的发展过程 生物方法融合:1957年,冈田善雄意外发现仙台病毒(HVJ),能诱导悬液中小鼠艾氏腹细胞(EAC)融合。然后Harris、Kada等用于诱导种间细胞融合,获得成功。 化学方法融合:1972年,卡尔森首先用硝酸钠进行烟草两个种的细胞原生质体的融合,1974年K a o等,首先发现聚乙二醇(PEG)能诱导植物细胞原生质体融合产生杂交细胞。 1975年Pentecorvo发现P E G也能帮助哺乳类动物细胞的融合,1976年,Davidson更进一步证实这一结果,并且认为其具有简单快速、高效率等优点。因而,1975年之后聚乙二醇就逐渐取代了仙台病毒。 电融合法电融合法:70年代未期和80年代初期发展起来的一种新的细 胞融合方法。1970年,Senda首先应用电脉冲,通过微电极在显微镜下使植物细胞融合,奠定电融合技术基础。 激光诱导卵细胞融合:激光诱导方法是最新的细胞融合方法,该法为张闻迪等人在1988年首先应用,他们利用激光微束的单色性、高功率密度、短脉宽和极小的作用范围等特点。对泥鳅受精卵进行融合试验,获得成功,且融合后的细胞可存活发育,经卵裂期、囊胚期、原肠期、孵化期、直至幼鱼。整个过程可通过显微镜观察,还可同时由电视摄象监视器观察和进行照相记录。 典型试题解析

试题:回答下列关于细胞工程的问题。(1)如图是细胞融合的示意图, 据图回答。 ①若A、B是植物细胞,则在细胞融合之前已用处理过。用 聚乙二醇诱导融合之后,体系中会出现未融合的细胞,原因 是。 ②若A是小鼠骨髓瘤细胞,B是受到抗原刺激的B淋巴细胞,用灭活的 仙台病毒诱导融合之后,需要用特定的选择性培养基进行筛选。在该培 养基上,细胞和的细胞都会 死亡,只有融合的杂种细胞(杂交瘤细胞)能够生长。杂交瘤细胞不止 一种,原因是。 (2)植物组织培养有一项应用是培育“脱毒苗”,动物细胞培养需要 创造“无菌无毒的环境”,脱毒苗中的“毒”是指,“无菌无毒环境”中的“毒”是指。 (3)制备单克隆抗体有一项重要的应用是作为诊断试剂,例如“早早 孕诊断试剂盒”。“早早孕诊断试剂盒”通过检测被测试者尿液中人绒 毛膜促性腺激素的含量,从而判断被测试者是否怀孕,其起检测作用的 核心物质是。 (4)动物的培育过程中需要进行细胞核移植,早期的细胞 核移植操作会将供体细胞的细胞核取出,再植入去核的卵母细胞,但取 出细胞核的过程会对细胞核造成一定的损伤。后期的核移植操作是直接 将供体细胞注射到去核卵母细胞外的透明带位置,再通过电刺激的方法 诱导,从而实现供体细胞核进入去核卵母细胞。 【答案】:(1)①纤维素酶和果胶酶融合的成功率不是百分之 百②未融合的亲本融合的具有同种核小鼠脾脏中分离 的B淋巴细胞是多种 (2)病毒代谢废物 (3)抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体 (4)克隆供体细胞膜与去核卵母细胞膜融合 【解析】:植物体细胞杂交技术:就是将不同种的植物体细胞原生质体 在一定条件下融合成杂种细胞,并把杂种细胞培育成完整植物体的技术;单克隆抗体的制备过程:首先用特定抗原注射小鼠体内,使其发生免疫,小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞,再利用动物细胞融合技术将 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合,经过两次筛选获得产生特定抗体的杂交 瘤细胞。据图分析,图示A细胞与B细胞融合,形成的C是正在融合的 细胞,D是杂种细胞。

造血干细胞移植临床应用研究进展

造血干细胞移植临床应用研究进展

解放军医学院 《血液系统》 论文题目:造血干细胞移植临床应用研究进展 学员姓名: 学号: 研究专业: 2016年月日

造血干细胞移植临床应用研究进展 何艳 ZS15078 造血干细胞移植是现代医学发展的一个重要里程碑,造血干细胞是最早发现,研究最多和最先用于治疗疾病的成体干细胞。血干细胞移植是从60年代逐渐发展起来的一种医疗技术,由于最初是通过抽取供体骨髓而获得造血干细胞,所以又称为骨髓移植。造血干细胞移植(HSCT)是通过大剂量放化疗预处理,清除受者体内的肿瘤或异常细胞,再将自体或异体造血干细胞移植给受者,使受者重建正常造血及免疫系统。目前广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤治疗。造血干细胞移植主要包括骨髓移植、外周血干细胞移植、脐血干细胞移植。由于骨髓为造血器官,早期进行的均为骨髓移植。近10年来,由于科学的进步,人们已可通过一些药物将骨髓中的造血干细胞"动员"到外周血中,通过血细胞分离机分取造血干细胞,称为"外周血干细胞移植"。 一般来说,人体有三个部位生产和存储造血干细胞,大部分在骨髓里,所以叫骨髓造血干细胞。还有一部分在外周血液中,也就是在血管里面有少量的造血干细胞。第三就是在脐带里有大量丰富的造血干细胞。一般根据患者的疾病种类、疾病状态及预后、HLA配型结果及供者年龄等因素综合考虑来选择造血干细胞移植方式。目前异

基因造血干细胞移植绝大多数为配型相同的同胞间、半相合父母与子女间、不全相合同胞间的移植,而随着全世界及我国骨髓库的增加,非血缘供者的异基因造血干细胞移植数量也在不断增加。不同移植类型各自优劣不同,自体造血干细胞移植的优点在于不受供者的限制,移植后不发生移植物抗宿主病,不需要使用免疫抑制剂,严重并发症较少,费用较低,缺点是复发率高。异基因造血干细胞移植治疗恶性疾病,植入的供者细胞有持久的抗肿瘤作用,复发率低,但严重并发症多,费用相对较高。近年来,全球每年的骨髓移植病例已超过1万例。中国造血干细胞移植已进入有序健康深入发展的状态,21世纪中国将成为造血干细胞移植的需求大。 骨髓移植技术使众多白细胞患者得到救治,使急性白血病患者的长期生存率提高到50%-70%。为发展此项技术做出了重要贡献的美国医学家托马斯因而获得了1990年度的诺贝尔医学奖。1976年托马斯报道100例晚期白血病病人经HLA相合同胞的骨髓移植后,13例奇迹般长期生存。从此全世界应用骨髓移植治疗白血病,再生障碍性贫血及其他严重血液病,严重血液功能缺陷病,急性放射病,部分恶性肿瘤等方面取得巨大成功,开创临床治疗白血病及恶性肿瘤的新纪元。目前异基因干细胞移植数一直占我国的半数以上,长期存活率已达75%,居国际先进水平以达到75%以上。 造血干细胞移植可以治疗多种血液病、实体瘤、免疫缺陷病和重度急性放射病,这已被很多人所熟悉。然而科学家们在对造血干细胞的研究中还取得了许多新进展并发现许多新功能,研究结果表明造

植物细胞融合的研究进展_综述_郭学民

河北科技师范学院学报 第19卷第1期,2005年3月 Jo ur nal o f Hebei N or mal U niver sity of Science&T echnolog y Co llege V o l.19 No1.1M arch2005 植物细胞融合的研究进展(综述) 郭学民1,2,徐兴友1,2,王同坤1,王华芳2,尹伟伦2 (1河北科技师范学院生命科学系,河北秦皇岛,066600;2北京林业大学生物科学与技术学院)摘要:概述了原生质体分离和培养的影响因素,介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。 关键词:细胞融合;原生质体;筛选与鉴定 中图分类号:Q321+.2 文献标识码:A 文章编号:1672-7983(2005)01-0065-05 细胞融合(cy to mixis),亦称细胞杂交(cell fusio n),是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程[1]。植物细胞融合可分为体细胞杂交(somatic hybridizatio n)和配子-体细胞杂交(gameto-somatic hy br idizatio n),前者是指不经过有性过程,而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[2],后者是指性细胞(如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等)原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[3]。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支,是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径,原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。 自1960年Cocking[4]用酶法分离出番茄根原生质体后,Natag a和T akebe[5]1970年首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株;1975年以色列的Vardi等[6]首次从木本植物Sham onti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株;在禾本科植物中,除在珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料,较早获得原生质体再生植株外,直到1985年Fujim ur a[7]等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株,才出现了重大突破。现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进,植物细胞融合获得了巨大成功。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。 1 原生质体的分离和培养 1.1 起始材料 起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。在以往的双子叶植物培养中,大多以叶片为分离原生质体的材料,近年来,起始材料的适用范围有了较大扩展。目前,以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式;禾本科植物原生质体培养获得成功的试验,几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。 1.2 基因型 同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同,所以在相同条件下,不同品种的再生能力不同。王光远和夏镇澳[8]在水稻原生质体培养中曾用26个品种进行组织培养,其中仅有3个品种(粳稻农虎6号、国香1号和上农香糯)能成功地用于原生质体培养,获得再生植株。据统计,小麦获得原生质体再生植株的基因型只有大约10个[9]。基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用,它不仅影响原生质体的产量和活力,而且还影响植株的再生。Cheng和Veillenux证明芙薯(Solanum phureja)从原生质体培养到愈伤组织形成受2个独立位点的显性基因的调控[10]。因此,现有 收稿日期:2004-03-09;修改稿收到日期:2004-12-12

综述:无缝克隆与基因融合(中文版)

无缝克隆与基因融合 基因融合技术是基因功能研究的关键工具。准确拼接的杂合分子,没有任何无关的序列,使我们可以对分子进行精确的研究。本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用,以及获得这些杂交分子的方法 前言 随着各种基因组测序项目的完成,人们越来越关注基因产物的功能分析。基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用,包括基因和蛋白标记,报告基因的研究,结构域互换研究,突变研究和基因敲除或者插入实验。传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应(所谓的剪切/粘贴反应),曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。然而,这种方法常常会在接合处留下操作的序列,例如酶切位点。这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔,在接合处引入多余的氨基酸残基,可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响,因此影响对融合基因精确的研究。这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处,概括了实现无缝基因融合的方法。 无缝基因融合及其应用 无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起,在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。这是获得杂交基因的理想情况。以下强调几个例子,以表明无缝基因融合的重要性。 启动子和外显子研究 基因启动子含有许多调控元件。转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件,获得关于基因调控机制的重要信息。然而,因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的,通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。在真核细胞中,通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计,得到嵌合体前体基因。只要杂合基因形成正确,无缝融合就可以通过拼接实现。 蛋白质功能研究和蛋白质工程 蛋白质由有功能结构域构成。为了阐述一个蛋白某个结构域的功能,需要构建该结构域删除或者被相似结构域替换的突变体。这种结构域删除或者互换实验将在很大程度上得益于相关元件的无缝融合,来消除有操作序列所带来的潜在的负面影响。更加概括地说,不同结构域的无缝融合对于蛋白质工程是非常重要的,包括获得新的杂交分子和抗体改造。对于抗体改造,互补决定区嫁接(CDR-grafting)和定点突变是经常要做的。嵌合体蛋白也可以通过內含肽介导的蛋白拼接和连接获得。只要含有內含肽的前体蛋白没有多余的序列,精确蛋白融合就可以实现。 蛋白质表达 标签和融合伴侣的使用促进了蛋白质的表达。它们赋予蛋白的可溶性和稳定性并促进接下来的目的蛋白的亲和纯化。在目的蛋白的活性不受到融合伴侣或者标签影响的情况下,整个融合蛋白可以直接用到接下来的研究中。对于酶学研究和测定,通常是这种情况。然而,在许多情况下,移除融合蛋白是必要的,这可以通过改造的蛋白酶酶切位点来完成。这个过程需要蛋白酶切位点和目的蛋白之间无缝的连接。为了进行功能研究,在一些情况下携带一个短标签(比如his标签)的融合蛋白被成功地结晶,移除这个标签是不必要的。然而,如果带有标签的蛋白无法结晶,就难以估量标签的影响,标签的切除通常是必要的。 在表达成熟和有活性蛋白的过程中,常常需要表达蛋白氨基酸序列与原来的一样。例如

细胞工程在细胞融合技术上的应用

摘要:细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项 心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段向操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。 关键词:方法动物细胞融合植物细胞融合应用 1.细胞融合常用的技术 1.1生物法 仙台病毒HVJ诱导法 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象+ 冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础, 细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视。 1.2化学法 1.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。1.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 1.2.2聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%~55%)对细胞的毒性应进一步减小。 1.3物理法 1.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。 1.3.2激光融合技术 1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。 2细胞融合技术的最新进展

造血干细胞移植后肺部感染的诊治进展

四综述四 D O I :10.3760/c m a .j .i s s n .1673-436X.2014.02.012作者单位:400016重庆医科大学附属第一医院呼吸内科 通信作者,郭述良,E m a i l :G U O S L 999@s i n a .c o m 造血干细胞移植后肺部感染的诊治进展 彭印印 郭述良 ?摘要? 自19世纪60年代末期第1例造血干细胞移植成功以来,造血干细胞移植为血液系统疾病二实体肿瘤二遗传和代谢性疾病提供了一种重要的治疗方式三但移植后感染性并发症很常见,尤其肺部感染具有较高的发病率和病死率三本文即对造血干细胞移植后肺部感染的诊治特点作一综述三 ?关键词? 造血干细胞移植; 肺部感染;移植物抗宿主病C l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fd i a g n o s i sa n dt r e a t m e n to f p u l m o n a r y i n f e c t i o n sa f t e rh e m a t o p o i e t i cs t e m c e l l t r a n s p l a n t a t i o n P e n g Y i n y i n ,G u oS h u l i a n g .D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ,t h eF i r s tH o s p i t a l a f f i l i a t e d t oC h o n g q i n g M e d i c a lU n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 400016,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :G u o S h u l i a n g , E m a i l :G U O S L 999@s i n a .c o m ?A b s t r a c t ? S i n c et h ef i r s th e m a t o p o i e t i cs t e m c e l l t r a n s p l a n t a t i o n (H S C T )s u c c e e d e di n1960s ,H S C Th a s o f f e r e da t h e r a p e u t i c o p t i o n f o r h i g h - r i s km a l i g n a n t h a e m a t o p o i e t i cd i s o r d e r s ,s o l i d t u m o r ,a n d g e n e t i cm e t a b o l i cd i s e a s e .H o w e v e r ,i n f e c t i o u s c o m p l i c a t i o na f t e r t r a n s p l a n t a t i o n i s c o mm o n ,e s p e c i a l l y t h em o r b i d i t y a n dm o r t a l i t y o f p u l m o n a r y i n f e c t i o na r eh i g h e r .T h i s a r t i c l e r e v i e w s t h e c h a r a c t e r i s t i c so f c u r r e n t d i a g n o s t i c a n d t h e r a p e u t i c a d v a n c e m e n t o f p u l m o n a r y i n f e c t i o n s a f t e rH S C T.?K e y w o r d s ? H e m a t o p o i e t i cs t e m c e l lt r a n s p l a n t a t i o n ;P u l m o n a r y i n f e c t i o n s ;G r a f t -v e r s u s - h o s t d i s e a s e 造血干细胞移植(h e m a t o p o i e t i cs t e m c e l l t r a n s p l a n t a t i o n ,H S C T )现已广泛应用于临床,为血液系统疾病二实体肿瘤二遗传和代谢性疾病提供了一种重要的治疗方式三H S C T 前需接受大剂量放化疗导致重度骨髓抑制,造血干细胞植入后其免疫功能重建需12个月左右[1] ,H S C T 后, 为预防和治疗移植物抗宿主病(g r a f t -v e r s u s -h o s t d i s e a s e ,G V H D ) 免疫抑制剂的使用,以及G V H D 本身均可导致免疫缺陷,故而细菌二真菌二病毒等感染率增高三而肺部感染依然是H S C T 后感染相关最主要的死 亡原因[2] 三本文即对H S C T 后肺部感染的特点及治疗进行综述三 1 H S C T 后发生肺部感染的危险因素已报道的H S C T 后肺部感染的危险因素包括:为预防和治疗G V H D 使用免疫抑制剂二G V H D 二 其他部位的感染二H L A 不相合二男性二清髓性预处理二移植后的非感染性肺部并发症[ 2-3 ]三但也有报道称非亲缘全相合的H S C T 相比于亲缘全相合的 H S C T 并没有更高的感染风险[4] 三 2 H S C T 后肺部感染的微生物谱及大致时限 早在1996年,S o u b a n i 等就总结了H S C T 后肺部感染的微生物谱及大致时限三H S C T 后的第1个月,即粒细胞减少阶段,以细菌(主要是来源于胃肠和口腔黏膜的革兰阴性菌)和真菌感染为主,也可见到单纯疱疹病毒感染三移植后100d 内, 巨细胞病毒(C y t o m e g a l o v i r u s ,C MV )多聚集于此阶段三H S C T 后100d 之后,主要是水痘-带状疱疹病毒(v a r i c e l l a -z o s t e r v i r u s ,V Z V )二细菌(以肺炎链球菌和其他革兰阳性病原体为主)等感染三 3 H S C T 后各种病原体的肺部感染 3.1 细菌性肺部感染 细菌性肺部感染可发生于 H S C T 后任何时间,常发生于粒细胞缺乏期三移植100d 内肺部感染以医院获得性肺炎为主, 主要病原体为革兰阴性菌,如铜绿假单胞菌二大肠杆菌二肺炎克雷伯菌二嗜麦芽寡氧单胞菌二军团菌二鲁氏不动杆菌二阴沟肠杆菌等三100d 后以社区获得性肺炎为主,主要为肺炎链球菌感染三 细菌性肺炎患者多有发热症状,但由于中性粒细胞减少和缺乏,其呼吸道症状及体征可不明显三胸片上炎性渗出性病变可缺如或不易发现三对于胸 四 131四国际呼吸杂志2014年1月第34卷第2期 I n t JR e s p i r ,J a n u a r y 2 014,V o l .34,N o .2

细胞融合技术研究进展

细胞融合技术研究进展 年级专业 课程 学生姓名 学号 指导教师

摘要:人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多,其应用范围也越来越广。对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。 关键词:细胞融合;机理;方法;应用 细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。 1细胞融合的机理 最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。 2细胞融合的方法 2.1生物法 自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。 2.2化学法 2.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%~55%)对细胞的毒性应进一步减小。 2.3物理法 2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。

PCR 技术综述

08检二陈勇0803010049 PCR技术综述 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术(即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术)之一。能通过体外(试管内)扩增将目的基因(或靶基因)片段百万倍的放大,具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。目前,这项已广泛应用于分子生物学的各个领域,在医学检验中也显示广阔的应用前景。PCR技术的展简史 1953年沃森(Watson)与克里克(Crick)提出的DNA结构模型。 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。 1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想:经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA 片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有耐高温,在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶等特点。由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别,将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA Polymerase。此酶的发现使PCR得以广泛应用。 20世纪90年代中期,随着多种自动化PCR扩增仪的问世,PCR 技术迅速普及,其应用范围也越来越广泛。近年来,PCR技术从原来的定性检测迅速发展到实时定量检测,它克服了传统PCR的许多不足,在分子诊断及其他相关领域发挥着重要作用。 PCR技术的基本原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA的方法,反应原理与细胞内的DNA 半保留复制相似,但PCR的反应体系要简单的多,主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3 ’末端互补的合成引物、四种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。基本过程是以待扩增的DNA片段为模板,首先高温变性,将混合物加热到94℃维持15到30秒,使模板DNA双链解旋成两条单链;然后逐渐降温退火,温度降到55℃,使引物与模板DNA单链碱基互补配对结合;最后在引物、四种dNTP、DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。理论上每次循环结束后靶DNA扩增一倍,即靶DNA数目以

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